用于降低电化学生物传感器中氧张力的系统和方法

摘要

在一个实施方案中，用于检测体液样品中的分析物的系统包含电化学生物传感器，所述电化学生物传感器配置为接收体液样品，测试分析物，并且产生分析物的分析物水平。所述系统进一步包含介质，所述介质配置为通过帮助分析物和生物传感器之间的电子交换来提供对分析物的测试。所述系统进一步包含氧张力减少剂，所述氧张力减少剂减少氧对介质的操作的干扰。

说明书

发明背景

诊断测试设备在许多场景中都有使用，包括家庭使用、医生办公室使用以及在健康展览会上使用。诊断测试设备通常对体液中的各种分析物进行测试，并且产生等同于实验室测试的结果。尽管将设备设计为易于使用并可靠，但是这类设备的用户通常不遵循特定的实验室程序，没有广泛的精密度和准确度双重检查，并且没有控制程序。此外，对于电化学测试条，很多时候在样品中存在可能提供错误结果的干扰化合物。一种这样的化合物是氧。当然，血液在暴露于空气时会迅速吸收氧，因此许多血液样品会含有氧。

发明概述

在一个实施方案中，用于检测体液样品中的分析物的系统包含电化学生物传感器，所述电化学生物传感器配置为接收所述体液样品，测试所述分析物，并且产生所述分析物的分析物水平。所述系统进一步包含介质，所述介质配置为通过帮助所述分析物和所述生物传感器之间的电子交换来提供对所述分析物的测试。所述系统进一步包含氧张力减少剂，所述氧张力减少剂减少氧对所述介质的操作的干扰。在一个可选方案中，所述介质是亚铁氰化物。在另一可选方案中，所述氧张力减少剂是漆酶。或者，漆酶与氧反应生成水。在另一可选方案中，所述分析物是血红蛋白。或者，所述氧张力减少剂是铂电极。在一个可选方案中，所述系统进一步包含仪表，所述仪表接收电化学信号。或者，所述仪表配置为在氧还原电压激活铂电极，这使铂电极减少氧的干扰，然后在检测电压激活，用于分析物的检测。在另一可选方案中，所述介质是亚铁氰化物，所述氧张力减少剂是漆酶，漆酶与氧反应生成水，并且所述分析物是血红蛋白。或者，所述亚铁氰化物涂覆在所述电化学传感器的电极上。

在一个实施方案中，一种用于检测体液样品中的分析物的电化学生物传感器(所述电化学生物传感器配置为接收所述体液样品，测试所述分析物，并且产生所述分析物的分析物水平)包括介质，所述介质配置为通过帮助所述分析物和所述生物传感器之间的电子交换来提供对所述分析物的测试。所述生物传感器进一步包括氧张力减少剂，所述氧张力减少剂减少氧对所述介质的操作的干扰。所述生物传感器进一步包括两个电极，这两个电极可由仪表激活以测试分析物。或者，所述介质是亚铁氰化物，所述氧张力减少剂是漆酶，漆酶与氧反应生成水，并且所述分析物是血红蛋白。在一个可选方案中，所述氧张力减少剂是铂电极，并且所述铂电极是两个电极之一。在另一可选方案中，所述铂电极可在氧还原电压激活，这使铂电极减少氧的干扰，然后在检测电压激活，用于所述分析物的检测。或者，所述亚铁氰化物涂覆在所述电化学传感器的电极上。

在一个实施方案中，氧的干扰减少的测试分析物的方法包括提供系统。所述系统包括电化学生物传感器，所述电化学生物传感器配置为接收所述体液样品，测试所述分析物，并且产生所述分析物的分析物水平。所述系统进一步包括介质，所述介质配置为通过帮助所述分析物和所述生物传感器之间的电子交换来提供对分析物的测试。所述系统进一步包括氧张力减少剂，所述氧张力减少剂减少氧对所述介质的操作的干扰。所述系统进一步包括用于接收所述电化学生物传感器的仪表。所述方法进一步包括用包含所述分析物的样品对所述电化学生物传感器进行上样(dosing)。所述方法进一步包括用所述仪表和所述电化学生物传感器检测样品的电特性并用所述仪表计算所述分析物的分析物水平。在一个可选方案中，所述方法进一步包括用氧张力减少剂减少氧的干扰，并且氧减少剂是漆酶。或者，漆酶将氧转化为水以提供减少。在另一可选方案中，所述介质是亚铁氰化物，并且所述分析物是血红蛋白。在一可选方案中，所述方法进一步包括用氧张力减少剂减少氧的干扰，并且氧减少剂是电化学生物传感器的铂电极。或者，所述减少包括在氧还原电压激活所述铂电极，这使铂电极减少氧的干扰，然后在检测电压激活所述铂电极。

