一种病理性血管生成抑制剂及其用途

摘要

本发明提供了一种病理性血管生成抑制剂及其用途，即异戊烯基焦磷酸异构酶1抑制剂在制备病理性血管生成抑制剂中的用途以及在制备用于预防和/或治疗病理性血管形成相关疾病的药物中的用途。本发明提供的病理性血管生成抑制剂比以往采用的抑制血管生成信号途径的手段更加有效地抑制病理性血管生成，从而能够更有效地预防和/治疗病理性血管生成相关性疾病。

说明书

技术领域

本发明属于医药领域，涉及一种病理性血管生成抑制剂以及一种用于预防和/或治疗病理性血管生成相关疾病的药物。具体地，本发明涉及异戊烯基二磷酸酯异构酶1抑制剂在制备病理性血管生成抑制剂以及在制备用于预防和/或治疗病理性血管生成相关疾病的药物中的用途。

背景技术

血管新生(angiogenesis)是指从已存在的血管新生出新的血管的过程，它是维持正常生命体发育、生理活动，以及病理形成的重要生物学过程(Carmeliet 2004)。血管新生是由许多复杂的信号通路调控的。这些信号通路的异常会引起血管新生的异常，并导致严重的病理学后果，如癌症以及其他与异常血管发育和形成相关的疾病等(Carmeliet2003)。在癌症中，癌细胞的增殖需要血管提供营养，癌组织中的缺氧环境会诱导血管的新生。因此，抑制血管的异常形成是治疗包括癌症在内的相关疾病的有效手段之一(Carmeliet 2004)。

然而，目前主要用于抑制血管形成的药物基本为针对血管生长因子VEGF和其受体VEGFR的抑制剂。在临床的相关研究中，发现这些药物并不能显著改善病人的存活率，其原因在于血管的形成可以绕过VEGF和VEGFR途径，通过其他生长因子促进血管的形成(Carmeliet 2005)。由于血管新生受多种因子的调节，因此血管新生的调控是一个十分复杂的动态平衡过程。近年来，发现通过抑制内皮细胞代谢，尤其是能量代谢途径可以克服上述缺点，从而更加有效地抑制血管的形成(Carmeliet 2015；Carmeliet and Baes 2008；Potent and Carmeliet 2017)。但最新的蛋白质组学研究指出通过抑制能量代谢途径并不足以杀死体内环境中的癌细胞，而通过抑制其他重要中间代谢产物或脂类或许更为有效(Carmeliet 2018)。

目前，与能量代谢途径相关的抑制剂有许多已在临床研究中用于治疗相关癌症，但对于其他存在血管异常相关因素的疾病则没有相关的临床研究报道(Iannelli etal.2018)。

基于以上现有技术的现状，当前对更有效的抑制病理性血管形成的药物仍存在迫切的需求。

发明内容

因此，针对现有技术中存在的不足之处，本发明的目的在于提供一种病理性血管生成抑制剂—异戊烯基二磷酸酯异构酶1抑制剂。本发明的研究表明，作为一种内皮细胞代谢酶抑制剂，异戊烯基二磷酸酯异构酶1抑制剂不仅能够显著地抑制病理性血管生成，从而用于预防和/治疗病理性血管生成相关性疾病，而且还能够与各种抗肿瘤药物联用获得协同治疗肿瘤的优异效果。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

一方面，本发明提供了异戊烯基焦磷酸异构酶1(IDI1)抑制剂在制备病理性血管生成抑制剂中的用途。

优选地，所述病理性血管生成为静脉血管生成。

另一方面，本发明提供了异戊烯基焦磷酸异构酶1抑制剂在制备用于预防和/或治疗病理性血管形成相关疾病的药物中的用途。

优选地，所述病理性血管生成为静脉血管生成。

本发明中提及的异戊烯基焦磷酸异构酶1(IDI1)是甲羟戊酸代谢途径中的检查点(check point)酶，其主要定位在线粒体和过氧化物酶体中，在各种组织和细胞中广泛表达。另有IDI2基因，其主要在肌肉细胞中表达。IDI1主要催化异戊烯焦磷酸(IPP)和二甲基烯丙基二磷酸(DMAPP)之间的转化反应，这是甲羟戊酸代谢途径中的关键步骤。本发明利用各种动物实验表明IDI1是大多数静脉血管形成的必要因子，这是首次发现的存在于动物体中的普遍调控静脉血管形成的代谢酶。本发明人发现，通过抑制甲羟戊酸途径的检查点酶—异戊烯基焦磷酸异构酶1的表达和/或活性，可以显著地抑制病理性血管形成，纠正血管的异常新生，如癌症的血管正常化，进而用来预防和/或治疗各种与之相关的疾病。

