一种从药桑中提取骈四氢呋喃类木脂素非对映异构体的方法

摘要

本发明公开了一种从药桑中提取骈四氢呋喃类木脂素非对映异构体的方法。该方法包括如下步骤：采用乙醇浸提粉碎后的药桑得浸提液，经浓缩得药桑总浸膏；经水分散后，依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇进行萃取，得到正丁醇部位浸膏；将正丁醇部位浸膏进行干法快速减压硅胶柱层析，采用氯仿‑甲醇洗脱体系进行梯度洗脱，收集最后的甲醇流分；将甲醇流分进行干法快速减压反相硅胶柱色谱分离，采用甲醇水溶液进行梯度洗脱，收集浓度为40％时的甲醇流分；将得到的甲醇流分经高效制备液相色谱仪制备即得。本发明首次从新疆药桑中提取分离出目标提取物，提取得率高，纯度好，解决了骈四氢呋喃类木脂素非对映异构体在结构上差异极小，用常规的分离方法无法得到单体的难题。

说明书

技术领域

本发明涉及一种从药桑中提取骈四氢呋喃类木脂素非对映异构体的方法，属于化合物提取领域。

背景技术

药桑又名毛桑，是我国唯一的黑桑种(Morus nigra L.)桑树(中国桑树品种志1993)。生长于新疆沙漠地区，特殊的22倍体染色体倍数类型导致药桑次生代谢产物与其它桑品种存在较大差异。药桑叶、药桑枝、药桑椹具有消炎、补血和镇静等药用功效，一直被作为维吾尔族的民间药材。药桑中木脂素含量较为丰富，从新疆药桑中提取分离活性木脂素，利于加快新疆特色桑属资源的药用价值的开发。

木脂素类天然产物在人类营养以及疾病防御治疗中具有重要作用，是传统天然药物的重要活性成分之一。药理学研究显示相关化合物在免疫调节、抗肿瘤、抗肝毒素作用、抗焦虑、抗病毒、抗菌、抗氧化和抗炎等方面表现出显著的多样性药理活性。木脂素类化合物及其复杂性结构与多样性生物功能一直是相关科研者的重要研究热点，此类化合物具有十分广阔的研究前景。

骈四氢呋喃类木脂素由于呋喃环上的氧原子与苯甲基相连，化合物遇到酸碱条件容易发生开环闭环，重复闭环时极易发生立体异构化，合成中所得产物异构化数目多，结构差异小，异构体的存在也影响终产物的形成，直接合成再分离是比较困难的，而从天然产物中直接提取得到不同构型的骈四氢呋喃类木脂素不失为一个很好的办法。

发明内容

本发明的目的是提供一种从新疆药桑中提取骈四氢呋喃类木脂素非对映异构体的方法，具有提取得率高、纯度好的优势。

本发明方法所制备的骈四氢呋喃类木脂素非对映异构体的结构式如1、式Ⅰ和式Ⅱ所示：

本发明提供的从新疆药桑中提取骈四氢呋喃类木脂素非对映异构体的方法包括以下步骤：

S1、采用乙醇浸提粉碎后的药桑，所得浸提液经浓缩得到药桑总浸膏；

所述药桑经自然阴干后再进行粉碎；通常采用药桑叶；

S2、所述药桑总浸膏经水分散后，依次采用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇进行萃取，得到正丁醇部位浸膏；