附图说明

图1示出血红蛋白传感器的一个实施方案的表现，使用含有或不含漆酶的静脉血和氧合的血液；

图2A示出血红蛋白测定的电流/电压曲线，所述测定在血液样品和缓冲溶液中使用亚铁氰化物涂覆的铂条进行；

图2B示出在金条上在-545mV或在铂条上用二电位方法(two potential method)对静脉血和氧合的血液的血红蛋白测定响应；

图2C示出铂条上血红蛋白测定的校准曲线，用一电位方法(仅施加单一电压)和二电位方法(施加两种电压，一种减少氧，另一种测试分析物)；

图3示出包括电极和亚铁氰化物的电极系统的一个实施方案的图；

图4示出本文所述系统的实施方案中漆酶相互作用的一种理论化反应方案；

图5示出电子从T1中心至T2/T3中心的多铜氧化酶转移的理论图。

发明详述

某些术语在本文中仅为了方便使用，不应视作对用于降低电化学生物传感器中的氧张力的系统和方法的实施方案的限制。在许多实施方案中，这些系统和方法包括使用多铜氧化酶。在许多实施方案中，所述系统和方法包括使用电化学生物传感器。一般来说，这些电化学生物传感器或测试条具有至少两个电极。它们具有样品与电极相互作用的孔。它们可以具有样品端口、毛细通道或许多其他特征，使样品能够到达可以与电极相互作用的孔。电极通常附着于导线，然后导线可以与仪表相互作用。仪表可以向电极提供电压或电流量。或者，其可以不提供。仪表可以测量样品的电特征，包括但不限于电流量、电压(电压差)、电阻和电容。由此，使用分析和方程，所关注的分析物的水平可以通过仪表测量并显示给用户。一般来说，电极(一个或两个)或孔中有试剂以帮助电特征的测量。或者，测试元件中的通道或其他区域可以具有试剂。在一些可选方案中，可以通过预混步骤添加试剂。在许多实施方案中，将试剂镀、附着或沉积于电极之一。在这样的配置中，试剂可以被样品中的氧氧化。这可能降低试剂的有效性或产生错误信号。因此，在许多实施方案中，多铜酶用来限制这种氧化。在许多实施方案中，铂电极用来限制这种氧化。在许多实施方案中，使用测试条，所述测试条使用亚铁氰化物作为介质测量血红蛋白。在一些实施方案中，通过测试条测试Hb A1c。在许多可选方案中，可以测试许多不同分析物，包括但不限于葡萄糖、脂质(HDL、LDL、甘油三酯)、肌酸酐等。

使用氧化酶或还原酶作为生物识别元件或者基于阴极过程的电化学生物传感器通常经受样品中的氧张力。在用于分析物检测的电位，直接在电极表面上的氧还原或者由生物传感器的传感酶催化的氧还原通常导致错误的分析物定量。因此，如何消除来自各种血液类型(动脉、毛细血管和静脉)或来自不同样品处理程序的氧的干扰是设计电化学护理点设备的一个挑战。有几种方法可能可以解决电化学生物传感器中的氧张力，如使用化学除氧剂(如亚硫酸钠、抗坏血酸)，仔细选择具有与酶氧化还原电位接近的氧化还原电位的介质，或者通过蛋白工程技术。例如，大多数化学除氧剂具有电化学活性。因此，如何控制化学清除剂的量以在不影响分析物分析的情况下实现去除氧的干扰是非常具有挑战性的。葡萄糖氧化酶-过氧化氢酶-葡萄糖氧去除系统可以去除使用硝酸盐还原酶的硝酸盐传感的氧的干扰。在这种情况下，通过葡萄糖氧化酶催化的葡萄糖氧化将氧还原为过氧化氢。然后通过过氧化氢酶将产生的过氧化氢转化为水和氧。这种技术可能是一种去除氧的干扰的有效方式，但是需要添加大量葡萄糖，且酶促反应中的葡萄糖酸生成导致pH持续下降，阻碍了其在护理点生物电化学设备设计中的更广泛应用。相反，在本文公开的系统和方法的许多实施方案中，评价了非常温和但有效的耗氧剂，包括多铜氧化酶如漆酶、胆红素氧化酶和/或不同电极材料如铂，因为它们能够将氧直接还原为水。因此，酶促氧去除系统不需要额外的底物，消除了对电化学传感表现的潜在副作用。