根据本发明所述的用途，其中所述异戊烯基焦磷酸异构酶1抑制剂可以选自抑制IDI1基因的表达和/或活性的siRNA、shRNA、磷酰二胺吗啉代低聚体(morpholino)、核糖酶、反义RNA或microRNA等。

根据本发明所述的用途，其中所述异戊烯基焦磷酸异构酶1抑制剂还可以选自抑制IDI1基因的表达和/或活性的化合物、代谢产物或抗体等。

优选地，所述抑制IDI1基因的表达和/或活性的化合物或代谢产物选自以下化合物：

更优选地，所述抑制IDI1基因的表达和/或活性的化合物或代谢产物选自以下化合物：

优选地，所述抑制IDI1基因的表达和/或活性的化合物或代谢产物为DMAPP的二烯类似物；更优选地，所述DMAPP的二烯类似物选自以下化合物：

根据本发明所述的用途，其中所述抑制异戊烯基焦磷酸异构酶1基因的表达和/或活性的shRNA的引物序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示。

根据本发明所述的用途，其中所述抑制异戊烯基焦磷酸异构酶1基因的表达和/或活性的siRNA的序列如SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示。

根据本发明所述的用途，其中所述病理性血管形成相关疾病可以为眼部疾病，包括但不限于早产儿视网膜病变、糖尿病性视网膜病变、老年性黄斑病变或伴有血管异常的角膜病等。

根据本发明所述的用途，其中所述病理性血管形成相关疾病可以为与血管异常增长相关的疾病，包括但不限于Klippel-Trenaunay综合征(KTS)、神经纤维瘤病、Beckwith-Wiedemann综合征、Proteus综合征、Sturge-Weber综合征或与PIK3CA相关的过度生长综合征(PROS)等。

根据本发明所述的用途，其中所述病理性血管形成相关疾病可以为癌症，包括但不限于基底细胞瘤、食道癌、成神经管细胞瘤、小细胞肺癌、胰腺癌、胃癌、直肠癌、卵巢癌、白血病、前列腺癌或乳腺癌等。

根据本发明所述的用途，其中所述病理性血管形成相关疾病可以为自身免疫疾病，包括但不限于类风湿性关节炎等。

根据本发明所述的用途，其中所述病理性血管形成相关疾病可以为肾病，包括但不限于糖尿病性肾病、肾纤维化或多囊性肾病。

根据本发明所述的用途，其中所述预防和/或治疗病理性血管形成相关疾病的药物还包含除异戊烯基焦磷酸异构酶1抑制剂之外的药物活性成分；优选地，所述除异戊烯基焦磷酸异构酶1抑制剂之外的药物活性成分选自EGFR抑制剂、激酶抑制剂、CTLA-4抑制剂、PD-1单抗或PD-L1单抗中的一种或多种。

根据本发明所述的用途，其中所述预防和/或治疗病理性血管形成相关疾病的药物还包含一种或多种药学上可接受的辅料。

优选地，所述药学上可接受的辅料选自填充剂、崩解剂、粘合剂和润滑剂中的一种或多种。

更优选地，所述填充剂选自微晶纤维素、淀粉和磷酸氢钙中的一种或多种；所述崩解剂选自交联聚维酮、交联羧甲基纤维素钠、羧甲基纤维素钙和低取代羟丙基纤维素中的一种或多种；所述粘合剂选自羟丙纤维素、聚维酮和羟丙甲纤维素中的一种或多种；所述润滑剂选自硬脂酸镁、硬脂酸钙、山嵛酸甘油酯、硬脂富马酸钠、二氧化硅、微粉硅胶和滑石粉中的一种或多种。

根据本发明所述的用途，其中所述预防和/或治疗病理性血管形成相关疾病的药物为经胃肠道给药的制剂或非经胃肠道给药的制剂。

优选地，所述经胃肠道给药的制剂为散剂、片剂、颗粒剂、胶囊、溶液、乳剂或混悬剂；所述非经胃肠道给药的制剂为注射剂。

更优选地，所述注射剂为静脉注射剂、肌内注射剂、皮下注射剂、皮内注射剂或腔内注射剂。

相应地，本发明还提供了一种体内或体外抑制受试者的病理性血管形成的方法，其包括将异戊烯基焦磷酸异构酶1(IDI1)抑制剂与所述受试者的血管相接触。本发明还提供了一种预防和/或治疗受试者的病理性血管形成相关疾病的方法，其包括给予有需要的受试者预防和/或治疗有效量的异戊烯基焦磷酸异构酶1(IDI1)抑制剂。

根据本发明所述的方法，其中所述异戊烯基焦磷酸异构酶1抑制剂可以选自抑制IDI1基因的表达和/或活性的siRNA、shRNA、磷酰二胺吗啉代低聚体(morpholino)、核糖酶、反义RNA或microRNA等。

