白细胞免疫球蛋白样受体2中和性抗体

摘要

本发明涉及结合并中和在NK细胞、T细胞和/或其它免疫细胞中具有抑制活性的人ILT2蛋白的抑制活性的药剂。此类药剂可以用于治疗癌症或感染性疾病。

说明书

本申请要求于2018年12月26日提交的美国临时申请第62/784,862号的权益，所述美国临时申请以全文引用的方式并入本文中；包含任何附图。

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技术领域

本发明涉及结合在NK细胞、T细胞、单核细胞、巨噬细胞和/或其它免疫细胞中具有抑制活性的人ILT2蛋白并且中和此类ILT2蛋白的抑制活性的药剂。此类药剂可以用于治疗癌症或感染性疾病。

背景技术

Ig样转录物(ILT)也被称为对应于CD85的淋巴细胞抑制受体或白细胞免疫球蛋白(Ig)样受体(LIR/LILR)。这个蛋白质家族由位于19q13.4染色体中的多于10个基因进行编码，并且包含激活成员和抑制成员两者。抑制LILR通过其含有介于两个与四个之间的基于免疫受体酪氨酸的抑制结构域(ITIM)的长胞质尾区传输信号，所述抑制结构域在磷酸化后募集介导对各种细胞内信号通路的抑制的SHP-1和SHP-2磷酸酶。ILT-2是I类MHC抗原的受体并且识别广谱的HLA-A、HLA-B、HLA-C和HLA-G等位基因。ILT-2(LILRB1)也是H301/UL18(人巨细胞病毒I类MHC同源物)的受体。配体结合导致免疫应答的抑制信号和下调。

据报道，除在树突状细胞(DC)上表达之外，ILT2蛋白还在NK细胞中被表达。NK细胞是在来自淋巴样祖细胞的骨髓中发育的单核细胞，并且形态学特征和生物学性质通常包含决定簇(CD)CD16、CD56和/或CD57的表达；细胞表面上不存在α/β或γ/δTCR复合物；结合并杀伤不能表达“自身”主要组织相容性复合体(MHC)/人白细胞抗原(HLA)蛋白的靶细胞的能力；以及杀伤表达活化NK受体的配体的肿瘤细胞或其它患病细胞的能力。NK细胞的特征在于它们能够结合并杀伤几种类型的肿瘤细胞系，而无需事先免疫或活化。NK细胞还可以释放可溶蛋白和细胞因子，从而对免疫系统产生调节作用；并且可以经历多轮细胞分裂，并且产生具有与亲代细胞类似的生物学性质的子代细胞。正常、健康的细胞受到NK细胞的裂解保护。

基于它们的生物学性质，本领域已经提出了依赖于NK细胞的调节的各种治疗策略。然而，NK细胞活性受到涉及刺激和抑制信号两者的复杂机制的调节。简而言之，NK细胞的裂解活性受到各种细胞表面受体的调节，所述表面受体在与靶细胞上的配体相互作用后转导阳性或阴性细胞内信号。通过这些受体传递的正信号与负信号之间的平衡决定了NK细胞是否裂解(杀伤)了靶细胞。NK细胞刺激信号可以由天然细胞毒性受体(NCR)，如NKp30、NKp44和NKp46；以及NKG2C受体、NKG2D受体、某些活化的杀伤性Ig样受体(KIR)和其它活化的NK受体介导(Lanier，《免疫学年度评审(Annual Review of Immunology》2005；23:225-74)。

基于它们的生物学性质，本领域已经提出了依赖于ILT家族成员的调节的各种策略，值得注意的是包含用于减轻树突状细胞中的ILT介导的耐受性的ILT抑制剂的疫苗接种策略。鉴于使HLA-G与免疫细胞(如NK细胞)的有相互关系的报道，ILT家族和其配体也很受关注。Wan等人(《细胞生理学和生物化学(Cell Physiol Biochem)》2017；44:1828-1841)报道，HLA-G(包含ILT2、ILT4和KIR2DL4在内的几种免疫受体的天然配体)可以通过与细胞表面表达的受体结合来抑制许多免疫细胞的功能。

HLA I类分子与ILT蛋白的相互作用是复杂的。HLA-G不仅与ILT2结合，而且与ILT4和其它受体(例如，属于KIR家族)结合。此外，存在许多HLA-G同种型，并且只有与β-2-微球蛋白(和其可溶性/分泌形式HLA-G7)相关的型HLA-G1与ILT2相关，而所有型HLA-G1、-G2、-G3、-G4、-G5、-G6和-G7与ILT4相关。同样，ILT2和ILT4不仅结合HLA-G，还与其它MHC I类分子结合。ILT2和ILT4使用它们的两个膜远端结构域(D1和D2)来识别MHC分子的α3结构域和β2m亚基，这两者在典型和非典型MHC I类分子中都是保守的。Kirwan和Burshtyn(《免疫学杂志(J Immunol)》2005；175:5006-5015)报道，虽然发现ILT2对过度表达ILT2的NK细胞系具有抑制作用，但正常(原代)NK细胞上的ILT2的量保持在阈值以下，这将允许直接识别大多数MHC-I等位基因。作者因此提出，在正常NK细胞中，ILT2就其本身而言并不具有活性，但可以与抑制KIR受体协作以增加KIR与HLA-C分子相互作用的功能范围。最近，Heidenreich等人2012(《临床和发育免疫学(Clinical and Developmental Immunology.)》第2012卷，文章ID 652130)得出结论，单独的ILT2不会直接影响NK细胞介导的对骨髓瘤的细胞毒性。

各个团体已经提出，通过使用结合或靶向HLA-G的抗体或其它药剂来治疗癌症，由此去除HLA-G介导的免疫抑制并且阻断与HLA-G相互作用的所有ILT和其它受体(如ILT2、ILT4、KIR2DL4和/或其它)(参见例如，WO2018/091580)。然而，靶向HLA-G不抑制ILT2与ILT蛋白的其它HLA I类配体的相互作用(如果有的话)。尽管对与所提出的HLA-G在肿瘤逃逸中的作用相关的ILT受体有所关注，但是还未临床开发提供对ILT2的抑制的治疗剂。

尽管最近通过使用免疫治疗剂取得了进展，但是对癌症治疗的显著改进的需求在很大程度上未得到满足。肾细胞癌(RCC)是一个特定实例。RCC是成人中最常见的肾癌类型，其中其是大约90-95％的病例的原因。肾细胞癌通常起源于近曲小管的衬壁。与许多其它癌症不同，肾细胞癌不是单个实体，而是由源自肾单位的不同部分(如上皮和/或肾小管)的不同细胞和肿瘤类型构成，每种不同细胞和肿瘤类型都具有不同的基因型、基因表达谱、组织学特征和临床表型。死亡率为大约40％，并且患有转移性肾细胞癌的患者的五年存活率低于10％。由于局部和转移性癌症仍然是所有泌尿道恶性肿瘤中最致命的，因此对疾病治疗的显著改进的需求在很大程度上未得到满足。

发明内容

ILT2在所有单核细胞和B细胞上被表达，但在CD4 T细胞和CD16阴性NK细胞中不被表达或仅表达非常低的水平。在表达CD16的细胞毒性淋巴细胞、NK细胞和CD8 T细胞(CD16+细胞)中，ILT2被表达，但其水平远低于在健康供体和癌症患者中的单核细胞和B细胞中的表达(参见实例1和2)。然而，有趣的是，如实例2和图2中所示出的，循环NK和CD8 T细胞上的ILT2表达在头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)、肺癌(例如，NSCLC)、肾细胞癌(RCC)和卵巢癌中特别地增加。此类癌症可能特别易受ILT2在其中发挥作用的免疫抑制的影响。因此，一方面，本公开提供了中和ILT2的抑制活性的抗体可以有利地用于治疗此类癌症。如本文中所示出的，中和ILT2的抑制活性的抗体在来自患有尿路上皮癌(也被称为移行细胞癌(TCC))的人类供体的细胞中示出功效。

另一方面，本公开提供了阻断人ILT2并且加强原代NK细胞中的NK细胞对肿瘤细胞的细胞毒性的抗体和抗原结合结构域(与单核细胞、B细胞或通常被工程化以表达ILT2的细胞相比，NK细胞具有相对低水平的ILT2表达)。所述抗体和抗原结合结构域在治疗广泛范围的癌症(包含在NK和/或CD8T细胞上(例如，在循环或肿瘤浸润NK或T细胞中)的ILT2的表达没有增加的癌症和/或患有在NK和/或CD8T细胞上的ILT2的表达没有增加的癌症的个体)方面可能特别有利。此外，所述抗体和抗原结合结构域可以特别用于治疗特征在于表达HLA-G(和/或其它ILT2配体，如HLA-A2)的肿瘤细胞的宽范围的癌症。所测试的抗体能够导致原代NK细胞在无需对任何其它NK细胞毒性受体进行组合调节(例如，使用药剂单独地结合和/或阻断抑制KIR受体或触发活化受体CD16)的情况下裂解表达HLA-G的肿瘤靶细胞。值得注意的是，所述抗体诱导NK细胞对肿瘤细胞的细胞毒性以作为具有被修饰以消除或降低与CD16(以及其它Fcγ受体)的结合的人Fc结构域的纯阻断性抗体。

此外，抗ILT2抗体能够导致原代NK细胞裂解也表达HLA-E(HLA I类分子，其抑制NK和CD8 T细胞的细胞毒性，但其不是ILT2的配体)的表达HLA-G的肿瘤靶细胞。因此，所述抗体还可以用于特征在于除HLA-G之外还表达HLA-E的肿瘤细胞的癌症。

尽管事实上，HLA-G与除ILT2之外的其它受体结合，并且先前可用的阻断性抗ILT2抗体通常也结合其它ILT2家族成员(ILT-1、-4、-5、-6和其组合)，但是ILT2-HLA-G相互作用-阻断性抗体的生成发现，一些抗体仅与ILT2结合，并且与仅在某些模型设置(如被制备成以高水平表达ILT2的高度分选或工程化的NK细胞系)中有效中和ILT2(或诱导NK介导的细胞毒性活性)的许多抗体不同，本发明的抗体能够在具有较低水平的ILT2的表达的原代人NK细胞(例如，供体衍生的NK细胞)中诱导NK介导的细胞毒性活性。效力的差异(在作用于原代NK细胞时)与结合亲和力无关，因为所选择的抗体都对ILT2具有相当强的亲和力。用于加强原代NK细胞的最有效的抗体属于与仅存在于ILT2上(而不是例如ILT-1、4、-5或-6上)的某些表位结合的抗体组。因此，在ILT受体中，蛋白质表面上存在ILT2独有的区域，所述区域在被阻断时会为原代NK细胞提供强大的增强作用。在不希望受到理论束缚的情况下，结合ILT2而不与ILT6结合可能具有为NK和/或CD8 T细胞活性提供较强的增强作用的优势，因为ILT6作为结合HLA I类分子的可溶性蛋白质天然存在，由此充当NK和/或T细胞的表面上的抑制受体(除ILT2之外)的天然抑制剂。

鉴于HLA I类分子以及β2M与ILT蛋白的复杂相互作用，开发了一种用于鉴定ILT2上的结合区域的策略，其采用由ILT2结构域片段的组合而制成的蛋白质以便使获得正确构型的蛋白质的机会最大化。结果示出，在原代人NK细胞中示出细胞毒性的特别良好的增强作用的抗ILT2抗体分为两个不同的组。一组与野生型ILT2多肽(和一系列ILT2结构域蛋白)结合，但丧失与了缺乏D1结构域部分的经修饰的ILT2蛋白的结合。第二组与野生型ILT2多肽(和一系列ILT2结构域蛋白)结合，但丧失了与缺乏D4结构域部分的经修饰的ILT2蛋白的结合。由结构域片段蛋白质鉴定的结构域内的进一步的点突变研究证实了上文所提到的结果。

一方面，本公开的抗体或抗原结合结构域能够增强效应细胞介导的肿瘤细胞的裂解。所述抗体可以进一步中和单核细胞、巨噬细胞、DC和/或B细胞中的ILT2的抑制信号传导。所述抗体可以进一步用于在其细胞表面表达相较于单核细胞、巨噬细胞、DC和/或其它细胞较低的水平的抑制ILT蛋白的人类个体和/或细胞(例如，NK和/或T细胞群)。中和ILT2的所述药剂可以有利地加强细胞毒性NK淋巴细胞的活性以及通过中和骨髓细胞(DC)中的ILT来促进适应性抗肿瘤免疫应答的发展，值得注意地是通过将CD8 T细胞分化和/或增殖成细胞毒性CD8 T细胞。此外，通过以相当的结合亲和力结合所有功能性抑制ILT-2同种型，所述抗体可以进一步跨人类个体群使用，例如而无需在治疗前进行诊断步骤以测定哪个或哪些ILT-2等位基因在每个个体中被表达。

在一个实施例中，所述抗体(例如，抗体或抗体片段)包括与人ILT2蛋白特异性结合的免疫球蛋白抗原结合结构域(任选地，高变区)。所述蛋白质中和ILT2蛋白的抑制信号传导。在任何实施例中，所述抗原结合结构域(或抗体或包括此类的其它蛋白质)可以被指定为不与人ILT1蛋白结合。在任何实施例中，所述抗原结合结构域(或抗体或包括此类的其它蛋白质)可以被指定为不与人ILT4蛋白结合。在任何实施例中，所述抗原结合结构域(或抗体或包括此类的其它蛋白质)可以被指定为不与人ILT5蛋白结合。在任何实施例中，所述抗原结合结构域(或抗体或包括此类的其它蛋白质)可以被指定为不与人ILT6蛋白结合。在一个实施例中，所述抗体不结合可溶性人ILT6蛋白。在一个实施例中，所述抗体不抑制可溶性人ILT6蛋白与HLA I类分子的结合。在任何实施例中，所述抗原结合结构域(或抗体或包括此类的其它蛋白质)可以被指定为不与ILT-1、ILT-3、ILT-5、ILT-6、ILT-7、ILT-8、ILT-9、ILT-10和/或ILT-11蛋白中的任何一个或多个结合(例如，缺乏与其中的每一个的结合)；在一个实施例中，所述抗原结合结构域(或抗体或包括此类的其它蛋白质)不与人ILT-1、-4、-5或-6蛋白(例如，野生型蛋白质、分别具有SEQ ID NO:3、5、6和7的氨基酸序列的蛋白质)中的任何一个结合。

在本文中的任何实施例中，任何ILT蛋白(例如，ILT-2)可以被指定为在细胞(例如，原代或供体细胞、NK细胞、T细胞、DC、巨噬细胞、单核细胞、被制备成表达蛋白质的重组宿主细胞)的表面表达的蛋白质。在本文中的另一个实施例中，任何ILT蛋白(例如，ILT-2)可以被指定为分离的、重组的和/或膜结合的蛋白质。

任选地，抗体可以被指定为与人ILT2多肽特异性结合并且中和ILT2多肽的抑制活性的抗体片段、全长抗体、多特异性或双特异性抗体。任选地，ILT2多肽在细胞(任选地，效应淋巴细胞、NK细胞、T细胞，例如从人类个体获得、纯化或分离(例如，在没有对细胞进行进一步的修饰的情况下)的原代NK细胞、NK细胞或NK细胞群)的表面被表达。

一方面，特异性结合人ILT2的抗体增强NK细胞对在其表面携带ILT2的配体(例如，天然配体；HLA I类蛋白，任选地HLA-A蛋白、HLA-B蛋白、HLA-F蛋白、HLA-G蛋白)的靶细胞的细胞毒性活性(例如，如通过对NK细胞毒性的标志物进行评估测定的)。在一个实施例中，所述NK细胞是原代NK细胞。任选地，所述靶细胞在其表面另外地携带HLA-E蛋白。与可以仅在表达高水平的ILT2的细胞(例如，在其细胞表面表达或被制备成在其细胞表面表达高水平的ILT2的单核细胞、巨噬细胞或ILT2转染的细胞和/或其它细胞或细胞系(例如，NK细胞系、T细胞系))中增强细胞毒性的抗体不同，本文中所描述的抗体可以甚至在表达低水平的ILT2的细胞(如人类个体(或来自人类供体)中的NK细胞)中起作用。增强此类低表达ILT2的NK细胞的细胞毒性的能力具有能够另外地动员这个细胞群抵抗靶细胞(例如，肿瘤细胞、病毒感染的细胞和/或细菌细胞)的优势。

在一个实施例中，提供了一种抗体或抗体片段(或包括此种片段的蛋白质)，其特异性结合人ILT2并且增强和/或恢复NK细胞(原代NK细胞)在标准4小时体外细胞毒性测定中的细胞毒性，在所述细胞毒性测定中，表达ILT2的NK细胞与表达ILT2的配体(例如，天然配体；HLA蛋白、HLA-G蛋白)的靶细胞一起温育。标准NK细胞毒性测定是众所周知的。在一个实施例中，在添加NK细胞之前，用

在本文中的任何方面，NK细胞(例如，原代NK细胞)可以被指定为从供体纯化的新鲜NK细胞，任选地在使用之前在37℃下温育过夜。在本文中的任何方面，NK细胞或原代NK细胞可以被指定为ILT2表达，例如，用于细胞可以在ILT2上通过流式细胞术进行门控的测定中。

在另一个实施例中，提供了一种抗体或抗体片段(或包括此种片段的蛋白质)，其特异性结合人ILT2并且中和ILT2多肽在人巨噬细胞中的抑制活性。在一个实施例中，所述抗体增加巨噬细胞介导的ADCC。在一个实施例中，所述抗体增加人巨噬细胞中的活化或信号传导。在一个实施例中，所述抗体在存在携带ILT2的天然配体(例如，HLA蛋白)的细胞的情况下中和ILT2多肽的抑制活性。

另一方面，本发明提供了以相当的亲和力结合ILT-2同种型1到6多肽中的每一个的功能中和抗ILT药剂(例如，抗体)。此类药剂具有有利的药理特性。所述药剂可以跨人类群体(即，在表达不同的ILT-2同种型的个体中)以相同的施用方案(施用模式、剂量和频率)使用。

在本文中的任何实施例的另一方面，结合ILT2的所述抗体可以被表征为能够抑制(降低)ILT2与其一种或多种HLA I类配体(具体地，HLA-A、HLA-B、HLA-F和/或HLA-G蛋白)之间的相互作用。在一个实施例中，结合ILT2的所述抗体可以被表征为能够抑制(降低)ILT2与表达ILT-2的一种或多种HLA配体(具体地，HLA-A、HLA-B和/或HLA-G蛋白)的靶细胞(例如，肿瘤细胞)之间的相互作用。

在本文中的任何实施例中，抗体的特征可以在于与人ILT2多肽的结合的结合亲和力的KD小于1×10

在本文中的任何实施例中，抗体的特征可以在于结合亲和力的单价KD小于2nM，任选地小于1nM。

在本文中的任何实施例中，抗体的特征可以在于如通过SPR测定的1:1结合拟合。在本文中的任何实施例中，抗体的特征可以在于解离或脱离速率(kd(1/s))小于约1E-2，任选地小于约小于约1E-3。

在本文中的任何实施例中，结合亲和力可以被指定为如通过表面等离子体共振(SPR)筛选(如通过用BIAcore

在一个实施例中，此外，所述抗体基本上不结合人ILT-1、ILT-3、ILT-4、ILT-5、ILT-6、ILT-7、ILT-8、ILT-9、ILT-10和/或ILT-11蛋白(例如表4中所示出的氨基酸序列)中的任何一个。

在一个实施例中，所述抗体的特征在于：与野生型人ILT2蛋白相比，与表达在残基34、36、76、82和84处具有氨基酸取代(取代E34A、R36A、Y76I、A82S、R84L)的人ILT2突变体多肽的细胞的结合降低；缺乏与人ILT-6多肽的结合；以及1:1结合拟合和/或解离或脱离速率(kd(1/s))小于约1E-2、任选地小于约小于约1E-3，如在SPR单价结合亲和力测定中测定的。

在一个实施例中，所述抗体的特征在于：与野生型人ILT2蛋白相比，与表达在残基F299、Y300、D301、W328、Q378和K381处具有氨基酸取代(取代F299I、Y300R、D301A、W328G、Q378A、K381N)、在残基W328、Q330、R347、T349、Y350和355处具有氨基酸取代(取代W328G、Q330H、R347A、T349A、Y350S、Y355A)和/或在残基D341、D342、W344、R345和R347处具有氨基酸取代(D341A、D342S、W344L、R345A、R347A)的人ILT2突变体多肽的细胞的结合降低；缺乏与人ILT-6多肽的结合；以及1:1结合拟合和/或解离或脱离速率(kd(1/s))小于约1E-2、任选地小于约小于约1E-3，如在SPR单价结合亲和力测定中测定的。

亲和力可以被指定为在1μg/mL的抗ILT2抗体被捕获到蛋白A染色质免疫沉淀上并且重组人ILT2蛋白在捕获到的抗体之上以5μg/mL注射时通过SPR来测定。在本文中的实施例中的任何实施例中，抗ILT抗体的特征可以在于与在细胞(例如，NK细胞、制备成表达ILT2的细胞，例如制备成在其表面表达ILT2的重组CHO宿主细胞，如实例中所示出的)的表面上表达的多肽的结合，并且任选地进一步其中所述抗体以高亲和力结合，如通过流式细胞术测定的。例如，抗体的特征可以在于与原代NK细胞(例如，从来自人类个体或供体的生物样品中纯化的NK细胞)、任选地CD56

另一方面，本公开提供了一种抗体或抗体片段(例如，抗原结合结构域或包括此类的蛋白质)，其与人ILT2多肽特异性结合并且能够中和一个或多个此类ILT在免疫细胞中的抑制活性并且能够阻断一个或多个此类ILT多肽与其HLA配体的相互作用。在一个实施例中，所述配体选自由HLA-A、HLA-B、HLA-F和HLA-G蛋白组成的组。在一个实施例中，抗体或抗体片段与人ILT2多肽结合，并且能够中和一个或多个此类ILT在人免疫细胞(例如，NK细胞、人原代NK细胞；CD56

还提供了此类抗体的片段和衍生物。在一个实施例中，所述抗体是能够与人ILT2多肽结合的抗原结合结构域(例如，单个抗原结合结构域、由重链可变结构域和轻链可变结构域组成的结构域等)。在一个实施例中，所述抗原结合结构域结合人ILT2多肽。在一个实施例中，提供了一种包括此种抗原结合结构域的蛋白质(例如，抗体、包括另外的非免疫球蛋白结构域的融合蛋白、Fc融合蛋白、进一步包括细胞表面受体部分的融合蛋白、多聚体或单体蛋白质、双特异性蛋白质和/或多特异性蛋白质)，或一种在其表面表达前述蛋白质中的任何蛋白质的分离的细胞。在一个实施例中，提供了对此种抗原结合结构域进行编码的核酸。

在一个实施例中，本公开的中和抗ILT抗体减轻由ILT2在免疫细胞中发挥的抑制活性，从而增强淋巴细胞有效识别和/或消除表达ILT2的天然配体的癌症细胞的能力。所述抗体(或抗体片段)由于一种类型或其它类型的配体的表达而降低癌症细胞逃逸裂解的能力，并且它们由此增强免疫系统对肿瘤的监视。在一个实施例中，提供了一种抗体或抗体片段，其特异性结合人ILT2并且减轻由ILT2在人NK细胞(例如，人原代NK细胞；CD56

在一个实施例中，所述抗体增加NK细胞的细胞毒性，如在标准体外细胞毒性测定中评估的，在所述细胞毒性测定中，表达ILT2的NK细胞从人类供体纯化并且与表达ILT2的HLA配体的靶细胞一起温育。在一个实施例中，通过细胞毒性/细胞毒性潜能的标志物(例如，CD107和/或CD137表达(动员))的增加来评估细胞毒性抑制的增加的活化或中和。在一个实施例中，通过

在一个实施例中，提供了一种的抗体或抗体片段(如可以掺入到包括此种片段的蛋白质中)，其结合人ILT2多肽并且能够中和包括SEQ ID NO:1或2的氨基酸序列的ILT2多肽的抑制活性。在一个实施例中，所述抗体或抗体片段(或包括此种片段的蛋白质)能够中和此种ILT2多肽在表达所述ILT2多肽的原代NK细胞中的抑制活性。在一个实施例中，所述抗体增加NK细胞的细胞毒性，如在标准体外细胞毒性测定中评估的，在所述细胞毒性测定中，表达特定ILT2的NK细胞从人类供体纯化并且与表达ILT2蛋白的天然配体的靶细胞一起温育。

在本文中的实施例的任何实施例的一方面，所述抗体是以二价方式结合存在于ILT2的细胞外结构域上的表位的四聚体(例如，全长、F(ab)'2片段)抗体或抗体片段。例如，以二价方式结合ILT的抗体或抗体片段可以包括各自能够结合ILT2多肽的两个抗原结合结构域。在本文中的实施例中的任何实施例的另一方面，所述抗体以单价方式与ILT2结合。在一个实施例中，以单价方式结合ILT2的所述抗体是Fab片段。

在本文中的实施例中的任何实施例中，与ILT2结合的所述抗体对表达ILT2的细胞是非消耗性的。

在本文中的实施例的任何实施例的一方面，所述抗体所述抗体包括能够由人新生儿Fc受体(FcRn)结合、但是具有降低的(例如，与天然人IgG1相比)或基本上缺乏通过其Fc结构域与人FcγR的结合的Fc结构域(例如，CD16'，任选地人CD16A、CD16B、CD32A、CD32B和/或CD64多肽中的一个或多个或每一个)。任选地，所述抗体包括IgG4同种型的人IgG1、IgG2、IgG3的Fc结构域，所述Fc结构域包括降低抗体对人CD16A、CD16B、CD32A、CD32B和/或CD64多肽中的一个或多个或每一个的结合亲和力的氨基酸修饰(例如，一个或多个取代)。

例如，单克隆抗体或抗体片段可以能够与人ILT2蛋白结合并且中和人ILT2蛋白的抑制活性，其中所述抗体不抑制可溶性人ILT6蛋白与HLA I类分子的结合，并且其中所述抗体或抗体片段缺乏Fc结构域，包括人IgG4结构域，或者包括被修饰以消除与人CD16多肽的结合的人Fc结构域，任选地进一步地其中所述Fc结构域被修饰以降低与人CD16A、CD16B、CD32A、CD32B和CD64多肽的结合。

