一种水母多肽及其应用

摘要

本发明涉及海洋生物利用技术领域，具体涉及到一种水母多肽及其应用。所述水母多肽为脱盐水母伞部或口腕部的酶解物，分子量<5000Da，其中分子量M<1000Da的占肽量的20‑35％，分子量1000Da

说明书

技术领域

本发明涉及海洋生物利用技术领域，具体涉及到一种水母多肽及其应用。

背景技术

皮肤屏障是人体的第一道生理屏障，由角质层、脂质等组成，能够抵抗外界细菌、病毒、刺激物等进入，其中Ⅰ型胶原蛋白由三条链互相缠绕形成特殊的三螺旋结构，是人体皮肤的重要组成部分，对维持皮肤张力，保持皮肤年轻态具有重要的作用。皮肤屏障受损不仅引起皮肤皱纹、老化，还能引起皮炎、湿疹、银屑病、病毒性皮肤病等，而皮肤中Ⅰ型胶原蛋白含量减少，也会造成皮肤的组织结构和生理功能发生退行性改变，表现为皮肤松弛、干燥等。因此皮肤屏障修复、避免皮肤炎症的发生、促进皮肤细胞Ⅰ型胶原蛋白合成对于保持皮肤年轻态，预防皮肤疾病具有重要的作用。

现阶段对皮肤屏障损伤修复活性物质的研究主要集中在植物提取物，如葡萄籽原花青素、甘草提取物等，化妆品行业大多用植物成分为主的组合物修复皮肤屏障，如野大豆提取物、虎杖根提取物、透骨草提取物等。然而，目前还未见海洋生物活性物质用于皮肤屏障损伤修复方面的研究报道。其次，为了舒缓皮肤炎症，部分化妆品中加入违禁的激素成分。长期使用含有激素的化妆品，严重影响着皮肤的生理功能，使皮肤的角质层变薄，增加皮肤的敏感性，甚至发生激素依赖性皮炎。同样的，对其它资源(例如从海洋生物)在此方面的应用研究也较少，因此从海洋生物中筛选抗炎活性物质用于化妆品，对于提升化妆品的安全性和品质具有重要的作用。此外，Ⅰ型胶原蛋白是由三条链互相缠绕形成特殊的三螺旋结构，随着年龄的增长，皮肤中Ⅰ型胶原蛋白含量减少，皮肤的组织结构和生理功能发生退行性改变，表现为皮肤松弛、干燥等。筛选具有促进皮肤细胞Ⅰ型胶原蛋白合成的生物活性物质，对于缓解皮肤老化具有重要的意义。

水母属于腔肠动物，资源丰富。由于含水量高，仅有很少一部分水母经腌制后作为食品，附加值低，造成了资源的浪费。水母中含有丰富的蛋白，利用酶解技术将水母中的蛋白转化为多肽，是对水母资源进行加工和高值化利用的关键。而且现阶段对水母肽的研究主要集中在水母胶原蛋白肽，即通过酸、碱、热水或酶法促溶提取水母胶原蛋白后，然后利用蛋白酶酶解胶原蛋白制备胶原蛋白肽。在水母胶原蛋白的提取过程中，有大量的酸溶性或碱溶性蛋白被弃除，导致水母蛋白的利用率低。利用酶解技术将水母中的蛋白转化为多肽，拓宽水母资源的应用领域，是对水母资源进行加工和高值化利用的关键。

虽然现有技术中也有公开一些利用海洋生物的相关技术，例如申请号为201710451233.7公开的海蜇胶原蛋白乳液的制备方法、授权公告号为CN107625789B的专利公开的仙后水母萃取物的用途等，然而这些公开的资料采用的具体海洋生物对象、具体的应用成分、所实现的效果等均相对较单一。因此本申请采用脱盐水母的酶解物作为研究对象，研究其作为炎症因子抑制剂，皮肤屏障损伤修复剂，以及Ⅰ型胶原蛋白合成制剂等方面的应用。