根据本发明所述的方法，其中所述异戊烯基焦磷酸异构酶1抑制剂还可以选自抑制IDI1基因的表达和/或活性的化合物、代谢产物或抗体等。

优选地，所述抑制IDI1基因的表达和/或活性的化合物选自以下化合物：

更优选地，所述抑制IDI1基因的表达和/或活性的化合物选自以下化合物：

优选地，所述抑制IDI1基因的表达和/或活性的化合物为DMAPP的二烯类似物；更优选地，所述DMAPP的二烯类似物选自以下化合物：

根据本发明所述的方法，其中所述抑制异戊烯基焦磷酸异构酶1基因的表达和/或活性的shRNA的引物序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示；

根据本发明所述的方法，其中所述抑制异戊烯基焦磷酸异构酶1基因的表达和/或活性的siRNA的序列如SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示。

根据本发明所述的方法，其中所述病理性血管形成相关疾病可以为眼部疾病，包括但不限于早产儿视网膜病变、糖尿病性视网膜病变、老年性黄斑病变或伴有血管异常的角膜病等。

根据本发明所述的方法，其中所述病理性血管形成相关疾病为与血管异常增长相关的疾病，包括但不限于Klippel-Trenaunay综合征(KTS)，神经纤维瘤病、Beckwith-Wiedemann综合征、Proteus综合征、Sturge-Weber综合征或PIK3CA相关的过度生长综合征(PROS)等。

根据本发明所述的方法，其中所述病理性血管形成相关疾病为癌症，包括但不限于基底细胞瘤、食道癌、成神经管细胞瘤、小细胞肺癌、胰腺癌、胃癌、直肠癌、卵巢癌、白血病、前列腺癌或乳腺癌等。

根据本发明所述的方法，其中所述病理性血管形成相关疾病可以为自身免疫疾病，包括但不限于类风湿性关节炎等。

根据本发明所述的方法，其中所述病理性血管形成相关疾病可以为肾病，包括但不限于糖尿病性肾病、肾纤维化或多囊性肾病。

本发明所述的“siRNA(small interfering RNA)”指的是一类长度为20-25个碱基对且与miRNA类似的双链RNA分子，其主要通过与互补配对的核苷酸序列结合来降解靶序列mRNA，进而阻止其翻译。

本发明所述的“shRNA(small hairpin RNA)”指的是一类具有发夹结构的人工RNA分子，其可通过RNA干扰沉默靶基因。shRNA可通质粒、细菌或病毒载体运载。表达载体整合到宿主基因组中后，shRNA通过RNA聚合酶II或III转录，所产生的类pre-microRNA分子再经过Drosha加工后成为pre-shRNA，其由Exportin 5转运出核，再进一步被Dicer加工后载入RNA诱导的沉默复合体(RISC)。正义链被降解，反义链引导RISC至含有与反义链互补序列的mRNA处，完全匹配后RISC降解靶基因mRNA。

本发明所述的“磷酰二胺吗啉代低聚体(morpholino)”属于第三代反义寡核苷酸，由美国Gene Tools公司独家研制，主要通过与RNA结合来阻断蛋白质转录或翻译，从而抑制基因的表达。

本发明中的“microRNA”是指在生物界普遍存在的包括约22个核苷酸的小非编码RNA，其可通过RNA沉默和基因表达的转录后调控发挥作用。

本发明中的化学结构式中的“PPO-”或“-OPP”是指二磷酸酯基。

本发明涉及的“病理性血管生成”指的是在某些疾病的发生和发展过程中发生的大量异常血管形成和生长的过程。这些病理性血管形成可发生在全身各处，包括关节、皮肤、肝脏、肾脏、肺、耳和其他上皮组织、尿道、卵巢和胎盘、脑、神经、眼、心脏、骨骼肌、以及内分泌器官等。在视网膜中，异常的血管形成是引起不可逆性视觉丧失的重要原因，抑制病理性血管形成可显著改善视觉。而在肾脏中，肾小球和肾小管周围的血管网络对肾脏的功能至关重要，这些血管网络的异常可导致肾脏相关疾病。抑制肾脏血管的异常增长可减少对肾脏的损伤并有利于肾脏功能的恢复。目前，在临床上抑制VEGF的表达是治疗糖尿病性肾病的一种选择，但其有副作用，如形成微血管栓，影响了其临床的效果(Tanabe 2018)。先前的研究证明，在癌症中，实体瘤的生长依赖血管新生，抑制血管新生可减少肿瘤，特别是癌细胞还未被血管化前的实体瘤类型的生长(Ichihara Kiura and Tanimoto 2011)。可通过本发明提及的方法治疗的癌症类型包括但不限于基底细胞瘤、食道癌、成神经管细胞瘤、小细胞肺癌、胰腺癌、胃癌、直肠癌、卵巢癌、白血病、前列腺癌和乳腺癌等。

