一种生产鸡马立克氏病毒株的方法及其应用

摘要

本发明涉及兽用生物制品领域，尤其涉及一种生产鸡马立克氏病毒株的方法及其应用。所述方法包括：将鸡胚成纤维细胞在36.5～39℃的条件下培养22～24小时；后接种工作毒株，继续在36.5～39℃的条件下培养至70％的细胞发生病变；所述鸡胚成纤维细胞的细胞生长采用F10‑199营养液，且密度为120～180万/ml。本发明通过特定的方法生产鸡马立克氏病病毒CVI988‑Rispens株批间差异小、收获病毒蚀斑数高，与国外同类疫苗相比具有相同的预防效果，实现培养面积大，节省空间，在有限的空间内实现提高产能的目的，同时保证纯净性、安全性、免疫原性良好，降低人为污染、质量不可控等风险。

说明书

技术领域

本发明涉及兽用生物制品领域，尤其涉及一种生产鸡马立克氏病毒株的方法及其应用。

背景技术

鸡马立克病是由疱疹病毒科的马立克氏病病毒(Marek’s disease virus，MDV)引起的鸡的一种高度传染肿瘤性疾病，以淋巴组织增生和肿瘤形成为特征，在外周神经、性腺、虹膜各种脏器、肌肉和皮肤发生单核细胞浸润。会感染损害鸡的免疫器官，造成免疫抑制，导致机体对疫苗的免疫应答和抵抗力下降，引起其他多种疾病的并发和继发感染，造成巨大的经济损失。

预防此病的有效方法是疫苗免疫，HVT冻干苗不能有效控制此病，而I型液氮苗的效果较HVT好，应用范围广。CVI988-Rispens制苗毒株为荷兰引进毒株，传统的生产工艺通常采用转瓶贴壁培养的方式，具有结构简单、投资少、技术成熟等优点，但同时也存在着污染风险高、可控性差、劳动强度大、占用空间大、能耗高、水耗量大等缺点。而用细胞工厂制备生产马立克氏病I型液氮苗的方法，具有易于规模化生产、能较好地维持病毒抗原稳定性、产能高、批间差异小等优点，生产的疫苗能够有效地控制预防马立克氏病。

发明内容

为了解决现有技术存在的问题，本发明的目的是提供一种生产鸡马立克氏病疫苗株的方法及其应用。

第一方面，本发明一种生产鸡马立克氏病毒株的方法，包括：将鸡胚成纤维细胞在36.5～39℃的条件下培养22～24小时；后接种工作毒株，继续在36.5～39℃的条件下培养至70％的细胞发生病变；

所述鸡胚成纤维细胞的细胞生长采用F10-199营养液，且密度为120～180万/ml。

进一步地，所述F10-199溶液包括：

HAM’S/F-10和199培养基。

进一步地，所述方法包括：

将鸡胚制成细胞悬液形式的鸡胚成纤维细胞；

将所述鸡胚成纤维细胞在36.5～39℃的条件下培养22～24小时；后接种工作毒株，继续在36.5～39℃的条件下培养至70％的细胞发生病变；

收集所有细胞，于2～8℃，2000～3000r/min离心10～20分钟，收集沉淀。

进一步地，所述工作毒株为血清I型的马立克氏病病毒CVI988-Rispens株。

进一步地，所述培养为在细胞工厂中进行培养，所述工作毒株的接种量为 1500～2000PFU/cm

第二方面，本发明提供一种马立克氏病疫苗，所述马立克氏病疫苗包括由所述方法制备得到的马立克氏病毒株。

进一步地，所述马立克氏病疫苗包括：权利要求1-5任一项所述方法制备得到的马立克氏病毒株、199营养液、新生牛血清和冷冻保护剂；

其中，199营养液、新生牛血清和冷冻保护剂的体积比为(70～90):(5～20):(5～20)。

进一步地，所述马立克氏病疫苗中所含病毒蚀斑数不低于3200PFU/羽份；和/或，所述冷冻保护剂为甘油、OriGen CD-50(55％二甲基亚砜，5％右旋糖酐40混合液)或二甲基亚砜中的一种或多种；和/或，所述199营养液包括：HAM’S/F-10和199培养基。

右旋糖酐是细胞外冷冻保护剂，DMSO具有高渗透性，是细胞内保护剂，二者共同来保护细胞的活性，防止细胞在解冻的时候重新形成冰晶，而影响细胞的活性，可以更好地保护疫苗的免疫原性。

