鸡肠源益生乳酸菌制剂的真空冷冻干燥工艺

摘要

本发明公开了鸡肠源益生乳酸菌制剂的真空冷冻干燥工艺；本发明，通过冷冻干燥前采取一定的保护措施，选用脱脂奶粉、海藻糖和低聚果糖作为合适的复合保护剂，以重量百分比计，复合保护剂配比为脱脂奶粉6‑18％，海藻糖6‑18％，低聚果糖1‑9％，余量为蒸馏水；将菌泥和保护剂按重量比1:4‑9进行配比，充分混匀，分装至冻干瓶中；通过在冰箱中预冻以及在真空冷冻干燥机中冻干处理后，从而能够在最大程度上减轻以及有效避免冷冻和干燥过程给细胞造成的损伤，能够有效提高菌体存活率；同时，在对菌种和保护剂进行混合时，将物料进行反复升降处理,使得物料在混料筒内具有良好的混合效果，菌泥与保护剂的接触更加充分均匀,有利于提高菌种的活性。

说明书

技术领域

本发明涉及生物制剂技术领域，尤其涉及鸡肠源益生乳酸菌制剂的真空冷冻干燥工艺。

背景技术

近年来，乳酸菌制剂的需求量在市场上逐年增大，对其活菌数质量和贮藏效果要求也越来越严格，乳酸菌制剂的保藏和制备又是其发挥诸多功效的重要保证和前提条件。在科技迅速发展的今天，真空冷冻干燥技术成为制备菌制剂和保藏微生物的有效方法，其原理是先把物料中的水分冻结成冰，之后再通过冰的升华作用去除水分。

微生物在冻干的过程中，微生物细胞和组成成分通常会受到一定的损伤，例如，蛋白质变性失活、膜通透性发生改变、DNA损伤、pH动态失衡以及生物膜脂肪酸成分发生改变；制备益生乳酸菌制剂的关键技术在于冻干保护剂的选择和使用，现有技术中的单一保护剂，在使用时，对乳酸菌冻干后的保护效果有限，无法最大限度提高菌种存活率；同时，传统的真空冷冻干燥工艺过程中，在将菌种与试剂进行混合时，混合效果不均匀，会影响菌种的活性，因此，设计鸡肠源益生乳酸菌制剂的真空冷冻干燥工艺是很有必要的。

发明内容

本发明解决的问题在于提供鸡肠源益生乳酸菌制剂的真空冷冻干燥工艺，通过冷冻干燥前采取一定的保护措施，选用脱脂奶粉、海藻糖和低聚果糖作为合适的复合保护剂，以重量百分比计，复合保护剂配比为脱脂奶粉6-18％，海藻糖6-18％，低聚果糖1-9％，余量为蒸馏水；将菌泥和保护剂按重量比1:4-9进行配比，充分混匀，分装至冻干瓶中；通过在冰箱中预冻以及在真空冷冻干燥机中冻干处理后，从而能够在最大程度上减轻以及有效避免冷冻和干燥过程给细胞造成的损伤，能够有效提高菌体存活率；同时，在对菌种和保护剂进行混合时，通过防尘箱内部的混料组件将需要混匀的物料进行混合,通过将物料进行反复升降处理,使得物料在混料筒的内部具有良好的混合效果，菌泥与保护剂的接触更加充分均匀,从而有利于提高菌种的活性。

为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：

鸡肠源益生乳酸菌制剂的真空冷冻干燥工艺，包括以下步骤：

步骤S1:将筛选出的戊糖片球菌菌株从-80℃冰箱中取出，用接种环将该菌株接种至MRS固体培养基上，于静置培养箱中培养，温度为16℃-42℃，过夜培养；用接种环从培养后的MRS固体培养基上挑取复苏的单菌落，接种至一支含有30mLMRS液体培养基的试管中，于振荡培养箱中培养，温度为16℃-42℃，转速160-200rpm，过夜培养，用于制备菌悬液；

步骤S2:将发酵液转至灭过菌的50mL离心管中，放入离心机中进行离心，倒去上清并对菌体进行称重，得到乳酸菌的菌泥，备用；将离心后制备的乳酸菌的菌泥，进行一系列梯度稀释，即10

步骤S3:选用脱脂奶粉、海藻糖和低聚果糖作为原料配制保护剂，以重量百分比计，保护剂中各组分的配比为脱脂奶粉6-18％，海藻糖6-18％，低聚果糖1-9％，余量为蒸馏水，配好后灭菌，备用；