本发明还可同时使用其他药物成分。除了可抑制IDI1的药物，合适的其他药物分子或处理方式也同样适用于本发明。例如，当治疗癌症时，可抑制IDI1的药物可与其他抗肿瘤(化疗)试剂联合使用，如EGFR抑制剂，各类激酶抑制剂等。这些其他类药物可在治疗的任何适合的时间给药。特别地，当治疗癌症时，作为抑制血管新生的活性成分的IDI1抑制剂可与免疫监测点抑制剂(ICIs，immuno-checkpoint inhibitors)联合使用。这些ICI包括并不限于CTLA-4抑制剂(如Ipilimumab)、PD-1单抗(如Nivolumab或Pembro-lizumab)及PD-L1单抗等。

本发明涉及的能抑制IDI1表达或活性的化合物或代谢产物在真菌中已有报道。Manfred Muehlbacher等(Biochemistry 1988)详细描述了七种潜在的能够抑制Clauicepspurpurea中的IDI1活性的化合物，如3-(氟甲基)-3-丁烯-l-基二磷酸酯和3,4-环氧基-3-甲基-l-丁基二磷酸酯，这些均为IDI1代谢底物IPP的类似物且为不可逆抑制剂，这些化合物或代谢产物同样适用于本专利。

此外，Zheng Wu等(J Am Chem Soc.2005)描述了DMAPP的二烯类似物(E-2-OPP，Z-2-OPP和4-OPP)同样是潜在的IDI1的抑制剂。它们的结构如上所示。这些化合物或代谢类似物同样适用于本专利。

本发明涉及的能抑制IDI1表达和/或活性的化合物或者代谢产物，除了上述提及的，还包括通过传统药物筛选方法和斑马鱼药物筛选平台筛选出的已知抑制剂的类似物或全新化合物(含可逆抑制剂)。

本发明中涉及的抗体是指可以结合IDI1且下调IDI1表达的抗体。这类抗体可以结合IDI1并干扰其酶活性。“抗体”或者“免疫球蛋白”指整个抗体或任何抗原结合片段或单链。“抗体”由至少两条重链(H)和两条轻链(L)组成。

细胞代谢的改变以及对不同代谢产物(如蛋白质、脂类、核苷酸等)的需求是癌症发生和发展过程中的一大特征。而代谢途径在内皮细胞的功能中的作用最近才引起学术界的重视。内皮细胞高度依赖于糖酵解途径来供应能量，而脂肪酸氧化途径可通过提供核苷酸原料来参与内皮细胞的增殖(De Bock et al.2013；Schoors etal.2015)。近年来的研究提出的靶向内皮细胞代谢是另一种抑制肿瘤和血管生成的新思路(Li Sun and Carmeliet2019)。除了能量代谢途径，众多其他非能量的代谢途径在内皮细胞和血管形成中的作用却知之甚少。

本申请的发明人出乎意料的发现，通过逆转录病毒介导的shRNA抑制人原代内皮细胞中IDI1基因的表达，得到的IDI1缺失的内皮细胞呈现出细胞迁徙的缺陷。而体外实验也充分表明IDI1是内皮细胞迁徙的促进因子。为了进一步证明IDI1在体内的作用，发明人建立了IDI1缺失的斑马鱼突变体模型。斑马鱼是研究内皮细胞以及血管形成的绝佳模式动物，已有通过斑马鱼疾病模型高通量筛选获得的候选药物分子进入临床试验阶段。发明人对idi1突变体的斑马鱼进行表型分析，发现突变体胚胎呈现出特异性静脉血管形成缺陷。本申请的体内和体外的实验结果充分地证明IDI1是血管形成的重要代谢酶，可以通过抑制IDI1来治疗病理性血管形成。之后，发明人利用斑马鱼和小鼠的相关疾病模型，证明抑制IDI1可显著抑制病理性血管形成。所有的证据均表明通过抑制IDI1的表达和/或活性可显著抑制病理性血管形成，进而提供一种用于预防和/或治疗病理性血管形成相关疾病的药物。

具体地，本申请的发明人通过以下方法证明了通过抑制IDI1的表达和/或活性可以显著地抑制病理性血管形成：

1)通过在人原代内皮细胞中抑制idi1基因，观察IDI1缺陷的内皮细胞表型对如细胞增殖、凋亡和迁徙的影响；

2)通过构建斑马鱼idi1突变体品系，研究其血管特异性表型和分子机制；

3)通过构建斑马鱼静脉血管异常增生模型，研究idi1缺失对斑马鱼静脉血管异常增生的影响；

4)通过构建小鼠血管异常增生模型，评价抑制IDI1表达对小鼠血管异常增生的影响。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