本发明进一步提供所述方法在提高马立克氏病毒株生产效率中的应用；所述马立克氏病毒株优选为马立克氏病病毒CVI988-Rispens株。

本发明进一步提供所述方法在提高马立克氏病毒株免疫原性中的应用；所述马立克氏病毒株优选为马立克氏病病毒CVI988-Rispens株。

作为一种优选的实施方式，本发明提供一种马立克氏病疫苗的制备方法，包括：

(1)鸡胚成纤维细胞悬液的制备：

选择10-15日龄鸡胚，经过消毒和清晰后，加入0.25～0.35％胰酶溶液在38.5～39.0℃水浴锅中消化20～30min后终止消化并弃去上清液，保留沉淀部分；向沉淀部分加入5％～10％血清的乳汉液分散细胞并稀释至每胚40～60mL，过滤后得到鸡胚成纤维细胞悬液用于后续流程；

(2)接种

进行异步接毒或同步接毒；

异步接毒包括：

将鸡胚成纤维细胞悬液分装于细胞工厂中，每层150～250mL，密度为140～160万/ml，经36.5～39.0℃培养22～24小时，即可形成致密的细胞单层，将工作种毒接种于生长发育良好的鸡胚成纤维细胞单层，置36.5～39.0℃温室中静置培养48～72小时，待病变达70％以上时，收获病变细胞；

同步接毒包括：

将工作种毒与制成的细胞悬液混匀，分装于细胞工厂中，每层150～250mL，密度为140～160万/ml，待病变达70％以上时，收获病变细胞；

(3)收获：

弃去营养液，用EDTA-胰酶消化液15～25mL/层与细胞充分接触，收集病毒细胞，后停止消化，于2～8℃，2000～3000r/min离心10～20分钟，离心后弃去上清；

(4)配苗与分装：

收集沉淀细胞，加入冻存液后混匀；所述冻存液配方为配苗体积70～85％的199营养液、配苗体积10～20％的新生牛血清和配苗体积的5～10％的二甲基亚砜；

(5)降温：

待苗温降至-80℃～-120℃时将疫苗放入液氮中保存。

本发明具备如下有益效果：

本发明涉及一种利用细胞工厂生产鸡马立克氏病病毒CVI988-Rispens株的方法。与传统转瓶工艺相比，利用该工艺生产的疫苗批间差异小、收获病毒蚀斑数高，与国外同类疫苗相比具有相同的预防效果，实现培养面积大，节省空间，在有限的空间内实现提高产能的目的，同时保证纯净性、安全性、免疫原性良好，降低人为污染、质量不可控等风险。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1

本实施例提供一种制备马立克氏病疫苗的方法，其中马立克氏病病毒CVI988-Rispens株采用异步法进行制备，具体如下：

(1)鸡胚成纤维细胞单层的制备：

选择血管清晰、发育良好的10日龄鸡胚，用75％的酒精和4％的碘酒消毒气室部位，无菌取出鸡胚，去除头和内脏后用汉克氏液洗涤2～3次，将胚体剪成1～3mm

(2)接种：

弃去细胞生长液，将199维持液与工作种毒混合，接种量为2000PFU/cm

(3)收获：

弃去营养液，用EDTA-胰酶消化液20mL/层与细胞充分接触，待病毒细胞脱落后，收集至无菌离心管中，加入199营养液200mL停止消化，无菌检验后，分至离心瓶中；于2～8℃，2000r/min离心10分钟，离心后弃去上清，收集沉淀细胞。

(4)配苗与分装：

收集沉淀细胞，加入配苗体积80％的199营养液、配苗体积10％的新生牛血清、配苗体积10％的冷冻保护剂二甲基亚砜，摇匀，取样做收获前无菌检验，进行活细胞计数，定量分装到无菌安瓶中封口，每瓶所含病毒蚀斑数不低于3200PFU/羽份。

(5)程序降温：

利用程序降温仪进行程序降温，待苗温降至-80℃～-120℃时将疫苗放入液氮中保存。

实施例2

本实施例提供一种制备马立克氏病疫苗的方法，其中马立克氏病病毒CVI988-Rispens株采用同步法进行制备，具体如下：

(1)鸡胚成纤维细胞悬液的制备：

选择血管清晰、发育良好的10日龄鸡胚，用75％的酒精和4％的碘酒消毒气室部位，无菌取出鸡胚，去除头和内脏后用汉克氏液洗涤2～3次，将胚体剪成1～3mm

(2)接种：

将工作种毒与制成的细胞悬液混匀，接种量为2000PFU/cm

(3)收获：

弃去营养液，用EDTA-胰酶消化液20mL/层与细胞充分接触，待病毒细胞脱落后，收集至无菌离心管中，加入199营养液200mL停止消化，无菌检验后，分至离心瓶中；于2～8℃，2000r/min离心10分钟，离心后弃去上清，收集沉淀细胞。

(4)配苗与分装：

收集沉淀细胞，加入配苗体积80％的199营养液、配苗体积10％的新生牛血清、配苗体积10％的冷冻保护剂二甲基亚砜，摇匀，取样做收获前无菌检验，进行活细胞计数，所含病毒蚀斑数不低于3200PFU/羽份，定量分装到无菌安瓶中封口。

