rs12252的多态性在检测新冠病毒抗体中的应用

摘要

本发明公开了rs12252的多态性在检测新冠病毒抗体中的应用。本发明发现，人接种新冠病毒疫苗90天后，rs12252位点的CC基因型人群中和抗体4倍增长人数显著高于CT基因型和TT基因型。说明新冠病毒疫苗在CC基因型人群中针对新冠病毒的特异性抗体水平更高。本发明可用于检测人接种新冠病毒疫苗后产生针对新冠病毒的特异性抗体的效价水平，筛查接种新冠病毒疫苗后低抗体水平的人，以及检测人接种新冠病毒疫苗后对新冠病毒抵抗力。

说明书

技术领域

本发明涉及生物医学领域中，rs12252的多态性在检测新冠病毒抗体中的应用。

背景技术

单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)指基因组单个核苷酸的变异，它是最微小的变异单元，是由单个核苷酸对置换、颠换、插入或缺失所形成的变异形式。单核苷酸多态性是基因组上高密度的遗传标志，在人类基因组中已发现的SNP数量超过3000万。作为第三代遗传标记SNP数量众多、分布密集，易于检测，因而是理想的基因分型目标。

rs12252是人染色体11p5.5上的一个二等位多态性的SNP位点，该变异是转换(T/C，在其互补链上则为A/G)，该位点位于干扰素诱导跨膜蛋白3(IFITM3)基因中。

COVID19大流行给人类带来了巨大的生命和财产损失，疫苗接种是抵抗新冠病毒感染人类的最有利武器。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何检测人接种新冠病毒疫苗后产生针对新冠病毒的特异性抗体的效价水平，或筛查接种新冠病毒疫苗后低抗体水平的人，或检测人接种新冠病毒疫苗后对新冠病毒抵抗力。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了下述1-3中任一应用：

1.检测人基因组中rs12252的多态性或基因型的物质在制备评价或辅助评价人接种新冠病毒疫苗后产生针对新冠病毒的特异性抗体的效价水平的产品中的应用；

2.检测人基因组中rs12252的多态性或基因型的物质在制备筛查或辅助筛查接种新冠病毒疫苗后低抗体水平的人的产品中的应用；所述抗体为针对新冠病毒的特异性抗体；

3.检测人基因组中rs12252的多态性或基因型的物质在制备检测或辅助检测人接种新冠病毒疫苗后对新冠病毒抵抗力的产品中的应用。

rs12252是人染色体11p5.5上的一个二等位多态性的SNP位点，该变异是转换(T/C，在其互补链上则为A/G)。

上述应用中，所述人可为年龄为25-59岁的人。所述人可为接种新冠病毒疫苗的人。所述人具体可为接种新冠病毒疫苗14-90天的人。

上述应用中，所述新冠病毒疫苗可为预防新冠病毒引起的肺炎的疫苗。

上述应用中，所述新冠病毒疫苗是的新型冠状病毒灭活疫苗(Vero细胞)。所述新冠病毒疫苗具体可为北京科兴中维生物技术有限公司生产的新型冠状病毒灭活疫苗(Vero细胞)。

上述应用中，所述rs12252基因型是CC、CT或TT。其中，CC是rs12252位点为C的纯合型，TT是rs12252位点为T的纯合型，CT是rs12252位点为T和C的杂合型。

上述应用中，所述人利用所述新冠病毒疫苗全程免疫后90天，CC基因型人群中和抗体4倍增长人数显著高于CT基因型和TT基因型。说明新冠病毒疫苗在CC基因型人群中针对新冠病毒的特异性抗体水平更高。