在本文中的实施例的任何实施例中，在与人淋巴细胞上的ILT2结合后，所述单克隆抗体具有增强或重构在靶细胞表面上携带ILT2的HLA蛋白配体的靶人细胞的裂解的能力，和/或当所述靶细胞与所述淋巴细胞(例如，效应淋巴细胞、来自人类个体的NK或CD8+T细胞，例如CD56

在本文中的实施例中的任何实施例中，所述HLA配体是天然配体，例如HLA-A、HLA-B、HLA-F或HLA-G蛋白。

在本文实施例的任何实施例中，在与人淋巴细胞(例如，原代NK细胞)上的ILT2结合后，当所述靶细胞与所述淋巴细胞接触时，所述单克隆抗体具有重构在靶细胞表面上携带ILT2的HLA配体的靶人细胞的裂解的能力。

一方面，抗体与人ILT2多肽的D1结构域结合。人ILT2多肽的结构域D1对应于SEQID NO:1的氨基酸残基24到121。一方面，所述抗体与细胞膜结合的D1结构域多肽(任选地，由膜锚和一个D1结构域组成的多肽，例如由SEQ ID NO:46的氨基酸序列组成的多肽)结合。一方面，抗体与在对应于SEQ ID NO:1的ILT2多肽的残基24到121的区段中的1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个或更多个残基(或所有残基)处具有突变的ILT2多肽的结合降低。

一方面，抗体与其氨基酸序列由SEQ ID NO:46中所示出的序列组成的膜锚定D1结构域ILT2蛋白结合，但不与其氨基酸序列由SEQ ID NO:47、48或49中所示出的序列组成的膜锚定结构域ILT2蛋白中的任何一个结合。

一方面，所述抗ILT2抗体与野生型ILT2多肽(例如，如在细胞的表面表达的)结合，但缺乏与具有对应于SEQ ID NO:1的ILT2多肽的残基24到121的区段的缺失的ILT2多肽(例如，如在细胞的表面表达的)的结合。

一方面，抗体与人ILT2多肽的D4结构域结合。人ILT2多肽的结构域D4对应于SEQID NO:1的氨基酸残基322到458。一方面，所述抗体与细胞膜结合的D4结构域多肽(任选地，由膜锚和一个D4结构域组成的多肽，例如由SEQ ID NO:49的氨基酸序列组成的多肽)结合。一方面，抗体与在对应于SEQ ID NO:1的ILT2多肽的残基322到458的区段中的1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个或更多个残基(或所有残基)处具有突变的ILT2多肽的结合降低。

一方面，抗体与其氨基酸序列由SEQ ID NO:49中所示出的序列组成的膜锚定D4结构域ILT2蛋白结合，但不与其氨基酸序列由SEQ ID NO:46、47或48中所示出的序列组成的膜锚定结构域ILT2蛋白中的任何一个结合。

一方面，所述抗ILT2抗体与野生型ILT2多肽(例如，如在细胞的表面表达的)结合，但缺乏与具有对应于SEQ ID NO:1的ILT2多肽的残基322到458的区段的缺失的ILT2多肽(例如，如在细胞的表面表达的)的结合。

一方面，所述抗ILT2抗体与在对应于SEQ ID NO:1的ILT2多肽的残基322到458的区段中的残基处具有突变的ILT2多肽的结合降低。在每种情况下，结合的降低与相应SEQID NO 1的野生型ILT2多肽进行比较。

本发明还提供了对具有任何前述性质的人或人源化抗体或抗体片段进行编码的核酸(或核酸组)、包括此种核酸的载体、包括此种载体的细胞、以及产生人抗ILT抗体的方法，所述方法包括在适于表达抗ILT抗体的条件下培养此种细胞。本发明还涉及组合物(如药学上可接受的组合物)和试剂盒，其包括此类蛋白质、核酸、载体和/或细胞，以及通常可以是促进组合物的调配、递送、稳定性或其它特性的活性成分或非活性成分的一种或多种另外的成分(例如，各种载体)。本发明进一步涉及制备和使用此类抗体、核酸、载体、细胞、生物体和/或组合物的各种新的和有用的方法，如在ILT2介导的生物活性的调节中，例如在治疗与其相关的疾病(值得注意地是癌症和感染性疾病)中。

在一个实施例中，提供了一种结合ILT2并且中和人ILT2的抑制活性的抗体，其用于治疗个体的癌症(例如，尿路上皮癌、HNSCC、卵巢癌、肾癌、肺癌、NSCLC)。任选地，所述抗体的特征进一步在于本文中所描述的抗体的性质中的任何性质。

本发明还提供了加强和/或调节有需要的受试者中的免疫细胞(例如，NK细胞、CD8+T细胞、单核细胞、巨噬细胞、DC)活性的活性的方法，例如通过调节CD56

所述抗体可以用于治疗患有癌症(例如，特征在于表达HL-G的肿瘤细胞的癌症，任选地，特征在于表达HLA-G的肿瘤细胞和表达HLA-E的肿瘤细胞的癌症，任选地进一步地，特征在于表达HLA-G和HLA-E两者的肿瘤细胞的癌症)的患者。例如，所述患者可以患有头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)、肺癌(任选地，NSCLC)、肾细胞癌(例如，透明细胞肾癌(CCRCC))、结肠直肠癌或卵巢癌。在另一个实施例中，所述受试者是患有感染性疾病(例如，病毒感染)的患者。

所述抗体对于用作单一疗法或与其它治疗剂组合使用可能是有利的。尽管用其它免疫调节剂进行治疗，但是所述抗体对于在其中个体的抗免疫应答受到或保持受到抑制的环境中使用可能是有利的。在一个实施例中，提供了一种治疗患有对用中和PD-1的抑制活性的药剂进行治疗应答较差(例如，正在进展、尚未完全应答或消退、无应答)的癌症的个体的癌症和/或活化所述个体中的CD8+肿瘤浸润T细胞的方法，所述方法包括向所述个体施用治疗活性量的抗ILT2抗体。

在本文提供的本发明的描述中将更加充分地描述这些方面，并且额外的方面、特征和优点将是显而易见的。

附图说明

图1示出了健康个体中的表达ILT2的细胞的百分比。B淋巴细胞和单核细胞总是表达ILT2，常规的CD4 T细胞和CD4 Treg细胞不表达ILT2，但很大一部分CD8 T细胞(约25％)、CD3+CD56+淋巴细胞(约50％)和NK细胞(约30％)表达ILT2。

图2A到2F示出了癌症患者相较于健康个体中的表达ILT2的细胞的百分比，其示出了单核细胞(图2A)、B细胞(图2B)、CD8 T细胞(图2C)、CD4γδT细胞(图2D)、CD16

图3示出了与同种型对照相比，在存在抗体的情况下，表达ILT2的NK细胞系对K562-HLA-G/HLA-E肿瘤靶细胞的裂解的增加％。抗体12D12、19F10a和商业292319在增强NK细胞毒性的能力方面比其它抗体更有效。

图4示出了如通过流式细胞术评估的三种示例性抗ILT2抗体阻断在细胞系的表面表达的HLA-G或HLA-A2与重组ILT2蛋白之间的相互作用的能力。12D12、18E1和26D8各自阻断ILT2与HLA-G或HLA-A2中的每一个的相互作用。

图5A是示出了使用原代NK细胞(来自两个人类供体)和制备成表达HLA-E和HLA-G的K562肿瘤靶细胞由抗ILT2抗体介导的表达CD137的总NK细胞的％的增加的代表性图。图5B是示出了使用来自两个人类供体的NK细胞和表达HLA-A2的B细胞系由抗ILT2抗体介导的表达CD137的ILT2阳性(左图)和ILT2阴性(右图)NK细胞的％的增加的代表性图。在用ILT2阳性NK细胞进行的每个测定中，12D12、18E1和26D8比抗体292319在更大程度上加强NK细胞毒性。图5A和5B中的每一个都示出了两个上图上的第一供体和两个下图上的第二供体。

图6A和6B从细胞毒性标志物CD137的增加倍数的角度示出了抗体增强原代NK细胞对肿瘤靶细胞的细胞毒性的能力。图6A示出了抗体增强使用来自5-12个不同供体的原代NK细胞在存在表达HLA-G的靶细胞的情况下针对表达HLA-G和HLA-E的K562靶细胞的NK细胞活化的能力。图6A示出了抗体增强使用来自3-14个不同供体的原代NK细胞在存在表达HLA-G的靶细胞的情况下针对表达HLA-A2的靶B细胞的NK细胞活化的能力。在每种情况下，12D12、18E1和26D8具有NK细胞毒性的较大增强。

图7示出了如通过流式细胞术评估的抗体与锚定到细胞表面的ILT2结构域片段蛋白质亚群的结合的代表性实例。

图8A示出了通过流式细胞术进行的抗体3H5、12D12和27H5与锚定到细胞的突变体ILT2蛋白(突变体1和2)的结合的滴定的代表性实例，其示出了这些抗体丧失了与突变体2的结合。图8B示出了通过流式细胞术进行的抗体26D8、18E1和27C10与D4结构域突变体4-1、4-1b、4-2、4-4和4-5的结合的滴定。抗体26D8和18E1丧失了与突变体4-1和4-2的结合，并且此外，26D8丧失了与突变体4-5的结合，而抗体18E1与突变体4-5的结合降低(但没有完全丧失结合)。相反，不加强原代NK细胞的细胞毒性的抗体27C10丧失了与突变体4-5的结合，但保留了与4-1或4-2的结合。

图9A示出了表示包含结构域1(顶部，用深灰色阴影表示)和结构域2(底部，用浅灰色阴影表示)的ILT2分子的一部分的模型。图9B示出了表示包含结构域3(顶部，用深灰色阴影表示)和结构域4(底部，用浅灰色阴影表示)的ILT2分子的一部分的模型。

图10A示出了如通过流式细胞术评估的三种示例性抗ILT2抗体阻断在细胞系的表面表达的HLA-G或HLA-A2与重组ILT2蛋白之间的相互作用的能力。所有抗体都阻断了HLA-G或HLA-A2之间的相互作用，而对照抗体则没有。图10B从细胞毒性标志物CD137的增加倍数的角度示出了通过评估原代NK细胞对肿瘤靶细胞的细胞毒性来测定的抗ILT2抗体增强NK细胞介导的ADCC的能力。虽然抗体12D12、2H2B、48F12和3F5有效增加NK细胞毒性，但是1A9、1E4C和3A7A则无效。

图11A、11B、11C和11D从细胞毒性标志物CD137的增加倍数的角度示出了通过评估原代NK细胞对肿瘤靶细胞的细胞毒性来测定的抗ILT2抗体12D12、18E1和26D8增强NK细胞介导的ADCC的能力。图11A示出了在3个不同的人NK细胞供体中，抗体12D12、18E1和26D8增强由利妥昔单抗(rituximab)介导的原代NK细胞针对肿瘤靶细胞的NK细胞活化的能力。图11B、11C和11D示出了每种情况下在3个不同的人NK细胞供体中，抗体12D12、18E1和26D8增强由西妥昔单抗(cetuximab)介导的原代NK细胞针对HN(图11B)、FaDu(图11C)或Cal27(图11D)HNSCC肿瘤靶细胞的NK细胞活化的能力。

图12示出了如通过流式细胞术测定的，发现HNSCC肿瘤细胞对HLA-G和HLA-A2始终呈阴性，但对用与HLA-A、B和C等位基因广泛地发生反应的抗体染色呈阳性。

图13示出了巨噬细胞通过呈能够与人Fcγ受体结合的小鼠IgG2b形式或呈不能与人Fcγ受体结合的HUB3形式的阻断ILT2的抗体对表达HLA-A2的B细胞的ADCP的增强。与抗CD20抗体利妥昔单抗组合，从增加倍数的角度示出结果。

图14示出了抗ILT2抗体对来自人类尿路上皮癌患者的ILT2阳性NK细胞和ILT2阴性NK细胞的活化的效应。抗ILT2抗体12D12、18E1和26D8中的每一个使得NK细胞对靶细胞的细胞毒性增加多于2倍。

图15示出了在CCRCC患者中，ILT2表达水平与存活率的相关性。CCRCC患者根据Cox回归的p值分为3组(高、中、低ILT2基因表达)(每组必须含有至少10％的患者)，并且为3组中的每组绘制存活概率曲线。较高ILT2与较低存活概率相关。

具体实施方式

定义

如说明书中所用，“一”或“一个”可能表示一个或多个。

当使用“包括”时，这可以任选地由“基本上由……组成”或“由……组成”替换。

人ILT2是淋巴细胞抑制受体或白细胞免疫球蛋白(Ig)样受体(LIR/LILR)家族的成员。ILT-2包含6个同种型。Uniprot标识符编号Q8NHL6(其全部公开内容以引用方式并入本文中)被称为典型序列，包括650个氨基酸，并且具有以下氨基酸序列(包含残基1-23的信号序列)：

不具有前导序列的ILT2氨基酸序列示出如下：

在本发明的上下文中，“中和”或“中和ILT2的抑制活性”是指ILT2蛋白对导致免疫细胞应答(例如，细胞毒性应答)的细胞内过程产生负面影响的能力受到抑制的过程。例如，中和ILT-2可以在例如基于标准NK或T细胞的细胞毒性测定中测量，在所述细胞毒性测定中，测量治疗性化合物刺激通过ILT阳性淋巴细胞杀伤HLA阳性细胞的能力。在一个实施例中，抗体制剂使ILT-2限制的淋巴细胞的细胞毒性增加至少10％，任选地使淋巴细胞细胞毒性增加至少40％或50％，或任选地使NK细胞毒性增加至少70％，并且参考所描述的细胞毒性测定。在一个实施例中，抗体制剂通过ILT-2限制的淋巴细胞使细胞因子释放增加至少10％，任选地使细胞因子释放增加至少40％或50％，或任选地使细胞因子释放增加至少70％，并且参考所描述的细胞毒性测定。在一个实施例中，抗体制剂通过ILT-2限制的淋巴细胞使细胞毒性的标志物(例如，CD107和/或CD137)的细胞表面表达增加至少10％，任选地增加至少40％或50％，或任选地使细胞毒性的标志物(例如，CD107和/或CD137)的细胞表面表达增加至少70％。

抗ILT2抗体“阻断”或“抑制”ILT2分子与其天然配体(例如，HLA分子)的结合的能力意指在使用可溶性或细胞表面相关的ILT2和天然配体(例如，HLA分子，例如HLA-A、HLA-B、HLA-F、HLA-G)的测定中，抗体可以以剂量依赖性方式可检测地降低ILT2分子与配体(例如，HLA分子)的结合，其中在不存在抗体的情况下，ILT2分子与配体(例如，HLA分子)可检测地结合。

每当在整个说明书中参考抗ILT2结合剂(例如，抗体)提及“治疗癌症”等时，均表示：(a)治疗癌症的方法，所述方法包括以下步骤：以允许治疗癌症的剂量(治疗有效量)，优选地如本文规定的剂量(量)将(用于至少一种治疗)的抗ILT2结合剂(优选地在药学上可接受的载剂材料中)施用于需要此种治疗的个体、哺乳动物，尤其是人；(b)使用用于治疗癌症的抗ILT2结合剂或抗ILT2结合剂用于所述治疗(特别是人)；(c)使用抗ILT2结合剂制造用于治疗癌症的药物制剂，使用抗ILT2结合剂制造用于治疗癌症的药物制剂的方法包括：将抗ILT2结合剂与药学上可接受的载体或包括适用于治疗癌症的有效剂量的抗ILT2结合剂的药物制剂混合；或(d)a)、b)和c)的任何组合，根据在本申请提交的国家允许申请专利的主题。

如本文所用，术语“抗原结合结构域”是指包括能够免疫特异性结合于表位的三维结构的结构域。因此，在一个实施例中，所述结构域可以包括高变区，任选地抗体链的VH和/或VL结构域，任选地至少VH结构域。在另一个实施例中，结合结构域可以包括抗体链的至少一个互补性决定区(CDR)。在另一个实施例中，结合结构域可以包括来自非免疫球蛋白支架的多肽结构域。

如本文可互换使用，术语“抗体”或“免疫球蛋白”包含完整抗体和其任何抗原结合片段或单链。典型的抗体包括通过二硫键互连的至少两条重(H)链和两条轻(L)链。每个重链包含重链可变区(V

术语“特异性结合”意指抗体可以优选地在竞争性结合测定中结合于结合配偶体，例如ILT2，如使用蛋白质、其中表位的重组形式，或存在于隔离的靶细胞的表面上的天然蛋白质所评估的。用于确定特异性结合的竞争性结合测定和其它方法在下文进一步描述，并且是本领域众所周知的。

当抗体被认为与特定单克隆抗体“竞争”时，这意味着抗体在结合测定中使用重组ILT2分子或表面表达的ILT2分子与单克隆抗体竞争。例如，如果测试抗体在结合测定中降低参考抗体与ILT2多肽或表达ILT2的细胞的结合，则称抗体相应地与参考抗体“竞争”。

如本文所用，术语“亲和力”是指抗体与表位结合的强度。抗体的亲和力由解离常数Kd给出，定义为[Ab]×[Ag]/[Ab-Ag]，其中[Ab-Ag]是抗体-抗原复合物的摩尔浓度，[Ab]是未结合的抗体的摩尔浓度，并且[Ag]是未结合的抗原的摩尔浓度。亲和力常数K

在本文上下文中，“决定簇”表示与多肽相互作用或结合的位点。

术语“表位”是指抗原决定簇，并且是抗体结合的抗原上的区域或区域。蛋白质表位可以包括直接参与结合的氨基酸残基以及被特异性抗原结合抗体或肽有效阻断的氨基酸残基，即抗体的“足迹”内的氨基酸残基。它是复杂抗原分子上最简单的形式或最小的结构区域，其可以与例如抗体或受体组合。表位可以是线性的或构象的/结构的。术语“线性表位”定义为由氨基酸的线性序列(一级结构)上连续的氨基酸残基构成的表位。术语“构象或结构表位”定义为由不完全连续的氨基酸残基构成的表位，并且因此代表通过折叠分子而彼此接近的氨基酸的线性序列的分开部分(二级、三级和/或四级结构)。构象表位取决于3维结构。因此，术语‘构象’通常与‘结构’可互换使用。

关于表达ILT2的细胞的术语“消耗(deplete)”或“消耗(depleting)”是指导致杀伤、消除、裂解或诱导此类杀伤、消除或裂解，从而负面影响样品或受试者中存在的此类表达ILT2的细胞的数量的过程、方法或化合物。关于过程、方法或化合物的“非消耗性的”是指过程、方法或化合物未耗尽。

术语“药剂”在本文中用于表示化学化合物，化学化合物、生物大分子或由生物材料制成的提取物的混合体。术语“治疗剂”是指具有生物活性的药剂。

出于本文的目的，“人源化”或“人”抗体是指其中一种或多种人免疫球蛋白的恒定和可变框架区与动物免疫球蛋白的结合区，例如CDR融合的抗体。设计此类抗体以维持衍生结合区的非人抗体的结合特异性，但是避免针对非人抗体的免疫反应。此类抗体可以从转基因小鼠或已经被“工程化”以响应抗原攻击产生特异性人抗体的其它动物中获得(参见，例如，Green等人(1994)《自然遗传学(Nature Genet)》7:13；Lonberg等人(1994)《自然(Nature)》368:856；Taylor等人(1994)《国际免疫药理学(Int Immun)》6:579，所述文献的全部教导通过引用并入本文)。完全人抗体也可以通过遗传或染色体转染方法以及噬菌体展示技术构建，所有这些都是本领域已知的(参见，例如，McCafferty等人(1990)《自然(Nature)》348:552-553)。人抗体也可以由体外活化的B细胞产生(参见，例如，美国专利第5,567,610号和第5,229,275号，所述专利通过引用以其整体并入)。

“嵌合抗体”是抗体分子，其中(a)恒定区或其部分被改变、替换或交换，使得抗原结合位点(可变区)连接到不同或改变的类、效应功能和/或物种、或赋予嵌合抗体新性质的完全不同的分子，例如酶、毒素、激素、生长因子、药物等的恒定区；或(b)可变区或其部分被具有不同或改变的抗原特异性的可变区改变、替换或交换。

当在本文中使用时，术语“高变区”是指抗体的负责抗原结合的氨基酸残基。高变区通常包括来自“互补性决定区”或“CDR”的氨基酸残基(例如，轻链可变结构域中的残基24-34(L1)、50-56(L2)和89-97(L3)以及重链可变结构域中的31-35(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)；Kabat等人1991)和/或来自“高变环”的那些残基(例如，轻链可变结构域中的残基26-32(L1)、50-52(L2)和91-96(L3)以及重链可变结构域中的26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)；Chothia和Lesk,《分子生物学期刊(J.Mol.Biol)》1987；196:901-917)，或用于确定负责抗原结合的必需氨基酸的类似系统。通常，此区域中氨基酸残基的编号通过Kabat等人，同上所述的方法进行。如“Kabat位置”、“如Kabat中的可变结构域残基编号”和“根据Kabat”等短语在本文中是指用于重链可变结构域或轻链可变结构域的此编号系统。使用Kabat编号系统，肽的实际线性氨基酸序列可以含有较少或额外的氨基酸，与可变结构域的FR或CDR的缩短或插入相对应。例如，重链可变结构域可以包含在CDR H2的残基52之后的单个氨基酸插入物(根据Kabat的残基52a)和在重链FR残基82之后的插入残基(例如，根据Kabat的残基82a、82b和82c等)。通过将抗体序列的同源区域与“标准”Kabat编号序列比对，可以确定给定抗体的Kabat残基编号。

如本文所用，“框架”或“FR”残基是指除了定义为CDR的那些区域之外的抗体可变结构域的区域。每个抗体可变结构域框架可以进一步细分为由CDR分开的连续区域(FR1、FR2、FR3和FR4)。

术语“Fc结构域”、“Fc部分”和“Fc区”是指抗体重链的C末端片段，例如，来自人γ(γ)重链的约氨基酸(aa)230到约aa 450，或其在其它类型的抗体重链中的对应序列(例如，人抗体的α、δ、ε和μ)，或其天然存在的同种异型。除非另有说明，否则在本公开全文中使用免疫球蛋白的普遍接受的Kabat氨基酸编号(参见Kabat等人(1991)《具有免疫学意义的蛋白质序列》,第5版,美国公共卫生局(United States Public Health Service),美国国立卫生研究院(National Institute of Health),贝塞斯达,马里兰州)。

术语“隔离的”、“纯化的”或“生物学上纯的”是指基本上或基本上不含在其天然状态下发现的通常伴随其的组分的材料。纯度和均匀性通常使用分析化学技术，如聚丙烯酰胺凝胶电泳或高效液相色谱法确定。作为制剂中存在的主要物质的蛋白质是基本上纯化的。

术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，指氨基酸残基的聚合物。术语适用于氨基酸聚合物，以及天然存在的氨基酸聚合物和非天然存在的氨基酸聚合物，其中一个或多个氨基酸残基是对应天然存在的氨基酸的人工化学模拟物。

当与参考例如细胞、或核酸、蛋白质或载体一起使用时，术语“重组”表示已经通过引入异源核酸或蛋白质、或对天然核酸或蛋白质的改变修饰了细胞、核酸、蛋白质或载体，或细胞衍生自如此修饰的细胞。因此，例如，重组细胞表达在天然(非重组)形式的细胞内未发现的基因，或表达以其它方式异常表达、表达不足或根本不表达的天然基因。

在本文的上下文中，术语“结合”多肽或表位的抗体表示以特异性和/或亲和力结合所述决定簇的抗体。

当在两个或更多个多肽的序列之间的关系中使用时，术语“同一性”或“相同的”是指多肽之间的序列相关性程度，如通过两个或更多个氨基酸残基的串之间的匹配数测定的。“同一性”测量两个或更多个序列中较小的序列之间相同匹配的百分比，其中间隙比对(如果有的话)由特定数学模型或计算机程序(即“算法”)解决。通过已知方法可以容易地计算相关多肽的同一性。此类方法包含但不限于以下中描述的那些：《计算分子生物学(Computational Molecular Biology)》，Lesk,A.M.编辑，牛津大学出版社，纽约，1988；《生物计算：信息学和基因组计划(Biocomputing:Informatics and Genome Projects)》，Smith,D.W.编辑，学术出版社，纽约，1993；《序列数据的计算机分析(Computer Analysisof Sequence Data)》，第1部分，Griffin,A.M.和Griffin,H.G.编辑，Humana Press，新泽西，1994；《分子生物学中的序列分析(Sequence Analysis in Molecular Biology)，vonHeinje,G.，学术出版社，1987；《序列分析引物(Sequence Analysis Primer)》，Gribskov,M.和Devereux,J.编辑，M.Stockton Press，纽约，1991；和Carillo等人，《工业与应用数学学会应用数学杂志(SIAM J.Applied Math.)》48,1073(1988)。

设计用于确定同一性的方法以给出测试序列之间的最大匹配。在公开可用的计算机程序中描述了确定同一性的方法。用于确定两个序列之间的同一性的计算机程序方法包含GCG程序包，包含GAP(Devereux等人,《核酸研究(Nucl.Acid.Res.)》12,387(1984)；遗传学计算机组，威斯康星大学，麦迪逊，威斯康星州)，BLASTP、BLASTN和FASTA(Altschul等人，《分子生物学期刊(J.Mol.Biol.)》215,403-410(1990))。BLASTX程序可从国家生物技术信息中心(NCBI)和其它来源公开获得(BLAST Manual，Altschul等人，NCB/NLM/NIHBethesda，Md.20894；Altschul等人，同上)。熟知的史密斯-沃特曼算法(Smith Watermanalgorithm)也可以用来确定一致性。

生产抗体

可用于治疗疾病(例如，癌症、感染性疾病)的抗ILT2药剂结合人ILT2蛋白的细胞外部分，任选地而与其它ILT家族成员(例如，活化ILT和/或其它抑制ILT)没有显著或高亲和力结合，并且降低在ILT2阳性免疫细胞的表面上表达的人ILT2的抑制活性。在一个实施例中，药剂抑制HLA I类分子(例如，与β

在一个实施例中，本文中所描述的抗ILT2药剂可以用于增加人类或来自人类供体的NK细胞或CD8 T细胞对携带ILT2的配体的靶细胞(例如，癌症细胞、K562细胞、WIL2-NS细胞、FaDu细胞、Cal27细胞)的细胞毒性。抗体可以用于增强NK细胞和/或CD8 T细胞的细胞毒性，例如将细胞毒性的水平恢复到基本上在其表面不表达ILT2蛋白的NK细胞或T细胞中观察到的所述水平。

