系统在提高非天然氨基酸的插入效率中的应用

摘要

本发明涉及基因工程领域，特别涉及系统在提高非天然氨基酸的插入效率中的应用。该系统可以将大肠杆菌翻译系统中终止因子(RF1、RF2、ArfB和Pth)都降解，产生不依赖密码子的翻译终止机制。该系统可以将大肠杆菌翻译系统中终止因子都降解，可以提高在目的蛋白中同时插入多个和多种非天然氨基酸酸的插入效率；在蛋白水平上，可以将大肠杆菌翻译系统中终止因子全部降解；将大肠杆菌翻译系统中终止因子都降解后，可以在TAG、TGA和TAA密码子插入非天然氨基酸，实现3个终止密码子的非天然氨基酸插入。

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程领域，特别涉及系统在提高非天然氨基酸的插入效率中的应用。

背景技术

在自然中，20种天然氨基酸可产生结构功能多样的天然蛋白质，但随着生物技术的发展，原有的蛋白质已不能满足其在蛋白质药物生产、酶稳定性等方面的需求。研究发现生物的遗传密码在不同物种间也存在一定的差异性，例如酿酒酵母的线粒体中，终止密码子UGA也能编码色氨酸。在包括人类在内的许多物种中，UGA亦可被用于编码常规氨基之外的非天然氨基酸(Unnatural amino acids，UNAAs)，例如硒代半胱氨酸、磷酸丝氨酸、对乙酰苯丙氨酸等。这些UNAA可赋予蛋白质新的化学性质、结构及功能，打开了新蛋白质工程的大门，为生物研究、生物治疗学及合成生物学提供了新的途径。

有研究者利用密码子拓展技术将非天然氨基酸插入到抗体中，其核心是需要引入一套正交的外源翻译工具，即能特异性识别非天然氨基酸的氨酰-tRNA合成酶以及能识别终止密码子的配对tRNA，构成氨酰tRNA合成酶/tRNA正交对。同时，引入的正交系统不能与宿主细胞中的内源性氨酰-tRNA合成酶，也不能与宿主细胞中tRNA发生交叉反应。Axup等利用对乙酰苯丙氨酸(pAcF)氨酰tRNA合成酶/tRNA

目前将NCAAs插入CFPS中的主要方法是基于天然翻译体系的终止密码子抑制，其本质上是利用终止密码子来编码氨基酸，然而CFPS中NCAAs的引入受到了内源性释放因子(release factor，RF)的竞争，其主要识别终止密码子引起肽链和核糖体从mRNA上释放，从而抑制NCAAs的插入。在细胞内RF1是基因组中300多个基因翻译终止所必需的，直接删除prfA基因会严重影响细胞的生长，甚至导致细胞死亡。

目前有多种方法可以提高非天然氨基酸(Unnatural amino acids，UNAAs)在细菌中的插入效率，例如细菌裂解后，通过透析除去内源的氨基酸、内源性的tRNA，之后加入非天然氨基酸或者相应的tRNA，此方法在一定程度上增加了非天然氨基酸的插入效率，由于没有除去释放因子RF，仍然会一定程度上造成翻译的提前终止，产生截短的蛋白。通过工程化底盘细胞，将大肠杆菌基因组上密码子UGA全部替换为UAA，并将RF1敲除已达到提高非天然氨基酸在蛋白翻译过程中的插入效率，此方法虽然在源头上除去了释放因子RF1，但是细菌中的翻译过程中的终止因子不仅仅只有RF1。

研究者利用亲和标签、RF1抗体及mf-lon蛋白酶降解含mf-ssrA标签的RF1蛋白将RF1从无细胞蛋白表达系统(Cell-free protein synthesis，CFPS)中除去，这些方法从蛋白水平、基因水平上降解RF1，从而降低其对琥珀密码子的抑制，以提高非天然氨基酸的插入效率，但是由于蛋白在翻译的过程中，蛋白翻译终止也不仅仅只是RF1作用，所以仍然存在一些竞争因子，抑制CFPS中NCAAs的插入；且利用目前的方法，同时插入多个NCAAs的效率较低。

因此，提供基于基因改造的多个非天然氨基酸蛋白的制备方法具有重要的现实意义。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了系统在提高非天然氨基酸的插入效率中的应用。本发明实现了在蛋白中同时插入多种和多个非天然氨基酸，其中插入2种非天然氨基酸的插入效率达17％，插入3种非天然氨基酸，效率达24％以上，插入12个非天然氨基酸，效率达69％，