发明内容

针对上述技术问题，本发明的第一方面提供了一种水母多肽，所述水母多肽为脱盐水母伞部或口腕部的酶解物，其分子量不高于5000道尔顿。

作为本发明一种优选的技术方案，所述酶解物包含高分子量多肽、中分子量多肽和低分子量多肽；所述高分子量多肽的分子量不低于3000道尔顿；所述低分子量多肽的分子量不高于1000道尔顿；所述中分子量多肽的分子量为1000～3000道尔顿。

作为本发明一种优选的技术方案，所述高分子量多肽的分子量为3000～5000道尔顿。

作为本发明一种优选的技术方案，所述低分子量多肽的含量为20～35wt％；所述中分子量多肽的含量为55～70wt％；所述高分子量多肽的含量不高于10wt％。

作为本发明一种优选的技术方案，所述酶解物中包含甘氨酸；所述甘氨酸的含量为10～15wt％。

本发明的第二个方面提供了如上所述的水母多肽的应用，应用于护肤制品的制备。

作为本发明一种优选的技术方案，所述护肤制品的制备方法包括如下步骤：将所述水母多肽用去离子水配成浓度为0.02-10mg/mL的水溶液，然后用孔径不大于0.25μm微孔滤膜过滤制得。

作为本发明一种优选的技术方案，所述护肤制品为炎症因子抑制剂。

作为本发明一种优选的技术方案，所述护肤制品为皮肤屏障修复剂。

作为本发明一种优选的技术方案，所述护肤制品为促进皮肤细胞Ⅰ型胶原蛋白合成制剂。

有益效果：本发明中对脱盐水母伞部或口腕部的酶解物(水母多肽)进行研究，实验分析发现由不同多肽组分组成的水母多肽在护肤品中应用是具有优异的效果。利用本申请的水母多肽分别促进人皮肤成纤维细胞HDFnⅠ型胶原蛋白的合成，制备皮肤屏障修复剂、炎症因子抑制剂等护肤制品，扩展了水母多肽的应用范围，为海洋生物活性物质应用于护肤品及皮肤疾病治疗领域开辟了新途径。此外，本发明从资源利用的角度，为应对水母旺发提供了有效的策略，提高了水母资源的附加值，延长了产业链。

附图说明

图1为本发明不同浓度的水母多肽作用下，人皮肤成纤维细胞HDFn和人皮肤角质形成细胞HaCaT的存活率图。

图2本发明实施例中不同浓度的水母多肽作用下，IL-1α的含量(**与空白对照比，p<0.01,#与阴性对照比，p<0.05，##与阴性对照比，p<0.01)。

图3本发明实施例中不同浓度的水母多肽作用下，表皮模型的ET

图4本发明实施例中不同浓度的水母多肽作用下，人皮肤成纤维细胞HDFnⅠ型胶原蛋白图(**与阴性对照比，p<0.01,#*与阴性对照比，p<0.05)。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明提供技术方案中的技术特征作进一步清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明中的词语“优选的”、“优选地”、“更优选的”等是指，在某些情况下可提供某些有益效果的本发明实施方案。然而，在相同的情况下或其他情况下，其他实施方案也可能是优选的。此外，对一个或多个优选实施方案的表述并不暗示其他实施方案不可用，也并非旨在将其他实施方案排除在本发明的范围之外。

应当理解，除了在任何操作实例中，或者以其他方式指出的情况下，表示例如说明书和权利要求中使用的成分的量的所有数字应被理解为在所有情况下被术语“约”修饰。因此，除非相反指出，否则在以下说明书和所附权利要求中阐述的数值参数是根据本发明所要获得的期望性能而变化的近似值。至少并不是试图将等同原则的适用限制在权利要求的范围内，每个数值参数至少应该根据报告的有效数字的个数并通过应用普通舍入技术来解释。

尽管阐述本发明的广泛范围的数值范围和参数是近似值，但是具体实例中列出的数值尽可能精确地报告。然而，任何数值固有地包含由其各自测试测量中发现的标准偏差必然产生的某些误差。