步骤S4：将步骤S2得到的菌泥和步骤S3得到的保护剂按重量比1:4-9进行配比，将二者通过混匀设备进行充分混匀，分装至冻干瓶中；

步骤S5:将制备好的菌泥与保护剂的混合液放至4℃冰箱中进行预冻1-3h，再放入-20℃冰箱中进行预冻2-24h，将预冻的样品放至真空冷冻干燥机中进行冻干，冻干时间为14-24h，压力为200pa以下，温度为-50℃～-60℃，冻干之后取出放至4℃冰箱中进行保藏。

作为本发明进一步的方案：所述步骤S1中，述步骤S3中保护剂的配比为脱脂奶粉18％，海藻糖12％，低聚果糖5％，余量为蒸馏水。。

作为本发明进一步的方案：所述步骤S4中，将步骤S2得到的菌泥和步骤S3得到的保护剂按重量比1:6进行配比。

作为本发明进一步的方案：所述步骤S2中，选用固定角转头离心机，且离心机的工作条件为5000-8000rpm、5-20min。

作为本发明进一步的方案：所述步骤S4中，混匀设备包括混匀平台、防尘箱、观察箱门、主备电源、混料组件、储放箱和物料盒，所述混匀平台的顶部端面一侧固定安装有防尘箱，所述防尘箱的顶部端面中央固定安装有主备电源，所述防尘箱的内侧设置有混料组件，所述防尘箱的端面一侧通过合页固定安装有观察箱门，所述混匀平台的顶部端面另一侧固定安装有储放箱，且储放箱的顶部端面固定安装有物料盒。

作为本发明进一步的方案：所述混料组件包括安装基座、电动导轨、限位开关、导轨滑块、连接支架、紧固架、防护罐、混料筒和安装罐盖，两个所述安装基座分别固定安装在混匀平台的顶部端面位于防尘箱内部两侧，所述安装基座的顶部端面中央固定安装有电动导轨，且电动导轨的顶部端头与防尘箱的顶部内壁贴合连接，所述电动导轨的顶部和底部均固定安装有限位开关，两个所述电动导轨的外壁一侧均安装有导轨滑块，且两个导轨滑块之间安装有连接支架，所述连接支架的端面一侧固定安装有紧固架，且紧固架的顶部和底部均与导轨滑块固定连接，所述连接支架的端面中央固定安装有防护罐，且防护罐的内部插接安装有混料筒，所述防护罐的顶部端面螺接安装有安装罐盖，所述安装罐盖的端面中央固定安装有密封垫板，且密封垫板的内侧与混料筒的顶部端面贴合连接。

作为本发明进一步的方案：所述防尘箱的内侧顶部端面中央通过螺钉固定安装有防撞橡胶，且防撞橡胶位于安装罐盖的顶部正上方。

作为本发明进一步的方案：所述混匀平台的底部端面四周均通过螺钉固定安装有抓地支脚，且混匀平台的两侧端面中央均通过螺钉固定安装有搬运握柄。

本发明的有益效果是：本发明，通过冷冻干燥前采取一定的保护措施，选用脱脂奶粉、海藻糖和低聚果糖作为合适的复合保护剂，以重量百分比计，复合保护剂配比为脱脂奶粉6-18％，海藻糖6-18％，低聚果糖1-9％，余量为蒸馏水；将菌泥和保护剂按重量比1:4-9进行配比，充分混匀，分装至冻干瓶中；通过在冰箱中预冻以及在真空冷冻干燥机中冻干处理后，从而能够在最大程度上减轻以及有效避免冷冻和干燥过程给细胞造成的损伤，能够有效提高菌体存活率；同时，在对菌种和保护剂进行混合时，通过防尘箱内部的混料组件将需要混匀的物料进行混合,通过将物料进行反复升降处理,使得物料在混料筒的内部具有良好的混合效果，菌泥与保护剂的接触更加充分均匀,从而有利于提高菌种的活性。

附图说明

图1为本发明中的脱脂奶粉浓度对冻干存活率的影响的折线图；

图2为本发明中的海藻糖浓度对冻干存活率的影响的折线图；

图3为本发明中的低聚果糖浓度对冻干存活率的影响的折线图；

图4为本发明的混匀设备的整体立体结构图；

图5为本发明的混匀设备的整体主视图；

图6为本发明的混匀设备的整体剖视图；

图例说明：1、混匀平台；2、防尘箱；3、观察箱门；4、主备电源；5、混料组件；6、储放箱；7、物料盒；51、安装基座；52、电动导轨；53、限位开关；54、导轨滑块；55、连接支架；56、紧固架；57、防护罐；58、混料筒；59、安装罐盖；510、防撞橡胶。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