现有的临床上抑制病理性血管形成的方法主要是通过抑制调控血管形成的信号分子，如抑制VEGF或VEGFR2等。然而，细胞已经形成对这些药物的抗性，并且其他类似促血管形成的信号途径被异常激活从而无法达到预期的抑制血管新生的作用，这也是这些药物在临床试验阶段无法获得有益疗效以及延长病人存活时间的重要原因。而本发明发现了血管形成过程中重要的代谢酶IDI1，而且血管内皮细胞无法利用代偿机制弥补IDI1缺失引起的血管抑制效应。与现有技术相比，本发明提供的IDI1抑制剂将比以往利用抑制血管生成信号途径的手段更加有效。此外，IDI1抑制剂可与其他目前临床上可用的抗肿瘤药物联合使用来获得更佳的治疗效果。

附图说明

以下结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：

图1是说明甲羟戊酸途径的示意图。

图2是采用shRNA抑制IDI1的表达和相应的内皮细胞的表型图。其中，图2A为使用Western blot检测IDI1表达水平的凝胶电泳图，actin(肌球蛋白)为上样参照；图2B显示使用细胞团血管形成法检测对照组shSCR和IDI1敲降内皮细胞的迁移能力。

图3显示过表达IDI1的人原代内皮细胞的表型。其中，图3A为Western blot检测对照(control)和IDI1过表达组细胞(OE，overexpression)IDI1的表达水平，vinculin(纽带蛋白)为上样参照；图3B显示使用伤口愈合法检测对照(control)和IDI1过表达的内皮细胞的迁移能力，其分别显示了对照和过表达IDI1的内皮细胞(OE)在伤口形成后0小时、6小时和10小时的愈合情况。

图4显示本发明的idi1突变斑马鱼模型的研究结果；其中，图4A显示野生型sib和突变体idi1等位基因的结构；图4B显示使用RT-PCR检测野生型sib和突变体斑马鱼idi1基因mRNA的表达情况；图4C显示使用Western blot检测野生型sib和突变体斑马鱼idi1基因的蛋白表达情况；图4D显示野生型sib和idi1基因突变体斑马鱼的整体油红O(Oil-Red)染色情况，可见在野生型sib血管中的中性脂类被油红O染色显示为红色信号，而此种信号在突变体idi1中却完全不见。

图5是显示idi1突变体斑马鱼的形态和动静脉分化情况的图。其中，图5A为3dpf的野生型和idi1突变体斑马鱼在白光下的形态以及在Tg(kdrl:GFP)遗传背景下在荧光显微镜中的血管的形态；图5B为野生型和idi1突变体斑马鱼的早期血管的动静脉分化情况，ephrinB2的原位杂交显示idi1突变体斑马鱼的动脉形成正常，flt4的原位杂交显示idi1突变体斑马鱼的静脉发育良好。

图6显示idi1突变体斑马鱼的头部血管发育情况。其中，图6A和6B分别显示52hpf的野生型和idi1突变体斑马鱼的头部血管的背面观。箭头和三角形图示分别指示中央动脉(central artery)和介于中央动脉和PHBC之间的静脉血管。从图可知，野生型斑马鱼具有发育良好的血管样式，而idi1突变体斑马鱼则缺失这些连接PHBC和中央动脉的静脉血管；图6C显示52hpf的野生型和idi1突变斑马鱼的头部血管的侧面观。箭头和三角形图示分别指示中央动脉和介于中央动脉和PHBC之间的静脉血管。

图7显示idi1突变体斑马鱼的躯干部血管发育情况。其中，图7A为48hpf的对照和idi1突变体斑马鱼躯干部血管侧面图，Se(segmental vessel)：分支血管；DA(dorsalaorta)：主动脉血管；PCV(posterial caudal vein)：后部主静脉血管。箭头分别标记分支血管和主动脉或主静脉的连接；7B显示图7A中野生型和idi1突变斑马鱼胚胎中每10个体节中静脉芽体的数量统计；7C为idi1突变体斑马鱼胚胎躯干部血管异常的简化模式图，其中左边为野生型斑马鱼，可见源自PCV的分支血管，而右图为idi1突变体斑马鱼，其源自PCV的分支血管数量显著下降；图7D显示5dpf的野生型斑马鱼和idi1突变体斑马鱼胚胎淋巴管发育情况，TD即throcic duct，Fli1:nGFP转基因可标记血管和淋巴管内皮细胞核；左图为野生型斑马鱼，箭头标记的TD为主要的淋巴管器官；而右图为idi1突变斑马鱼，TD则缺失。

图8显示idi1突变斑马鱼的尾部血管发育情况。其中，图8A显示在3dpf的对照胚胎中，尾端静脉丛包括一个主静脉(腹部静脉，VV)和诸多细小背部静脉(背部静脉，DV)，右边为示意图；图8B显示在idi1突变体胚胎中，代替的是许多细小静脉(CV)，右边为示意图。