上述应用中，所述检测人基因组中rs12252的多态性或基因型具体可通过检测rs12252的核苷酸种类确定。

上述应用中，检测人基因组中rs12252的多态性或基因型的物质可为通过下述至少一种方法确定rs12252的多态性或基因型所需的试剂和/或仪器：DNA测序、限制性酶切片段长度多态性、单链构象多态性、变性高效液相色谱、SNP芯片、TaqMan探针技术和SequenomMassArray技术。其中，利用Sequenom MassArray技术确定rs12252的多态性或基因型所需的试剂和/或仪器包括PCR引物对、基于单碱基延伸反应的延伸引物、磷酸酶(如虾碱性磷酸酶(shrimp alkaline phosphatase，SAP))、树脂、芯片、MALDI-TOF(matrix-assistedlaser desorption/ionization–time of fligh，基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱)以及Sequenom MassArray技术所需要的其他试剂和仪器；利用限制性酶切片段长度多态性确定rs 12252的多态性或基因型所需的试剂和/或仪器包括PCR引物对和限制性内切酶；SNP芯片包括基于核酸杂交反应的芯片、基于单碱基延伸反应的芯片、基于等位基因特异性引物延伸反应的芯片、基于“一步法”反应的芯片、基于引物连接反应的芯片、基于限制性内切酶反应的芯片、基于蛋白DNA结合反应的芯片，及基于荧光分子DNA结合反应的芯片。

上述应用中，所述检测人基因组中rs12252的多态性或基因型的物质可包括扩增包括rs12252在内的基因组DNA片段的PCR引物对/或限制性内切酶MscI。所述检测人基因组中rs12252的多态性或基因型的物质也可仅为扩增包括rs12252在内的基因组DNA片段的PCR引物对和/或限制性内切酶MscI。

本发明的一个实施例中，采用限制性酶切片段长度多态性确定rs12252的多态性和基因型。所述PCR引物对在序列上没有特殊要求，只要能扩增出包括rs12252在内的基因组DNA片段即可，具体可为序列表中SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的单链DNA。所述限制性内切酶具体可为MscI。

上述应用中，所述评价人接种新冠病毒疫苗后产生针对新冠病毒的特异性抗体的效价水平的产品、筛查接种新冠病毒疫苗后低抗体水平的人的产品和检测人接种新冠病毒疫苗后对新冠病毒抵抗力的产品可为试剂、试剂盒或系统。上述应用中，所述系统可包括试剂、试剂盒和/或仪器。

上述应用中，所述评价人接种新冠病毒疫苗后产生针对新冠病毒的特异性抗体的效价水平的产品、筛查接种新冠病毒疫苗后低抗体水平的人的产品和检测人接种新冠病毒疫苗后对新冠病毒抵抗力的产品均可包括所述检测人基因组中rs12252的多态性或基因型的物质，还可进一步包括定量检测针对新冠病毒的抗体水平的系统。所述定量检测针对新冠病毒的抗体水平的系统可为通过酶联免疫反应检测针对新冠病毒的抗体水平所需的试剂和/或仪器。

本文中，所述针对新冠病毒的抗体水平可为血浆中的针对新冠病毒的抗体水平。

本发明可用于检测人接种新冠病毒疫苗后产生针对新冠病毒的特异性抗体的效价水平，筛查接种新冠病毒疫苗后低抗体水平的人，以及检测人接种新冠病毒疫苗后对新冠病毒抵抗力。

附图说明

图1.接种新冠疫苗不同时间点中和抗体滴度变化情况。B图每种基因型从左至右依次为接种疫苗前，接种第一剂后21天，接种第二剂后14天，接种第二剂后90天。

图2.比较接种新冠疫苗后中和抗体增长倍数。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。下述实施例中，如无特殊说明，序列表中各核苷酸序列的第1位均为相应DNA/RNA的5′末端核苷酸，末位均为相应DNA/RNA的3′末端核苷酸。

实施例1、

rs12252是人染色体11p5.5上的一个二等位多态性的SNP位点，该变异是转换(T/C，在其互补链上则为A/G)，该位点位于IFITM3基因中，记为IFITM3 rs12252。rs12252基因型是CC、CT或TT。其中，CC是rs12252位点为C的纯合型，TT是rs12252位点为T的纯合型，CT是rs12252位点为T和C的杂合型。