在搅拌和超声的条件下进行分散；

S3、将所述正丁醇部位浸膏进行干法快速减压硅胶柱层析，采用氯仿-甲醇洗脱体系进行梯度洗脱，收集最后的甲醇流分；

可采用甲醇溶解所述正丁醇部位浸膏，硅胶拌样，减压旋蒸至干粉状，取出充分研磨待用；

S4、将所述甲醇流分进行干法快速减压反相硅胶柱色谱分离，采用甲醇水溶液进行梯度洗脱，收集浓度为40％时的甲醇流分；

具体地，所述甲醇流分用超纯水溶解过0.45μm水系膜，湿法上样；

S5、将步骤S4得到的所述甲醇流分经高效制备液相色谱仪制备得到式Ⅰ和式Ⅱ所示骈四氢呋喃类木脂素非对映异构体；

具体地，采用40％的HPLC级甲醇溶解步骤S4得到的所述甲醇流分，并过0.45μm滤膜，然后进行色谱制备。

上述的制备方法中，步骤S1中，采用体积浓度为80％的乙醇水溶液进行浸提；

所述浸提的温度为室温，时间为48～72h；

所述浸提的次数为1～3次，优选3次；

所述浸提液依次经减压浓缩、真空冷冻干燥得到所述药桑总浸膏。

上述的制备方法中，步骤S2中，所述萃取的条件如下：

水相与所述石油醚、所述乙酸乙酯和所述正丁醇的体积比均为1：1～3：1～3：1～3，优选1：1：1：1；

每次萃取的次数为1～3次，优选3次。

上述的制备方法中，步骤S3中，所述氯仿-甲醇洗脱体系为氯仿、氯仿与甲醇的混合液和甲醇，每个梯度洗脱剂洗脱至无成分流出；

所述氯仿与甲醇的混合液中，氯仿与甲醇的体积比为10：0.2～0.6。

上述的制备方法中，步骤S3中，所述干法快速减压硅胶柱层析采用HF254薄层色谱硅胶，以减压抽滤的形式获得流分。

上述的制备方法中，步骤S4中，所述干法快速减压反相硅胶柱色谱采用ODS填料；

依次采用甲醇体积分数为10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％和100％的所述甲醇水溶液进行洗脱，每一梯度洗脱2～8个柱体积。

具体地，装柱时干法装柱，敲平整，抽紧实后，以初始梯度洗脱剂预洗脱两个柱体积，一是为了使柱层更加紧实，二是为了使硅胶润湿，有利于上样后的洗脱。开启可调真空度的减压抽滤泵，根据柱层高度一次倾倒一定体积的洗脱剂，将柱子抽干，获得一份流分，将流分移出，再倒同等体积洗脱剂重复上述操作，当第一梯度洗脱目标样品层流出后，换第二梯度洗脱剂继续洗脱，每一梯度洗脱剂洗脱2～8个柱体积，按上述步骤进行，直至最后梯度洗脱完毕。

上述的制备方法中，步骤S5中，所述高效制备液相色谱仪制备的条件如下：

岛津shim-pack GIST C18制备色谱柱(20×250mm，5μm)；

流动相为40％的甲醇水溶液；

检测波长为272nm；

柱温为室温；

收集30min和37min的色谱峰，分别经减压浓缩即为式Ⅰ和式Ⅱ所示骈四氢呋喃类木脂素非对映异构体。

本发明首次从新疆药桑中提取分离出了目标提取物，提取得率高，纯度好，解决了骈四氢呋喃类木脂素非对映异构体(丁香脂素-4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷与表丁香脂素-4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷)在结构上差异极小，用常规的分离方法无法得到单体的难题。

附图说明

图1为实施例1提取的式Ⅰ所示化合物的

图2为实施例1提取的式Ⅰ所示化合物的

图3为实施例1提取的式Ⅰ所示化合物的HSQC谱(核磁共振碳-氢相关谱)。

图4为实施例1提取的式Ⅰ所示化合物的HMBC谱(核磁共振碳-氢远程相关谱)。

图5为实施例1提取的式Ⅱ所示化合物的

图6为实施例1提取的式Ⅱ所示化合物的

图7为实施例1提取的式Ⅱ所示化合物的HSQC谱(核磁共振碳-氢相关谱)。

图8为实施例1提取的式Ⅱ所示化合物的HMBC谱(核磁共振碳-氢远程相关谱)。

图9为实施例1提取的式Ⅰ所示化合物的高分辨质谱图。

图10为实施例1提取的式Ⅱ所示化合物的高分辨质谱图。

图11为实施例1提取的式Ⅰ所示化合物的纯度液相色谱图。

图12为实施例1提取的式Ⅱ所示化合物的纯度液相色谱图。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例提取的骈四氢呋喃类木脂素非对映异构体如式Ⅰ(表丁香脂素-4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷)和式Ⅱ(丁香脂素-4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷)所示：

实施例1、药桑中骈四氢呋喃类木脂素非对映异构体的提取

A、将采集的药桑叶(新疆和田地区)自然阴干后取5kg碾碎，80％乙醇间歇搅拌浸泡72h，过滤，重复三次，将所得滤液减压浓缩，取出真空冷冻干燥成粘稠状药桑总浸膏；

B、用5L蒸馏水分散1kg上述总浸膏，边搅拌边超声，使分布均匀，按水相：萃取剂(1：1)的比例先用极性小的石油醚萃取三次，再将萃取过的水相用乙酸乙酯(1：1)萃取三次，边萃取边减压浓缩萃取液；