可以赋予蛋白更多的特性，扩大蛋白的应用范围。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了mf-lon蛋白酶经mf-ssrA标签的介导，在定向降解蛋白翻译中的终止因子中的应用。

在本发明的一些具体实施方案中，所述终止因子包括RF1、RF2、ArfB或Pth中的一个或多个。

在本发明的一些具体实施方案中，所述蛋白翻译为大肠杆菌蛋白翻译系统。

本发明还提供了mf-lon蛋白酶经mf-ssrA标签的介导，在提高多种和/或多个非天然氨基酸的插入效率中的应用。

在本发明的一些具体实施方案中，所述非天然氨基酸包括Bock、pAzF或Sep中的一种或多种。

在本发明的一些具体实施方案中，所述多个包括2个、3个或12个。

本发明还提供了mf-lon蛋白酶经mf-ssrA标签的介导，在降解大肠杆菌翻译系统中的终止因子，提高在目的蛋白上插入多种和/或多个非天然氨基酸的效率中的应用；所述终止因子包括RF1、RF2、ArfB或Pth中的一个或多个；所述非天然氨基酸包括Bock、pAzF或Sep中的一种或多种；所述多个包括2个、3个或12个。

基于上述，本发明还提供了提高多种和/或多个非天然氨基酸插入效率的系统，包括mf-lon蛋白酶和mf-ssrA标签。

在本发明的一些具体实施方案中，所述系统还包括弹性蛋白样多肽(Elastin-like polypeptide,ELP)。

本发明还提供了所述的系统在定向降解蛋白翻译中的终止因子中的应用；所述终止因子包括RF1、RF2、ArfB或Pth中的一个或多个。

本发明还提供了所述的系统在提高多种和/或多个非天然氨基酸的插入效率中的应用；所述非天然氨基酸包括Bock、pAzF或Sep中的一种或多种；所述多个包括2个、3个或12个。

本发明的有益效果包括但不限于：

1.可以将大肠杆菌翻译系统中终止因子(RF1、RF2、ArfB和Pth)都降解，产生不依赖密码子的翻译终止机制。

2.将大肠杆菌翻译系统中终止因子都降解，可以提高在目的蛋白中同时插入多个和多种非天然氨基酸酸的插入效率；

3.在蛋白水平上，可以将大肠杆菌翻译系统中终止因子全部降解；

4.将大肠杆菌翻译系统中终止因子都降解后，可以在TAG、TGA和TAA密码子插入非天然氨基酸，实现3个终止密码子的非天然氨基酸插入。

本发明的一些实施例中，借助弹性蛋白样多肽(Elastin-like polypeptide,ELP)可以实现在同一种蛋白中插入12个非天然氨基酸(Bock)，其插入效率高达69％，大大提高了非天然氨基酸的插入效率。

在本发明的研究中，弹性蛋白样多肽不是必要的，但是在一些实施例中需要，因为本发明在同一种蛋白中插入12个非天然氨基酸，理论上在其它蛋白中也是可以实现。由于本发明插入的非天然氨基酸较多，需要筛选合适的位点；同时非天然氨基酸的侧链结构可能会影响目标蛋白的空间结构，进而影响其功能，而本发明选择的弹性蛋白样多肽由15个氨基酸组成，根据弹性蛋白样多肽的性质，其第14位氨基酸可以被任意氨基酸替代而不影响其功能，所以本发明选择弹性蛋白样多肽。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1示实验原理图；

图2示线性化模板的制备流程图；

图3示Western Blot蛋白定量；

图4示释放因子RF1和RF2检验；

图5示非天然氨基酸的插入活性检测；

图6示双插、三插活性的检测；

图7示十二插活性的检测；

图8示终止因子的作用。

具体实施方式

本发明公开了系统在提高非天然氨基酸的插入效率中的应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

支原体的Lon蛋白酶(mf-Lon)能特异性的识别mf-ssrA标签(pdt3标签)，而不被大肠杆菌中的Lon蛋白酶降解。λ-Red介导的重组技术系统，利用pTKRED质粒中的大肠杆菌外切酶和I-SceI归位内切酶等，可以将基因定点插入到大肠杆菌染色体的任意位置。本发明将Lon蛋白酶降解系统和λ-Red介导的重组技术系统整合在一起，将mf-ssrA基因插入到的目的基因之后。将表达mf-Lon和o-aaRS/o-tRNA的质粒转化到宿主细菌中，在阿拉伯糖诱导下培养细菌，细菌破碎后，制备S30抽提液，并测定非天然氨基酸的插入效率。