图9显示idi1的缺失对BMP诱导形成的异位增生血管的影响的结果。其中，图9A上方图显示热激后过表达bmp2b的野生型斑马鱼胚胎侧面，可见从躯干和尾部静脉向上生长的新生血管A，如曲线所示；下方图显示热激后过表达bmp2b的idi1突变斑马鱼胚胎侧面，其新生血管如曲线所示；图9B为图9A中异常新生血管的面积的统计图。

图10显示IDI1 siRNA抑制低氧诱导的血管异常增生的小鼠模型的结果。其中，图10A和B为P17(出生后17天)小鼠眼球视网膜CD31整体免疫荧光图，图10A显示对照组，图10B显示IDI1 siRNA注射组，视网膜范围已标示；图10C为新生异常血管的面积统计。

图11显示IDI1在人癌症组织中的表达以及IDI1的表达与癌症病人存活时间相关性的结果。其中，图11A为乳腺癌、肝癌和胰腺癌和各对照正常组织中的IDI1表达量；图11B显示在乳腺癌中高表达IDI1和低表达IDI1亚型和病人的存活率的相关性分析。

具体实施方式

下面结合实施例及附图来详细说明本发明。应当理解，实施例仅用于进一步说明和阐释本发明，并非用于限制本发明。

除非另外定义，本说明书中有关技术和科学的术语与本领域技术人员所通常理解的意思相同。虽然在实验或实际应用中可以应用与此间所述相似或相同的方法和材料，但本文还是在下文中对材料和方法做了描述。在相冲突的情况下，以本说明书包括的定义为准。另外，材料、方法和例子仅供说明，而不具限制性。

在下列实施例中，未注明具体条件的实验方法通常采用常规条件，例如《精编分子生物学实验指南》(F.M.奥斯伯，R.E.金斯顿，J.G.塞德曼等主编，马学军，舒跃龙译，北京：科学出版社，2004)中所述的方法进行。

实施例1 shRNA介导的IDI1的敲降

合成两个靶向人IDI1基因(NCBI基因登录号为3422)不同位点的引物序列ShIDI1-1和ShIDI1-2，并克隆到逆转录病毒shRNApLKO.1载体(Addgene)中。其中，

ShIDI1-1序列SEQ ID NO:1：

5’-CCGGCGTGTTGTAGTCATCCATTAACTCGAGTTAATGGATGACTACAACACGTTTTTG-3’；

ShIDI1-2序列SEQ ID NO:2：

5’-CCGGCCAGATCCCAATGAGATTAAACTCGAGTTTAATCTCATTGGGATCTGGTTTTTG-3’。

在HEK293细胞(

然后对IDI1敲降的内皮细胞(shIDI1 HUVEC)进行细胞增殖和迁移的功能分析。细胞计数发现IDI1被敲降的细胞增殖明显降低，细胞团血管形成法(spheroid assay)分析发现IDI1被敲降的内皮细胞有更少的芽体(sprout)伸出，表明IDI1缺失的内皮细胞的迁徙能力受到明显抑制，如图2B所示。

体外实验证明，人原代静脉内皮细胞的高效增殖和迁徙运动依赖于IDI1基因的表达。

实施例2 IDI1过表达对人原代内皮细胞的影响

为了研究IDI1过表达是否会影响内皮细胞的功能，发明人克隆并构建了IDI1过表达的逆转录病毒载体并在HEK293细胞(

实施例3 idi1斑马鱼突变体模型

为了研究idi1基因在体内的功能，鉴定了一个斑马鱼idi1基因突变品系并对其进行表型分析。本突变的等位基因(allele)La014590Tg来源于斑马鱼信息与研究中心(Zebrafish Information and Research Center，ZIRC)。一对引物SEQ ID NO:3和4用于确定突变的等位基因，其中所述野生型和突变体idi1等位基因的结构如图4A所示。

正向引物序列SEQ ID NO:3：

5’-AAAGACCCCACCTGTAGGTTTG-3’；

反向引物序列SEQ ID NO:4：

5’-ACCGTTACCAGAGAGCTAGT-3’。

Idi1杂合体自交用于产生突变体斑马鱼胚胎。收集发育至2天的斑马鱼(2dpf，days post-hybridization)对照和突变体胚胎，使用抗idi1抗体(GeneTex,货号为GTX106100)通过Western Blot检测IDI1蛋白的表达水平，发现在突变体胚胎中已检测不到IDI1蛋白的存在，如图4C所示，这些数据证明该突变体是一个无效突变体(null mutant)，可以用于研究idi1在斑马鱼发育中的作用。