(5)程序降温：

利用程序降温仪进行程序降温，待苗温降至-80℃～-120℃时将疫苗放入液氮中保存。

试验例1

上述实施例1中马立克氏病病毒CVI988-Rispens株的产量为600万羽份。

上述实施例2中马立克氏病病毒CVI988-Rispens株的产量为600万羽份。

本试验例针对实施例2生产的鸡马立克氏病I型液氮苗(CVI988-Rispens株)的纯净性、安全性以及免疫效果，对该疫苗进行了纯净性检验、安全性检验(与3种马立克细胞毒、1种国内疫苗对比)以及与效力评价(1种国外马立克疫苗对比)。

(1)纯净性检验

按现行《中国兽药典》进行无菌、支原体、外源病毒检验。结果见表1、2、3。

表1鸡马立克氏病I型液氮苗(CVI988-Rispens株)无菌检验结果

注：“－”表示无菌生长。

表2鸡马立克氏病I型液氮苗(CVI988-Rispens株)支原体检验结果

注：“－”表示阴性；“+”表示阳性。

表3鸡马立克氏病I型液氮苗(CVI988-Rispens株)外源病毒检验结果

注：“－”表示鸡贫血病毒检验ELISA结果小于或等于0.35，判为阴性、禽白血病病毒检验ELISA结果小于 0.3，判为阴性、或禽网状内皮组织增生症病毒检验结果未出现特异性绿色荧光。

通过上述检验结合表1、2、3可以看出：3批鸡马立克氏病I型液氮苗 (CVI988-Rispens株)的无菌检验、支原体检验、外源病毒检验均为阴性，证明该疫苗纯净。

(2)安全性检验：1日龄SPF雏鸡120只，分成6组，每组20只，1-5组分别颈部皮下接种Z4(1000PFU/只)、SB1(1000PFU/只)、CVI988-Rispens(30000PFU/ 只)、HVT(1000PFU/只)、RB1B(1000PFU/只)，另一组接种CEF悬液作对照。接种后9天每试验组取10只鸡，称重、剖检，称法氏囊重，检查脾脏肿大坏死病变和胸腺萎缩程度，并按0-3评分(0-正常，3-脾脏严重肿大坏死/胸腺严重萎缩)，余下的试验鸡继续饲养至90日龄，全部实验鸡剖检，检查MD病变，试验期内死亡鸡一律剖检，检查MD病变。

表4鸡马立克氏病I型液氮苗(CVI988-Rispens株)的安全性试验

注：相对体重※＝对照组试验鸡(10日龄)的体重87.9-110.7g(平均95g)，试验组数值为对照组的相对百分数。

从表4可以看出：用10倍使用剂量的CVI988/Rispens疫苗免疫1日龄SPF鸡，未引起试验鸡体重减轻，对法氏囊、脾脏、胸腺等免疫器官未造成损害。继续观察到 90日龄，未发现有任何MD临床症状和剖检病理变化。结果表明CVI988/Rispens疫苗是非常安全的。

(3)效力评价：用实施例2的鸡马立克氏病1型(CVI988/Rispens)活疫苗及其他2种MD疫苗(2+3型双价疫苗和HVT冻干疫苗)对2种来源的SPF鸡进行了免疫效力试验，两种SPF鸡种蛋分别来自乾元浩南京生物药厂SPF鸡场和北京实验动物中心SPF鸡场。

从1日龄免疫到7日龄攻毒期间死亡的鸡以及攻毒后1周内死亡的鸡为非特异死亡，从每个处理组试验鸡总数中扣除，攻毒1周以后死亡的鸡，逐个剖检，记录大体肿瘤变化及法氏囊、胸腺和脾脏等免疫器官的的变化，可疑时采集病料做组织学检查， 70日龄时将存活的鸡全部扑杀，剖检，记录大体肿瘤变化及法氏囊、胸腺和脾脏等免疫器官变化，可疑时采集病料做组织学检查。

从下表5和表6中结果可以看出：本效力评价试验中设了2+3型双价疫苗和HVT 冻干疫苗作对照，从试验数据中可以看出CVI988/Rispens疫苗的保护力是三者中最高的。

表5疫苗效力评价试验

表6疫苗效力评价

注：①试验1

②MD+鸡＝大体MD肿瘤鸡+大体MD肿瘤可疑而组织学证实为MD的鸡+超强毒攻击1周后至3周内死亡虽无明显肿瘤但胸腺、法氏囊和脾脏高度萎缩的鸡

③MD

④保护指数(PI)的计算及统计分析

PI＝(攻毒对照组MD阳性率-免疫组MD阳性率)/攻毒对照组MD阳性率×100

PI的差异显著性检验用卡方分析，右标不同字母代表差异显著。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。