本发明的第一方面提供了一种水母多肽，所述水母多肽为脱盐水母伞部或口腕部的酶解物，其分子量不高于5000道尔顿。

本发明中对所述脱盐水母伞部或口腕部的酶解方法不作特殊限定，可以根据本领域常规的方法进行酶解制备得到，例如将脱盐水母伞部或口腕部在去离子水中溶解，加入相应的酶，然后调节体系的酸碱性和温度等条件进行水解得到。也可以从市面上购买获得。

申请人发现当将脱盐水母伞部或口腕部的酶解用于炎症因子抑制剂、皮肤屏障修复剂以及促进皮肤细胞Ⅰ型胶原蛋白合成制剂等制剂时，其中的多肽分子量不能太高，否则会严重影响制剂对Ⅰ型胶原蛋白的合成促进速度，影响皮肤屏障修复效果，以及炎症因子的抑制效果。可能是当酶解物中多肽的分子量过高时，由于高分子量的多肽分子结构中物理缠结点较多，导致其往皮肤内部的渗透速度降低，影响其在表皮内的迁移及被吸收的速度。而当采用的多肽分子量低于5000道尔顿时，上述制剂中的活性成分能够快速被肌肤细胞吸收，活化角质形成细胞HaCaT和成纤维细胞HDFn，从而加强皮肤对外界刺激的免受性。

在一些实施方式中，所述酶解物包含高分子量多肽、中分子量多肽和低分子量多肽；所述高分子量多肽的分子量不低于3000道尔顿；所述低分子量多肽的分子量不高于1000道尔顿；所述中分子量多肽的分子量为1000～3000道尔顿。

在一些实施方式中，所述高分子量多肽的分子量为3000～5000道尔顿。

在一些实施方式中，所述低分子量多肽的含量为20～35wt％；所述中分子量多肽的含量为55～70wt％；所述高分子量多肽的含量不高于10wt％。

本发明中对所述脱盐水母伞部或口腕部的酶解物的分子量以及多肽含量的测定方法并不作特殊限定，可以根据本领域常规手段进行测试即可，例如电泳法、高效液相色谱法等方式进行测试得到。

发明人在研究本申请的水母多肽过程中发现，对其中不同分子量多肽的分子量以及含量进行调控可以在很大程度上加快所得制剂对角质形成细胞HaCaT和成纤维细胞HDFn的保护和促增殖分化作用，进一步改善所得制剂对炎症因子的抑制效果，皮肤修护效果，以及皮肤细胞Ⅰ型胶原蛋白合成的促进效果。发明人推测其可能是由于通过不同分子量不同含量的多肽复配之后，制剂在使用时小分子量的多肽被快速吸收，与肌肤内的角质形成细胞(HaCaT)和成纤维细胞(HDFn)接触，调节肌肤微观状态，而中分子量多肽和高分子量多肽再逐步被肌肤细胞吸收，逐步改善肌肤微观环境，避免这些关键细胞直接暴露在高浓度的制剂成分中，出现细胞中毒的现象发生。同时，不同分子量多肽组合之后，在多肽中长短不一的链段之间的相互作用之下，还能提高一些分子量低、活性高多肽的稳定性，从而提高制剂的综合效果。

在一些实施方式中，所述酶解物中包含甘氨酸；所述甘氨酸的含量为10～15wt％。申请人发现酶解物中含有的甘氨酸含量对降低水母多肽对角质形成细胞(HaCaT)和成纤维细胞(HDFn)的毒性有一定的影响，通过控制其中甘氨酸的含量有助于降低水母多肽对上述两种细胞的毒性，有助于提高水母多肽制剂中水母多肽活性成分的含量，从而有助于改善制剂的对皮肤屏障修复效果，以及炎症因子的抑制效果。可能是体系中的甘氨酸能够改善不同分子量多肽之间的相互作用，加强体系中各个成分之间的协同增效作用，从而实现上述效果。

本发明的第二个方面提供了如上所述的水母多肽的应用，应用于护肤制品的制备。

在一些实施方式中，所述护肤制品的制备方法包括如下步骤：将所述水母多肽用去离子水配成浓度为0.02-10mg/mL的水溶液，然后用孔径不大于0.25μm微孔滤膜过滤制得。优选的，采用0.22μm微孔滤膜过滤制得。