一、受试者及样品

129例接种北京科兴中维生物技术有限公司的新型冠状病毒灭活疫苗(Vero细胞)的健康志愿者(未感染新型冠状病毒)，年龄25-59岁之间。

提取每个人的基因组DNA。

二、rs 12252位点的基因分型

(1)扩增含SNP位点的核苷酸片段

根据rs12252的侧翼序列设计引物，正向引物F：5’-GAAAAGGAAACTGTTGAGAACCGAA-3’(SEQ ID NO.1)，反向引物R：5’-GAGCCTCCTCCTAAACCTGCAC-3’(SEQ ID NO.2)，扩增出待测SNP所在的核苷酸片段，PCR产物为序列表中SEQ ID NO.3。rs12252位点位于SEQ ID NO.3的140bp处，该处核苷酸为C或T，当该处核苷酸为T时，可被MscI内切酶(识别序列为TGG^CCA)识别。

其中，PCR反应体系以50μl计为：150-200ng/μl人基因组DNA 1μl，10μM引物F和R各2μl，Premix Taq HS 25μl，余量为ddH

PCR反应条件为：95℃10分钟；95℃60秒，55℃30秒，72℃30秒，35个循环；72℃5分钟。

(2)针对第142位核苷酸的不同选择适当的内切酶进行PCR-RFLP

该PCR产物用MscI内切酶酶切，反应体系以20μl计为：PCR扩增产物10μl，快速消化MscI酶(Fast Digest MScI，Fermentas公司)1μl，10×FastDigest Green缓冲液2μl，无核酸酶的ddH

然后，将得到的酶切产物在2％琼脂糖凝胶中进行电泳，溴化乙锭染色，凝胶成像系统中观察。

制胶：用蒸馏水将与胶接触的器皿洗干净，室温自然晾干，将含有Golden View的2％琼脂糖凝胶倒入模板中，插入13个孔的梳子，待胶自然聚合后，拔出梳子，则制得含有13个孔的2％的琼脂糖凝胶。

电泳：向15μl酶切产物中加入6×上样缓冲液3μl，上样检测，100V恒压，电泳2小时。

根据PCR-RFLP的结果确定该位点在检测群体中的基因型。当PCR产物的140bp处核苷酸均为C时，MscI内切酶不可识别该位点，即PCR产物不能被切开，凝胶中只有一条带，长度为562bp，该基因型记为CC型；当140bp处的核苷酸均为T时，即可将PCR扩增片段切成两个片段，一个为420bp，另一个片段为142bp，该基因型记为TT型；当140bp处既含有C又含有T时，即凝胶电泳中含有三条带，长度分别约为562bp、420bp和142bp，该基因型记为杂合型CT型。(图1)

结果表明，129例志愿者中，38人为CC基因型，59人为CT基因型，32人为TT基因型，不同IFITM3 rs12252基因多态性人群在年龄和性别间无显著性差异，表1。

表1年龄和性别在不同IFITM3 rs12252基因多态性人群中的比较

三、中和抗体的检测

分别在各志愿者接种疫苗前、接种第一针剂疫苗第21天、全程疫苗免疫第14天(即接种第二针剂疫苗第14天)、全程疫苗免疫第90天(即接种第二针剂疫苗第90天)采取外周血血浆进行中和抗体检测，采用中和抗体检测试剂盒(北京热景生物技术有限公司，批号：21010115)进行。实验原理：基于磁微粒化学发光免疫分析技术，采用竞争法检测血浆样本中新型冠状病毒中和抗体。