本发明利用mf-lon蛋白酶在mf-ssrA标签(即pdt#3标签课题组已申请专利CN201910763138.X)的介导下，定向降解几种蛋白翻译过程中的关键因子，提高多种非天然氨基酸的插入效率。

利用上述系统将释放因子RF1和RF2降解，以提高非天然氨基酸的插入效率。

利用上述系统将大肠杆菌翻译系统中终止因子(RF1、RF2、ArfB和Pth)降解，产生不依赖密码子的翻译终止机制。

利用上述系统，可以在蛋白水平上将大肠杆菌的必须基因产物降解，以提高非天然氨基酸的插入效率。

利用上述系统，可以在蛋白水平上，敲除大肠杆菌中任何感兴趣的蛋白。

利用上述系统，将大肠杆菌翻译系统中终止因子降解，实现3个终止密码子的非天然氨基酸插入。

利用上述系统，将大肠杆菌翻译系统中终止因子降解，提高在目的蛋白上插入多种非天然氨基酸的效率。

该系统不限于大肠杆菌中，也可以应用到其他微生物无细胞技术。

本发明提供的系统在提高非天然氨基酸的插入效率中的应用中，所用原料及试剂均可由市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1利用λ-Red系统在RF1和RF2基因上插入pdt3标签

1.电转感受态的制备：

将冻存的BL21 Star(DE3)菌株用LB培养基以1：100000的比例稀释后，用涂布器涂板后，置于37℃恒温培养箱中过夜培养，挑取单菌落置于无抗的LB培养基中培养，12h后转接到3ml无抗的LB培养基中，待OD600达到0.6时，将其置于冰上静止15min后，以4000rpm/min 4℃离心3min，弃去上清后，用1ml灭菌水重选菌体，以4000rpm/min 4℃离心3min，重复一次，之后用100ul10％甘油重悬，液氮速冻，-80℃保存。

2.制备线性化模板

以BL21 Star(DE3)菌株的基因组和pTKS/CS质粒为模板按照以下步骤进行PCR反应：共需要进行4轮PCR反应：

第一轮PCR反应：

反应体系：

表1

表2

反应条件：

表3

第二轮PCR反应：

反应体系：

表4

反应条件：

表5

第三轮PCR反应：

反应条件：

表6

反应条件：

表7

第四轮PCR反应：

反应条件：

表8

反应条件：

表9

每步PCR反应结束，进行琼脂糖凝胶，之后进切胶回收相应的目的片段，首先称重洁净的1.5ml离心管，之后在蓝光下将目的片段切割下来，置于相应的离心管中，称重后，按照0.1g加入100ul溶胶液置于56℃金属浴中，待凝胶完全融化后，置于冰上2min后，转入制备管中，12000rpm/min 1min，弃去液体，重复此步骤直至所有液体转移到制备管中，之后加入600ul buffer W，12000rpm/min 1min，弃去液体，重复一次后空离心2min；之后加入50ulddH2O洗脱。测定浓度后，置于-20℃中保存。

3.转化pTKRED质粒：

取出电转感受态BL21 Star(DE3)在冰上融化后，加入5ul pTKRED质粒，置于冰上10min后，利用电转仪将大片段转入菌株中，之后加入1ml SOB培养基，30℃活化1h后，涂布于100ug/ml Spe的LB平板，30℃避光培养。20h后看到明显菌落。挑取单菌落置于含100ug/ml Spe的LB培养基中培养，待OD600达到0.6时，按照上述步骤制备电转感受态BL21 Star(DE3)-RED质粒。

4.转化大片段：

取出电转感受态BL21 Star(DE3)-RED质粒在冰上融化后，加入5ul纯化后的上述大片段，置于冰上10min后，利用电转仪将大片段转入菌株中，之后加入1ml SOB培养基，30℃活化1h后，涂布于2mM IPTG，100ug/ml Spe和20ug/ml Tet的LB平板，30℃避光培养。20h后看到明显菌落。挑取单菌落置于含2mM IPTG，100ug/ml Spe和20ug/ml Tet的LB培养基中培养，培养1h后，进行菌检：