在一个实施例中，药剂与I类HLA分子竞争与ILT2分子结合，即，药剂阻断ILT2与其HLA I类配体(例如，在每种情况下与β

在本发明的一方面，药剂是选自全长抗体、抗体片段和合成或半合成抗体衍生分子的抗体。

在本发明的一方面，药剂是选自完全人抗体、人源化抗体和嵌合抗体的抗体。

在本发明的一方面，药剂是选自IgA、IgD、IgG、IgE和IgM抗体的抗体的片段。

在本发明的一方面，药剂是包括选自IgG1、IgG2、IgG3和IgG4的恒定结构域的抗体的片段。

在本发明的一方面，药剂是选自以下的抗体片段：Fab片段、Fab'片段、Fab'-SH片段、F(ab)2片段、F(ab')2片段、Fv片段、重链Ig(美洲驼或骆驼Ig)、V

在本发明的一方面，药剂是合成或半合成抗体衍生的分子，其选自scFV、dsFV、微抗体、双功能抗体、三功能抗体、κ体、IgNAR和多特异性抗体。

一方面，本公开的抗体或抗原结合结构域可以被表征为以比与另外的人ILT(例如，ILT-1、ILT-3、ILT-4、ILT-5、ILT-6、ILT-7、ILT-8、ILT-9、ILT-10和/或ILT-11)结合低至少100倍、任选地至少1000倍或10000倍的结合亲和力(例如，KD)与ILT2结合。可以例如通过表面等离子体共振测定与重组ILT多肽结合的亲和力(例如，根据本文中的实例的方法)。

在本发明的一方面，抗体呈纯化或至少部分纯化的形式。在本发明的一方面，抗体基本上呈隔离的形式。

可以通过本领域已知的多种技术产生抗体。通常，所述抗体通过用包括ILT2多肽、优选地人ILT2多肽、任选地包括SEQ ID NO:1或2的氨基酸序列或基本上由其组成的多肽的免疫原使非人动物(优选地，小鼠)免疫而产生。ILT2多肽可以包括人ILT2多肽或其片段或衍生物(通常是免疫原性片段，即，包括暴露于表达ILT2多肽的细胞的表面上的表位的多肽的一部分)的全长序列。此类片段通常含有成熟多肽序列的至少约7个连续氨基酸，甚至更优选地其至少约10个连续氨基酸。片段通常基本上衍生自受体的细胞外结构域。在一个实施例中，免疫原包括脂质膜中的野生型人ILT2多肽，通常在细胞表面。在具体实施例中，免疫原包括任选地处理或裂解的完整细胞，特别是完整的人细胞。在另一个实施例中，多肽是重组ILT2多肽。

用抗原免疫非人哺乳动物的步骤可以以本领域熟知的任何方式进行，用于刺激小鼠中抗体的产生(参见，例如，E.Harlow和D.Lane，《抗体：实验室手册(Antibodies：ALaboratory Manual.)》，纽约冷泉港冷泉港实验室出版社，(1988)，其全部公开内容通过引用并入本文)。将免疫原悬浮或溶解在缓冲液中，任选地与佐剂，如完全或不完全的弗氏佐剂一起。用于确定免疫原的量、缓冲液的类型和佐剂的量的方法是本领域技术人员众所周知的，并且不以任何方式进行限制。对于不同的免疫原，这些参数可能有所不同，但是很容易阐明。

类似地，足以刺激抗体产生的免疫位置和频率也是本领域众所周知的。在典型的免疫方案中，非人动物在第1天和约一周后再次腹膜内注射抗原。随后在第20天左右召回抗原注射，任选地与如不完全弗氏佐剂等佐剂一起注射。召回注射是静脉内进行的，并且可以连续数天重复进行。随后在第40天，通常在没有佐剂的情况下静脉内或腹膜内加强注射。此方案导致约40天之后产生产生抗原特异性抗体的B细胞。也可以使用其它方案，只要它们导致产生表达针对免疫中所用抗原的抗体的B细胞即可。

在替代性实施例中，分离来自非免疫非人类哺乳动物的淋巴细胞，使其在体外生长，并且然后在细胞培养物中暴露于免疫原。然后收集淋巴细胞，并且进行下述融合步骤。

对于单克隆抗体，下一个步骤是从免疫的非人类哺乳动物中分离脾细胞，并且随后将这些脾细胞与永生化细胞融合，以形成产生抗体的杂交瘤。从非人类哺乳动物中分离脾细胞是本领域众所周知的，并且通常涉及从麻醉的非人类哺乳动物中除去脾脏，将其切割成小块，并且通过细胞过滤网的尼龙网，将来自脾脏的脾细胞挤压到合适的缓冲液中，以产生单个细胞悬浮液。将细胞洗涤、离心并且重悬于裂解任何红细胞的缓冲液中。再次离心溶液，并且最后将沉淀中剩余的淋巴细胞重悬于新鲜缓冲液中。

一旦分离并且存在于单细胞悬浮液中，淋巴细胞可以融合到永生细胞系。尽管本领域已知许多其它可用于产生杂交瘤的永生细胞系，但是这通常是小鼠骨髓瘤细胞系。鼠类骨髓瘤细胞系包含但不限于可从美国圣地亚哥的Salk研究所细胞分配中心获得的MOPC-21和MPC-11小鼠肿瘤，可从美国马里兰州罗克维尔市的美国典型培养物收集获得的X63Ag8653和SP-2细胞衍生的那些。使用聚乙二醇等进行融合。然后，使所得杂交瘤在含有抑制未融合的亲代骨髓瘤细胞的生长或存活的一种或多种物质的选择性培养基中生长。例如，如果亲代骨髓瘤细胞缺乏次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(HGPRT或HPRT)，则杂交瘤的培养基通常将包含次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸苷(HAT培养基)，所述物质阻止HGPRT缺陷型细胞的生长。

杂交瘤通常生长于巨噬细胞的饲养层上。巨噬细胞优选地来自用于分离脾细胞的非人类哺乳动物的同窝幼虫，并且通常在铺板杂交瘤之前几天，用不完全弗氏佐剂等引发。融合方法描述于Goding，“单克隆抗体：原理和实践(Monoclonal Antibodies:Principlesand Practice)”，第59-103页(学术出版社，1986)，所述文献的公开内容通过引用并入本文。

使细胞在选择培养基中生长足够的时间，以用于菌落形成和抗体产生。这通常介于约7天到约14天之间。

然后测定杂交瘤菌落产生与ILT2多肽基因产物特异性结合的抗体。测定通常是比色ELISA型测定，尽管可以采用可以适合杂交瘤生长的孔的任何测定。其它测定包含放射免疫测定法或荧光活化细胞分选。检查所需抗体产生阳性的孔，以确定是否存在一个或多个不同的菌落。如果存在多于一个菌落，则可以将细胞重新克隆并且生长，以确保仅单个细胞已经产生了产生所需抗体的菌落。通常，还将测试抗体结合ILT2多肽，例如表达ILT2的细胞的能力。

可以在合适的培养基，如DMEM或RPMI-1640中大量生长已证实产生单克隆抗体的杂交瘤。可替代地，杂交瘤细胞可以在动物中作为腹水肿瘤在体内生长。

在充分生长以产生所需的单克隆抗体之后，将含有单克隆抗体(或腹水)的生长培养基与细胞分离，并且纯化其中存在的单克隆抗体。纯化通常是通过凝胶电泳、渗析、使用蛋白A或蛋白G琼脂糖或连接固相支持物，如琼脂糖或琼脂糖珠的抗小鼠Ig色谱法来实现的(全部描述于例如《抗体纯化手册(Antibody Purification Handbook)》中，生物科学，出版号18-1037-46，AC版，所述文献的公开内容通过引用并入本文)。通常通过使用低pH缓冲液(pH等于或小于3.0的甘氨酸或乙酸盐缓冲液)从蛋白A/蛋白G柱上洗脱结合抗体，立即中和含抗体的馏分。根据需要将这些馏分合并、透析和浓缩。

通常重新克隆和重新测定具有单个表观菌落的阳性孔，以确保仅检测和产生一种单克隆抗体。

抗体也可以通过选择免疫球蛋白的组合文库产生，例如在(Ward等人《自然(Nature)》，341(1989)第544页，其全部公开内容通过引用并入本文)中所公开。

可以在ILT2蛋白上滴定抗体，以获得实现与ILT2多肽最大结合所需的浓度。关于与ILT2多肽(或表达此类的细胞)的结合的“EC50”是指抗ILT2抗体产生其关于与ILT2多肽(或表达此类的细胞)的结合的最大应答或效应的50％的有效浓度。

一旦鉴定出能够结合ILT2和/或具有其它期望性质的抗体，通常还将使用标准方法(包含本文中所描述的那些标准方法)评估所述抗体与其它多肽(包含其它ILT2多肽和/或无关多肽)结合的能力。理想地，抗体仅以实质亲和力与ILT2结合，并且不以显著水平与无关多肽或与其它ILT蛋白(值得注意的是ILT-1、-3、-4、-5、-6、-7和/或-8)。然而，应当了解，只要ILT2的亲和力(例如，如通过SPR测定的KD)比其它ILT和/或其它无关多肽的亲和力基本上大(例如，10倍、100倍、1000倍、10,000倍、或更多)，则抗体适用于本发明方法中。

抗ILT2抗体可以制备为非消耗性抗体，使得它们已经降低或基本上缺乏与人Fcγ受体的特异性结合。此类抗体可以包括已知不结合CD16和任选地另外的其它Fcγ受体或与其具有低结合亲和力的各种重链的恒定区。一个此类实例是已降低CD16结合、但保留与其它受体(如CD64)的显著结合的人IgG4恒定区。可替代性，不包括恒定区的具有经修饰的Fc结构域的抗体或抗体片段(如Fab或F(ab')2片段)可以用于避免Fc受体结合。可以根据本领域已知的方法评估Fc受体结合，包含例如在BIACORE测定中测试抗体与Fc受体蛋白的结合。可以使用任何抗体同种型，其中Fc部分被修饰以最小化或消除与Fc受体的结合(参见例如，WO03101485，其公开内容以引用的方式并入本文中)。如例如基于细胞的测定等用于评估Fc受体结合的测定在本领域中是公知的，并且描述于，例如WO03101485中。

从杂交瘤中分离对结合ILT2多肽上存在的表位的抗体进行编码的DNA，并且将其放置于合适的表达载体中，以转染到合适的宿主中。然后，将宿主用于重组产生抗体或其变体，如所述单克隆抗体的人源化形式、抗体的活性片段、包括抗体的抗原识别部分的嵌合抗体、或包括可检测部分的形式。

编码单克隆抗体的DNA可以容易地分离，并且使用常规方法测序(例如，通过使用能够特异性地结合到编码鼠抗体的重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)。分离后，可以将DNA置于表达载体中，然后将其转染到宿主细胞中，如大肠杆菌细胞、猿猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或不以其它方式产生免疫球蛋白的骨髓瘤细胞，以获得重组宿主细胞中单克隆抗体的合成。如本说明书中其它地方所述，可以修饰此类DNA序列用于任何大量目的，例如用于人源化抗体、产生片段或衍生物、或用于修饰抗体的序列，例如在抗原结合位点中，以优化抗体的结合特异性。编码抗体的DNA在细菌中的重组表达是本领域熟知的(参见，例如，Skerra等人,《当前免疫学观点(Curr.Opinion in Immunol.)》第5期,第256页(1993)；以及Pluckthun,《免疫学(Immunol.)》第130期,第151页(1992)。

对与ILT2多肽结合的一种或多种抗体的鉴定可以使用多种免疫学筛选测定中的任何一种容易地确定，其中抗体竞争可以被评估。许多此类测定是常规实践的，并且在本领域中是众所周知的(参见，例如，美国专利第5,660,827号，所述专利通过引用并入本文)。应当理解，实际上确定本文所述的抗体结合的表位并不需要以任何方式识别与本文所述的单克隆抗体结合相同或实质上相同的表位的抗体。

交叉阻断测定也可以用于评价测试抗体是否影响HLA I类配体与人ILT2的结合。例如，为了测定抗ILT2抗体制剂是否减少或阻断ILT2与HLA I类分子的相互作用，可以进行以下测试：将剂量范围的抗人ILT2 Fab与固定剂量的人ILT2-Fc在室温下共温育30分钟，然后添加到表达HLA I类配体的细胞系上持续1小时。在染色缓冲液中洗涤细胞两次之后，将在染色缓冲液中稀释的PE偶联的山羊抗小鼠IgG Fc片段二级抗体添加到细胞中，并且将平板在4℃下再温育30分钟。将细胞洗涤两次，并且在配备有HTFC酶标仪的Accury C6流式细胞仪上进行分析。在不存在测试抗体的情况下，ILT2-Fc与细胞结合。在存在与阻断ILT2与HLA I类的结合的ILT2-Fc预先温育的抗体制剂的情况下，ILT2-Fc与细胞的结合降低。

一方面，抗体缺乏与被修饰以缺乏D1结构域的ILT2蛋白的结合。一方面，抗体结合全长野生型ILT2多肽，但缺乏与被修饰以缺乏SEQ ID NO:1的氨基酸序列的残基24到121的区段的ILT2蛋白的结合。另一方面，抗体结合全长野生型ILT2多肽，但与被修饰以缺乏D4结构域的ILT2蛋白的结合降低。一方面，抗体结合全长野生型ILT2多肽，但缺乏与被修饰以缺乏SEQ ID NO:1的氨基酸序列的残基322到458的区段的ILT2蛋白的结合。

可以测量抗ILT2抗体与被转染以表达ILT2突变体的细胞的结合，并且将其与抗ILT2抗体结合表达野生型ILT2多肽(例如，SEQ ID NO:1)的细胞的能力进行比较。抗ILT2抗体与突变体ILT2多肽之间的结合降低意味着结合亲和力降低(例如，如通过已知方法，如对表达特定突变体的细胞进行的FACS测试，或通过对与突变体多肽的结合进行的Biacore

在一些实施例中，结合的显著降低意指相对于抗体与野生型ILT2多肽之间的结合，抗ILT2抗体与突变体ILT2多肽之间的结合亲和力和/或能力降低大于40％、大于50％、大于55％、大于60％、大于65％、大于70％、大于75％、大于80％、大于85％、大于90％或大于95％。在某些实施例中，结合减少到可检测限度以下。在一些实施例中，当抗ILT2抗体与突变体ILT2多肽的结合小于抗ILT2抗体与野生型ILT2多肽之间观察到的结合的50％(例如，小于45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％或10％)时，证明结合显著降低。

一旦获得了具有ILT2所期望的结合的抗原结合化合物，就可以评估其抑制ILT2的能力。例如，如果抗ILT2抗体降低或阻断由HLA配体诱导的ILT2活化(例如，如存在于细胞上)，则其可以增加ILT2限制性淋巴细胞的细胞毒性。这可以通过典型的细胞毒性测定来评估，其实例如下所述。

可以使用例如表达ILT2的NK细胞和表达ILT2的HLA配体的靶细胞，在标准的4小时体外细胞毒性测定中测试抗体减少ILT2介导的信号传导的能力。此类NK细胞不能有效地杀伤表达配体的靶标，因为ILT2识别HLA配体，从而导致引发和传播阻止淋巴细胞介导的细胞溶解的抑制信号传导。可以使用在使用前在37℃下温育过夜的原代NK细胞(例如，从供体中纯化的新鲜NK细胞)进行此类测定。此类体外细胞毒性测定可以通过本领域众所周知的标准方法进行，如例如在Coligan等人编辑的《免疫学实验指南(Current Protocols inImmunology)》，格林出版协会和纽约州威利国际科学(1992，1993)中所述。在添加NK细胞之前，用

抗体的抑制活性(即，提高细胞毒性的潜力)也可以以许多其它方式中的任一种来评估，例如，通过其对细胞内游离钙的作用，如所述，例如，在Sivori等人,《实验医学杂志(J.Exp.Med.)》1997；186:1129-1136中，其公开内容通过引用并入本文，或通过对NK细胞毒性活化的标志物，如脱粒标志物CD107或CD137表达的作用。NK或CD8 T活性也可以使用任何基于细胞的细胞毒性测定进行评估，例如，测量任何其它参数以评估抗体刺激NK细胞杀伤靶细胞(如P815、K562细胞或合适的肿瘤细胞)的能力，如Sivori等人,《实验医学杂志》1997；186:1129-1136；Vitale等人,《实验医学杂志》1998；187:2065-2072；Pessino等人,《实验医学杂志》1998；188:953-960；Neri等人《临床和诊断实验室免疫学(Clin.Diag.Lab.Immun.)》2001；8:1131-1135；Pende等人,《实验医学杂志》1999；190:1505-1516，所述文献中的每一个的全部内容以引用的方式并入本文中。

在一个实施例中，抗体制剂使ILT2限制性淋巴细胞的细胞毒性增加至少10％，优选地使NK细胞毒性增加至少30％、40％或50％，或更优选地使NK细胞毒性增加至少60％70％。

细胞毒性淋巴细胞的活性也可以使用细胞因子释放测定来解决，其中将NK细胞与抗体一起温育，以刺激NK细胞的细胞因子产生(例如IFN-γ和TNF-α产生)。在示例性方案中，培养4天之后，通过细胞表面和胞浆内染色评估从PBMC产生的IFN-γ，并且通过流式细胞术分析。简而言之，以5μg/ml的终浓度添加布雷菲德菌素A(Sigma Aldrich)，持续培养最后4小时。然后在通透化之前，将细胞与抗CD3和抗CD56 mAb一起温育(IntraPrep

可以基于与人ILT2结合而不与例如如在细胞的表面表达的人ILT1、ILT4、ILT5或ILT6蛋白结合来评估和/或选择抗体。一方面，抗体结合存在于在细胞表面表达的人ILT2上的抗原决定簇。在一个实施例中，决定簇不存在于例如如在细胞的表面表达的人ILT6蛋白上；任选地，决定簇不存在于例如如在细胞的表面表达的人ILT1、ILT4、ILT5或ILT6蛋白中的任何一个上。决定簇不存在于可溶性ILT6蛋白上，任选地可溶性ILT-6片段或可溶性ILT-6融合蛋白，如具有通过连接肽与人IgG1 Pro100-Lys330片段(如可从R&D系统公司(R&DSystems,Inc.)获得)融合的表4的氨基酸序列的ILT-6。

在一个实施例中，抗ILT2抗体与ILT-2同种型1、-2、-3、-4、-5和/或-6蛋白中的每一个结合(并中和其抑制活性)。

一方面，提供了一种产生中和ILT2的抑制活性的抗体的方法，所述方法包括：

(a)提供结合ILT2蛋白的多种抗体，

(b)对以下进行评估：(i)所述抗体与选自由人ILT-1、-4、-5和-6多肽组成的组的一种或多种(或所有)ILT蛋白的结合，(ii)所述抗体干扰HLA-G与ILT2之间的相互作用的能力和/或所述抗体中和ILT2多肽的抑制活性的能力，以及(iii)所述抗体增强原代NK细胞对表达ILT-2的配体(例如，HLA-G，任选地进一步地HLA-E)的靶细胞的细胞毒性活性的能力，以及

(c)选择(i)与ILT2多肽结合、(ii)干扰HLA-G与ILT2之间的相互作用和/或中和ILT2多肽的抑制活性并且(iii)增强原代NK细胞对靶细胞的细胞毒性活性的抗体(例如，来自步骤(b)中评估的那些抗体)。任选地，所述方法可以进一步包括评估抗体与ILT2多肽上的位点的结合并且选择与ILT2多肽的结构域1结合的抗体的步骤。在上述产生抗体的方法中的任何一种方法中，所述方法可以进一步包括评估抗体与ILT2多肽上的位点的结合并且选择与ILT2多肽的结构域4结合的抗体的步骤。在上述产生抗体的方法中的任何一种方法中，所述方法可以进一步包括评估抗体与ILT2多肽的结合亲和力并且选择显示出1:1结合拟合和/或解离或脱离速率(kd(1/s))小于约1E-2、任选地小于约小于约1E-3(如在SPR单价结合亲和力测定中测定的)的抗体的步骤。

一方面，提供了一种产生中和ILT2的抑制活性的抗体的方法，所述方法包括：

(a)提供结合ILT2蛋白的多种抗体，

(b)对以下进行评估：(i)所述抗体与选自由人ILT-1、-4、-5和/或-6多肽组成的组的一种或多种(或所有)ILT蛋白的结合，(ii)所述抗体增强原代NK细胞对表达ILT-2的配体(例如，HLA-G，任选地进一步地HLA-E)的靶细胞的细胞毒性活性的能力，以及

(c)选择(i)与ILT2多肽结合而不与人ILT-1、-4、-5和/或-6多肽结合并且(ii)增强原代NK细胞对靶细胞的细胞毒性活性的抗体(例如，来自步骤(b)中评估的那些抗体)。

在一个实例中，抗体筛选可以包括使用突变体ILT2多肽表征和/或定向对抗体的选择。例如，产生或测试结合并中和ILT2的抗体的方法可以包括以下步骤：

(a)提供结合ILT2多肽的多种抗体，

(b)使所述抗体中的每个抗体与在选自由E34、R36、Y76、A82和R84(参考SEQ IDNO:2)组成的组的1个、2个、3个、4个或5个或更多个残基处包括突变的突变体ILT2多肽接触，并且相对于抗体与包括SEQ ID NO:2的氨基酸序列的野生型ILT2多肽之间的结合，评估抗体与突变体ILT2多肽之间的结合，以及

(c)选择其与突变体ILT2多肽的结合相对于抗体与包括SEQ ID NO:2的氨基酸序列的野生型ILT2多肽之间的结合有所降低的抗体(例如，以进行进一步的评价、以进行进一步的加工、产生一定量的抗体、以用于治疗)。所述方法可以任选地进一步包括步骤(d)，其包括评估所述抗体增强NK细胞对表达ILT-2的配体的靶细胞的细胞毒性活性的能力，并且选择增强NK细胞对所述靶细胞的细胞毒性活性的抗体。

在一个实例中，抗体筛选可以包括使用突变体ILT2多肽表征和/或定向对抗体的选择。例如，产生或测试结合并中和ILT2的抗体的方法可以包括以下步骤：

(a)提供结合ILT2多肽的多种抗体，

(b)使所述抗体中的每个抗体与在选自由299、300、301、328、330、347、349、350、355、378和381(参考SEQ ID NO:2)组成的组的1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个或更多个残基处包括突变的突变体ILT2多肽接触，并且相对于抗体与包括SEQ ID NO:2的氨基酸序列的野生型ILT2多肽之间的结合，评估抗体与突变体ILT2多肽之间的结合，以及

(c)选择其与突变体ILT2多肽的结合相对于抗体与包括SEQ ID NO:2的氨基酸序列的野生型ILT2多肽之间的结合有所降低的抗体(例如，以进行进一步的评价、以进行进一步的加工、产生一定量的抗体、以用于治疗)。

所述方法可以任选地进一步包括步骤(d)，其包括评估所述抗体增强NK细胞对表达ILT-2的配体的靶细胞的细胞毒性活性的能力，并且选择增强NK细胞对所述靶细胞的细胞毒性活性的抗体。在一个实施例中，步骤(b)包括使所述抗体中的每个抗体与在选自由299、300、301、328、378和381组成的组的1个、2个、3个、4个、5个或6个残基处包括突变的突变体ILT2多肽接触。在一个实施例中，步骤(b)包括使所述抗体中的每个抗体与在选自由328、330、347、349、350和355组成的组的1个、2个、3个、4个、5个或6个残基处包括突变的突变体ILT2多肽接触。

在上述产生抗体的方法中的任何一种方法中，所述方法可以进一步包括评估抗体与ILT2多肽的结合亲和力并且选择特征在于解离或脱离速率(kd(1/s))小于约1E-2(如通过SPR在结合测定中测定的)的抗体的步骤。然后可以进一步产生所选择的抗体(例如，在重组宿主细胞中)，进一步评价其生物活性(例如，加强免疫细胞、原代NK细胞等的活性的能力)，和/或指定其用于或将其用于治疗疾病(例如，癌症)。

有利地，可以任选地基于与本文中所描述的抗体(例如，12D12、26D8、18E1、2A8A、2A9、2C4、2C8、2D8、2E2B、2E2C、2E8、2E11、2H2A、2H2B、2H12、1A10D、1E4B、3E5、3E7A、3E7B、3E9B、3F5、4C11B、4E3A、4E3B、4H3、5D9、6C6或48F12)中的任何抗体结合ILT2多肽的表面上的相同的区域或表位(例如，表位或结合区域定向筛选)来鉴定和选择抗体。一方面，所述抗体与抗体12D12、26D8、18E1、2A8A、2A9、2C4、2C8、2D8、2E2B、2E2C、2E8、2E11、2H2A、2H2B、2H12、1A10D、1E4B、3E5、3E7A、3E7B、3E9B、3F5、4C11B、4E3A、4E3B、4H3、5D9、6C6或48F12中的任何抗体基本上结合相同的表位。在一个实施例中，所述抗体与至少部分地与由抗体12D12、26D8、18E1、2A8A、2A9、2C4、2C8、2D8、2E2B、2E2C、2E8、2E11、2H2A、2H2B、2H12、1A10D、1E4B、3E5、3E7A、3E7B、3E9B、3F5、4C11B、4E3A、4E3B、4H3、5D9、6C6或48F12结合的表位重叠或在所述表位中包含至少一个残基的ILT2的表位结合。由抗体结合的残基可以被指定为存在于ILT2多肽的表面上(例如，于在细胞的表面上表达的ILT2多肽上)。

抗ILT2抗体与ILT2上的位点的结合可以通过测量抗ILT2抗体与用ILT2突变体转染的细胞的结合来评估，如与抗ILT2抗体结合野生型ILT2多肽(例如，SEQ ID NO:1)的能力相比。抗ILT2抗体与突变体ILT2多肽(例如，表6的突变体)之间的结合降低意味着结合亲和力降低(例如，如通过已知方法，如对表达特定突变体的细胞进行的FACS测试，或通过对与突变体多肽的结合进行的Biacore测试)和/或抗ILT2抗体的总结合能力的降低(例如，如通过抗ILT2抗体浓度对多肽浓度的图中Bmax的降低所证明的)。结合的显著降低指示，当抗ILT2抗体与ILT2结合时，突变残基直接参与与抗ILT2抗体的结合或与结合蛋白紧密接近。