甲羟戊酸代谢途径的一个分支为胆固醇代谢，是血管中的脂类分子合成的基础。为了进一步确定idi1突变体的可靠性，油红O染色法被用于检测血管中中性脂类的存在。结果显示，idi1突变体的斑马鱼胚胎的主要血管中检测不到油红O的染色信号，如图4D所示，说明斑马鱼idi1突变体中idi1的缺失引起了下游胆固醇合成代谢的缺陷。

发明人进一步发现，发育到3dpf的idi1突变体无明显的整体形态的变化，且用动静脉分化的标志基因ephrinB2(基因登录号为30219)和flt4(基因登录号为30121)经原位杂交检测显示无动静脉分化的缺陷，如图5B所示，这些结果进一步说明idi1的缺失只影响血管内皮细胞而不影响其他细胞组织。

进一步地，发明人将这一突变体与血管内皮细胞特异性绿色荧光蛋白标记的转基因斑马鱼Tg(kdrl:GFP)

躯干部的血管形成分为两波。初级血管形成是由背主动脉内皮细胞向背侧迁徙增殖形成体节间动脉血管(intersomitic arteries)。次级血管形成是由后主静脉内皮细胞迁徙增殖形成体节间静脉血管和淋巴血管的过程(Ellertsdóttir et al.2010)。idi1突变体的体节间动脉与对照的胚胎无明显差异，而体节间静脉的发育受到影响，如图7所示。其中，图7A为48hpf的对照和idi1突变体斑马鱼躯干部血管侧面图。Se(segmental vessel)：分支血管；DA(dorsal aorta)：主动脉血管；PCV(posterial caudal vein)：后部主静脉血管。箭头分别标记为分支血管和主动脉或主静脉的连接；图7B显示图7A中野生型和idi1突变斑马鱼胚胎中每10个体节中静脉芽体的数量统计；图7C为显示idi1突变体斑马鱼胚胎躯干部血管异常的简化模式图，其中左边为野生型斑马鱼，可见源自PCV的分支血管，而右图为idi1突变体斑马鱼，其源自PCV的分支血管数量显著下降；图7D显示5dpf的野生型斑马鱼和idi1突变体斑马鱼胚胎淋巴管发育情况；TD即throcic duct；Fli1:nGFP转基因可标记血管和淋巴管内皮细胞核；左图为野生型斑马鱼，箭头标记的TD为主要的淋巴管器官；而右图为idi1突变斑马鱼，TD则缺失。结果显示，在idi1突变体中，从背主静脉迁移的静脉芽数不到对照组的二分之一。这些数据显示idi1缺失只影响静脉血管的血管形成。

而在尾部，来自背主静脉的血管芽向腹面迁移形成蜂窝状血管网络，称为尾端静脉丛(Caudal vein plexus)。在大于2dpf的idi1突变体的斑马鱼中，此种蜂窝血管网络从未形成，如图8所示。图8显示idi1突变斑马鱼的尾部血管发育情况。其中，图8A显示在3dpf的对照胚胎中，尾端静脉丛包括一个主静脉(腹部静脉，VV)和诸多细小背部静脉(背部静脉，DV)，右边为示意图；图8B显示在idi1突变体胚胎中，代替的是许多细小静脉，右边为示意图。在3dpf的对照胚胎中，尾端静脉丛包括一个主静脉(腹部静脉，VV)和诸多细小背部静脉(背部静脉，DV)，但是在idi1突变体胚胎中，这一精细的结构被打乱，且无明显的腹部主静脉和背部静脉的区别，代替的是许多细小静脉，如图8B所示，这一表现显示的是静脉血管形成和重塑的缺陷。

综上所述，发明人在2-3pdf的斑马鱼idi1突变体中发现多处静脉血管特异性的异常。

实施例4 idi1缺陷可抑制由BMP引起的血管异常形成

先前的研究指出在斑马鱼中过表达BMP2b可诱导形成病理性异位血管(ectopicvessels)的形成(Y Wakayama等，2015)，于是发明人研究idi1缺失是否同样会抑制病理性血管形成。发明人在对照和idi1突变体斑马鱼1-2细胞期胚胎中显微注射热休克启动子表达的bmp2b质粒Hsp70l:bmp2b-FLAG(Wakayama et al.2015)。发育到22h的胚胎经过39℃热激2小时，24h后再热激30分钟，之后分别定量这两组胚胎发育至48hpf的异位血管覆盖的面积。结果显示idi1突变体胚胎的异位血管明显少于对照组，如图9所示。图9显示idi1缺失对BMP诱导形成的异位增生血管的影响的结果。其中，图9A上方图显示热激后过表达bmp2b的野生型斑马鱼胚胎侧面，可见从躯干和尾部静脉向上生长的新生血管A，如曲线所示；下方图显示热激后过表达bmp2b的idi1突变斑马鱼胚胎侧面，其新生血管如曲线所示；图9B为图9A中异常新生血管的面积的统计图。这些结果说明idi1缺失抑制由促血管因子BMP诱导的血管形成过程。