反应条件：

表10

反应步骤：

表11

PCR反应完成后，进行琼脂糖凝胶电泳验证。

5.Tet抗性的去除：

挑取菌检正确的菌株接种于3ml LB(2mM IPTG、0.2％阿拉伯糖和100ug/ml Spe)中，30℃培养15h以上。取菌液划线于2mM IPTG、0.2％阿拉伯糖和100ug/ml Spe的LB平板。30℃培养24h左右得到明显的菌落。挑取菌落进行PCR验证：反应步骤同4中的步骤。将F3-LR的PCR产物送去测序。

6.pTKRed质粒的去除：

将测序正确的菌株，划Spe 100ug/ml的LB平板，30℃培养。挑取单菌落于3ml无抗LB中，42℃培养5h，取菌液划线于无抗平板，37℃过夜培养。选取3个单菌落，分别挑于无抗LB和Spe100ug/ml的LB中隔夜培养。如果Spe中的未长则证明已经去除，存菌。

7.其他引起翻译终止的因子(ArfB和Pth)也利用上述步骤加标签，引起翻译终止的因子(ssrA和ArfA)利用上述步骤敲除。

8.最终按照上述步骤，构建了无翻译终止的因子(RF1、RF2、ssrA、ArfA ArfB和Pth)的SfB-ABCFPTfA菌株

表12 引物序列表

实施例2 S30抽出液的制备及细菌内RF1和RF2的检验

1.制备电转感受态及细菌培养：

将上述测序正确的BL21 Star(DE3)-SLA3B3菌株按照上述步骤制备BL21 Star(DE3)-SLA3B3电转感受态，之后将pZA16mflon-pAzFRS质粒电转到BL21 Star(DE3)-SLA3B3中，涂板(Amp-LB板)，37℃过夜培养；从平板上挑取单菌落，接种于22mL的LB液体培养基中，37℃摇床过夜培养10小时。取一部分菌需要冻存保种。吸取10mL过夜的菌液，接种于1.0L含有1mM阿拉伯糖的S30培养基中和1mL的1 00mg/ml氨苄青霉素钠，37℃摇床培养11h左右，至OD

2.收集菌体

①培养结束后，立即将菌液置于冰浴中，静止30min，称量空的50ml离心管的重量，并标记；

②离心收集菌体(4200rpm，4℃，30min)。

③加入30mL S30buffer缓冲液重悬洗涤菌体，并转移至50mL离心管后，离心收集菌体(5000g，4℃，15min)，此步骤需要重复一次；

④充分弃去上清液，称量离心管的重量，计算湿菌体的重量(总重量-净离心管重量)；

⑤将菌体放入-80℃冷冻，保存。

S30 buffer配方：

表13

3.S30抽提液的制备：

①从-80℃中取出保存的菌体，置于冰浴解冻，解冻后，按照1.1g(110％)湿菌体加入1mL S30 buffer的比例加入S30buffer，完全重悬菌体。

②仪器预冷，调节压力至1655bar(24000psi)，破碎1次，

③离心收集上清液(30000g，4℃，30min)

④重复上述步骤一次

⑤run-off：将上清转移至15ml离心管中，锡箔纸包裹后，置于37℃220rpm/min孵育1h；

⑥离心收集上清液(30000g，4℃，30min)

⑦将收集的上清，既得BL21Star(DE3)-SLA3B3抽提液，分装后，液氮速冻，-80℃保存。

4.RF1和RF2的检验

样品处理：取上述培养的菌体1ml，8000rpm/min 2min离心收集菌体，用S30buffer清洗菌体一次，之后加入60ul S30 buffer和12ul 6×SDS Loading Buffer混匀后，置于98℃金属浴中煮沸10min，12000r/min 4℃离心1min。取上述两次离心后的破碎液(run-off前)和最后run-off后收集的上清15μL加入3μL 6×SDS Loading Buffer混匀后，置于98℃金属浴中煮沸10min，12000r/min 4℃离心1min。

上样后，经SDS-PAGE凝胶电泳后，利用湿转(100V-120min)转到PVDF膜上，加入4mL的5％BSA封闭2h，用TBST洗4次，10min/次，加入稀释后的一抗(兔抗Flag标签的单抗)孵育2h，用TBST洗4次，10min/次，再加入稀释后的二抗(HRP标记的山羊抗兔多抗)孵育2h，用TBST洗4次，10min/次，将膜取出加入0.8mL的ECL plus发光液，孵育1min，进行显影。