在一些实施例中，结合的显著降低意指相对于抗体与野生型ILT2多肽之间的结合，抗ILT2抗体与突变体ILT2多肽之间的结合亲和力和/或能力降低大于40％、大于50％、大于55％、大于60％、大于65％、大于70％、大于75％、大于80％、大于85％、大于90％或大于95％。在某些实施例中，结合减少到可检测限度以下。在一些实施例中，当抗ILT2抗体与突变体ILT2多肽的结合小于抗ILT2抗体与野生型ILT2多肽之间观察到的结合的50％(例如，小于45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％或10％)时，证明结合显著降低。

在一些实施例中，提供了对突变体ILT2多肽表现出显著较低的结合的抗ILT2抗体，在所述突变体ILT2多肽中，相较于与不包括一个或多个此类取代的野生型ILT2多肽(例如，SEQ ID NO:1的多肽)的结合，包括由抗体12D12、26D8、18E1、2A8A、2A9、2C4、2C8、2D8、2E2B、2E2C、2E8、2E11、2H2A、2H2B、2H12、1A10D、1E4B、3E5、3E7A、3E7B、3E9B、3F5、4C11B、4E3A、4E3B、4H3、5D9、6C6或48F12结合的氨基酸残基的区段中的残基被不同的氨基酸取代。

在一些实施例中，提供了结合由抗体12D12、26D8或18E1结合的ILT2上的表位的抗ILT2抗体(例如，除12D12、26D8或18E1之外)。

在本文中的任何实施例中，抗体可以被表征为除GHI/75、292319、HP-F1、586326和292305之外的抗体(或共享其CDR的抗体)。

一方面，抗ILT2抗体结合位于人ILT2蛋白的D1结构域(结构域1)上或内的表位。一方面，抗ILT2抗体与抗体12D12竞争与人ILT2蛋白的D1结构域(结构域1)上的表位结合。

D1结构域可以被定义为对应的或具有如下氨基酸序列：

GHLPKPTLWAEPGSVITQGSPVTLRCQGGQETQEYRLYREKKTALWITRIPQELVKKGQFPIPSITWEHAGRYRCYYGSDTAGRSESSDPLELVVTGA(SEQ ID NO:55)。

一方面，抗ILT2抗体与在选自由以下组成的组的残基处具有突变的ILT2多肽的结合降低(任选地，丧失与其的结合)：E34、R36、Y76、A82和R84(参考SEQ ID NO:2)；任选地，突变体ILT2多肽具有突变：E34A、R36A、Y76I、A82S、R84L。在一个实施例中，此外，抗体与在选自由G29、Q30、Q33、T32和D80(参考SEQ ID NO:2)组成的组的一个或多个(或所有)残基处包括突变的突变体ILT2多肽的结合降低，任选地，所述突变体ILT2多肽具有突变：G29S、Q30L、Q33A、T32A、D80H。一方面，抗ILT2抗体与具有以下突变的ILT2多肽的结合降低(任选地，丧失与其的结合)：G29S、Q30L、Q33A、T32A、E34A、R36A、Y76I、A82S、D80H和R84L。在每种情况下，结合的降低或丧失可以被指定为相对于抗体与包括SEQ ID NO:2的氨基酸序列的野生型ILT2多肽之间的结合。

一方面，抗ILT2抗体结合包括选自由E34、R36、Y76、A82和R84(参考SEQ ID NO:2)组成的组的氨基酸残基(例如，残基中的一个、两个、三个、四个或五个残基)的ILT2上的表位。一方面，抗ILT2抗体结合包括选自由G29、Q30、Q33、T32和D80(参考SEQ ID NO:2)组成的组的氨基酸残基(例如，残基中的一个、两个、三个、四个或五个残基)的ILT2上的表位。一方面，抗ILT2抗体结合包括(i)选自由E34、R36、Y76、A82和R84组成的组的氨基酸残基(例如，残基中的一个、两个、三个、四个或五个残基)以及(ii)选自由G29、Q30、Q33、T32和D80组成的组的氨基酸残基(例如，残基中的一个、两个、三个、四个或五个残基)的ILT2上的表位。一方面，抗ILT2抗体结合包括选自由G29、Q30、Q33、T32、E34、R36、Y76、A82、D80和R84组成的组的氨基酸残基(例如，残基中的一个、两个、三个、四个或五个残基)的ILT2上的表位。

一方面，抗ILT2抗体结合位于人ILT2蛋白的D4结构域(结构域4)上或内的表位。一方面，抗ILT2抗体与抗体26D8和/或18E1竞争与人ILT2蛋白的D4结构域(结构域4)上的表位结合。

D4结构域可以被定义为对应的或具有如下氨基酸序列：

FYDRVSLSVQPGPTVASGENVTLLCQSQGWMQTFLLTKEGAADDPWRLRSTYQSQKYQAE

FPMGPVTSAHAGTYRCYGSQSSKPYLLTHPSDPLELVVSGPSGGPSSPTTGPTSTSGPEDQPLTPTGSDPQSGLGRH(SEQ ID NO:56)。

一方面，抗ILT2抗体与在选自由以下组成的组的残基处具有突变的ILT2多肽的结合降低(任选地，丧失与其的结合)：F299、Y300、D301、W328、Q378和K381(参考SEQ ID NO:2)；任选地，突变体ILT2多肽具有突变：F299I、Y300R、D301A、W328G、Q378A、K381N。在一个实施例中，此外，抗体与在选自由W328、Q330、R347、T349、Y350和Y355(参考SEQ ID NO:2)组成的组的一个或多个(或所有)残基处包括突变的突变体ILT2多肽的结合降低，任选地，所述突变体ILT2多肽具有突变：W328G、Q330H、R347A、T349A、Y350S、Y355A。在一个实施例中，此外，抗体与在选自由D341、D342、W344、R345和R347(参考SEQ ID NO:2)组成的组的一个或多个(或所有)残基处包括突变的突变体ILT2多肽的结合降低，任选地，所述突变体ILT2多肽具有突变：D341A、D342S、W344L、R345A、R347A。在一个实施例中，抗体与具有以下突变的突变体ILT2多肽的结合降低：F299I、Y300R、D301A、W328G、Q330H、R347A、T349A、Y350S、Y355A、Q378A和K381N。在一个实施例中，抗体与具有以下突变的突变体ILT2多肽的结合降低：F299I、Y300R、D301A、W328G、D341、D342、W344、R345、R347、Q378A和K381N。在一个实施例中，抗体与具有以下突变的突变体ILT2多肽的结合降低：F299I、Y300R、D301A、W328G、Q330H、D341A、D342S、W344L、R345A、R347A、T349A、Y350S、Y355A、Q378A和K381N。在每种情况下，结合的降低或丧失可以被指定为相对于抗体与包括SEQ ID NO:2的氨基酸序列的野生型ILT2多肽之间的结合。

一方面，抗ILT2抗体结合包括选自由F299、Y300、D301、W328、Q378和K381(参考SEQID NO:2)组成的组的氨基酸残基(例如，残基中的一个、两个、三个、四个或五个残基)的ILT2上的表位。一方面，抗ILT2抗体结合包括选自由W328、Q330、R347、T349、Y350和Y355(参考SEQ ID NO:2)组成的组的氨基酸残基(例如，残基中的一个、两个、三个、四个或五个残基)的ILT2上的表位。一方面，抗ILT2抗体结合包括选自由D341、D342、W344、R345和R347(参考SEQ ID NO:2)组成的组的氨基酸残基(例如，残基中的一个、两个、三个、四个或五个残基)的ILT2上的表位。

一方面，抗ILT2抗体结合包括选自由F299、Y300、D301、W328、Q330、D341、D342、W344、R345、R347、T349、Y350、Y355、Q378和K381组成的组的氨基酸残基(例如，残基中的一个、两个、三个、四个或五个残基)的ILT2上的表位。

一方面，抗ILT2抗体结合包括(i)选自由F299、Y300、D301、W328、Q378和K381组成的组的氨基酸残基(例如，残基中的一个、两个、三个、四个或五个残基)以及(ii)选自由Q330、R347、T349、Y350和Y355组成的组的氨基酸残基(例如，残基中的一个、两个、三个、四个或五个残基)的ILT2上的表位。一方面，抗ILT2抗体结合包括(i)选自由F299、Y300、D301、W328、Q378和K381组成的组的氨基酸残基(例如，残基中的一个、两个、三个、四个或五个残基)，(ii)选自由Q330、R347、T349、Y350和Y355组成的组的氨基酸残基(例如，残基中的一个、两个、三个、四个或五个残基)以及(iii)选自由D341、D342、W344、R345和R347组成的组的氨基酸残基(例如，残基中的一个、两个、三个、四个或五个残基)的ILT2上的表位。

抗体26D8的重链可变区的氨基酸序列被列出为SEQ ID NO:12(另请参见表A)，轻链可变区的氨基酸序列被列出为SEQ ID NO:13(另请参见表A)。在具体实施例中，提供了与单克隆抗体26D8结合基本上相同的表位或决定簇的抗体；任选地，所述抗体包括抗体26D8的高变区。在本文中的实施例的任何实施例中，抗体26D8的特征可以在于氨基酸序列和/或对其进行编码的核酸序列。在一个实施例中，所述单克隆抗体包括26D8的Fab或F(ab')

另一方面，提供了一种抗体，其中所述抗体或抗体片段包括：26D8的HCDR1区，其包括氨基酸序列EHTIH(SEQ ID NO:14)或其至少3个、4个或5个连续氨基酸的序列，任选地其中这些氨基酸中的一个或多个氨基酸可以被不同的氨基酸取代；26D8的HCDR2区，其包括氨基酸序列WFYPGSGSMKYNEKFKD(SEQ ID NO:15)或其至少4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个连续氨基酸的序列，任选地其中这些氨基酸中的一个或多个氨基酸可以被不同的氨基酸取代；26D8的HCDR3区，其包括氨基酸序列HTNWDFDY(SEQ ID NO:16)或其至少4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个连续氨基酸的序列，任选地其中这些氨基酸中的一个或多个氨基酸可以被不同的氨基酸取代；26D8的LCDR1区，其包括氨基酸序列KASQSVDYGGDSYMN(SEQ ID NO:17)或其至少4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个连续氨基酸的序列，任选地其中这些氨基酸中的一个或多个氨基酸可以被不同的氨基酸取代；26D8的LCDR2区，其包括氨基酸序列AASNLES(SEQ ID NO:18)或其至少4个、5个或6个连续氨基酸的序列，任选地其中这些氨基酸中的一个或多个氨基酸可以被不同的氨基酸取代；26D8的LCDR3区，其包括氨基酸序列QQSNEEPWT(SEQ ID NO:19)或其至少4个、5个、6个、7个或8个连续氨基酸的序列，任选地其中这些氨基酸中的一个或多个氨基酸可以缺失或被不同的氨基酸取代。

抗体18E1的重链可变区的氨基酸序列被列出为SEQ ID NO:20(另请参见表A)，轻链可变区的氨基酸序列被列出为SEQ ID NO:21(另请参见表A)。在具体实施例中，提供了与单克隆抗体18E1结合基本上相同的表位或决定簇的抗体；任选地，所述抗体包括抗体18E1的高变区。在本文中的实施例的任何实施例中，抗体18E1的特征可以在于氨基酸序列和/或对其进行编码的核酸序列。在一个实施例中，所述单克隆抗体包括18E1的Fab或F(ab')

另一方面，提供了一种抗体，其中所述抗体或抗体片段包括：18E1的HCDR1区，其包括氨基酸序列AHTIH(SEQ ID NO:22)或其至少3个或4个连续氨基酸的序列，任选地其中这些氨基酸中的一个或多个氨基酸可以被不同的氨基酸取代；18E1的HCDR2区，其包括氨基酸序列WLYPGSGSIKYNEKFKD(SEQ ID NO:23)或其至少4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个连续氨基酸的序列，任选地其中这些氨基酸中的一个或多个氨基酸可以被不同的氨基酸取代；18E1的HCDR3区，其包括氨基酸序列HTNWDFDY(SEQ ID NO:24)或其至少4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个连续氨基酸的序列，任选地其中这些氨基酸中的一个或多个氨基酸可以被不同的氨基酸取代；18E1的LCDR1区，其包括氨基酸序列KASQSVDYGGASYMN(SEQ ID NO:25)或其至少4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个连续氨基酸的序列，任选地其中这些氨基酸中的一个或多个氨基酸可以被不同的氨基酸取代；18E1的LCDR2区，其包括氨基酸序列AASNLES(SEQ ID NO:26)或其至少4个、5个或6个10个连续氨基酸的序列，任选地其中这些氨基酸中的一个或多个氨基酸可以被不同的氨基酸取代；18E1的LCDR3区，其包括氨基酸序列QQSNEEPWT(SEQ ID NO:27)或其至少4个、5个、6个或7个连续氨基酸的序列，任选地其中这些氨基酸中的一个或多个氨基酸可以缺失或被不同的氨基酸取代。

抗体12D12的重链可变区的氨基酸序列被列出为SEQ ID NO:28(另请参见表A)，轻链可变区的氨基酸序列被列出为SEQ ID NO:29(另请参见表A)。在具体实施例中，提供了与单克隆抗体12D12结合基本上相同的表位或决定簇的抗体；任选地，所述抗体包括抗体12D12的高变区。在本文中的实施例的任何实施例中，抗体12D12的特征可以在于氨基酸序列和/或对其进行编码的核酸序列。在一个实施例中，所述单克隆抗体包括12D12的Fab或F(ab')

另一方面，提供了一种抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段包括：12D12的HCDR1区，其包括氨基酸序列SYWVH(SEQ ID NO:30)或其至少3个或4个连续氨基酸的序列，任选地其中这些氨基酸中的一个或多个氨基酸可以被不同的氨基酸取代；12D12的HCDR2区，其包括氨基酸序列VIDPSDSYTSYNQNFKG(SEQ ID NO:31)或其至少4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个连续氨基酸的序列，任选地其中这些氨基酸中的一个或多个氨基酸可以被不同的氨基酸取代；12D12的HCDR3区，其包括氨基酸序列GERYDGDYFAMDY(SEQ ID NO:32)或其至少4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个连续氨基酸的序列，任选地其中这些氨基酸中的一个或多个氨基酸可以被不同的氨基酸取代；12D12的LCDR1区，其包括氨基酸序列RASENIYSNLA(SEQ ID NO:33)或其至少4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个连续氨基酸的序列，任选地其中这些氨基酸中的一个或多个氨基酸可以被不同的氨基酸取代；12D12的LCDR2区，其包括氨基酸序列AATNLAD(SEQ ID NO:34)或其至少4个、5个或6个连续氨基酸的序列，任选地其中这些氨基酸中的一个或多个氨基酸可以被不同的氨基酸取代；12D12的LCDR3区，其包括氨基酸序列QHFWNTPRT(SEQ ID NO:35)或其至少4个、5个、6个或7个连续氨基酸的序列，任选地其中这些氨基酸中的一个或多个氨基酸可以缺失或被不同的氨基酸取代。

相应的VH和VL以及抗体3H5、27C10和27H5分别示出于SEQ ID NO:36-37、38-39和40-41中。任选地，抗体的HCDR1、2、3和LCDR1、2、3序列可以被指定为所有(或各自独立地)是Kabat编号系统的序列、Chotia编号的序列、IMGT编号或任何其它适合的编号系统的序列。

在本文中的实施例中的任何实施例的另一方面，重链CDR(例如，CDR1、2和/或3)的特征可以在于由鼠类IGHV1(例如，IGHV1-66或IGHV1-66*01，或IGHV1-84或IGHV1-84*01)基因或者由大鼠、非人灵长类动物或对应于其或与其至少80％、90％、95％、98％或99％相同的人基因来进行编码或衍生自所述基因。在本文中的实施例中的任何实施例的另一方面，轻链CDR(例如，CDR1、2和/或3)的特征可以在于由鼠类IGKV3基因(例如，IGKV3-4或IGKV3-4*01，或IGKV3-5或IGKV3-5*01基因)或者由大鼠、非人灵长类动物或对应于其或与其至少80％、90％、95％、98％或99％相同的人基因来进行编码或衍生自所述基因。

在本文中的实施例中的任何实施例的另一方面，重链CDR(例如，CDR1、2和/或3)的特征可以在于由鼠类IGHV2(例如，IGHV1-3或IGHV1-3*01)基因或者由大鼠、非人灵长类动物或对应于其或与其至少80％、90％、95％、98％或99％相同的人基因来进行编码或衍生自所述基因。在本文中的实施例中的任何实施例的另一方面，轻链CDR(例如，CDR1、2和/或3)的特征可以在于由鼠类IGKV10基因(例如，IGKV10-96或IGK10-96*02)或者由大鼠、非人灵长类动物或对应于其或与其至少80％、90％、95％、98％或99％相同的人基因来进行编码或衍生自所述基因。

在本文中的实施例中的任何实施例的另一方面，重链CDR(例如，CDR1、2和/或3)的特征可以在于由鼠类IGHV1或IGHV1-84基因(例如，IGHV1-84*01)基因来进行编码。在本文中的实施例中的任何实施例的另一方面，轻链CDR(例如，CDR1、2和/或3)的特征可以在于由鼠类IGKV3或IGKV3-5基因(例如，IGKV3-5*01)来进行编码。

在本文中的实施例中的任何实施例的另一方面，12D12、26D8、18E1、2A8A、2A9、2C4、2C8、2D8、2E2B、2E2C、2E8、2E11、2H2A、2H2B、2H12、1A10D、1E4B、3E5、3E7A、3E7B、3E9B、3F5、4C11B、4E3A、4E3B、4H3、5D9、6C6或48F12的重链和轻链的CDR1、2和3中的任一个的特征可以在于其至少4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个连续氨基酸的序列，和/或被表征为具有与特定CDR或对应SEQ ID NO中列出的CDR集共有至少50％、60％、70％、80％、85％、90％或95％序列同一性的氨基酸序列。

任选地，在任何实施例中，12D12、26D8、18E1、2A8A、2A9、2C4、2C8、2D8、2E2B、2E2C、2E8、2E11、2H2A、2H2B、2H12、1A10D、1E4B、3E5、3E7A、3E7B、3E9B、3F5、4C11B、4E3A、4E3B、4H3、5D9、6C6或48F12抗体可以被指定为具有与人IgG型(任选地，人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4同种型)的免疫球蛋白重链恒定区融合的包括相应抗体的抗原结合区的一部分或全部的重链(例如，重链CDR1、2和3)，任选地所述重链进一步包括氨基酸取代以降低效应功能(与人Fcγ受体的结合)。任选地，在任何实施例中，12D12、26D8、18E1、2A8A、2A9、2C4、2C8、2D8、2E2B、2E2C、2E8、2E11、2H2A、2H2B、2H12、1A10D、1E4B、3E5、3E7A、3E7B、3E9B、3F5、4C11B、4E3A、4E3B、4H3、5D9、6C6或48F12抗体可以被指定为具有与人κ型的免疫球蛋白轻链恒定区融合的包括相应抗体的抗原结合区的一部分或全部的轻链(例如，轻链CDR1、2和3)。

抗体2A8A、2A9、2C4、2C8、2D8、2E2B、2E2C、2E8、2E11、2H2A、2H2B、2H12、1A10D、1E4B、3E5、3E7A、3E7B、3E9B、3F5、4C11B、4E3A、4E3B、4H3、5D9、6C6和48F12的相应的重链和轻链可变区的氨基酸序列列出于表A中。在具体实施例中，提供了一种抗体，其与单克隆抗体2A8A、2A9、2C4、2C8、2D8、2E2B、2E2C、2E8、2E11、2H2A、2H2B、2H12、1A10D、1E4B、3E5、3E7A、3E7B、3E9B、3F5、4C11B、4E3A、4E3B、4H3、5D9、6C6或48F12结合基本上相同的表位或决定簇；任选地，所述抗体包括抗体2A8A、2A9、2C4、2C8、2D8、2E2B、2E2C、2E8、2E11、2H2A、2H2B、2H12、1A10D、1E4B、3E5、3E7A、3E7B、3E9B、3F5、4C11B、4E3A、4E3B、4H3、5D9、6C6或48F12的高变区。在本文中的实施例的任何实施例中，抗体26D8的特征可以在于氨基酸序列和/或对其进行编码的核酸序列。在一个实施例中，所述单克隆抗体包括2A8A、2A9、2C4、2C8、2D8、2E2B、2E2C、2E8、2E11、2H2A、2H2B、2H12、1A10D、1E4B、3E5、3E7A、3E7B、3E9B、3F5、4C11B、4E3A、4E3B、4H3、5D9、6C6或48F12的Fab或F(ab')

另一方面，提供了一种包括以下的抗体或抗体片段(或其相应的VH或VL结构域)：

2H2B的HCDR1区(Kabat位置31-35)，其包括氨基酸序列NYYMQ(SEQ ID NO:139)或其至少3个、4个或5个连续氨基酸的序列，任选地其中这些氨基酸中的一个或多个氨基酸可以被不同的氨基酸取代，任选地其中所述HCDR1(或VH)在Kabat位置32、33、34和/或35处包括氨基酸取代，任选地其中所述HCDR1(或VH)在Kabat位置32、33、34和/或35处包括至少两个芳香族残基(例如，Y、H或F)，任选地其中所述HCDR1(或VH)在Kabat位置32处包括芳香族残基和/或在35处包括芳香族残基N或Q；

2H2B的HCDR2区(Kabat位置50-65)，其包括氨基酸序列WIFPGSGESSYNEKFKG(SEQID NO:140)或WIFPGSGESNYNEKFKG(SEQ ID NO:161)或其至少4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个连续氨基酸的序列，任选地其中这些氨基酸中的一个或多个氨基酸可以被不同的氨基酸取代，任选地其中这些氨基酸中的一个或多个氨基酸可以被不同的氨基酸取代，任选地其中所述HCDR2(或VH)在Kabat位置52A、54、55、56、57、58、60和/或65处包括氨基酸取代，任选地其中52A处的残基是P或L，任选地其中54处的残基是G、S、N或T，任选地其中55处的残基是G、N或Y，任选地其中56处的残基是E或D，任选地其中57处的残基是S或T，任选地其中58处的残基是S、K或N，任选地其中60处的残基是N或S，任选地其中65处的残基是G或V；

2H2B的HCDR3区(Kabat位置95-102)，其包括氨基酸序列TWNYDARWGY(SEQ ID NO:141)或其至少4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个连续氨基酸的序列，任选地其中这些氨基酸中的一个或多个氨基酸可以被不同的氨基酸取代，任选地其中所述HCDR3(或VH)在Kabat位置95处包括氨基酸取代，任选地其中95处的残基是T或S，任选地其中所述HCDR3(或VH)在Kabat位置101处包括氨基酸取代，任选地其中101处的残基是G或V；

2H2B的Kabat LCDR1区(Kabat位置34-34)，其包括氨基酸序列IPSESIDSYGISFMH(SEQ ID NO:142)或其至少4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个连续氨基酸的序列，任选地其中这些氨基酸中的一个或多个氨基酸可以被不同的氨基酸取代，任选地其中所述LCDR1(或VL)在Kabat位置24、25、26、27、27A、28、33和/或34处包括氨基酸取代，任选地其中24处的残基是I或R，任选地其中25处的残基是A、P或V，任选地其中26处的残基是S或N，任选地其中27处的残基是E或D，任选地其中27A处的残基是S、G、T、I或N，任选地其中28处的残基是Y或F，任选地其中33处的残基是M、I或L，任选地其中34处的残基是H或S，任选地其中LCDR1(或VL)在Kabat位置29、30、31和/或32处包括氨基酸缺失；

2H2B的Kabat LCDR2区(Kabat位置50-56)，其包括氨基酸序列RASNLES(SEQ IDNO:143)或其至少4个、5个或6个连续氨基酸的序列，任选地其中这些氨基酸中的一个或多个氨基酸可以被不同的氨基酸取代，任选地其中这些氨基酸中的一个或多个氨基酸可以被不同的氨基酸取代，任选地其中所述LCDR2(或VL)在Kabat位置50、53和/或55处包括氨基酸取代，任选地其中50处的残基是R或G，任选地其中53处的残基是N、T或I，任选地其中54处的残基是D、E或V；

2H2B的LCDR3区(Kabat位置89-97)，其包括氨基酸序列QQSNEDPFT(SEQ ID NO:144)或其至少4个、5个、6个、7个或8个连续氨基酸的序列，任选地其中这些氨基酸中的一个或多个氨基酸可以缺失或被不同的氨基酸取代，任选地其中所述LCDR3(或VL)在Kabat位置91、94和/或96处包括氨基酸取代，任选地其中91处的残基是S或T，任选地其中94处的残基是D或A，任选地其中96处的残基是F或。

另一方面，提供了一种包括以下的抗体或抗体片段：2A8A的HCDR1区，其包括氨基酸序列NFYIH(SEQ ID NO:145)；2A8A的HCDR2区，其包括氨基酸序列WIFPGSGETKFNEKFKV(SEQ ID NO:146)；2A8A的HCDR3区，其包括氨基酸序列SWNYDARWGY(SEQ ID NO:147)；2A8A的LCDR1区，其包括氨基酸序列RASESIDSYGISFLH(SEQ ID NO:148)；2A8A的LCDR2区，其包括氨基酸序列RASNLES(SEQ ID NO:149)；2A8A的LCDR3区，其包括氨基酸序列QQSNEDPFT(SEQID NO:150)。任选地，任何CDR序列可以被表征为所列出的序列的至少4个、5个、6个或7个连续氨基酸的序列，任选地其中这些氨基酸中的一个或多个氨基酸可以缺失或被不同的氨基酸取代。

另一方面，提供了一种包括以下的抗体或抗体片段：2C4的HCDR1区，其包括氨基酸序列NYYVQ(SEQ ID NO:151)；2C4的HCDR2区，其包括氨基酸序列WIFPGSGETNYNEKFKA(SEQID NO:152)；2C4的HCDR3区，其包括氨基酸序列TWNYDARWGY(SEQ ID NO:141)；2C4的LCDR1区，其包括氨基酸序列RPSENIDSYGISFMH(SEQ ID NO:181)；2C4的LCDR2区，其包括氨基酸序列RASNLES(SEQ ID NO:149)；2C4的LCDR3区，其包括氨基酸序列QQTNEDPFT(SEQ ID NO:153)。任选地，任何CDR序列可以被表征为所列出的序列的至少4个、5个、6个或7个连续氨基酸的序列，任选地其中这些氨基酸中的一个或多个氨基酸可以缺失或被不同的氨基酸取代。