下面给出具体实施例。

实施例1：

参见图1-3，鸡肠源益生乳酸菌制剂的真空冷冻干燥工艺，包括以下步骤：

步骤S1:将筛选出的戊糖片球菌菌株从-80℃冰箱中取出，用接种环将该菌株接种至MRS固体培养基上，于静置培养箱中培养，温度为37℃，过夜培养；用接种环从培养后的MRS固体培养基上挑取复苏的单菌落，接种至一支含有30mLMRS液体培养基的试管中，于振荡培养箱中培养，温度为37℃，转速180rpm，过夜培养，用于制备菌悬液；

步骤S2:将发酵液转至灭过菌的50mL离心管中，放入离心机中进行离心，倒去上清并对菌体进行称重，得到乳酸菌的菌泥，备用；将离心后制备的乳酸菌的菌泥，进行一系列梯度稀释，即10

其中，选用固定角转头离心机，且离心机的工作条件为6000rpm、20mi n；

步骤S3:选用脱脂奶粉、海藻糖和低聚果糖作为原料配制保护剂，以重量百分比计，保护剂中各组分的配比为脱脂奶粉18％，海藻糖12％，低聚果糖5％，余量为蒸馏水，配好后灭菌，备用；

步骤S4：将步骤S2得到的菌泥和步骤S3得到的保护剂按重量比1:4-9进行配比，将二者通过混匀设备进行充分混匀，分装至冻干瓶中；选用脱脂奶粉、海藻糖和低聚果糖作为保护剂的组成原料；

其中，参见图4-6，混匀设备包括混匀平台1、防尘箱2、观察箱门3、主备电源4、混料组件5、储放箱6和物料盒7，混匀平台1的顶部端面一侧固定安装有防尘箱2，防尘箱2的顶部端面中央固定安装有主备电源4，防尘箱2的内侧设置有混料组件5，防尘箱2的端面一侧通过合页固定安装有观察箱门3，混匀平台1的顶部端面另一侧固定安装有储放箱6，且储放箱6的顶部端面固定安装有物料盒7。

混料组件5包括安装基座51、电动导轨52、限位开关53、导轨滑块54、连接支架55、紧固架56、防护罐57、混料筒58和安装罐盖59，两个安装基座51分别固定安装在混匀平台1的顶部端面位于防尘箱2内部两侧，安装基座51的顶部端面中央固定安装有电动导轨52，且电动导轨52的顶部端头与防尘箱2的顶部内壁贴合连接，电动导轨52的顶部和底部均固定安装有限位开关53，两个电动导轨52的外壁一侧均安装有导轨滑块54，且两个导轨滑块54之间安装有连接支架55，连接支架55的端面一侧固定安装有紧固架56，且紧固架56的顶部和底部均与导轨滑块54固定连接，连接支架55的端面中央固定安装有防护罐57，且防护罐57的内部插接安装有混料筒58，防护罐57的顶部端面螺接安装有安装罐盖59，安装罐盖59的端面中央固定安装有密封垫板，且密封垫板的内侧与混料筒58的顶部端面贴合连接；

防尘箱2的内侧顶部端面中央通过螺钉固定安装有防撞橡胶510，且防撞橡胶510位于安装罐盖59的顶部正上方；避免安装罐盖59在上升时与防尘箱2的顶部内壁发生碰撞，提高防护效果；

混匀平台1的底部端面四周均通过螺钉固定安装有抓地支脚，且混匀平台1的两侧端面中央均通过螺钉固定安装有搬运握柄；搬运握柄便于将混匀平台1搬运移动，通过抓地支脚便于将混匀平台进行支撑，提高整体结构的稳定性；