结果显示：25-59岁CC基因型人群接种新冠疫苗中和抗体维持时间较CT/TT基因型人群时间长。129例志愿者全程疫苗免疫后14天中和抗体滴度中位数达到最高32(16,128)，显著高于接种第一针剂疫苗后21天的4(4,4)和全程免疫后90天的8(8,16)，即接种新冠疫苗90天后中和抗体水平显著下降(图1，A)；不同IFITM3rs12252基因多态性人群接种疫苗不同时间点中和抗体滴度的动态变化情况与总体人群变化趋势一致。CC基因型人群全程疫苗免疫后14天中和抗体滴度中位数达到最高32(16,128)，显著高于接种第一针剂疫苗后21天的4(4,4)和全程免疫后90天的16(8,32)；CT基因型人群全程疫苗免疫后14天中和抗体滴度中位数达到最高32(16,64)，显著高于接种第一针剂疫苗后21天的4(4,4)和全程免疫后90天的8(8,16)；TT基因型人群全程疫苗免疫后14天中和抗体滴度中位数达到最高32(20,128)，显著高于接种第一针剂疫苗后21天的4(4,4)和全程免疫后90天的8(8,16)，图1，B；全程免疫疫苗后90天，CC基因型人群中和抗体滴度中位数为16(8,32)，高于CT基因型8(4,8)和TT基因型8(4,8)，但是未见显著性差异，p值分别为0.1239(图1，C)。

结果还显示：接种第一针剂疫苗后21天CC、CT和TT基因型人群中和抗体滴度增长倍数中位数均为1(1,1)，之间无显著差异(图2，A)；全程免疫后14天，CC、CT和TT基因型人群中和抗体增长倍数中位数分别为8(4,32)、8(4,16)和8(5,32)，之间无显著差异(图2，B)；全程免疫后90天，CC基因型人群中和抗体增长倍数为4(2,8)高于CT(2，p＝0.0553)和TT(2，p＝0.1125),但未见显著差异(图2，C)；接种第一针剂疫苗后21，CC基因型人群中和抗体4倍增长人数百分比为0％，显著低于CT基因型(7％，p＝0.0104),CC与TT以及CT与TT间无显著差异(图2，D)；全程免疫后14天，CC基因型人群中和抗体4倍增长人数百分比为89％，高于CT基因型(81％)和TT基因型(78％),并无显著差异(图2，E)；全程免疫后90天，CC基因型人群中和抗体4倍增长人数百分比为63％(24/38)，显著高于CT基因型(41％，p＝0.0003，24/59)和TT基因型(41％，p＝0.0003，13/32)，见图2，F。

中和抗体滴度增长倍数：免疫后不同时间点中和抗体滴度/免疫前中和抗体滴度。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

<110> 首都医科大学附属北京佑安医院

<120> rs12252的多态性在检测新冠病毒抗体中的应用

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223>

<400> 1

gaaaaggaaa ctgttgagaa ccgaa 25

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223>

<400> 2

gagcctcctc ctaaacctgc ac 22

<210> 3

<211> 562

<212> DNA

<213> 人（Homo sapiens）

<220>

<221> misc_feature

<222> (140)..(140)

<223> y为c或t

<400> 3

gaaaaggaaa ctgttgagaa ccgaaactac tggggaaagg gagggctcac tgagaaccat 60

cccagtaacc cgaccgccgc tggtcttcgc tggacaccat gaatcacact gtccaaacct 120

tcttctctcc tgtcaacagy ggccagcccc ccaactatga gatgctcaag gaggagcacg 180

aggtggctgt gctgggggcg ccccacaacc ctgctccccc gacgtccacc gtgatccaca 240

tccgcagcga gacctccgtg cccgaccatg tcgtctggtc cctgttcaac accctcttca 300

tgaacccctg ctgcctgggc ttcatagcat tcgcctactc cgtgaaggtg cgtatggccc 360

cagggaatgc tcagagggtg ccgctgagcc tggagctcca cctgcccaca tgctgcctgg 420

ggtggggact tgtgtgtccc tgtgactgtg agtttgtgtg cacctctgtc ccgtgtgtgc 480

ccacgtcagt ggctttgtct gtgtgatctg tgtgtgtgtg tggcttgggg aatctgccca 540

gtgcaggttt aggaggaggc tc 562