另一方面，提供了一种包括以下的抗体或抗体片段：2E2B的HCDR1区，其包括氨基酸序列NYYMQ(SEQ ID NO:154)；2E2B的HCDR2区，其包括氨基酸序列WIFPGGGESNYNEKFKG(SEQ ID NO:155)；2E2B的HCDR3区，其包括氨基酸序列TWNYDARWGY(SEQ ID NO:141)；2E2B的LCDR1区，其包括氨基酸序列IPSESIDSYGISFMH(SEQ ID NO:156)；2E2B的LCDR2区，其包括氨基酸序列RASNLES(SEQ ID NO:149)；2E2B的LCDR3区，其包括氨基酸序列QQSNEDPFT(SEQID NO:150)。任选地，任何CDR序列可以被表征为所列出的序列的至少4个、5个、6个或7个连续氨基酸的序列，任选地其中这些氨基酸中的一个或多个氨基酸可以缺失或被不同的氨基酸取代。

另一方面，提供了一种包括以下的抗体或抗体片段：2C8的HCDR1区，其包括氨基酸序列NYYIQ(SEQ ID NO:157)；2C8的HCDR2区，其包括氨基酸序列WIFPGNGETNYNEKFKG(SEQID NO:158)；2C8的HCDR3区，其包括氨基酸序列TWNYDARWGY(SEQ ID NO:141)；2C8的LCDR1区，其包括氨基酸序列RANESIDSYGISFMH(SEQ ID NO:159)；2C8的LCDR2区，其包括氨基酸序列RASNLDS(SEQ ID NO:160)；2C8的LCDR3区，其包括氨基酸序列QQSNEDPFT(SEQ ID NO:150)。任选地，任何CDR序列可以被表征为所列出的序列的至少4个、5个、6个或7个连续氨基酸的序列，任选地其中这些氨基酸中的一个或多个氨基酸可以缺失或被不同的氨基酸取代。

另一方面，提供了一种包括以下的抗体或抗体片段：2E2C的HCDR1区，其包括氨基酸序列NYYMQ(SEQ ID NO:154)；2E2C的HCDR2区，其包括氨基酸序列WIFPGSGESNYNEKFKG(SEQ ID NO:161)；2E2C的HCDR3区，其包括氨基酸序列TWNYDARWGY(SEQ ID NO:141)；2E2C的LCDR1区，其包括氨基酸序列IPSESIDSYGISFMH(SEQ ID NO:162)；2E2C的LCDR2区，其包括氨基酸序列RASNLES(SEQ ID NO:149)；2E2C的LCDR3区，其包括氨基酸序列QQSNEDPFT(SEQID NO:150)。任选地，任何CDR序列可以被表征为所列出的序列的至少4个、5个、6个或7个连续氨基酸的序列，任选地其中这些氨基酸中的一个或多个氨基酸可以缺失或被不同的氨基酸取代。

另一方面，提供了一种包括以下的抗体或抗体片段：2A9的HCDR1区，其包括氨基酸序列NYYIH(SEQ ID NO:163)；2A9的HCDR2区，其包括氨基酸序列WIFPGSGETNYNEKFKV(SEQID NO:164)；2A9的HCDR3区，其包括氨基酸序列TWNYDARWGY(SEQ ID NO:141)；2A9的LCDR1区，其包括氨基酸序列RASESIDSYGISFMH(SEQ ID NO:165)；2A9的LCDR2区，其包括氨基酸序列RASNLES(SEQ ID NO:149)；2A9的LCDR3区，其包括氨基酸序列QQSNEDPFT(SEQ ID NO:150)。任选地，任何CDR序列可以被表征为所列出的序列的至少4个、5个、6个或7个连续氨基酸的序列，任选地其中这些氨基酸中的一个或多个氨基酸可以缺失或被不同的氨基酸取代。

另一方面，提供了一种包括以下的抗体或抗体片段：2E11的HCDR1区，其包括氨基酸序列NYYIH(SEQ ID NO:163)；2E11的HCDR2区，其包括氨基酸序列WIFPGSGDTNYNEKFKG(SEQ ID NO:166)；2E11的HCDR3区，其包括氨基酸序列TWNYDARWGY(SEQ ID NO:141)；2E11的LCDR1区，其包括氨基酸序列RVSESIDSYGISFMH(SEQ ID NO:167)；2E11的LCDR2区，其包括氨基酸序列RASTLES(SEQ ID NO:168)；2E11的LCDR3区，其包括氨基酸序列QQSNEDPFT(SEQID NO:150)。任选地，任何CDR序列可以被表征为所列出的序列的至少4个、5个、6个或7个连续氨基酸的序列，任选地其中这些氨基酸中的一个或多个氨基酸可以缺失或被不同的氨基酸取代。

另一方面，提供了一种包括以下的抗体或抗体片段：2E8的HCDR1区，其包括氨基酸序列NFYIH(SEQ ID NO:145)；2E8的HCDR2区，其包括氨基酸序列WIFPGNGETNYSEKFKG(SEQID NO:169)；2E8的HCDR3区，其包括氨基酸序列TWNYDARWVY(SEQ ID NO:170)；2E8的LCDR1区，其包括氨基酸序列RASDGIDSYGISFMH(SEQ ID NO:171)；2E8的LCDR2区，其包括氨基酸序列RASILES(SEQ ID NO:172)；2E8的LCDR3区，其包括氨基酸序列QQTNEDPFT(SEQ ID NO:153)。任选地，任何CDR序列可以被表征为所列出的序列的至少4个、5个、6个或7个连续氨基酸的序列，任选地其中这些氨基酸中的一个或多个氨基酸可以缺失或被不同的氨基酸取代。

另一方面，提供了一种包括以下的抗体或抗体片段：2H12的HCDR1区，其包括氨基酸序列NFYIH(SEQ ID NO:145)；2H12的HCDR2区，其包括氨基酸序列WIFPGNGETNYSEKFKG(SEQ ID NO:173)；2H12的HCDR3区，其包括氨基酸序列TWNYDARWGY(SEQ ID NO:141)；2H12的LCDR1区，其包括氨基酸序列RASDGIDSYGISFMH(SEQ ID NO:174)；2H12的LCDR2区，其包括氨基酸序列RASTLES(SEQ ID NO:168)；2H12的LCDR3区，其包括氨基酸序列QQTNEAPFT(SEQID NO:175)。任选地，任何CDR序列可以被表征为所列出的序列的至少4个、5个、6个或7个连续氨基酸的序列，任选地其中这些氨基酸中的一个或多个氨基酸可以缺失或被不同的氨基酸取代。

另一方面，提供了一种包括以下的抗体或抗体片段：1E4B的HCDR1区，其包括氨基酸序列NYYIN(SEQ ID NO:176)；1E4B的HCDR2区，其包括氨基酸序列WIFPGNGDTNYNEKFKG(SEQ ID NO:177)；1E4B的HCDR3区，其包括氨基酸序列TWNYDARWGY(SEQ ID NO:141)；1E4B的LCDR1区，其包括氨基酸序列RASESIDSYMS(SEQ ID NO:178)；1E4B的LCDR2区，其包括氨基酸序列GASNLES(SEQ ID NO:179)；1E4B的LCDR3区，其包括氨基酸序列QQSNEDPWT(SEQ IDNO:180)。任选地，任何CDR序列可以被表征为所列出的序列的至少4个、5个、6个或7个连续氨基酸的序列，任选地其中这些氨基酸中的一个或多个氨基酸可以缺失或被不同的氨基酸取代。

另一方面，提供了一种包括以下的抗体或抗体片段：3E5的HCDR1区，其包括氨基酸序列NFYIH(SEQ ID NO:145)；3E5的HCDR2区，其包括氨基酸序列WIFPGTGETNFNEKFKV(SEQID NO:182)；3E5的HCDR3区，其包括氨基酸序列SWNYDARWGY(SEQ ID NO:183)；3E5的LCDR1区，其包括氨基酸序列RASESIDSFGISFMH(SEQ ID NO:184)；3E5的LCDR2区，其包括氨基酸序列RASNLES(SEQ ID NO:149)；3E5的LCDR3区，其包括氨基酸序列QQSNEAPFT(SEQ ID NO:185)。任选地，任何CDR序列可以被表征为所列出的序列的至少4个、5个、6个或7个连续氨基酸的序列，任选地其中这些氨基酸中的一个或多个氨基酸可以缺失或被不同的氨基酸取代。

另一方面，提供了一种包括以下的抗体或抗体片段：3E7A的HCDR1区，其包括氨基酸序列NYYIH(SEQ ID NO:163)；3E7A的HCDR2区，其包括氨基酸序列WIFPGSGETNFNEKFKG(SEQ ID NO:186)；3E7A的HCDR3区，其包括氨基酸序列TWNYDARWGY(SEQ ID NO:141)；3E7A的LCDR1区，其包括氨基酸序列RASESIDSYGISFMH(SEQ ID NO:187)；3E7A的LCDR2区，其包括氨基酸序列RASNLES(SEQ ID NO:149)；3E7A的LCDR3区，其包括氨基酸序列QQSNEDPFT(SEQID NO:150)。任选地，任何CDR序列可以被表征为所列出的序列的至少4个、5个、6个或7个连续氨基酸的序列，任选地其中这些氨基酸中的一个或多个氨基酸可以缺失或被不同的氨基酸取代。

另一方面，提供了一种包括以下的抗体或抗体片段：3E7A或3E7B的HCDR1区，其包括氨基酸序列NYYIH(SEQ ID NO:163)；3E7A或3E7B的HCDR2区，其包括氨基酸序列WIFPGSGETNFNEKFKG(SEQ ID NO:188)；3E7A或3E7B的HCDR3区，其包括氨基酸序列TWNYDARWGY(SEQ ID NO:141)；3E7A或3E7B的LCDR1区，其包括氨基酸序列RASESIDSYGISFMH(SEQ ID NO:189)；3E7A或3E7B的LCDR2区，其包括氨基酸序列RASNLES(SEQ ID NO:149)或RASNLVS(SEQ ID NO:190)；3E7A或3E7B的LCDR3区，其包括氨基酸序列QQSNEDPFT(SEQ IDNO:150)。任选地，任何CDR序列可以被表征为所列出的序列的至少4个、5个、6个或7个连续氨基酸的序列，任选地其中这些氨基酸中的一个或多个氨基酸可以缺失或被不同的氨基酸取代。

另一方面，提供了一种包括以下的抗体或抗体片段：3E9B的HCDR1区，其包括氨基酸序列NYYIH(SEQ ID NO:163)；3E9B的HCDR2区，其包括氨基酸序列WIFPGSGETNYNEKFKG(SEQ ID NO:191)；3E9B的HCDR3区，其包括氨基酸序列TWNYDARWGY(SEQ ID NO:141)；3E9B的LCDR1区，其包括氨基酸序列RASETIDSYGISFMH(SEQ ID NO:192)；3E9B的LCDR2区，其包括氨基酸序列RASNLES(SEQ ID NO:149)；3E9B的LCDR3区，其包括氨基酸序列QQSNEDPFT(SEQID NO:150)。任选地，任何CDR序列可以被表征为所列出的序列的至少4个、5个、6个或7个连续氨基酸的序列，任选地其中这些氨基酸中的一个或多个氨基酸可以缺失或被不同的氨基酸取代。

另一方面，提供了一种包括以下的抗体或抗体片段：3F5的HCDR1区，其包括氨基酸序列NYYIQ(SEQ ID NO:157)；3F5的HCDR2区，其包括氨基酸序列WIFPGNNETNYNEKFKG(SEQID NO:193)；3F5的HCDR3区，其包括氨基酸序列SWNYDARWGY(SEQ ID NO:147)；3F5的LCDR1区，其包括氨基酸序列RASEIIDSYGISFMH(SEQ ID NO:194)；3F5的LCDR2区，其包括氨基酸序列RASNLES(SEQ ID NO:149)；3F5的LCDR3区，其包括氨基酸序列QQSNEDPFT(SEQ ID NO:150)。任选地，任何CDR序列可以被表征为所列出的序列的至少4个、5个、6个或7个连续氨基酸的序列，任选地其中这些氨基酸中的一个或多个氨基酸可以缺失或被不同的氨基酸取代。

另一方面，提供了一种包括以下的抗体或抗体片段：4C11B的HCDR1区，其包括氨基酸序列NYYIH(SEQ ID NO:163)；4C11B的HCDR2区，其包括氨基酸序列WIFPGSGETNYSEKFKG(SEQ ID NO:195)；4C11B的HCDR3区，其包括氨基酸序列SWNYDARWGY(SEQ ID NO:147)；4C11B的LCDR1区，其包括氨基酸序列RASESIDSYGISFMH(SEQ ID NO:196)；4C11B的LCDR2区，其包括氨基酸序列RASNLES(SEQ ID NO:149)；4C11B的LCDR3区，其包括氨基酸序列QQSNEDPFT(SEQ ID NO:150)。任选地，任何CDR序列可以被表征为所列出的序列的至少4个、5个、6个或7个连续氨基酸的序列，任选地其中这些氨基酸中的一个或多个氨基酸可以缺失或被不同的氨基酸取代。

另一方面，提供了一种包括以下的抗体或抗体片段：4E3A或4E3B的HCDR1区，其包括氨基酸序列NYYIQ(SEQ ID NO:157)；4E3A或4E3B的HCDR2区，其包括氨基酸序列WIFPGSGETNYNENFKA(SEQ ID NO:197)或WIFPGSGETNYNENFRA(SEQ ID NO:198)；4E3A或4E3B的HCDR3区，其包括氨基酸序列TWNYDARWGY(SEQ ID NO:141)；4E3A或4E3B的LCDR1区，其包括氨基酸序列RPSENIDSYGISFMH(SEQ ID NO:199)；4E3A或4E3B的LCDR2区，其包括氨基酸序列RASNLES(SEQ ID NO:149)；4E3A或4E3B的LCDR3区，其包括氨基酸序列QQSNEDPFT(SEQ IDNO:150)。任选地，任何CDR序列可以被表征为所列出的序列的至少4个、5个、6个或7个连续氨基酸的序列，任选地其中这些氨基酸中的一个或多个氨基酸可以缺失或被不同的氨基酸取代。

另一方面，提供了一种包括以下的抗体或抗体片段：4H3的HCDR1区，其包括氨基酸序列NYYIH(SEQ ID NO:163)；4H3的HCDR2区，其包括氨基酸序列WIFPGSGDTNYNEKFKG(SEQID NO:200)；4H3的HCDR3区，其包括氨基酸序列TWNYDARWGY(SEQ ID NO:141)；4H3的LCDR1区，其包括氨基酸序列RVSESIDSYGISFMH(SEQ ID NO:201)；4H3的LCDR2区，其包括氨基酸序列RASTLES(SEQ ID NO:168)；4H3的LCDR3区，其包括氨基酸序列QQSNEDPFT(SEQ ID NO:150)。任选地，任何CDR序列可以被表征为所列出的序列的至少4个、5个、6个或7个连续氨基酸的序列，任选地其中这些氨基酸中的一个或多个氨基酸可以缺失或被不同的氨基酸取代。

另一方面，提供了一种包括以下的抗体或抗体片段：5D9的HCDR1区，其包括氨基酸序列NYYIH(SEQ ID NO:163)；5D9的HCDR2区，其包括氨基酸序列WIFLGSGETNYNEKFKG(SEQID NO:202)；5D9的HCDR3区，其包括氨基酸序列SWNYDARWGY(SEQ ID NO:147)；5D9的LCDR1区，其包括氨基酸序列RASESIDSYGISFIH(SEQ ID NO:203)；5D9的LCDR2区，其包括氨基酸序列RASNLES(SEQ ID NO:149)；5D9的LCDR3区，其包括氨基酸序列QQSNEDPFT(SEQ ID NO:150)。任选地，任何CDR序列可以被表征为所列出的序列的至少4个、5个、6个或7个连续氨基酸的序列，任选地其中这些氨基酸中的一个或多个氨基酸可以缺失或被不同的氨基酸取代。

另一方面，提供了一种包括以下的抗体或抗体片段：6C6的HCDR1区，其包括氨基酸序列NFYIH(SEQ ID NO:145)；6C6的HCDR2区，其包括氨基酸序列WIFPGSGETNYNERFKG(SEQID NO:204)；6C6的HCDR3区，其包括氨基酸序列SWNYDARWGY(SEQ ID NO:147)；6C6的LCDR1区，其包括氨基酸序列RASESIDSYGISFMH(SEQ ID NO:205)；6C6的LCDR2区，其包括氨基酸序列RASNLES(SEQ ID NO:149)；6C6的LCDR3区，其包括氨基酸序列QQSNEDPFT(SEQ ID NO:150)。任选地，任何CDR序列可以被表征为所列出的序列的至少4个、5个、6个或7个连续氨基酸的序列，任选地其中这些氨基酸中的一个或多个氨基酸可以缺失或被不同的氨基酸取代。

另一方面，提供了一种包括以下的抗体或抗体片段：2D8的HCDR1区，其包括氨基酸序列NFYIH(SEQ ID NO:145)；2D8的HCDR2区，其包括氨基酸序列WIFPGSGETNFNEKFKV(SEQID NO:206)；2D8的HCDR3区，其包括氨基酸序列SWNYDARWGY(SEQ ID NO:147)；2D8的LCDR1区，其包括氨基酸序列RASESVDSYGISFMH(SEQ ID NO:207)；2D8的LCDR2区，其包括氨基酸序列RASILES(SEQ ID NO:172)；2D8的LCDR3区，其包括氨基酸序列QQSNEDPFT(SEQ ID NO:150)。任选地，任何CDR序列可以被表征为所列出的序列的至少4个、5个、6个或7个连续氨基酸的序列，任选地其中这些氨基酸中的一个或多个氨基酸可以缺失或被不同的氨基酸取代。

另一方面，提供了一种包括以下的抗体或抗体片段：48F12的HCDR1区，其包括氨基酸序列SYGVS(SEQ ID NO:208)；48F12的HCDR2区，其包括氨基酸序列IIWGDGSTNYHSALVS(SEQ ID NO:209)；48F12的HCDR3区，其包括氨基酸序列PNWDYYAMDY(SEQ ID NO:210)；48F12的LCDR1区，其包括氨基酸序列RASQDISNYLN(SEQ ID NO:211)；48F12的LCDR2区，其包括氨基酸序列YTSRLHS(SEQ ID NO:212)；48F12的LCDR3区，其包括氨基酸序列QQGITLPLT(SEQ ID NO:213)。任选地，任何CDR序列可以被表征为所列出的序列的至少4个、5个、6个或7个连续氨基酸的序列，任选地其中这些氨基酸中的一个或多个氨基酸可以缺失或被不同的氨基酸取代。

在抗体(例如，12D12、26D8、18E1、27C10、2A8A、2A9、2C4、2C8、2D8、2E2B、2E2C、2E8、2E11、2H2A、2H2B、2H12、1A10D、1E4B、3E5、3E7A、3E7B、3E9B、3F5、4C11B、4E3A、4E3B、4H3、5D9、6C6或48F12)中的任何抗体中，指定的可变区和CDR序列可以包括序列修饰，例如取代(1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个或更多个序列修饰)。在一个实施例中，重链和轻链的CDR 1、2和/或3中的任何一个或多个(或全部)包括一个、两个、三个或更多个氨基酸取代，任选地其中被取代的残基是人源序列中存在的残基。在一个实施例中，取代是保守修饰。保守序列修饰是指不会显著影响或改变含有氨基酸序列的抗体的结合特性的氨基酸修饰。此类保守修饰包含氨基酸取代、添加和缺失。可以通过本领域已知的标准技术，将修饰引入到本发明的抗体中，如定点诱变和PCR介导的诱变。保守氨基酸取代通常是其中氨基酸残基被具有具有类似的理化性质的侧链的氨基酸残基替换的那些氨基酸取代。指定的可变区和CDR序列可以包括一个、两个、三个、四个或更多个氨基酸插入、缺失或取代。在进行取代的情况下，优选的取代将是保守修饰。在本领域中已经定义了具有类似侧链的氨基酸残基家族。这些家族包含具有碱性侧链的氨基酸(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、具有酸性侧链的氨基酸(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、具有不带电荷的极性侧链的氨基酸(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、具有非极性侧链的氨基酸(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸)、具有β支链侧链的氨基酸(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和具有芳香族侧链的氨基酸(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此，抗体的CDR区内的一个或多个氨基酸残基可以被来自相同侧链家族的其它氨基酸残基替换，并且可以使用本文中所描述的测定，测试改变的抗体的保留功能(即，本文中所列出的性质)。

任选地，在任何实施例中，VH可以在Kabat位置32、33、34和/或35处包括氨基酸取代。VH可以在Kabat位置52A、54、55、56、57、58、60和/或65处包括氨基酸取代。在任何实施例中，VH可以在Kabat位置95和/或101处包括氨基酸取代。在任何实施例中，VL可以在Kabat位置24、25、26、27、27A、28、33和/或34处包括氨基酸取代，和/或在Kabat位置29、30、31和/或32处包括氨基酸缺失。在任何实施例中，VL可以在Kabat位置50、53和/或55处包括氨基酸取代。在任何实施例中，VL可以在Kabat位置91、94和/或96处包括氨基酸取代。

任选地，在本文中的任何实施例中，抗ILT2抗体可以被表征为抗体中的任何抗体的功能保守变体、重和/或轻链、本文中所描述的其CDR或可变区。“功能保守变体”是指蛋白质或抗体中的给定氨基酸残基已经改变而不更改多肽的整体构象和功能，包含但不限于用具有类似性质(例如，极性、氢键合潜力、酸性、碱性、疏水性、芳香族等)的氨基酸置换氨基酸。除了那些被指示为保守的氨基酸之外的氨基酸在蛋白质中可以不同，使得类似功能的任何两种蛋白质之间的蛋白质或氨基酸序列相似度百分比可以变化并且可以是如根据比对方案，如通过聚类方法测定的例如70％到99％，其中相似度是基于MEGALIGN算法。“功能保守变体”还包含如通过BLAST或FASTA算法测定的具有至少60％氨基酸同一性，优选地至少75％、更优选地至少85％、仍优选地至少90％并且甚至更优选地至少95％，并且具有与其所比较的天然或亲本蛋白(例如，重或轻链，或其CDR或可变区)相同或基本上类似的性质或功能的多肽。在一个实施例中，所述抗体包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区是抗体2H2B、48F12、3F5、12D12、26D8或18E1的重链可变区的功能保守变体，所述轻链可变区是相应的2H2B、48F12、3F5、12D12、26D8或18E1抗体的轻链可变区的功能保守变体。在一个实施例中，所述抗体包括重链和轻链，所述重链是与本文中所公开的人重链恒定区、任选地人IgG4恒定区、任选地经修饰的IgG(例如，IgG1)恒定区(例如，SEQ ID NO:42-45中的任何一个的恒定区)融合的抗体2H2B、48F12、3F5、12D12、26D8或18E1的重链可变区的功能保守变体，所述轻链是与人Cκ轻链恒定区融合的相应的2H2B、48F12、3F5、12D12、26D8或18E1抗体的轻链可变区的功能保守变体。

表A

抗体的片段和衍生物(其被本申请中使用的术语“抗体(antibody)”或“抗体(antibodies)”涵盖，除非另有说明或上下文明显矛盾)可以通过本领域已知的技术产生。“片段”包括完整抗体的一部分，通常是抗原结合位点或可变区。抗体片段的实例包含Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2和Fv片段；双功能抗体；任何抗体片段是具有由一个不间断的连续氨基酸残基序列组成的一级结构的多肽(在本文中称为“单链抗体片段”或“单链多肽”)，包含但不限于(1)单链Fv分子(2)仅含有一个轻链可变结构域的单链多肽，或含有轻链可变结构域的三个CDR，无相关的重链部分的其片段和(3)仅含有一个重链可变区的单链多肽，或含有重链可变区的三个CDR，无相关的轻链部分的其片段；和由抗体片段形成的多特异性(例如，双特异性)抗体。尤其包含纳米抗体、结构域抗体、单结构域抗体或“dAb”。

在某些实施例中，可以在插入到表达载体中之前，修饰产生抗体的杂交瘤的DNA，例如，通过用编码序列取代人重链和轻链恒定结构域代替同源非人类序列(例如，Morrison等人，《美国国家科学院院刊(PNAS)》pp.6851(1984))，或通过共价连接免疫球蛋白编码序列全部或部分非免疫球蛋白多肽的编码序列。以所述方式，制备具有原始抗体的结合特异性的“嵌合”或“杂合”抗体。通常，此类非免疫球蛋白多肽取代抗体的恒定结构域。

任选地，抗体是人源化的。“人源化”形式的抗体是特异性嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(如Fv、Fab、Fab'、F(ab')2或抗体的其它抗原结合子序列)，其含有衍生自鼠免疫球蛋白的最小序列。在大多数情况下，人源化抗体是人免疫球蛋白(受体抗体)，其中来自受体的互补决定区(CDR)的残基被来自原始抗体(供体抗体)的CDR的残基替换，同时维持原始抗体所需的特异性、亲和力和能力。

在一些情况下，人免疫球蛋白的Fv框架残基可以被对应的非人残基替换。更进一步，人源化抗体可以包括在受体抗体或导入的CDR或框架序列中未发现的残基。进行这些修饰以进一步改进和优化抗体性能。通常，人源化抗体将包括基本上全部至少一个、并且通常两个可变结构域，其中所有或基本上所有CDR区对应于原始抗体的那些，并且所有或基本上所有FR区是人免疫球蛋白共有序列中的那些。人源化抗体最佳地还将包括免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，通常是人免疫球蛋白恒定区的至少一部分。另外的细节参见Jones等人，《自然(Nature)》，321，第522页(1986)；Reichmann等人，《自然(Nature)》，332，第323页(1988)；Presta，《结构生物学评论(Curr.Op.Struct.Biol.)》，2，第593页(1992)；Verhoeyen等人，《科学(Science)》，239，第1534页；以及美国专利第4,816,567号，所述专利的全部公开内容通过引用并入本文)。用于人源化抗体的方法是本领域熟知的。