Western Blot结果显示：在蛋白上样量一致的情况下(图3)，whole cell中与未诱导组相比，释放因子RF1和RF2的在胞内的含量明显降低，说明LR系统构建成功；同时随着细菌破碎后，在30000g和4℃下，释放因子RF1和RF2的合成受阻，但是诱导的mf-lon蛋白仍然可以发挥活性，释放因子RF1和RF2持续被降解，最终在两次离心后，释放因子RF1和RF2被完全降解(图3)。

实施例3 S30抽提液活性的测定

1.GFP-WT、GFP-149TAG、GFP-149TGA和GFP-149TAA模板的制备

取实验室保存的pET23a-GFP、pET23a-GFP149TAG、pET23a-GFP149TGA和pET23a-GFP149TAA菌株，进行平板划线，之后放入37℃培养中，培养14h，挑取单菌落，置于5ml的LB(100ug/ml Amp)中，220rpm/min 37℃培养14h，之后按照试剂盒说明书提取质粒。将质粒按照以下步骤进行PCR反应：

表14

反应条件：

表15

PCR反应结束后，进行琼脂糖凝胶电泳，并按照前面叙述的步骤，进行切胶回收。测定浓度后，-20℃中保存。

2.S30抽提液活性的检测

①配制20×Amino Acid(20×AA)：按照下表进行20×Amino Acid(20×AA)的配置，请按照表中的顺序自上往下依次加入。

表16

②20×PEP的配置

表17

③25×Nucleotide Mix(25×NM)

表18

④配制10×Salt Mix(10×SM)

表19

⑤配制4×Buffer Mix：按照下表进行4×Buffer Mix的配置

表20

⑥按照以下表格将T7RNAP(实验室保存)和4×BufferMix混合在一起，之后按照顺序从上往下依次加入相应试剂，最后加入飞天然氨基酸，混合均匀后取18ul加入384板中，放入酶标仪中，设置反应的温度30℃，反应3h，以485nm为激发波长，535nm为发射波长检测GFP的表达量。

表21

S30抽提液活性的测定：

荧光结果显示：利用S30抽提液制备的无细胞蛋白表达系统，可以将非天然氨基酸Bock、pAzF和Sep插入到GFP蛋白中，说明CFPS系统构建成功；与对照组相比，敲除释放因子RF1和RF2，可以显著的提高非天然氨基酸的插入效率；通过考察不同终止密码子的插入情况，可知敲除释放因子RF1和RF2后，可以将Bock、pAzF和Sep三种非天然氨基酸都可以插入不同的终止密码子，实现3个终止密码子的非天然氨基酸插入(图5、表22)。

表22

3.双插、三插活性的检测

按照上述制备抽提液的方法，以SfB-ABCFPTfA菌株为宿主细菌制备抽提液。按照上述表格将T7RNAP(实验是保存)和4×BufferMix混合在一起，之后按照顺序从上往下依次加入相应试剂，最后将两种NCAAs(Bock和pAzF)或者三种(Bock、pAzF和Sep)加入体系中，混合均匀后取18ul加入384板中，放入酶标仪中，设置反应的温度30℃，反应3h，以485nm为激发波长，535nm为发射波长检测GFP的表达量。

荧光结果显示：对照组相比，敲除释放因子RF1和RF2，可以显著的提高双插(Bock和pAzF)、三插(Bock、pAzF和Sep)在CFPS中的插入效率且插入效率高达50％以上(图6、表23)。

表23

4.十二插活性的检测

①模板的制备：

取实验室保存的pET23a-ELP、pET23a-ELP12TAG-GFP、pET23a-ELP6(TAG TGA)-GFP、pET23a-ELP4(TAG TGA TAA)-GFP和pET23a-ELP三插-GFP突变菌株，进行平板划线，之后放入37℃培养中，培养14h，挑取单菌落，置于5ml的LB(100ug/ml Amp)中，220rpm/min 37℃培养14h，之后按照试剂盒说明书提取质粒。将质粒按照以下步骤进行PCR反应：