通过引入多铜氧化酶和/或通过适当选择电极材料，消除血液样品中的氧张力对电化学设备表现的影响。为了消除电化学POC(护理点)传感器表现中来自各种血型(动脉、毛细血管和静脉)或由各种样品处理程序引入的氧张力的影响，开发了本文的系统和方法。在许多实施方案中，使用静脉血或氧合的血液评价用亚铁氰化物条的血红蛋白测定，引入或不引入氧还原试剂如多铜氧化酶。通过在具有大空间间隙的容器中连续摇动约15min，将氧引入相同静脉血中，手动制备氧合的血液。结果显示，当不引入氧还原试剂时，在静脉血和氧合的血液之间观察到传感器表现的显著差异。当将氧还原试剂引入氧合的血液时，消除了这种差异。此外，适当选择电极材料如使用铂电极也有助于抑制氧张力。

使用氧化酶或还原酶作为生物识别元件或者基于阴极过程的电化学生物传感器通常经受样品中的氧张力。在用于分析物检测的电位，氧可以在电极表面上直接还原，或者被传感酶或生物传感器的介质催化，导致背景信号改变或错误的分析物定量。因此，如何消除来自各种血液类型(动脉、毛细血管和静脉)或来自不同样品处理程序的氧的干扰是设计电化学护理点设备的一个挑战。

到目前为止，已经提出并应用几种方法来减轻电化学生物传感器的氧张力，如使用化学除氧剂(如亚硫酸钠、抗坏血酸)，适当选择具有与酶氧化还原电位接近的氧化还原电位的介质，或者通过蛋白工程技术。以化学除氧剂为例，大多数化学除氧剂如亚硫酸钠或抗坏血酸具有电化学活性。因此，如果控制化学清除剂量以在不影响电化学生物传感器分析的情况下去除氧的干扰是非常棘手的。已经努力寻找有效方式来处理电化学设备中的氧张力，同时不影响传感器表现。可以探索葡萄糖氧化酶-过氧化氢酶-葡萄糖氧去除系统，以去除使用硝酸盐还原酶的硝酸盐传感的氧的干扰。在这种情况下，通过葡萄糖氧化酶催化的葡萄糖氧化将氧还原为过氧化氢。然后通过过氧化氢酶将产生的过氧化氢转化为水和氧。已经证实这种技术是消除氧的干扰的有效方式，但是需要添加大量葡萄糖，且由于酶促反应的葡萄糖酸生成导致pH持续下降，这阻碍了其在护理点生物电化学设备设计中的更广泛应用。

在本文的系统和方法的实施方案中，评价了温和、生态友好且有效的耗氧剂如多铜氧化酶，因为它们具有将氧直接还原为水的能力。漆酶是多铜酶的实例，其可以催化多种化合物的氧化，同时使用分子氧作为电子受体。通过经由T1中心至三核T2/T3簇的内部电子转移实现这个反应，产生水作为唯一的副产物。因此，在当前系统中消除了如葡萄糖氧化酶-过氧化氢酶-葡萄糖氧去除系统中显示的副产物对传感器表现的副作用。

还原血红蛋白测定用作模型系统以测试在没有和有漆酶的情况下氧张力对传感器表现的影响。图1示出在没有和有漆酶的情况下用静脉血和氧合的血液的传感器响应。通过将具有大气隙的小瓶中的静脉血倒置约20min以确保所有血红蛋白被氧合来制备氧合的血液。从图1可以看出，血红蛋白生物传感器对静脉血和氧合的血液表现出不同的响应。图1示出在有和没有漆酶的情况下使用静脉血和氧合的血液的血红蛋白传感器表现。使用的条是金条上的亚铁氰化物条。将条在pH 6.5缓冲溶液中用聚合物如PEO(聚乙二醇)和PVA(聚乙烯醇)以及非离子表面活性剂涂覆。E＝-525mV.将血液裂解并用pH 7.5缓冲混合物溶液以及表面活性剂裂解剂triton X-100、血红蛋白松弛剂：咪唑、阳离子表面活性剂TTAB(十四烷基三甲基溴化铵)和杀生物剂组分(1,2-苯并异噻唑啉酮)处理。血液和缓冲混合物溶液的比例为1比5。在氧合的血液中观察到更高的斜率，因为在电极表面上在-545mV的负电位干扰氧和亚铁氰化物之间的氧化反应使亚铁氰化物减少，导致错误地增加的传感器响应。通过将漆酶引入氧合的血液/缓冲混合物溶液，对氧合的血液的传感器响应与静脉血相同。添加漆酶将血红蛋白传感器对氧合的血液的响应斜率从549.96降低至388.1，表明漆酶能够从氧合的血液样品去除氧张力。