用于制备人源化抗体的人可变结构域，轻链和重链两者的选择对于降低抗原性非常重要。根据所谓的“最佳拟合”方法，针对已知人可变结构域序列的整个文库，筛选抗体的可变结构域的序列。然后接受最接近小鼠的人序列作为人源化抗体的人框架(FR)(Sims等人，《免疫学杂志(J.Immunol.)》第151期,第2296页(1993)；Chothia和Lesk,《分子生物学杂志(J.Mol.)》第196期,1987,第901页)。另一种方法使用来自特定轻链或重链亚组的所有人抗体的共有序列的特定框架。相同的框架可以用于几种不同的人源化抗体(Carter等人,《美国国家科学院院刊(PNAS)》89,第4285页,(1992)；Presta等人,《免疫学杂志(J.Immunol.)》,151,第2623页(1993))。

更重要的是，抗体被人源化，保留对ILT受体的高亲和力和其它有利的生物学性质。为了实现此目标，根据一种方法，通过使用亲代和人源化序列的三维模型分析亲代序列和各种概念性人源化产物的过程，制备人源化抗体。三维免疫球蛋白模型通常是可获得的，并且是本领域技术人员熟悉的。可获得计算机程序，其说明和显示所选候选免疫球蛋白序列的可能的三维结构。检查这些显示允许分析残基在候选免疫球蛋白序列的功能中的可能作用，即，分析影响候选免疫球蛋白结合其抗原的能力的残基。以此方式，可以从共有序列和输入序列中选择并组合FR残基，从而实现所需的抗体特性，如对一个或多个靶抗原的亲和力增加。通常，CDR残基直接且最实质地参与影响抗原结合。

制备“人源化”单克隆抗体的另一种方法是使用转基因鼠(XenoMouse)(Abgenix，Fremont，CA)作为用于免疫的小鼠。转基因鼠是一种小鼠宿主，根据其免疫球蛋白基因被功能性人免疫球蛋白基因替换。因此，由此小鼠或由此小鼠的B细胞制备的杂交瘤产生的抗体已经人源化。转基因鼠描述于美国专利第6,162,963号中，其通过引用以其整体并入本文。

人抗体也可以根据各种其它技术产生，如通过使用已经被工程化以表达人抗体库的其它转基因动物用于免疫(Jakobovitz等人，《自然(Nature)》362(1993)255)，或通过使用噬菌体展示方法从抗体库选择。此类技术是本领域技术人员已知的，并且可以从本申请公开的单克隆抗体开始实施。

在一个实施例中，抗ILT2抗体可以制备成使得它们与人Fcγ受体不具有实质性的特异性结合，例如，CD16A、CD16B、CD32A、CD32B和/或CD64中的任何一个或多个)。此类抗体可以包括已知缺乏或与Fcγ受体具有低结合的各种重链的恒定区。可替代地，不包括(或包括部分)恒定区的抗体片段，如F(ab')2片段，可以用于避免Fc受体结合。可以根据本领域已知的方法评估Fc受体结合，包含例如在BIACORE测定中测试抗体与Fc受体蛋白的结合。而且，通常可以使用任何抗体IgG同种型，其中Fc部分被修饰(例如，通过引入1个、2个、3个、4个、5个或更多个氨基酸取代)，以最小化或消除与Fc受体的结合(参见，例如，WO 03/101485，其公开内容通过引用并入本文)。如基于细胞的测定等用于评估Fc受体结合的测定在本领域中是公知的，并且描述于，例如WO 03/101485中。

在一个实施例中，抗体可以在Fc区中包括一个或多个特定突变，其导致与效应细胞具有最小相互作用的抗体。沉默的效应功能可以通过抗体的Fc区中的突变获得，并且已经在本领域中描述：N297A突变、LALA突变(Strohl,W.,2009,《生物技术当前述评(Curr.《生物技术当前述评(Curr.Opin.Biotechnol.)》第20卷，第6期：685-691)；和D265A(Baudino等人，2008，《免疫学杂志(J.Immunol.)》181:6664-69)还参见Heusser等人，WO2012/065950，其公开内容通过引用并入本文。在一个实施例中，抗体在铰链区中包括一个、两个、三个或更多个氨基酸取代。在一个实施例中，抗体是IgG1或IgG2，并且在残基233-236，任选地233-238(EU编号)处包括一个、两个或三个取代。在一个实施例中，抗体是IgG4，并且在残基327、330和/或331(EU编号)处包括一个、两个或三个取代。沉默Fc lgG1抗体的实例是在lgG1 Fc氨基酸序列中包括L234A和L235A突变的LALA突变体。Fc突变的另一个实例是残基D265或D265和P329处的突变，例如在lgG1抗体中用作DAPA(D265A，P329A)突变(US 6,737,056)。另一种经修饰的lgG1抗体在残基N297处包括突变(例如，N297A、N297S突变)，其产生去糖基化/非糖基化抗体。减少和/或消除FcγR-相互作用的其它突变包含：残基L234和G237(L234A/G237A)处的取代；残基S228、L235和R409(S228P/L235E/R409K、T、M、L)处的取代；残基H268、V309、A330和A331(H268Q/V309L/A330S/A331S)处的取代；残基C220、C226、C229和P238(C220S/C226S/C229S/P238S)处的取代；残基C226、C229、E233、L234和L235(C226S/C229S/E233P/L234V/L235A)处的取代；残基K322、L235和L235(K322A/L234A/L235A)处的取代；残基L234、L235和P331(L234F/L235E/P331S)处的取代；残基234、235和297处的取代；残基E318、K320和K322(L235E/E318A/K320A/K322A)处的取代；残基(V234A、G237A、P238S)处的取代；残基243和264处的取代；残基297和299处的取代；取代使得由EU编号系统定义的残基233、234、235、237和238包括选自PAAAP、PAAAS和SAAAS的序列(参见WO2011/066501)。

在一个实施例中，所述抗体可以包括人lgG1起源的Fc结构域，包括一个或多个Kabat残基234、235、237、330和/或331处的突变。此类Fc结构域的一个实例包括Kabat残基L234、L235和P331(例如，L234A/L235E/P331S或(L234F/L235E/P331S)处的取代。此类Fc结构域的另一个实例包括Kabat残基L234、L235、G237和P331(例如，L234A/L235E/G237A/P331S)处的取代。此类Fc结构域的另一个实例包括Kabat残基L234、L235、G237、A330和P331(例如，L234A/L235E/G237A/A330S/P331S)处的取代。在一个实施例中，抗体包括任选地人IgG1同种型的Fc结构域，其包括：L234X

在一个实施例中，抗体包括重链恒定区，所述重链恒定区包括下文的氨基酸序列，或与其至少90％、95％或99％相同但保留Kabat位置234、235和331处的氨基酸残基的氨基酸序列(下划线)：

A S T K G P S V F P L A P S S K S T S G G T A A L G C L V K D Y F P EP V T V S W N S G A L T S G V H T F P A V L Q S S G L Y S L S S V V T V P S SS L G T Q T Y I C N V N H K P S N T K V D K R V E P K S C D K T H T C P P C PA P E

在一个实施例中，抗体包括重链恒定区，所述重链恒定区包括下文的氨基酸序列，或与其至少90％、95％或99％相同但保留Kabat位置234、235和331处的氨基酸残基的氨基酸序列(下划线)：

A S T K G P S V F P L A P S S K S T S G G T A A L G C L V K D Y F P EP V T V S W N S G A L T S G V H T F P A V L Q S S G L Y S L S S V V T V P S SS L G T Q T Y I C N V N H K P S N T K V D K R V E P K S C D K T H T C P P C PA P E

在一个实施例中，抗体包括重链恒定区，所述重链恒定区包括下文的氨基酸序列，或与其至少90％、95％或99％相同但保留Kabat位置234、235、237、330和331处的氨基酸残基的氨基酸序列(下划线)：

A S T K G P S V F P L A P S S K S T S G G T A A L G C L V K D Y F P EP V T V S W N S G A L T S G V H T F P A V L Q S S G L Y S L S S V V T V P S SS L G T Q T Y I C N V N H K P S N T K V D K R V E P K S C D K T H T C P P C PA P E

在一个实施例中，抗体包括重链恒定区，所述重链恒定区包括下文的氨基酸序列，或与其至少90％、95％或99％相同但保留Kabat位置234、235、237和331处的氨基酸残基的序列(下划线)：

A S T K G P S V F P L A P S S K S T S G G T A A L G C L V K D Y F P EP V T V S W N S G A L T S G V H T F P A V L Q S S G L Y S L S S V V T V P S SS L G T Q T Y I C N V N H K P S N T K V D K R V E P K S C D K T H T C P P C PA P E

Fc相互作用消除ILT2阻断抗体将导致ILT2处缺乏激动剂活性。此类抗体还导致无或低ADCC活性，这意味着Fc相互作用消除抗体表现出低于50％特异性细胞裂解的ADCC活性。优选地，抗体基本上缺乏ADCC活性，例如，抗体表现出低于5％或低于1％的ADCC活性(特异性细胞裂解)。此类抗体也可以导致在细胞(例如，NK细胞、T细胞、单核细胞、树突状细胞、巨噬细胞)的表面处缺乏ILT2的FcγR-介导的交联。

在一个实施例中，抗体在选自由以下组成的组的残基中的任何一个、两个、三个、四个、五个或更多个处的重链恒定区中具有取代：220、226、229、233、234、235、236、237、238、243、264、268、297、298、299、309、310、318、320、322、327、330、331和409(重链恒定区中残基的编号根据Kabat的EU编号)。在一个实施例中，抗体在残基234、235和322处包括取代。在一个实施例中，抗体在残基234、235和331处具有取代。在一个实施例中，抗体在残基234、235、237和331处具有取代。在一个实施例中，抗体在残基234、235、237、330和331处具有取代。在一个实施例中，Fc结构域是由人IgG1亚型构成的。氨基酸残基根据根据Kabat的EU编号指示。

抗ILT2抗体可以掺入药物调配物中，所述药物调配物包括1mg/ml到500mg/ml的浓度，其中所述调配物的pH为2.0到10.0。调配物可以进一步包括缓冲系统、一种或多种防腐剂、一种或多种张力剂、一种或多种螯合剂、稳定剂和表面活性剂。在一个实施例中，药物调配物是含水调配物，即包括水的调配物。此类调配物通常是溶液或悬浮液。在另外的实施例中，药物调配物是水溶液。术语“含水调配物”定义为包括至少50％w/w水的调配物。同样，术语“水溶液”定义为包括至少50％w/w水的溶液，并且术语“水性悬浮液”定义为包括至少50％w/w水的悬浮液。

在另一个实施例中，药物调配物是冻干调配物，医师或患者在使用之前加入溶剂和/或稀释剂。

在另一个实施例中，药物调配物是干燥调配物(例如，冷冻干燥或喷雾干燥)，无需任何预先溶解即可使用。

在另外的方面，药物调配物包括此类抗体的水溶液和缓冲液，其中抗体以1mg/ml或更高的浓度存在，并且其中所述调配物的pH为约2.0到约10.0。

在另一个实施例中，调配物的pH处于选自由以下组成的列表的范围内：约2.0到约10.0、约3.0到约9.0、约4.0到约8.5、约5.0到约8.0、和约5.5到约7.5。

在另外的实施例中，缓冲剂选自由以下组成的组：乙酸钠、碳酸钠、柠檬酸盐、甘氨酰甘氨酸、组氨酸、甘氨酸、赖氨酸、精氨酸、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、磷酸钠和三(羟甲基)-氨基甲烷、二羟乙甘氨酸、三甲基甘氨酸、苹果酸、琥珀酸、马来酸、富马酸、酒石酸、天冬氨酸或其混合体。这些特定缓冲液中的每一种构成本发明的替代性实施例。

在另外的实施例中，调配物进一步包括药学上可接受的防腐剂。在另外的实施例中，调配物进一步包括等渗剂。在另外的实施例中，调配物还包括螯合剂。在本发明的另外的实施例中，调配物进一步包括稳定剂。在另外的实施例中，调配物进一步包括表面活性剂。为方便起见，参考《雷明顿：药学技术与实践(Remington:The Science and Practiceof Pharmacy)》，第19版，1995。

本发明的肽药物调配物中可能存在其它成分。此类附加成分可以包含润湿剂、乳化剂、抗氧化剂、填充剂、张力调节剂、螯合剂、金属离子、油质媒剂、蛋白质(例如人血清白蛋白、明胶或蛋白质)和两性离子(例如氨基酸，如甜菜碱、牛磺酸、精氨酸、甘氨酸、赖氨酸和组氨酸)。当然，此类额外的成分不应对本发明的药物调配物的总体稳定性产生不利影响。

含有根据本发明的抗体的药物组合物可以在几个部位施用于需要此类治疗的患者，例如，在局部部位，例如皮肤和粘膜部位，在旁路吸收的部位，例如，在动脉中、静脉中、心脏和涉及吸收的部位施用，例如，在皮肤、皮下、肌肉或腹部施用。根据本发明的药物组合物的施用可以通过几种施用途径，例如皮下、肌肉内、腹膜内、静脉内、舌、舌下、口腔、口中、口服、胃和肠、鼻，肺，例如，通过细支气管和肺泡或其组合，表皮、真皮、透皮、阴道、直肠、眼，例如通过结膜、尿道和肠胃外给需要此类治疗的患者。

也可以通过检查其它已经开发的治疗性单克隆抗体的经验确定合适的抗体调配物。已经证明几种单克隆抗体在临床情况下是有效的，如美罗华(利妥昔单抗)、赫赛汀(曲妥珠单抗(Trastuzumab))、索雷尔(奥马珠单抗)、百克沙(托西莫单抗)、坎帕斯(阿仑单抗(alemtuzumab))、泽娃灵、Oncolym和类似的调配物可以与本发明的抗体一起使用。例如，可以在100mg(10mL)或500mg(50mL)一次性小瓶中以10mg/mL的浓度供应单克隆抗体，调配用于在9.0mg/mL氯化钠、7.35mg/mL柠檬酸钠二水合物、0.7mg/mL聚山梨醇酯80和无菌注射用水中IV施用。将pH调节到6.5。在另一个实施例中，以包括约20mM柠檬酸钠、约150mM NaCl的调配物供应抗体，pH为约6.0。

恶性肿瘤的诊断和治疗

还提供了使用如本文所述的抗ILT2抗体治疗个体，特别是人类患者的方法。在一个实施例中，本发明提供了如本文所述的抗体在制备用于施用于人类患者的药物组合物中的用途。通常，患者患有癌症或感染性疾病(例如，细菌疾病或病毒疾病)或具有患上癌症或感染性疾病风险。

例如，一方面，本发明提供了一种加强有需要的患者的ILT2限制性白细胞(例如，淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞、B细胞、NK细胞、CD8 T细胞)的活性(例如，对肿瘤细胞的细胞毒性)和/或增殖的方法，所述方法包括向所述患者施用本公开的中和抗ILT-2抗体的步骤。所述抗体可以是例如人或人源化抗ILT2抗体，所述抗体降低或防止原代NK细胞和/或CD8 T细胞中的ILT2介导的抑制信号传导的HLA介导的活化(例如，如根据本文中所公开的方法测定的)。在一个实施例中，所述方法涉及增加患有其中增加的淋巴细胞(例如，NK和/或CD8+T细胞)活性是有益的疾病的患者的此类淋巴细胞的活性和/或数量，所述疾病涉及、影响易由NK或CD8+T细胞裂解的细胞或由其引起，或者所述疾病由NK或CD8+T细胞活性不足引起、加剧、永久化或以其它方式表征，如癌症或感染性疾病。

在一个实施例中，本公开的抗体用于治疗特征在于HLA-A2和/或HLA-G的表达，任选地HLA-A2和/或HLA-的过表达(与在健康个体中的例如健康组织中的表达相比)的肿瘤。

已知各种各样的癌症的特征在于表达HLA-G的肿瘤细胞。例如，已经报告了皮肤黑色素瘤、透明细胞肾癌、视网膜母细胞瘤、棘细胞癌、原位癌、结肠直肠癌、卵巢癌、皮肤T细胞淋巴瘤、子宫内膜腺癌、皮肤B细胞淋巴瘤、胃癌、壶腹癌、胆管癌和胰腺导管腺癌中的HLA-G+病变(大于30％的肿瘤细胞)。也已经报告了白血病、基底细胞癌、膀胱癌、乳腺癌、恶性间皮瘤、光化性角化病和肺癌中的HLA-G+病变(小于30％的肿瘤细胞)。此外，已知各种各样的癌症(包含表达HLA-G的许多癌症)的特征在于表达HLA-E的肿瘤细胞，例如，已知表达HLA-E(包含以高水平)的非小细胞肺癌(NSCLC)、肾细胞癌(RCC)、黑色素瘤、头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)、结肠直肠癌、宫颈癌和卵巢癌。

在一个实施例中，抗ILT2抗体用于治疗膀胱癌。在一个实施例中，抗ILT2抗体用于治疗尿路上皮癌。尿路上皮癌(也被称为移行细胞癌)是膀胱的恶性肿瘤，其可以扩散(转移)到身体的其它部位。尿路上皮癌可以开始于泌尿道的任何部位中，包含肾盂、输尿管、膀胱或尿道。

本文中的方法和组合物可以用于治疗肾细胞癌。肾细胞癌的初始症状通常包含：尿液中带血(寻求医疗建议时，在40％的受影响的人中出现)；和/或侧腹部痛(40％)；和/或腹部或侧腹部中硬块(25％)；和/或体重减轻(33％)；和/或发热(20％)；和/或高血压(20％)；和/或盗汗；和/或不适。肾细胞癌通常还与许多“副肿瘤综合征”相关，所述许多“副肿瘤综合征”是由肿瘤本身产生的激素或身体对肿瘤的攻击引起的并且通常会影响实际上并不容纳肿瘤的组织。最常见的症状选自：贫血或红细胞增多；和/或高血钙水平；和/或血小板增多；和/或继发性淀粉样变性。

应当了解，肾细胞癌是涵盖一定范围的不同类型的RCC的一般术语，包含：转移性透明细胞RCC；局部性透明细胞RCC；多房囊性透明细胞RCC；管囊性RCC；甲状腺样滤泡性RCC；获得性囊性肾病相关RCC；混合嗜酸性/嫌色性RCC。因此，在一个实施例中，本文中的方法和组合物用于治疗转移性透明细胞RCC。在一个实施例中，本文中的方法和组合物用于治疗局部性透明细胞RCC。在一个实施例中，本文中的方法和组合物用于治疗多房囊性透明细胞RCC。在一个实施例中，本文中的方法和组合物用于治疗管囊性RCC。在一个实施例中，本文中的方法和组合物用于治疗甲状腺样滤泡性RCC。在一个实施例中，本文中的方法和组合物用于治疗获得性囊性肾病相关RCC。在一个实施例中，本文中的方法和组合物用于治疗混合嗜酸性/嫌色性RCC。

可以在有或没有预先检测步骤以评估HLA-A2和/或HLA-G(和/或HLA-E)在肿瘤细胞的表面上的表达的情况下用抗ILT2抗体治疗个体。一方面，肿瘤或癌症可以是已知特征通常在于表达HLA-A2和/或HLA-G(和任选地进一步地HLA-E)(或ILT2的一种或多种其它天然配体)的一种类型的肿瘤或癌症。在一些实施例中，治疗方法可以包括检测来自个体的肿瘤的生物样品中(例如，肿瘤细胞上)的HLA-A2和/或HLA-G(和任选地进一步地HLA-E)核酸或多肽的步骤。测定生物样品表达HLA-A2和/或HLA-G(和任选地进一步地HLA-E)(例如，在每种情况下，任选地与参考相比，以可检测水平表达HLA-A2和/或HLA-G(和任选地进一步地HLA-E)、至少以预定水平表达表达HLA-A2和/或HLA-G(和任选地进一步地HLA-E)、以高水平表达HLA-A2和/或HLA-G(和任选地进一步地HLA-E)、或用抗HLA-A2和/或抗HLA-G(和/或抗HLA-E)抗体进行高强度染色)可以用于将患者指定为患有可以从用中和ILT2的活性的药剂进行治疗中获得特别强的益处的癌症。在一个实施例中，所述方法包括：测定生物样品中的HLA-A2和/或HLA-G(和任选地进一步地HLA-E)核酸或多肽的表达水平；以及将所述水平与对应于受益于用抑制中和ILT2的活性的药剂进行治疗的个体的参考水平(例如，值、强细胞表面染色等)进行比较。测定生物样品以对应于和/或提高到参考水平的水平表达HLA-G和/或HLA-A2(和任选地进一步地HLA-E)核酸或多肽指示个体患有可以从用抑制中和ILT2的活性的药剂进行治疗获得特别强的益处的癌症。任选地，检测生物样品中的HLA-A2和/或HLA-G(和任选地进一步地HLA-E)多肽包括检测在恶性细胞的表面上表达的HLA-A2和/或HLA-G(和任选地进一步地HLA-E)多肽。

在本文中的癌症治疗或预防方法中的任一个的一个实施例中，治疗或预防个体的癌症包括：

a)测定患有癌症的个体内的恶性细胞(例如，肿瘤细胞)是否表达ILT2的HLA I类配体(例如，HLA-A2和/或-G)，以及

b)在测定ILT2的一个或多个配体由恶性细胞(例如，肿瘤细胞)(例如在其表面上)表达时，向个体施用抗ILT2抗体(例如，根据本公开的任何方面的抗体)。

在一个实施例中，测定生物学样品(例如，包括肿瘤细胞、肿瘤组织和/或肿瘤邻近组织的样品)表达ILT2的配体指示个体患有可以用抑制ILT2多肽的抗体治疗和/或可以从所述抗体收获益处的癌症。

在一个实施例中，ILT2的配体的显著表达意指所述一个或多个配体在从给定个体获取的大量肿瘤细胞中表达。虽然不受精确百分比值的约束，但在一些实例中，如果在至少10％、20％、30％、40％、50％或更多从患者获取的肿瘤细胞上(在样品中)检测到配体，则可以说其被表达。

测定个体是否具有表达HLA-G多肽的癌症细胞可以例如包括：从包括来自癌症细胞的个体获得生物样品(例如，通过进行活检)；使所述细胞与结合HLA-A2和/或HLA-G多肽的抗体接触；以及检测细胞是否在其表面上表达HLA-A2和/或HLA-G。对于抗HLA-G抗体，参见例如，Fournel等人(2000)《组织抗原(Tissue Antigens)》55:510-518和WO2018/091580中的MEM-G/9和其它抗体，所述文献的公开内容以引用的方式并入本文中。任选地，测定个体是否具有表达HLA-A2和/或HLA-G的癌症细胞包括进行免疫组织化学测定。任选地，测定个体是否具有表达HLA-A2和/或HLA-G的癌症细胞包括进行流式细胞术测定。

在一个实施例中，本公开的抗体用于治疗其NK细胞和/或CD8 T细胞处的ILT2表达水平显著和/或升高(与在健康个体中的例如健康组织中的表达相比)的个体。可以在有或没有评估NK细胞和/或CD8 T细胞的表面处的ILT2表达的预先检测步骤的情况下用抗ILT2抗体治疗个体。肿瘤或癌症可以是已知特征通常在于NK细胞和/或CD8 T细胞的表面处的ILT2表达水平显著和/或升高的一种类型的肿瘤或癌症(例如，HNSCC、NSCLC、RCC、卵巢癌)。在一个实施例中，此种癌症是对免疫疗法(例如，用抑制PD-1多肽的药剂进行治疗)有抗性或无应答的癌症。在一些方面，在评估从个体获得的NK细胞和/或CD8 T细胞(例如，来自肿瘤或肿瘤邻近组织的NK和/或CD8 T细胞、循环NK和/或CD8 T细胞)的表面处的ILT2表达的存在和/或水平时，个体可以被选择成接受用抗ILT2抗体进行的治疗。一方面，在包括测定循环中的或肿瘤环境中的表达ILT2的细胞的存在(例如，数量)和/或测定循环中的或肿瘤环境中的NK和/或CD8 T细胞上的ILT2的表达水平的步骤的治疗中，可以用抗ILT2抗体治疗个体。NK和/或CD8 T细胞上的ILT2表达升高和/或表达ILT2的NK和/或CD8 T细胞的数量升高的存在可以指示个体将从用抗ILT2抗体进行的治疗中获得特别的益处。然后可以用抗ILT2抗体治疗此类个体。与健康(非癌症)对照个体或健康(非肿瘤)对照组织相比，可以测定升高的数量或表达水平。

在任何方面，治疗个体的癌症的可以包括：

a)测定个体在循环中和/或肿瘤或肿瘤邻近组织(例如，肿瘤浸润细胞)中是否具有特征在于ILT2表达的NK和/或CD8 T细胞，任选地其中细胞表面处的ILT2表达与在健康个体的循环NK和/或CD8 T细胞中观察到的表达相比有所增加，以及

b)在测定个体在循环中和/或肿瘤或肿瘤邻近组织中具有特征在于ILT2表达的NK和/或CD8 T细胞时，任选地其中细胞表面处的ILT2表达与在健康个体的循环NK和/或CD8 T细胞中观察到的表达相比有所增加，向所述个体施用中和人ILT2多肽的抑制活性的抗体。

本文中的方法和组合物用于治疗多种其它癌症和其它增殖性疾病。因为这些方法通过阻断淋巴细胞上的抑制受体来增强免疫应答，因此适用于非常广泛的癌症。在一个实施例中，用本公开的抗ILT2抗体治疗的人类患者患有肝癌、骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头颈癌(例如HNSCC)、乳腺癌、肺癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、去势抵抗性前列腺癌(CRPC)、黑色素瘤、子宫癌、结肠癌、直肠癌、肛门癌、胃癌、睾丸癌、子宫癌、输卵管癌、子宫内膜癌、子宫颈癌、阴道癌、外阴癌、非霍奇金氏淋巴瘤、食管癌、小肠癌、内分泌系统癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、儿童实体瘤、淋巴细胞性淋巴瘤、膀胱癌、肾癌或输尿管癌、肾盂癌、中枢神经系统肿瘤(CNS)、原发性CNS淋巴瘤、肿瘤血管生成、脊髓轴肿瘤、脑干胶质瘤、垂体腺瘤、卡波西氏肉瘤、表皮样癌、鳞状细胞癌、环境诱导的癌症，包含由石棉诱导的那些癌症，血液学恶性肿瘤，包含例如多发性骨髓瘤、B细胞淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤/原发性纵隔B细胞淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、急性髓性淋巴瘤、慢性髓性白血病、慢性淋巴细胞白血病、滤泡性淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤、免疫母细胞性大细胞淋巴瘤、前体B淋巴母细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、急性淋巴细胞白血病、蕈样真菌病、间变性大细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤和前体T淋巴母细胞淋巴瘤、以及所述癌症的任何组合。本发明还适用于转移性癌症的治疗。可以在治疗之前、期间或之后，测试或选择患者的上述临床属性中的一种或多种。