表24

反应条件：

表25

PCR反应结束后，进行琼脂糖凝胶电泳，并按照前面叙述的步骤，进行切胶回收。测定浓度后，-20℃中保存。

②按照上述制备抽提液的方法，以SfB-ABCFPTfA菌株为宿主细菌制备抽提液。按照上述表格将T7RNAP(实验室保存)和4×BufferMix混合在一起，之后按照顺序从上往下依次加入相应试剂，最后将三种非天然氨基酸(Bock、pAzF和Sep)加入体系中，混合均匀后取18ul加入384板中，放入酶标仪中，设置反应的温度30℃，反应3h，以485nm为激发波长，535nm为发射波长检测GFP的表达量。

荧光结果显示：对照组相比，敲除释放因子RF1和RF2，可以显著的提高十二插在CFPS中的插入效率(图7、表26)。

表26

5.无终止子目的基因的表达

取实验室保存的pET23a-GFP菌株，进行平板划线，之后放入37℃培养中，培养14h，挑取单菌落，置于5ml的LB(100ug/ml Amp)中，220rpm/min 37℃培养14h，之后按照试剂盒说明书提取质粒。将质粒按照以下步骤进行PCR反应：

表27

反应条件：

表28

PCR反应结束后，进行琼脂糖凝胶电泳，并按照前面叙述的步骤，进行切胶回收。测定浓度后，-20℃中保存。

按照上述制备抽提液的方法，以SfB-ABCFPTfA菌株为宿主细菌制备抽提液，依照上述表格将T7RNAP(实验室保存)和4×BufferMix混合在一起，之后分别回填RF1、RF2、ArfB和Pth终止因子，最后按照CFPS体系从上往下依次加入相应试剂，加入体系中，混合均匀后取18ul加入384板中，放入酶标仪中，设置反应的温度30℃，反应3h，以485nm为激发波长，535nm为发射波长检测GFP的表达量。

荧光结果显示：向CFPS系统中回填RF1、RF2、ArfB和Pth终止因子，促进CFPS系统中核糖体的释放，使核糖体参与下一轮翻译过程，实现了不依赖密码子的翻译终止机制。其中向体系中回填ArfB和Pth终止因子可以提高GFP的荧光值达2倍以上(图8、表29)。

表29

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 天津大学

<120> 系统在提高非天然氨基酸的插入效率中的应用

<130> MP2119107

<160> 24

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

agggtgaaca tggtggttat 20

<210> 2

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

taatggaata tcaacactgg ttacg 25

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cagtcgcttt gcagaatgtg gat 23

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gctattcttc ctgccacaa 19

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

agtggttcgg ttggttagg 19

<210> 6

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

caacactggt tacgtgaagt agggataaca gggtaatatt tacgttgaca ccacctttc 59

<210> 7

<211> 64

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

cagtgttgat attccattaa ttaccctgtt atccctacta agcacttgtc tcctgtttac 60

tccc 64

<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

cgggtggtca gcacgttaac ac 22

<210> 9

<211> 76

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

cttcacgtaa ccagtgttga tattccatta ttaaactcgt cttctgttcg cctggcccgc 60

gttcagcata aaggtc 76

<210> 10

<211> 76

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

cgttcagcat aaaggtcggc acttcgttgg tgttttcttc gtttttgttc gccgcttcct 60

gctcggacaa cgccgc 76

<210> 11

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

agcgtatgta tctgcgctg 19

<210> 12

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

tgaggaacca acatgtctga ac 22

<210> 13

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

gatcctgcaa gccgtggaat tt 22

<210> 14

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

catgtctgaa caacacgcat agggataaca gggtaatatt tacgttgaca ccacctttc 59

<210> 15

<211> 62

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

ttcagacatg ttggttcctc aattaccctg ttatccctac taagcacttg tctcctgttt 60

ac 62

<210> 16

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

tgatatcgaa atcaacccgg cg 22

<210> 17

<211> 76

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

tgcgtgttgt tcagacatgt tggttcctca ttaaactcgt cttctgttcg cctggcccgc 60

gttcagcata aaggtc 76

<210> 18

<211> 76

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

cgttcagcat aaaggtcggc acttcgttgg tgttttcttc gtttttgttc gccgctaacc 60

ctgctttcaa acttgc 76

<210> 19

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

gatctcgatc ccgcggcgct aata 24

<210> 20

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

ggccccaagg ggttatgcta gt 22

<210> 21

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

gcgctaatac gactcactat aggg 24

<210> 22

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

ggccccaagg ggttatgcta gt 22

<210> 23

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

gatctcgatc ccgcggcgct aata 24

<210> 24

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

gatgcccgct gcggttac 18