在使用时，通过混匀平台1两侧的搬运握柄能够将该装置搬运到合适的使用位置，并通过混匀平台1底部的抓地支脚对混匀平台1进行支撑，通过防尘箱2内部的混料组件5将需要混匀的物料进行混匀，并通过储放箱6和物料盒7进行储放；将观察箱门3打开后，将安装罐盖59从防护罐57的顶部取下后，混料筒58从防护罐57内部取出，将需要混匀的物料放置在混料筒58的内部后，再将混料筒58复位，将安装罐盖59盖合固定在防护罐57的顶部，使得密封垫板与混料筒58的顶部贴合，从而将物料封堵在混料筒58的内部，将观察箱门3闭合，主备电源4为安装基座51顶部的电动导轨52和限位开关53供电，使得导轨滑块54能够在两个限位开关53之间往复快速移动，由于连接支架55通过紧固架56与导轨滑块54连接，当导轨滑块54升降移动时，能够通过连接支架55带动防护罐57以及混料筒58进行升降，随着防护罐57反复进行升降，使得混料筒58内部的物料能够进行混匀，混匀一段时间后，可将混料筒58取出，分装至分装瓶内部，通过物料盒7将分装瓶进行放置，也可通过储放箱6将分装瓶进行储放；防撞橡胶510能够避免安装罐盖59在上升时与防尘箱2的顶部内壁发生碰撞，提高防护效果；

步骤S5:将制备好的菌泥与保护剂的混合液放至4℃冰箱中进行预冻1h，再放入-20℃冰箱中进行预冻2h，将预冻的样品放至真空冷冻干燥机中进行冻干，冻干时间为14h，压力为80pa，温度为-55℃，冻干之后取出放至4℃冰箱中进行保藏；

冻干保护剂单因素实验：

将空白对照组和添加有脱脂奶粉保护剂的实验组的冻干样品一同取出，进行复水活化，再经过活菌计数法，对10

表1：脱脂奶粉作为保护剂的冻干存活率

将空白对照组和添加有海藻糖保护剂的实验组的冻干样品一同取出，进行复水活化，再经过活菌计数法，对10

表2：海藻糖作为保护剂的冻干存活率

将空白对照组和添加有低聚果糖保护剂的实验组的冻干样品一同取出，进行复水活化，再经过活菌计数法，对10

表3：低聚果糖作为保护剂的冻干存活率

根据单因素实验结果可知：脱脂奶粉作为保护剂存活率最高的浓度为15％，存活率达到66.87％；海藻糖作为冻干保护剂时，保护效果最好的浓度为9％，存活率达到51.29％；低聚果糖作为保护剂存活率最高的浓度为5％，存活率达到57.07％；

正交实验：

选择在冻干过程中保护效果较好的三种保护剂脱脂奶粉、海藻糖、低聚果糖这三个因素来设计正交实验；按照浓度配比添加保护剂，与菌泥混合均匀，分别测算冻干前和冻干后活菌数；根据正交实验结果可知，最佳复合保护剂配比为脱脂奶粉：浓度为18％、海藻糖：浓度为12％、低聚果糖：浓度为5％，存活率达到最高，为93.6％。

实施例2：

参见图1-3，鸡肠源益生乳酸菌制剂的真空冷冻干燥工艺，包括以下步骤：

步骤S1:将筛选出的戊糖片球菌菌株从-80℃冰箱中取出，用接种环将该菌株接种至MRS固体培养基上，于静置培养箱中培养，温度为37.5℃，过夜培养；用接种环从培养后的MRS固体培养基上挑取复苏的单菌落，接种至一支含有30mLMRS液体培养基的试管中，于振荡培养箱中培养，温度为37.5℃，转速180rpm，过夜培养，用于制备菌悬液；

步骤S2:将发酵液转至灭过菌的50mL离心管中，放入离心机中进行离心，倒去上清并对菌体进行称重，得到乳酸菌的菌泥，备用；将离心后制备的乳酸菌的菌泥，进行一系列梯度稀释，即10

其中，选用固定角转头离心机，且离心机的工作条件为7000rpm、15min；

步骤S3:选用脱脂奶粉、海藻糖和低聚果糖作为原料配制保护剂，以重量百分比计，保护剂中各组分的配比为脱脂奶粉15％，海藻糖10％，低聚果糖4％，余量为蒸馏水，配好后灭菌，备用；

步骤S4：将步骤S2得到的菌泥和步骤S3得到的保护剂按重量比1:4-9进行配比，将二者通过混匀设备进行充分混匀，分装至冻干瓶中；

步骤S5:将制备好的菌泥与保护剂的混合液放至4℃冰箱中进行预冻1.5h，再放入-20℃冰箱中进行预冻5h，将预冻的样品放至真空冷冻干燥机中进行冻干，冻干时间为18h，压力为200pa以下，温度为-60℃，冻干之后取出放至4℃冰箱中进行保藏。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。