无论个体中存在的等位基因(例如，产生ILT2的功能性抑制同种型1、2和3的等位基因)如何，抗体组合物都可以用于治疗个体。在一个实施例中，抗体组合物用于治疗表达包括SEQ ID NO:1的氨基酸序列的ILT2蛋白的个体、表达包括SEQ ID NO:2的氨基酸序列的ILT2蛋白的个体和表达包括SEQ ID NO:3的氨基酸序列的ILT2蛋白的个体。任选地，不需要或执行先前的评估步骤来测定在个体中表达的ILT2的特定等位基因或同种型。在一个实施例中，使用相同的施用方案来治疗其细胞表达ILT2的第一个同种型的此类个体和表达ILT2的第二个同种型的个体；施用方案可以包括相同的施用模式、相同的剂量和相同的施用频率，而与个体中表达的ILT2的特定等位基因无关。

在某些方面，抗ILT2抗体可以用于治疗具有特征在于耗竭和/或免疫抑制的一种或多种标志物的免疫效应细胞的个体的癌症。

在某些方面，抗ILT2抗体(任选地与本文中进一步描述的组合治疗组合)可以用于治疗具有针对免疫治疗剂(例如，抑制PD-1多肽的药剂、结合肿瘤相关抗原并且属于介导对肿瘤细胞的ADCC的人IgG1或其它同种型的抗体)的应答的不良疾病预后(例如，通过指示缺乏足够的抗肿瘤免疫应答、指示免疫耗竭和/或指示免疫抑制的一种或多种标志物所证明的不良预后，值得注意的是，针对用抑制PD-1多肽(例如，抗PD-1或抗PDL1抗体)的药剂进行治疗的应答的不良预后)的个体的癌症。基于一种或多种预测因素，具有较差疾病预后的个体例如处于较高的进展风险中。

在一个实施例中，一种或多种预测因素包括循环中或肿瘤环境中的表达ILT2的细胞的存在(例如，数量)，和/或在循环中或肿瘤环境中的NK和/或CD8 T细胞上的ILT2的表达水平。NK和/或CD8 T细胞上的ILT2表达升高和/或表达ILT2的NK和/或CD8 T细胞的数量升高的存在可以指示个体具有针对用抑制PD-1多肽的抗体进行治疗的应答的不良预后。

一方面，抗ILT2抗体可以用于治疗具有针对抑制PD-1轴的药剂(例如，抗体)的应答的不良预后、或属于无应答者、或已经经历针对用抑制PD-1轴的药剂(例如，抗体)进行治疗的部分或不完全应答和/或在用抑制PD-1轴的药剂(例如，抗体)进行治疗后其疾病已经进展的个体的癌症(例如，头颈癌、肺癌、肾细胞癌、膀胱癌、HNSCC、NSCLC、CCRCC、UCC)。在一个实施例中，用抗ILT2抗体治疗个体，而不用抑制PD-1轴的药剂进行组合治疗(例如，作为抗ILT2单一疗法，或抗ILT2抗体和除抑制PD-1轴的药剂之外的第二治疗剂的组合)。在另一个实施例中，用抗ILT2抗体与抑制PD-1轴的药剂组合治疗个体。

在某些方面，抗ILT2抗体(任选地与本文中进一步描述的组合治疗组合)可以用于治疗具有针对免疫治疗剂(例如，抑制PD-1多肽的药剂、结合肿瘤相关抗原并且属于介导对肿瘤细胞的ADCC的人IgG1或其它同种型的抗体)的应答的不良疾病预后(例如，通过指示缺乏足够的抗肿瘤免疫应答、指示免疫耗竭和/或指示免疫抑制的一种或多种标志物所证明的不良预后，值得注意的是，针对用抑制PD-1多肽(例如，抗PD-1或抗PDL1抗体)的药剂进行治疗的应答的不良预后)的个体的癌症。基于一种或多种预测因素，具有较差疾病预后的个体例如处于较高的进展风险中。

在一个实施例中，一种或多种预测因素包括循环中或肿瘤环境中的表达ILT2的细胞的存在(例如，数量)，和/或在循环中或肿瘤环境中的NK和/或CD8 T细胞上的ILT2的表达水平。NK和/或CD8 T细胞上的ILT2表达升高和/或表达ILT2的NK和/或CD8 T细胞的数量升高的存在可以指示个体具有针对用抑制PD-1多肽的抗体进行治疗的应答的不良预后。

在任何方面，治疗个体的癌症的可以包括：

(a)测定个体是否患有在先前用抑制人PD-1多肽的药剂进行的治疗期间对治疗有应答、但已经复发或进展的癌症，

b)在测定个体患有在先前用抑制人PD-1多肽的药剂进行的治疗期间对治疗有应答、但已经复发或进展的癌症后，向所述个体施用：中和人ILT2多肽的抑制活性的药剂(任选地，抗体)，任选地进一步地与抑制人PD-1多肽的药剂组合。

在任何方面，治疗个体的癌症的可以包括：

a)测定个体是否患有对用抑制人PD-1多肽的药剂进行治疗具有抗性的癌症，以及

b)在测定个体患有对用抑制人PD-1多肽的药剂进行治疗具有抗性的癌症后，向所述个体施用：中和人ILT2多肽(例如，在人原代NK和/或CD8 T细胞中)的抑制活性的药剂(任选地，抗体)，任选地与抑制人PD-1多肽的药剂组合。

抗ILT2抗体可以在作为单一疗法中或在与一种或多种其它和/或治疗剂的组合治疗中使用。另外的疗法或治疗剂通常以针对所治疗的特定疾病或病状的单一疗法中通常用于所述药剂的量和治疗方案施用。此类治疗剂包含但不限于抗癌剂和化学治疗剂。

另一方面，提供了一种降低癌症进展的风险、降低已经历开始的细胞群中的进一步的癌症进展的风险和/或提供用于减少人类患者的癌症进展的治疗方案的方法，所述方法包括以足以实现应答(部分或完全应答)的量和方案向患者施用一种或多种第一治疗(例如，诱导疗法，如化学治疗剂)，并且然后向患者施用一定量的抗ILT2抗体或相关组合物(或应用组合施用方法)。

在另外的方面，提供了一种促进哺乳动物宿主(如人类患者)的癌症的缓解的方法，所述方法包括向所述宿主施用包括抗ILT2抗体的组合物，以促进所述宿主的癌症缓解。

在甚至另外的方面，提供了一种用于降低发展出癌症(例如，转移性或晚期癌症)的风险、减少癌性病状的发作的时间和/或降低在早期阶段中诊断出的癌症的严重程度的方法，所述方法包括向宿主施用预防有效量的抗ILT2抗体或相关组合物，以实现一个或多个期望的生理效应。

在另外的方面，提供了一种提高被诊断患有癌症(例如，头颈癌、肺癌、肾细胞癌、膀胱癌、HNSCC、NSCLC、CCRCC、UCC)的人类患者在相关时间段内存活的可能性的方法。另一方面，提供了一种改善癌症患者的生活质量的方法，所述方法包括以有效改善其生活质量的量向所述患者施用组合物。在另外的方面，本文中所描述的方法可以应用于显著减少脊椎动物宿主中的癌症细胞的数量，使得例如癌症细胞的总数减少。在相关意义上，提供了一种用于杀伤脊椎动物(如人类癌症患者)中的癌症细胞(例如，直接或间接引起其死亡)的方法。

在一个实施例中，抗ILT2中和性抗体缺乏与人CD16的结合，又加强表达CD16的效应细胞(例如，NK细胞或效应T细胞)的活性。因此，在一个实施例中，抗ILT2组合物与能够诱导对其结合的细胞的ADCC(例如，通过由NK细胞表达的CD16)的含Fc结构域的蛋白质组合使用。通常，此类含Fc结构域的蛋白质是与所关注抗原(例如，肿瘤细胞上存在的抗原(肿瘤抗原))结合的抗体，并且包括Fc结构域或其部分，并且将通过抗原结合结构域表现出与抗原的结合并且通过Fc结构域表现出与Fcγ受体(例如，CD16)的结合。。肿瘤抗原在本领域中是众所周知的，例如受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)、B7-H3、B7-H4、B7-H6、Crypto、CD4、CD20、CD30、CD19、CD38、CD47、EGFR、Her2(ErbB2/Neu)、CD22、CD33、CD79、CD123、CD138、CD171、PSCA、PSMA、BCMA、CD52、CD56、CD80、CD70和CD123。在一个实施例中，其ADCC活性将至少部分地由CD16介导。在一个实施例中，另外的治疗剂是具有天然或经过修饰的人Fc结构域的抗体，例如来自人IgG1或IgG3抗体的Fc结构域。术语“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”或“ADCC”是本领域熟知的术语，并且是指细胞介导的反应，其中表达Fc受体(FcR)的非特异性细胞毒性细胞识别靶细胞上结合的抗体，并且随后引起靶细胞的裂解。介导ADCC的非特异性细胞毒性细胞包含自然杀伤(NK)细胞、巨噬细胞、单核细胞、DC和嗜酸性粒细胞。术语“ADCC诱导抗体”是指如通过本领域技术人员已知的一种或多种测定法测量的，证明ADCC的抗体。此类活性的典型特征在于Fc区与各种FcR的结合。不受任何特定机制的限制，本领域技术人员将认识到抗体证明ADCC的能力可以是，例如，通过其亚类(如lgG1或lgG3)、通过引入到Fc结构域中的突变、或通过修饰抗体的Fc结构域中的碳水化合物模式。诱导ADCC的抗体的实例包含利妥昔单抗(用于淋巴瘤、CLL的治疗)、曲妥单抗(用于乳腺癌的治疗)、阿仑单抗(用于慢性淋巴细胞性白血病的治疗)和西妥昔单抗(用于结肠直肠癌、头颈部鳞状细胞癌的治疗)、达雷木单抗(daratumumab)、曲齐妥单抗(drozitumab)、杜利他单抗(duligotumab)、依诺苏单抗(enoticumab)、盖尼塔单抗(ganitumab)、耐昔妥珠单抗(necitumumab)、奥法木单抗(ofatumumab)、帕尼单抗(panitumumab)、帕曲妥单抗(patritumab)、普林木单抗(pritumumab)、雷莫芦单抗(ramucirumab)和帕妥珠单抗(pertuzumab)。ADCC增强抗体的实例包含但不限于：GA-101(低岩藻糖基化抗CD20)、玛格图单抗(margetuximab)(Fc增强抗HER2)、美泊利单抗、MEDI-551(Fc工程化抗CD19)、奥比努单抗(obinutuzumab)(糖工程化/低岩藻糖基化抗CD20)、奥卡拉单抗(ocaratuzumab)(Fc工程化抗CD20)、

在一个实施例中，抗ILT2中和性抗体可以有利地与中和人PD-1的抑制活性(例如，抑制PD-1与PD-L1之间的相互作用)的药剂组合使用，任选地进一步地在是对用中和人PD-1的抑制活性的药剂进行的治疗的不良应答者(或对所述治疗不敏感)的个体中。抗ILT2中和性抗体可以用于加强表达PD-1的效应细胞(例如，NK或效应T细胞，例如表达ILT2的NK细胞)的活性。因此，在一个实施例中，第二或附加第二治疗剂是中和人PD-1的抑制活性的抗体或其它药剂。中和人PD-1的抑制活性的药剂或抗体的实例包含结合PD1或PD-L1的抗体。许多此类抗体是已知的，并且可以例如以通常使用此类药剂的示例性剂量和/或频率来使用。在一个实施例中，第二或另外的第二治疗剂是抑制PD-1轴(即，抑制PD-1或PD-L1)的药剂(例如，抗体)。结合PD1或PD-L1的抗体可以例如以通常作为例如如下文所描述的单一疗法使用此类药剂的示例性剂量和/或频率来使用。

PD-1是CD28受体家族的抑制成员，所述CD28受体家族还包含CD28、CTLA-4、ICOS和BTLA。PD-1在活化的B细胞、T细胞和髓样细胞上表达(Okazaki等人(2002)《当前免疫学观点)》14:391779-82；Bennett等人(2003)《免疫学杂志》170:711-8)。已经鉴定出PD-1的两个配体PD-L1和PD-L2，已经示出所述两个配体在与PD-1结合时下调T细胞活化(Freeman等人(2000)《实验医学杂志》192:1027-34；Latchman等人(2001)《自然-免疫学(Nat Immunol)》2:261-8；Carter等人(2002)《欧洲免疫学杂志(Eur J Immunol)》32:634-43)。PD-L1在多种人类癌症中是丰富的(Dong等人(2002)《自然-医学(Nat.Med.)》8:787-9)。PD-1与PD-L1之间的相互作用导致肿瘤浸润淋巴细胞减少、T细胞受体介导的增殖减少以及癌细胞的免疫逃避。通过抑制PD-1与PD-L1的局部相互作用可以逆转免疫抑制，并且当PD-1与PD-L2的相互作用也被阻断时，这种效应是累加的。PD-1的阻断可以有利地涉及使用例如通过阻断与其天然配体PD-L1的相互作用来阻止PD-L1诱导的PD-1信号传导的抗体。一方面，抗体结合PD-1(抗PD-1抗体)；此种抗体可以阻断PD-1与PD-L1之间和/或PD-1与PD-L2之间的相互作用。另一方面，抗体结合PD-L1(抗PD-L1抗体)并且阻断PD-1与PD-L1之间的相互作用。

目前，市场上或临床评价中有至少六种阻断PD-1/PD-L1途径的药剂，这些药剂中的任何药剂都可以与本公开的抗ILT2抗体组合使用。一种药剂是BMS-936558(纳武单抗(Nivolumab)/ONO-4538，Bristol-Myers Squibb；以前的MDX-1106)。纳武单抗(商品名称

在治疗方法中，抗ILT2抗体和第二治疗剂可以单独、一起或依次施用、或以混合物形式施用。在一些实施例中，在施用第二治疗剂之前施用抗原结合化合物。例如，可以在施用第二治疗剂之前约0天到30天施用抗ILT2抗体。在一些实施例中，在施用第二治疗剂之前约30分钟到约2周、约30分钟到约1周、约1小时到约2小时、约2小时到约4小时、约4小时到约6小时、约6小时到约8小时、约8小时到1天、或约1天到5天施用结合ILT2的化合物。在一些实施例中，抗ILT2抗体与治疗剂的施用同时施用。在一些实施例中，在施用第二治疗剂之后施用抗ILT2抗体。例如，可以在施用第二治疗剂之后大约0天到30天施用抗ILT2抗体。在一些实施例中，在施用第二治疗剂之后约30分钟到约2周、约30分钟到约1周、约1小时到约2小时、约2小时到约4小时、约4小时到约6小时、约6小时到约8小时、约8小时到1天、或约1天到5天施用抗ILT抗体。

在其它方面，提供了使用本公开的抗体鉴定ILT2+细胞的方法。评估ILT2在细胞(例如，单核细胞、DC、巨噬细胞、NK细胞、T细胞)上的共表达可以在诊断或预后方法中使用。例如，可以从个体(例如，从血液样品，从癌症患者获得的癌症或癌症邻近组织)获得生物样品，并且分析ILT2+细胞的存在。ILT2在此类细胞上的表达可以例如用于鉴定具有被ILT2多肽抑制的此类细胞(例如，肿瘤浸润NK和/或T细胞)的个体。例如，ILT2在此类细胞上的表达可以用于鉴定具有例如在肿瘤或肿瘤环境中被ILT2多肽抑制的免疫细胞(例如，NK细胞和/或CD8 T细胞)的个体。方法例如可以用作对用中和ILT2的药剂进行的治疗的应答的预后。ILT2在此类细胞上的表达可以指示适于用如本文中所公开的本公开的抗体进行治疗的个体。

实例

实例1：ILT2(LILRB1)在健康人类供体记忆CD8 T细胞和CD56暗淡NK细胞上被表达

通过对来自健康人类供体的新鲜全血进行流式细胞术来测定外周血单核细胞上的LILRB1表达。NK群被测定为CD3-CD56+细胞(抗CD3 AF700-生物传奇公司(BioLegend)#300424；抗CD56 BV421-BD生物科学公司(BD Biosciences)#740076)。在NK细胞中，CD56明亮亚群被鉴定为CD16-细胞，而CD56暗淡亚群被鉴定为CD16+细胞(抗CD16BV650-BD生物科学公司#563691)。CD4+和CD8+T细胞分别被鉴定为CD3+CD56-CD4+和CD3+CD56-CD8+细胞(CD3-参见上文；CD4 BV510-BD生物科学公司#740161；CD8BUV737-BD生物科学公司#564629)。在CD4+T细胞群中，Tconv和Treg分别被鉴定为CD127+CD25-/低和CD127低CD25高细胞(CD127 PE-Cy7-BD生物科学公司#560822；CD25VioBright-美天旎生物技术公司(Miltenyi Biotec)#130-104-274)。在CD8+T细胞群中，原初细胞群、中枢记忆细胞群、效应记忆细胞群和效应记忆T细胞群分别被鉴定为CD45RA+CCR7+、CD45RA-CCR7+、CD45RA-CCR7-、CD45RA+CCR7-细胞(CD45RA BUV395-BD生物科学公司#740298；CCR7 PerCP-Cy5.5-生物传奇公司#353220)。命名为“CD3+CD56+ly”的群是包括NKT细胞和γδT细胞的异质细胞群。单核细胞被鉴定为CD3-CD56-CD14+细胞(CD14 BV786-BD生物科学公司#563691)，并且B细胞被鉴定为CD3-CD56-CD19+细胞(CD19 BUV496-BD生物科学公司#564655)。使用抗LILRB1抗体(克隆HP-F1-APC-生物传奇公司#17-5129-42)。将全血与染色Ab混合体在黑暗中在室温下一起温育20分钟，然后按照提供者TDS用Optilyse C(贝克曼库尔特公司(Beckman Coulter)#A11895)裂解红细胞。将细胞用PBS洗涤两次，并用Fortessa流式细胞仪(BD生物科学公司)显示荧光。

结果示出在图1中。虽然B淋巴细胞和单核细胞通常总是表达ILT2，常规CD4 T细胞和CD4 Treg细胞不表达ILT2，但是相当一部分CD8 T细胞(约25％)、CD3+CD56+淋巴细胞(约50％)和NK细胞(约30％)表达ILT2，这表明一定比例的此类CD8 T和NK细胞群中的每个细胞群可以根据HLA I类配体存在于例如肿瘤细胞上而被ILT2抑制。

在CD8 T细胞中，ILT2表达不存在于原初细胞上，但存在于CD8 T细胞的效应记忆部分，并且在较小程度上存在于中枢记忆CD8 T细胞上。在NK细胞中，ILT2表达基本上仅在CD16+亚群(CD56暗淡)上，并且在CD16-NK细胞(CD56明亮)上的频率低得多。

实例2：ILT2在多种人类癌症中被上调

通过对从人类癌症患者供体的全血中纯化的外周血单核细胞(PBMC)进行流式细胞术来测定单核细胞、B细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞以及CD16-和CD16+NK细胞两者上的ILT2表达。使用实例1中详述的相同抗体混合体鉴定细胞群并评估ILT2表达。将PBMC与抗体混合体在黑暗中在4℃下一起温育20分钟，在染色缓冲液中洗涤两次，并在Fortessa流式细胞仪上测量荧光。

来自癌症患者样品的结果示出在图2中。如可以看出的，ILT2再一次在所有单核细胞和B细胞上被表达。然而，在淋巴细胞亚群、NK细胞和CD8 T细胞上，ILT2在来自三种类型的癌症(HNSCC、NSCLC和RCC)的细胞上更加频繁地(具有统计学显著性)被表达。ILT2在卵巢癌中也被上调，尽管需要研究更大数量的患者样品。在头颈癌(HNSCC)、肺癌(NSCLC)和肾癌(RCC)中，在CD8 T细胞、γδT细胞(αβT细胞上无表达)和CD16+NK细胞中观察到癌症患者样品中的ILT2表达增加。

实例3：抗ILT2抗体的生成

材料与方法

ILT-2_6xHis重组蛋白的克隆和产生

ILT-2蛋白(Uniprot登录号Q8NHL6)在NruI限制性位点与BamHI限制性位点之间被克隆到pTT-5载体中。使用重链肽前导。用以下引物进行PCR：

ILT-2_正向_ACAGGCGTGCATTCGGGGCACCTCCCCAAGCCCAC(SEQ ID NO:57)

ILT-2_反向_CGAGGTCGGGGGATCCTCAATGGTGGTGATGATGGTGGTGCCTTCCCAGACCACTCTG(SEQ ID NO:58)

在蛋白质的C端部分处添加6xHis标签以进行纯化。用生成的载体转染EXPI293细胞系以进行瞬时生产。使用Ni-NTA珠从上清液中纯化蛋白质，并使用SEC纯化单体。

ILT-2_6xHis重组蛋白的氨基酸序列如下所示：

GHLPKPTLWAEPGSVITQGSPVTLRCQGGQETQEYRLYREKKTALWITRIPQELVKKGQFPIPSITWEHAGRYRCYYGSDTAGRSESSDPLELVVTGAYIKPTLSAQPSPVVNSGGNVILQCDSQVAFDGFSLCKEGEDEHPQCLNSQPHARGSSRAIFSVGPVSPSRRWWYRCYAYDSNSPYEWSLPSDLLELLVLGVSKKPSLSVQPGPIVAPEETLTLQCGSDAGYNRFVLYKDGERDFLQLAGAQPQAGLSQANFTLGPVSRSYGGQYRCYGAHNLSSEWSAPSDPLDILIAGQFYDRVSLSVQPGPTVASGENVTLLCQSQGWMQTFLLTKEGAADDPWRLRSTYQSQKYQAEFPMGPVTSAHAGTYRCYGSQSSKPYLLTHPSDPLELVVSGPSGGPSSPTTGPTSTSGPEDQPLTPTGSDPQSGLGRHHHHHHH(SEQ IDNO:59)

在细胞表面表达ILT家族成员的CHO和KHYG细胞系的生成

使用以下引物通过PCR扩增ILT-2的完整形式：ILT-2_正向ACAGGCGTGCATTCGGGGCACCTCCCCAAGCCC(SEQ ID NO:60)和ILT-2_反向_CCGCCCCGACTCTAGACTAGTGGATGGCCAGAGTGG(SEQ ID NO:61)。将PCR产物在合适的限制性位点处插入到表达载体中。使用重链肽前导。然后，将载体转染到CHO和KHYG细胞系中以获得在细胞表面表达ILT-2蛋白的稳定克隆。然后，使用这些细胞进行杂交瘤筛选。类似地制备表达其它ILT家族成员的CHO细胞，包含表达ILT-1、ILT-3、ILT-4、ILT-5、ILT-6、ILT7和ILT-8的细胞。用于制备表达ILT-1、ILT-3、ILT-4、ILT-5和ILT-6的细胞的ILT蛋白的氨基酸序列提供在下表4中。

在细胞表面表达HLA-G的K562细胞系的生成

使用以下引物通过PCR扩增HLA-G的完整形式(基因库登录号NP_002118.1，序列如下所示)：HLA-G_正向5'CCAGAACACAGGATCCGCCGCCACCATGGTGGTCATGGCGCCC3'(SEQ ID NO:62)、HLA-G_反向_5'TTTTCTAGGTCTCGAGTCAATCTGAGCTCTTCTTTC 3'(SEQ ID NO:63)。将PCR产物在BamHI限制性位点与XhoI限制性位点之间插入到载体中，并用于转导不表达HLA-E或被工程化以稳定过表达HLA-E的K562细胞系。

HLA-G氨基酸序列：

HLA-E氨基酸序列(Uniprot P13747)：

免疫和筛选

通过用ILT-2_6xHis蛋白使balb/c小鼠产生免疫来进行免疫。在免疫方案之后，处死小鼠以进行融合并获得杂交瘤。使用杂交瘤上清液来染色CHO-ILT2和CHO-ILT4细胞系，以在流式细胞术实验中检查单克隆抗体反应性。简而言之，将细胞与50μl的上清液在4℃下一起温育1小时，洗涤三次，并使用与AF647偶联的二级抗体山羊抗小鼠IgG Fc特异性抗体(杰克逊免疫研究实验室有限公司(Jackson Immunoresearch)，JI115-606-071)。染色30分钟后，将细胞洗涤三次，并使用FACS CANTO II(贝迪公司(Becton Dickinson))进行分析。

筛选出约1500个杂交瘤上清液，以鉴定产生与ILT2结合并具有阻断ILT2与HLA-G相互作用的能力的抗体的那些杂交瘤上清液。简而言之，将重组的带6xHIS标签的ILT2在与10

这个测定允许鉴定一组在阻断ILT2与其HLA I类配体HLA-G相互作用方面极为有效的抗ILT2抗体。抗体3H5、12D12、26D8、18E1、27C10、27H5、1C11、1D6、9G1、19F10a和27G10被鉴定为具有良好的阻断活性，并且因此被选择进行进一步的研究。

所产生的抗体被生产作为具有带有导致缺乏与人Fcγ受体CD16A、CD16B、CD32A、CD32B和CD64的结合的Fc结构域突变L234A/L235E/G237A/A330S/P331S(Kabat EU编号)的重链的经修饰的人IgG1抗体。然后，在本文中所描述的所有其它实验中使用这些Fc结构域突变的L234A/L235E/G237A/A330S/P331S抗体。简而言之，将每个抗体的VH和Vk序列(本文中所示出的VH和Vk可变区)克隆到分别含有携带上文所提到的突变的人IgG1恒定结构域和人Ck恒定结构域的表达载体中。将获得的两种载体共转染到CHO细胞系中。建立的细胞池用于在CHO培养基中产生抗体。