总之，斑马鱼胚胎发育过程是一个血管新生高度活跃的时期，idi1在血管新生高度活跃的时期发挥重要作用，但并不影响大多数细胞的发育和功能。这暗示idi1可能并不影响内皮细胞静息状态下的维持，而在健康个体中绝大多数血管内皮细胞处于静息状态，这对开发IDI1抑制剂避免较大副作用具有重要的临床意义。抑制IDI1可能为人体内的一般细胞所忍受，而不具有明显的毒性副作用。Idi1突变的斑马鱼只表现出静脉血管形成的缺陷，而血管异常的增长综合征主要是静脉血管的异常生长，IDI1作为静脉血管生成的因子对于治疗静脉异常的疾病具有很强的特异性。

实施例5抑制IDI1表达可用于治疗老鼠由低氧诱导的眼部血管增生

氧诱导的小鼠眼部视网膜血管异常增生(oxygen-induced retinopathy,OIR)是研究病理学血管形成的经典模型。发明人人工合成了可抑制小鼠idi1基因表达的siRNA，其正义序列是SEQ ID NO:5

5’-rCrCrArArCrGrArGrArUrUrArArArArGrCrUrArUrUrGrCUA-3’；

反义序列是SEQ ID NO:6

5’-rUrArGrCrArArUrArGrCrUrUrUrUrArArUrCrUrCrGrUrUrGrGrGrA-3’。

野生型老鼠(斑马鱼国际资源中心ZIRC)自交产生的胎鼠在出生后的第七天，与母鼠一同置于氧气培养箱中，其氧气浓度为75％±2。五天后，新生的小鼠(P12)和母鼠被转移至正常的氧气浓度条件下。此时，腹腔注射麻醉剂麻醉新生小鼠。扩大眼球，并在每只新生小鼠的左眼珠后0.5mm处注射1μg可抑制小鼠idi1基因表达的siRNA(1:1，1μg/μL siRNA与lipofectamine 3000(Thermo Fisher，货号为L30000001)在室温下混合15分钟)，右眼珠注射对照同体积(1μL)的PBS。五天后，P17小鼠经过量注射麻醉剂死亡后取出左右眼球，并用4％PFA室温固定2小时。再经多次PBS反复清洗后，视网膜被取出，并经IB4染料(1:100，10μg/mL，PBS稀释)室温染色过夜。经过PBS多次冲洗后，将视网膜剪成四小叶并平展于载玻片，用荧光显微镜拍照并用ImageJ软件计算分析新生血管占整个视网膜面积的比例，如图10所示。图10显示IDI1 siRNA抑制低氧诱导的血管异常增生的小鼠模型的结果。其中，图10A为P17(出生后17天)小鼠眼球视网膜CD31整体免疫荧光图，左边显示对照组，右边显示IDI1siRNA注射组；视网膜范围已标示；图10B显示新生异常血管的面积统计。结果显示对照组的视网膜呈现出明显的病理性血管新生，而注射可抑制idi1基因表达的siRNA的视网膜中病理性新生血管面积明显受到抑制，统计学检测后二者显示显著性差异(p<0.05)。

实施例6 IDI1基因在人类癌症组织中的表达以及其与存活的相关性。

发明人利用在线数据库Gent2(http://medical-genome.kribb.re.kr/GENT2/)分析了人IDI1基因在不同癌症类型细胞中的表达情况，如图11所示。IDI1基因在乳腺癌、肝癌和胰腺癌细胞中明显比对照正常组织细胞高表达。以乳腺癌为例，Kaplan-Meier生存曲线表明高表达IDI1基因的癌症病人具有更短的存活时间。这项结果结合斑马鱼和小鼠中的实验结果显示，靶向idi1基因及抑制其活性可以对上述癌症的治疗发挥多项作用，首先抑制IDI1可以有效抑制血管内皮的生长，降低肿瘤细胞对氧和养分的获取，其次抑制IDI1本身对癌细胞的生长起到抑制作用。

以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110> 陈晓文

<120> 一种病理性血管生成抑制剂及其用途

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ccggcgtgtt gtagtcatcc attaactcga gttaatggat gactacaaca cgtttttg 58

<210> 2

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ccggccagat cccaatgaga ttaaactcga gtttaatctc attgggatct ggtttttg 58

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

aaagacccca cctgtaggtt tg 22

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

accgttacca gagagctagt 20

<210> 5

<211> 48

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

rcrcrararc rgrargraru rurararara rgrcruraru rurgrcua 48

<210> 6

<211> 54

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

rurargrcra rarurargrc rurururura rarurcrurc rgrururgrg rgra 54