通过测定水母多肽对角质形成细胞HaCaT和成纤维细胞HDFn的毒性，确定水母多肽安全剂量。皮肤角质形成细胞和成纤维细胞在保护皮肤免受外界侵扰和组织损伤修复过程中起着重要作用，所以选用角质形成细胞HaCaT和成纤维细胞HDFn测定水母多肽对这两种细胞的毒性，以确定水母多肽安全剂量。实验步骤如下：收集对数生长周期的人皮肤成纤维细胞HDFn或人角质形成细胞HaCaT，按细胞密度为8000个/孔接种至96孔板，每孔含培养液100μl。在培养箱(37℃，5％CO

不同浓度下人皮肤成纤维细胞HDFn和人角质形成细胞HaCaT存活率见附图1，由附图1并结合细胞的生长状态，得到水母多肽对两种皮肤细胞的安全剂量为0.02-10mg/mL。

其中：水母多肽的配制方法：取150mg水母多肽，加入10mL去离子水溶解，制得15mg/mL的水母多肽溶液；然后将15mg/mL的水母多肽用去离子水稀释，分别配制浓度为0.02mg/mL、0.04mg/mL、0.08mg/mL、0.16mg/mL、0.32mg/mL、0.63mg/mL、1.25mg/mL、2.5mg/mL、5mg/mL、10mg/mL、15mg/mL的水母多肽溶液。

在一些实施方式中，所述护肤制品为炎症因子抑制剂。本发明的所述水母多肽炎症因子抑制剂可单独使用，也可以作为功效成分与其他物质组合使用。所述水母多肽作为炎症因子抑制剂，可用于化妆品和医药领域。

利用三维表皮模型评价水母多肽作为炎症因子抑制剂的功效，可参考如下文献进行：张艳云，李润芝，姜珊，何晴，魏利娜，卢永波，徐丽明.三维表皮模型

1).表皮模型复苏：在无菌24孔板中加入0.9mL EpiRecovery培养基，将表皮模型转移至培养基中，置于培养箱(37℃，5％CO

1).表皮模型复苏：在无菌24孔板中加入0.9mL EpiRecovery培养基，将表皮模型转移至培养基中，置于培养箱(37℃，5％CO

1).表皮模型复苏：在无菌24孔板中加入0.9mL EpiRecovery培养基，将表皮模型转移至培养基中，置于培养箱(37℃，5％CO

在一些实施方式中，所述护肤制品为皮肤屏障修复剂。本发明中的所述水母多肽皮肤屏障修复剂可单独使用，也可以作为功效成分与其他物质组合使用。

利用三维表皮模型评价水母多肽皮肤屏障修复功效可参考如下文献进行：张艳云，李润芝，姜珊，何晴，魏利娜，卢永波，徐丽明.三维表皮模型

1).表皮模型活化：在无菌24孔板中加入0.9mL EpiRecovery培养基，将表皮模型转移至培养基中，置于培养箱(37℃，5％CO

1).表皮模型活化：在无菌24孔板中加入0.9mL EpiRecovery培养基，将表皮模型转移至培养基中，置于培养箱(37℃，5％CO

1).表皮模型活化：在无菌24孔板中加入0.9mL EpiRecovery培养基，将表皮模型转移至培养基中，置于培养箱(37℃，5％CO

在一些实施方式中，所述护肤制品为促进皮肤细胞Ⅰ型胶原蛋白合成制剂。本发明的所述水母多肽促进皮肤细胞Ⅰ型胶原蛋白合成制剂可单独使用，也可以作为功效成分与其他物质组合使用。

水母多肽促进皮肤细胞Ⅰ型胶原蛋白合成的实验方法为：1).水母多肽用去离子水溶解，0.22μm微孔滤膜过滤后，备用。2).收集对数生长周期的人皮肤成纤维细胞HDFn，按细胞密度为10

收集对数生长周期的人皮肤成纤维细胞HDFn，按细胞密度为10

收集对数生长周期的人皮肤成纤维细胞HDFn，按细胞密度为10

收集对数生长周期的人皮肤成纤维细胞HDFn，按细胞密度为10

最后指出，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。