还评价了不同电极基底材料(金vs.铂)对氧的干扰的影响。以上显示的结果是在金条上。在不引入除氧剂漆酶的情况下，静脉血和氧合的血液的传感器表现存在显著差异。在本文中，评价了将条基底材料从金改变为铂是否会由于其对氧还原的有效催化能力而消除对传感器表现的氧张力。血液样品和缓冲溶液中用亚铁氰化物涂覆的铂条的血红蛋白测定的CV曲线如图2A所示。对于没有和有血液样品的缓冲溶液，在第一次阴极扫描时在-0.4V附近的电位观察到还原峰，这可能是由铂电极表面上发生的溶解氧的干扰还原反应所致。在-0.4V的电位的还原峰仅出现在第一个阴极循环中，而不出现在随后的循环中。因为氧还原峰电位高于血红蛋白检测电位(-545mV)，所以我们设计了二电位方法，利用铂氧还原能力在-400mV的电位保持一定时间(氧还原电压)去除氧张力，然后施加相对较低的电位(-545mV)以检测血红蛋白(检测电压)。在-545mV或用二电位方法在铂条上对静脉和氧合的血液的血红蛋白测定响应如图2B所示。在铂条上用一个电位在-545mV还原测试，氧合的血液表现出比静脉血显著更高的响应(18％)。对于氧合的血液的二电位处理，静脉血和氧合的血液之间没有统计上的显著差异。采用一电位或二电位方法的铂条上的血红蛋白测定的校准曲线如图2(C)所示。与单电位法相比，二电位法使斜率从319.67降低至235.66，这是由于从溶液去除氧的干扰。此外，用二电位法在铂条上仍观察到线性剂量响应。从这些结果来看，对于基于阴极还原反应的电化学测定，铂是一种很好的候选电极材料，因为它具有氧还原能力以去除氧的干扰，同时不影响传感器表现。图2A示出在血液样品和缓冲溶液中使用亚铁氰化物涂覆的铂条的血红蛋白测定的电容对电压曲线；扫描速率：50mv/s。图2B示出在-545mV在铂条上和用二电位测试技术(-400mV一定时间，然后在-545mV测量血红蛋白)在铂条上的电容vs.电压曲线。图2C示出在铂条上使用单电位技术和二电位测试技术的血红蛋白测定的校准曲线。

在许多实施方案中，传感器系统由工作电极、对电极和填充检测电极组成。图3示出这种电极系统的示意图。电极320可以由金、铂或碳材料制成。将隔离物放置在电极上以限定流体通道，并且将盖材料放置在隔离物的顶部以限制流体体积，允许流体上样并流入具有排气孔的通道。

传感器用亚铁氰化物涂覆310，所述亚铁氰化物作为条试剂溶液中的介质，所述条试剂溶液由以下组成：结合聚合物330如：PEO(聚氧化乙烯)、PVA(聚醋酸乙烯酯)或羟丙基甲基纤维素，表面活性剂：具有不同pH的缓冲液系统(例如MES(2-(N-吗啉代)乙磺酸))中的Triton X-100。在操作中，Hb-Fe(III)340转化(还原)为Hb-Fe(II)350。

在许多实施方案中，将传感器用条试剂溶液中的100mM亚铁氰化物涂覆。条试剂由以下组成：结合聚合物如PEO(聚氧化乙烯)、PVA(聚醋酸乙烯酯)或羟丙基甲基纤维素，表面活性剂：pH为6.5的MES缓冲液中的Triton X-100。条试剂和缓冲系统的pH可以基于实验需要而变化。