C、用正丁醇(1：1)萃取乙酸乙酯萃取过的水相三次，合并减压浓缩正丁醇萃取液，真空冷冻干燥成粘稠状正丁醇部位浸膏，得正丁醇部位浸膏126.63g；

D、用适量甲醇溶解20g正丁醇部位浸膏，200～300目硅胶拌样，减压旋蒸至干粉状，取出充分研磨待用；

E、将拌样后的正丁醇部位硅胶干粉经过干法快速减压硅胶柱层析，采用氯仿、氯仿：甲醇＝(10：0.2，10：0.4，10：0.5，10：0.6)、甲醇洗脱体系进行梯度洗脱，收集最后的甲醇流分减压浓缩至干，得11g甲醇干基；

F、取2.5g步骤E中所得的甲醇干基用超纯水溶解，过0.45μm水系膜，湿法上样，通过干法快速减压反相硅胶柱色谱进一步分离，采用甲醇梯度(10％、15％、20％，25％、30％、35％、40％、100％)分步洗脱，收集40％甲醇流分浓缩至干，得40％甲醇流分干基140.3mg；

G、40％甲醇流分干基140.3mg用40％的HPLC级甲醇溶解，过0.45μm针孔滤膜，经岛津高效液相制备色谱仪制备，制备条件为：岛津shim-pack GIST C18制备色谱柱(20×250mm，5μm)，40％甲醇溶液做流动相，流速10mL/min，检测波长272nm，柱温室温，收集30min，37min的色谱峰，减压浓缩后得式Ⅰ(30min色谱峰物质)12mg，式Ⅱ(37min色谱峰物质)4.6mg；

H、所得式Ⅰ和式Ⅱ所示化合物通过沃特世液质联用仪及布鲁克核磁共振波谱仪进行结构确证。

式Ⅰ和式Ⅱ所示化合物的电喷雾电离质谱数据均为579.20809[M-H]

从

相对构型的确定，天然产物中的骈四氢呋喃类木脂素中两个四氢呋喃环均以顺式骈合,对于苯环取向不同时，C-7，7'和C-8，8'的化学位移明显不同，可以判断苯环(直立或平伏)取向；根据相关文献【石建功，苷茂罗等，《木脂素化学》，化学工业出版社，2009，55-56】记载的7，9'：7'，9-双环氧木脂烷类的氢谱特征；再结合【Xing-Cong Li,Dayna Barnes,Ikhlas Khan.A New Lignan Glycoside from Eleutherococcus senticosus[J].PlantaMed,2001,67(8).】所记载的episyringaresionol 4″-O-β-D-glucopyranoside化合物核磁信息，结合【Nzunzu LAMI,Shigetoshi KADOTA,Tohru KIKUCHI,et.al.Constituents ofthe Roots of Boerhaavia diffusa L.III.Identification of Ca

表1式Ⅰ所示化合物和式Ⅱ所示化合物的核磁共振氢谱、碳谱数据

本实施例提取得到的式Ⅰ所示化合物(表丁香脂素-4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷)的纯度液相色谱图如图11所示岛津shim-pack GIST C18柱(4.6×250mm，5μm)，40％甲醇溶液做流动相，流速1mL/min，检测波长272nm，柱温为室温)，Ⅱ所示化合物(丁香脂素-4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷)的纯度液相色谱图如图12所示(岛津shim-pack GIST C18柱(4.6×250mm，5μm)，10～100％甲醇溶液做流动相，流速1mL/min，检测波长272nm，柱温为室温)，由图11可以看出，保留时间为3min的色谱峰为二甲基亚砜溶剂峰，保留时间为10.322min的峰为表丁香脂素-4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷，11.080min峰为杂质峰，根据峰面积归一法计算得式Ⅰ所示化合物纯度为92.04％；由图12可以看出保留时间为3min的色谱峰为二甲基亚砜溶剂峰，保留时间为6.062min的峰为丁香脂素-4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷与9.336min峰为杂质峰，根据峰面积归一法计算得式Ⅱ所示化合物纯度为94.63％。

本发明提供的从新疆药桑中提取骈四氢呋喃类木脂素非对映异构体的方法，首次从新疆药桑中分离提取出了目标化合物,方法简单实用,产品纯度高收率好,对于药桑的深度开发利用有着积极意义，也为木脂素类化合物的应用提供了一个稳定、绿色、高效的植物来源。

尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以做出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。