以1:5的体积比将全血在pH为7.5的裂解溶液中裂解。裂解溶液由以下组成：裂解剂如浓度为0.75％的Triton X-100、血红蛋白稳定剂-优选880mM的咪唑、10mMNaCl、3mMCaCl2和阳离子表面活性剂如TTAB或Zwittergent以及杀菌剂如浓度为8.1mM的1,2-苯丙异噻唑-3-酮。将血液样品在37℃的生理温度保持几分钟(优选3-5分钟)，然后加样到亚铁氰化物涂覆的条上，并且测量在-525mV的电位的电流输出。为了消除对传感器表现的氧干扰，将多铜氧化酶(优选漆酶)直接添加至裂解溶液，经证实其有效消除氧干扰，在氧合的血液和静脉血之间产生相似响应。

图4示出系统中漆酶相互作用的一种理论化反应方案。多铜酶如漆酶能够催化氧到水的四电子还原。在图4左侧的方案中，氧通过使其氧化来干扰亚铁氰化物。在右侧的反应方案中，因为漆酶已将氧转化为水，所以涉及氧的划叉的(xed out)反应方案不会发生以氧化亚铁氰化物。因此，通过在裂解溶液中添加漆酶，消除了静脉血和氧合的血液之间的传感器表现差异，这是由于漆酶催化氧生成水的能力。此外，据证实铂电极有效消除氧的干扰，因为它能够在负电位还原氧。

图5示出电子从T1中心至T2/T3中心的多铜氧化酶转移的理论图。多铜氧化酶是具有四个含铜辅基的蛋白：1型(T1)、2型(T2)、双核3型(T3)，其中T2和T3位点形成三核铜簇。氧结合至多铜氧化酶的三核中心并还原为水，使用通过I型铜从底物内部转移的电子。多铜氧化酶是具有四个铜原子辅基的蛋白。它们可以使用分子氧作为电子受体催化多种化合物的氧化。

铂和金都是常见的电极材料，但是铂可以催化氧还原。目前，铂是燃料电池中氧还原反应最实用的催化剂。在这个研究中，为了消除会导致错误信号的氧干扰，我们利用铂电极优异的氧还原能力，使用二电位法在低电位去除氧干扰，同时不触发电极表面的血红蛋白还原反应。

将本文提供的系统和方法应用于其他系统具有很大的潜力，因为多铜酶用作氧清除剂直接与氧反应以消除氧的干扰。优选将酶添加至缓冲系统中，但是也可以固定在电极表面上。举一个应用到其他系统的实例，常规葡萄糖传感器使用葡萄糖氧化酶作为传感酶，其易受不同样品类型中氧水平的影响。将多铜酶(例如漆酶)添加至涂覆试剂中很可能会有助于降低来自样品的氧张力。

对于铂系统，在介质氧化还原电位低于氧还原电位的基于还原反应的传感器系统中应用二电位法是可行的。因此，可以在低电位处理步骤中减少氧干扰，同时不影响第二步中的检测反应。

在许多实施方案中，所述系统的部分以包括微处理器的设备提供。本文描述的系统和方法的各种实施方案可以完全或部分在软件和/或固件中实现。这种软件和/或固件可以采用包含在非暂时性计算机可读存储介质中或上的指令的形式。然后可以由一个或多个处理器读取和执行那些指令以实现本文描述的操作的执行。指令可以是任何合适的形式，例如但不限于源代码、编译代码、解释代码、可执行代码、静态代码、动态代码等。这种计算机可读介质可以包括任何有形的非暂时性介质，用于以一台或多台计算机可读的形式存储信息，例如但不限于只读存储器(ROM)；随机存取存储器(RAM)；磁盘存储介质；光存储介质；闪存等。

本文描述的系统和方法的实施方案可以在各种系统中实现，包括但不限于智能电话、平板电脑、笔记本电脑以及计算设备和云计算资源的组合。例如，部分操作可能发生在一个设备中，而其他操作可能发生在远程位置，如远程服务器。例如，数据的收集可能发生在智能手机上，而数据分析可能发生在服务器或云计算资源中。任何单个计算设备或计算设备的组合可以执行所述方法。

在各种情况下，方法的部分可以在模块、子例程或其他计算结构中实现。在许多实施方案中，所述方法和体现所述方法的软件可以记录在固定的有形介质上。

虽然在前面的详细描述中已详细描述具体实施方案，但是本领域技术人员会理解，可以根据本公开的整体教导及其广泛的发明构思开发对这些细节的各种修改和替代。因此，应当理解本公开的范围不限于本文公开的特定实例和实施方式，而是旨在覆盖如所附潜力要求及其任何和所有等同物定义的精神和范围内的修改。