实例4：经修饰的人IgG1 Fc结构域与FcγR的结合

先前已评价实例3中所采用的L234A/L235E/G237A/A330S/P331S Fc结构域以及其它Fc突变和野生型抗体，以如下评估与人Fcγ受体的结合。

在25℃下在Biacore T100设备(通用电气医疗集团(GE Healthcare)的Biacore)上进行SPR(表面等离子体共振)测量。在所有Biacore实验中，HBS-EP+(通用电气医疗集团的Biacore)和10mM NaOH、500mM NaCl分别用作运行缓冲液和再生缓冲液。用Biacore T100评价软件对传感图进行分析。克隆、产生和纯化重组人FcR的(CD64、CD32a、CD32b、CD16a和CD16b)。

所测试的抗体包含：具有野生型人IgG1结构域的抗体、具有带有S241P取代的人IgG4结构域的抗体、具有N297S取代的人IgG1抗体、具有L234F/L235E/P331S取代的人IgG1抗体、具有L234A/L235E/P331S取代的人IgG1抗体、具有L234A/L235E/G237A/A330S/P331S取代的人IgG1抗体和具有L234A/L235E/G237A/P331S取代的人IgG1抗体。

将抗体共价固定到传感器Chip CM5上的葡聚糖层中的羧基。用EDC/NHS(N-乙基-N'-(3-二甲基氨基丙基)碳二酰胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺(通用电气医疗集团的Biacore)活化芯片表面。在偶联缓冲液(10mM乙酸盐，pH 5.6)中将抗体稀释到10μg/ml，并且注射直至达到合适的固定水平(即，800RU到900RU)。使用100mM乙醇胺pH 8(通用电气医疗集团的Biacore)进行剩余活化基团的失活。

按照经典动力学向导(如制造商推荐的)评估单价亲和力研究。将CD64的范围为0.7到60nM和所有其它FcR的60到5000nM的可溶性分析物(FcR)的系列稀释液注射到固定的双特异性抗体上，并允许其在再生前解离10分钟。使用CD64的1:1动力学结合模型和所有其它FcR的稳态亲和力模型拟合整个传感图集。

结果示出在下表7中。结果示出，虽然全长野生型人IgG1与所有人Fcγ受体结合，并且特别地，人IgG4与FcγRI(CD64)显著结合(表7中所示出的KD)，但是L234A/L235E/G237A/A330S/P331S取代和L234A/L235E/G237A/P331S取代消除了与CD64以及与CD16a的结合。

实例5：ILT2阻断抗体增强NK细胞裂解的能力

通过实例3中所描述的表达ILT2的KHYG细胞在存在抗体的情况下裂解靶细胞的能力来测定抗ILT2抗体控制ILT2介导的NK细胞活化抑制的能力。效应细胞是表达ILT2和GFP的KHYG细胞作为对照，并且靶细胞是被制备成表达HLA-G的装载51Cr的K562细胞系(

这个实验评价了实例2中所鉴定的抗体3H5、12D12、26D8、18E1、27C10、27H5、1C11、1D6、9G1、19F10a、27G10以及可商购获得的抗体GHI/75(小鼠IgG2b，生物传奇公司#333720)、292319(小鼠IgG2b，生物技术公司(Bio-Techne)#MAB20172)、HP-F1(小鼠IgG1，e生物科学公司(eBioscience)#16-5129-82)、586326(小鼠IgG2b，生物技术公司#MAB30851)和292305(小鼠IgG1，生物技术公司#MAB20171)。

结果示出在图3中。大多数ILT2/HLA-G阻断抗体示出NK细胞系对K562-HLA-G肿瘤靶细胞的细胞毒性％显著增加。然而，某些抗体在增加NK细胞毒性方面特别有效。抗体12D12、19F10a和商业292319在增强NK细胞对靶细胞的细胞毒性的能力方面比其它抗体更有效。抗体18E1、26D8尽管不太有效，但显示出作为细胞毒性强化剂的活性，在较小程度上优于3H5和商业抗体HP-F1。在诱导对靶细胞的细胞毒性的能力方面，其它抗体(包含27C10、27H5、1C11、1D6、9G1和商业抗体292305、586326、GHI/75)的活性明显低于18E1、26D8。

实例6：阻断ILT2与HLA I类分子的结合

HLA/ILT2阻断测定

通过流式细胞术评估的抗ILT2抗体阻断在细胞系的表面表达的HLA-G或HLA-A2与重组ILT2蛋白之间的相互作用的能力。简而言之，将带有BirA标签的ILT2蛋白生物素化以获得每个ILT2蛋白1个生物素分子。将APC缀合的链霉亲和素(SA)与生物素化的ILT2蛋白(比例为1个链霉亲和素/4个ILT2蛋白)混合以形成四聚体。将抗ILT2 Ab(12D12、18E1、26D8)与ILT2-SA四聚体在染色缓冲液中在4℃下一起温育30分钟。将Ab-ILT2-SA复合物添加到表达HLA-G或HLA-A2的细胞上，并在4℃下温育1小时。在配备有HTFC板装载器的AccuryC6流式细胞仪上评价复合物在细胞上的结合，并使用FlowJo软件进行分析。

这个测定允许鉴定一组在阻断ILT2与其HLA I类配体HLA-G相互作用方面极为有效的抗ILT2抗体。抗体3H5、12D12、26D8、18E1、27C10、27H5、1C11、1D6、9G1、19F10a和27G10全部都阻断了ILT2与HLA-G和HLA-A2的结合。图4示出了抗体12D12、18E1和26D8的代表性结果。

实例7：通过流式细胞术在表达ILT2的细胞上进行抗体滴定

为了解释NK细胞毒性诱导的差异，在实验中测试了未经标记的抗体3H5、12D12、26D8、18E1、27C10、27H5、1C11、1D6、9G1、19F10a和27G10以及可商购获得的抗体GHI/75、292319、HP-F1、586326和292305与被修饰以表达人ILT-2的CHO细胞的结合。将细胞与30μg/ml到5×10-

结果示出在下表1中。除了其EC50比其它抗体高出的范围为1-log的抗体GHI/75之外，其余抗体全部示出相当的EC50值，这表明结合亲和力的差异不能解释观察到的增强NK细胞毒性的能力的差异。

表1

实例8：单价亲和力测定

测试了抗体3H5、12D12、26D8、18E1、27C10、27H5、1C11、1D6、9G1、19F10a和27G10以及可商购获得的抗体GHI/75、292319和HP-F1与人ILT2蛋白的结合亲和力。

使用SPR(表面等离子体共振)方法来测试抗体3H5、12D12、26D8、18E1、27C10、27H5、1C11、1D6、9G1、19F10a、27G10(所有人IgG1同种型)。在25℃下在Biacore T200ap设备(通用电气医疗集团的Biacore)上进行测量。在所有Biacore实验中，HBS-EP+(通用电气医疗集团的Biacore)和NaOH 10mM分别用作运行缓冲液和再生缓冲液。用Biacore T100评价软件对传感图进行分析。蛋白A购自(通用电气医疗集团)。在因内特制药公司(InnatePharma)处克隆、产生和纯化人ILT2重组蛋白。将蛋白A蛋白质共价固定到传感器Chip CM5上的葡聚糖层中的羧基。用EDC/NHS(N-乙基-N'-(3-二甲基氨基丙基)碳二酰胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺(通用电气医疗集团的Biacore)活化芯片表面。在偶联缓冲液(10mM乙酸盐，pH 5.6)将蛋白A稀释到10μg/ml，并且注射直至达到合适的固定水平(即，600RU)。使用100mM乙醇胺pH 8(通用电气医疗集团的Biacore)进行剩余活化基团的失活。将2μg/mL的抗ILT2抗体捕获到蛋白A芯片上，并将重组人ILT2蛋白以范围为250nM到1.95nM的不同浓度注射到捕获到的抗体上。对于空白扣除，再次进行循环，从而用运行缓冲液替换ILT2蛋白。按照制造商推荐的常规捕获动力学方案(通用电气医疗集团的Biacore，动力学向导)进行单价亲和力分析。将范围为1.95nM到250nM的人ILT2蛋白的七个连续稀释液依次注射到捕获到的抗体上，并允许其在再生前解离10分钟。根据曲线的轮廓使用1:1动力学结合模型或两态反应模型拟合整个传感器图集。

使用OCTET分析来评价抗体GHI/75、292319和HP-F1(所有小鼠同种型)。在OctetRED96系统(颇尔富迪生物公司(Fortebio))上进行测量。在所有Biacore实验中，动力学缓冲液10X(颇尔富迪生物公司)和甘氨酸10mM pH 1.8分别用作运行缓冲液和再生缓冲液。使用数据分析9.0软件分析图。使用抗小鼠IgG Fc捕获(AMC)生物传感器。将5μg/mL的抗ILT2抗体被捕获到抗小鼠IgG Fc捕获(AMC)生物传感器上。注射重组人ILT2蛋白的七个稀释液(292319和HP-F1为1000nM到15.625nM并且GHI-75为100nM到1.5625nM)。使用模型1:1拟合曲线。

结果示出在下表2中。KD差异通常似乎与增强NK细胞毒性的能力的差异无关。因此，结合亲和力并不能解释抗体增强NK细胞毒性的能力的差异。

表2

实例9：鉴定增加原代人NK细胞中的细胞毒性的抗体

考虑了先前抗体无法中和NK细胞中的ILT2的可能性可能与原代NK细胞中的ILT2表达的差异(例如与在其表面表达较高水平的ILT2的经高度选择或修饰的NK细胞系相比)有关。研究并选择了来自许多健康人类供体的原代NK细胞中的抗体。通过评估NK细胞上的CD137表面表达通过活化测定来研究实例5的抗ILT2抗体的效应。在每种情况下，将原代NK细胞(作为从供体中纯化的新鲜NK细胞)用作效应细胞，并且将表达HLA-E/G的K562细胞(慢性髓性白血病(CML))用作靶标。因此，靶标不仅表达ILT2配体HLA-G，而且表达HLA-E，其是在一系列癌症细胞的表面上表达的HLAI类配体并且可以与NK和CD8 T细胞的表面上的抑制受体相互作用。

简而言之，通过对总NK细胞、ILT2阳性NK细胞和ILT2阴性NK细胞上的CD137表达进行流式细胞术通过分析来测定抗ILT2抗体对NK细胞活化的效应。效应细胞是原代NK细胞(从供体中纯化的新鲜NK细胞，使用前在37℃下温育过夜)，并将靶细胞(K562 HLA-E/G细胞系)以比率1:1混合。CD137测定是在96U孔板中以完整RPMI，200μL终/孔完成的。将抗体与效应细胞在37℃下预温育30分钟，并且然后将靶细胞在37℃下共温育过夜。以下步骤：以500g旋转3分钟；用染色缓冲液(SB)洗涤两次；添加50μL的染色Ab混合体(抗CD3太平洋蓝(Pacific blue)-BD生物科学公司；抗CD56-PE-Vio770-美天旎生物技术公司；抗CD137-APC-美天旎生物技术公司；抗ILT2-PE-克隆HP-F1，e生物科学公司)；在4℃下温育30分钟；用SB洗涤两次；用SB重悬沉淀物；并用Canto II(HTS)显示荧光。阴性对照是NK细胞对单独的和在存在同种型对照的情况下的K562-HLA-E/G。

图5A是示出了使用来自两个人类供体的NK细胞和制备成表达HLA-E和HLA-G的K562肿瘤靶细胞由抗ILT2抗体介导的表达CD137的总NK细胞的％的增加的代表性图。图5B是示出了使用来自两个人类供体的NK细胞和表达HLA-A2的B细胞系由抗ILT2抗体介导的表达CD137的ILT2阳性(左图)和ILT2阴性(右图)NK细胞的％的增加的代表性图。

令人惊讶地，观察到在增强NK细胞系的细胞毒性方面最为有效的抗体不一定能够活化原代人NK细胞。在增强NK细胞系的细胞毒性方面最为有效的抗体12D12、19F10a和292319中，与同种型对照抗体相比，19F10a和292319两者都基本上缺乏活化原代NK细胞的能力。

另一方面，抗体12D12、18E1和26D8示出对原代NK细胞的强活化。对ILT2阳性NK细胞的研究示出，这些抗体的介导使得NK细胞对靶细胞的活化增加两倍。作为对照，表达CD137的ILT2阴性NK细胞的％不受所述抗体的影响。

图6A和6B从细胞毒性标志物CD137的增加倍数的角度示出了抗体增强原代NK细胞对肿瘤靶细胞的细胞毒性的能力。图6A示出了抗体增强使用来自5-12个不同供体的原代NK细胞在存在表达HLA-G的靶细胞的情况下针对表达HLA-G和HLA-E的K562靶细胞的NK细胞活化的能力。图6A示出了抗体增强使用来自3-14个不同供体的原代NK细胞在存在表达HLA-G的靶细胞的情况下针对表达HLA-A2的靶B细胞的NK细胞活化的能力。在每种情况下，12D12、18E1和26D8具有与抗体之一(292319)相比更大的NK细胞毒性增强，所述抗体之一属于在使用实例5中的NK细胞系时示出最强的NK细胞毒性增强的抗体。

实例10：与ILT家族成员的结合的表征

为了进一步表征抗体的结合特异性，通过流式细胞术测试抗体与被制备成表达不同的ILT家族蛋白的细胞的结合。除上文所描述的表达ILT2(LILRB1)的细胞之外，生成表达人ILT1(LILRA2)、ILT3(LILRB4)、ILT4(LILRB2)、ILT5(LILRB3)、ILT6(LILRA3)、ILT7(LILRA4)或ILT8(LILRA6)的细胞。

使用下表3中所描述的引物通过PCR扩增人ILT基因。将PCR产物在合适的限制性位点处插入到表达载体中。使用重链肽前导，并在N端(表4中的序列中未示出)处添加具有氨基酸序列GKPIPNPLLGLDST(SEQ ID NO:80)的V5标签。本文中所使用的不同的人ILT蛋白的氨基酸序列在下表4中示出。然后，将载体转染到CHO细胞系中以获得在细胞表面表达不同的ILT蛋白的稳定克隆。

表3

表4：ILT序列

简而言之，对于流式细胞术筛选，将抗体与每种表达ILT的CHO细胞系(CHO ILT1细胞系、CHO ILT2细胞系、CHO ILT3细胞系、CHO ILT4细胞系、CHO ILT5细胞系、CHO ILT6细胞系、CHO ILT7细胞系，CHO ILT8细胞系))一起温育1小时，在染色缓冲液中洗涤两次，通过用PE标记的山羊抗小鼠IgG H+L多克隆抗体(pAb)(可商购获得的抗体，杰克逊免疫研究实验室有限公司#115-116-146)或用PE标记的山羊抗人IgG H+L pAb(嵌合抗体，杰克逊免疫研究实验室有限公司#109-116-088)揭示，用染色缓冲液洗涤两次，并在配备有HTFC板装载器的Accury C6流式细胞仪上获取染色，并使用FlowJo软件进行分析。

结果示出，除ILT2之外，许多抗ILT2抗体还与ILT6(LILRA3)结合，单独地(即，ILT2/ILT6交叉反应性)或另外地与ILT4或ILT5结合(即，ILT2/ILT4/ILT6或ILT2/ILT5/ILT6交叉反应性)。抗体1C11、1D6、9G1、19F10a、27G10、商业抗体586326和292305与ILT2以及ILT6结合。此外，除ILT2和ILT6外，抗体586326还与ILT4结合，而除ILT2和ILT6之外，抗体292305还结合ILT5。最后，除ILT2之外，商业抗体292319还与ILT1结合(ILT1/ILT2交叉反应性)。然而，通过3H5、12D12、26D8、18E1、27C10和27H5例示的抗体的子集仅与ILT2结合，而不与其它ILT家族成员蛋白结合。

实例11：表位作图

ILT2蛋白的生成

使用下表中所描述的引物通过PCR扩增对不同的人ILT2结构域D1(对应于SEQ IDNO:1中所示的序列的残基24-121)、D2(对应于SEQ ID NO:1中所示的序列的残基122-222)、D3(对应于SEQ ID NO:1中所示的序列的残基223-321)、D4(对应于SEQ ID NO:1中所示的序列的残基322-458)及其组合进行编码的核酸序列。将PCR产物在合适的限制性位点处插入到表达载体中。使用重链肽前导序列，并在N端处添加V5标签，并通过流式细胞术确认细胞表面处的表达。对于所有没有D4结构域随后的结构域，添加CD24 GPI锚以允许锚定在细胞膜处。所产生的含有不同的人ILT2结构域片段的蛋白质的氨基酸序列示出在下表5中。然后，将载体转染到CHO细胞系中以获得在细胞表面表达不同的ILT2结构域蛋白的稳定克隆。

表5

结果

通过流式细胞术测试ILT2选择性抗体与不同的锚定的ILT2片段的结合。3H5、12D12和27H5全部都与ILT2的D1结构域结合。这些抗体与表达含有ILT2的D1结构域的蛋白质(SEQ ID NO:46、50和53的蛋白质)的所有细胞结合，而不与表达缺乏D1结构域的ILT2蛋白(SEQ ID NO:47-49、51、52和54的蛋白质)的任何细胞结合。因此，抗体3H5、12D12和27H5与由SEQ ID NO:1中所示的序列的残基24-121定义的ILT2的结构域(也被称为结构域D1)结合。抗体26D8、18E1和27C10全部都与ILT2的D4结构域结合。这些抗体与表达含有ILT2的D4结构域的蛋白质(SEQ ID NO:49、52和54的蛋白质)的所有细胞结合，而不与表达缺乏D4结构域的ILT2蛋白(SEQ ID NO:46-28、50、51或53的蛋白质)的任何细胞结合。因此，抗体26D8、18E1和27C10与由SEQ ID NO:1中所示的序列的残基322-458定义的ILT2的结构域结合。图7示出了抗体与SEQ ID NO:46的锚定的ILT2结构域D1片段蛋白(左图)、SEQ ID NO:48的D3结构域片段蛋白(中间图)和SEQ ID NO:49的D4结构域蛋白(右图)的代表性示例结合。

对结合ILT2而不与密切相关的ILT6结合的抗体的鉴定允许在暴露的氨基酸上设计ILT2突变并且ILT2与ILT6之间有所不同。然后，可以针对丧失与在ILT2的D1、D2或D4结构域中具有氨基酸取代的不同的ILT2突变体的结合对在ILT6上没有交叉反应的抗ILT2抗体进行作图。丧失与ILT2突变体的结合以及丧失与人ILT6的结合可以用于鉴定由增强NK细胞毒性的抗体结合的ILT2上的表位。

ILT2突变体的生成

通过PCR生成ILT2突变体。扩增的序列在琼脂糖凝胶上运行，并且使用MachereyNagel PCR Clean-Up Gel Extraction试剂盒(参考740609)进行纯化。然后用ClonTechInFusion系统将为每种突变体生成的纯化的PCR产物连接到表达载体中。将含有突变序列的载体制备成Miniprep并且测序。测序之后，使用Promega PureYield

表6

结果

通过流式细胞术测试ILT2选择性抗体与每个突变体的结合。进行第一实验，以测定在一个浓度下丧失与一个或几个突变体的结合的抗体。为了确认结合的丧失，对结合似乎受ILT2突变影响的抗体进行了抗体滴定。测试抗体的结合的丧失或降低指示特定突变体的一个或多个或全部残基对于抗体的核心表位是重要的，并且由此允许鉴定ILT2的结合区域。

抗体3H5、12D12和27H5结合ILT2的结构域D1中的表位，因为这三个抗体丧失与在ILT2的结构域1(D1结构域)中的残基34、36、76、82和84处具有氨基酸取代(取代E34A、R36A、Y76I、A82S、R84L)的突变体2的结合。12D12和27H5没有丧失与任何其它突变体的结合，然而，3H5与在残基29、30、33、32、80处具有氨基酸取代(取代G29S、Q30L、Q33A、T32A、D80H)的突变体1的结合也降低(部分丧失)。因此，这些氨基酸残基以及缺乏与人ILT6多肽的结合可以鉴定表征增强原代NK细胞中的细胞毒性的抗ILT2抗体的表位。

图8A示出了通过流式细胞术进行的抗体3H5、12D12和27H5与突变体1和2的结合的滴定的代表性实例。图9A示出了表示包含结构域1(顶部，用深灰色阴影表示)和结构域2(底部，用浅灰色阴影表示)的ILT2分子的一部分的模型。图示出了如由突变体1(M1)和突变体2(M2)中被取代的氨基酸残基定义的抗体的结合位点。

抗体26D8、18E1和27C10全部都结合ILT2的结构域D4中的表位。抗体26D8和18E1丧失与突变体4-1和4-2的结合。突变体4-1在残基299、300、301、328、378和381处具有氨基酸取代(取代F299I、Y300R、D301A、W328G、Q378A、K381N)。突变体4-2在残基328、330、347、349、350和355处具有氨基酸取代(取代W328G、Q330H、R347A、T349A、Y350S、Y355A)。此外，26D8丧失了与突变体4-5的结合，而抗体18E1与突变体4-5的结合降低(但没有完全丧失结合)。27C10也丧失了与突变体4-5的结合，但不与任何其它突变体结合。突变体4-5在残基341、342、344、345和347处具有氨基酸取代(取代D341A、D342S、W344L、R345A、R347A)。26D8和18E1没有丧失与任何其它突变体的结合。因此，这些氨基酸残基以及缺乏与人ILT6多肽的结合可以鉴定表征增强原代NK细胞中的细胞毒性的抗ILT2抗体的表位。

图8B示出了通过流式细胞术进行的抗体26D8、18E1和27C10与D4结构域突变体4-1、4-1b、4-2、4-4和4-5的结合的滴定的代表性实例。

图9B示出了表示包含结构域3(顶部，用深灰色阴影表示)和结构域4(底部，用浅灰色阴影表示)的ILT2分子的一部分的模型。图示出了如由全部都位于ILT2的结构域4内的突变体4-1、4-2和4-5中被取代的氨基酸残基定义的抗体的结合位点。加强原代NK细胞的细胞毒性的抗体26D8、18E1结合由突变体4-1和4-2定义的位点，而不与由突变体4-5定义的位点结合，而不加强原代NK细胞的细胞毒性的抗体27C10与由突变体4-5定义的位点结合。

实例12：ILT2-HLA-G阻断抗体增强原代人NK细胞中的细胞毒性的亲和力结合阈值

为了更好地理解是在增强原代NK细胞毒性方面具有高度活性的抗ILT2抗体的活性的基础的机制，使用实例3中所描述的方法进行进一步的免疫和筛选，与如实例10中的对与密切相关的ILT家族成员的结合进行的另外的筛选组合。

用ILT-2_6xHis蛋白使Balb/c小鼠产生免疫。在免疫方案之后，处死小鼠以进行融合并获得杂交瘤。使用杂交瘤上清液来染色实例10中所描述的表达ILT的CHO细胞系(各自表达ILT1(LILRA2)、ILT3(LILRB4)、ILT4(LILRB2)、ILT5(LILRB3)、ILT6(LILRA3)或ILT7(LILRA4)之一的CHO系)，以在流式细胞术实验中检查单克隆抗体反应性。简而言之，将细胞与50μl的上清液在4℃下一起温育1小时，洗涤三次，并使用与AF647偶联的二级抗体山羊抗小鼠IgG Fc特异性抗体(杰克逊免疫研究实验室有限公司(Jackson Immunoresearch)，JI115-606-071)。染色30分钟后，将细胞洗涤三次，并使用FACS CANTO II(贝迪公司(Becton Dickinson))进行分析。

克隆并筛选抗体，以鉴定与ILT2结合而不与人ILT1、ILT3、ILT4、ILT5、ILT6或ILT7结合并且具有阻断ILT2与HLA-G之间的相互作用的能力的那些所产生的抗体。简而言之，在添加经纯化的抗ILT2抗体之前，将重组生物素化ILT2与APC缀合的链霉亲和素在4℃下一起温育20分钟。20分钟后，将复合物与5×10

如实例5中所描述的，通过流式细胞术评估抗ILT2抗体阻断在细胞系的表面表达的HLA-G或HLA-A2与重组ILT2蛋白之间的相互作用的能力。这些测定允许鉴定一组在阻断ILT2与其HLA I类配体HLA-G相互作用方面极为有效的抗ILT2抗体。抗体12D12、2A8A、2A8B、2A9、2B11、2C4、2C8、2D8、2E2B、2E2C、2E8、2E11、2G5、2H2A、2H2B、2H12、1A9、1A10B、1A10C、1A10D、1E4B、1E4C、3A7A、3A7B、3A8、3B5、3E5、3E7A、3E7B、3E9A、3E9B、3F5、4A8、4C11B、4E3A、4E3B、4H3、5C5、5D9、6C6、10H1、48F12、15D7、2C3全部都阻断了ILT2与HLA-G和HLA-A2的结合。图10A示出了抗体12D12、2H2B、48F12、1E4C、1A9、3F5和3A7A的代表性结果。如实例11中所示出的，通过流式细胞术测试所产生的抗体与不同的锚定的ILT2片段和ILT2点突变体的结合，并将其生产作为具有带有突变L234A/L235E/G237A/A330S/P331S的人IgG1 Fc结构域的经修饰的嵌合抗体。

如实例9中，测试抗ILT2抗体增加原代人NK细胞中的细胞毒性的能力。简而言之，通过对总NK细胞、ILT2阳性NK细胞和ILT2阴性NK细胞上的CD137表达进行流式细胞术来测定抗ILT2抗体对NK细胞活化的效应。效应细胞是原代NK细胞(从供体中纯化的新鲜NK细胞，使用前在37℃下温育过夜)，并将靶细胞(WIL2-NS细胞系)以比率1:1混合。

图10B是示出了使用来自两个人类供体的NK细胞和内源性表达HLA-A2的WIL2-NS由抗ILT2抗体12D12、2H2B、48F12、1E4C、1A9、3F5和3A7A介导的表达CD137的总NK细胞的％的增加的代表性图。抗体示出对原代NK细胞的强活化。对ILT2阳性NK细胞的研究示出，这些抗体的介导使得NK细胞对靶细胞的活化强增加。这些抗体在点突变体上的表位的表征示出，与抗体3H5、12D12和27H5类似，对其结构域结合进行测试的抗体2H2B、48F12和3F5全部都与ILT2的D1结构域结合；它们与表达含有ILT2的D1结构域的蛋白质(SEQ ID NO:46、50和53的蛋白质)的所有细胞结合，而不与表达缺乏D1结构域的ILT2蛋白(SEQ ID NO:47-49、51、52和54的蛋白质)的任何细胞结合。在测试与ILT-2点突变体的结合时，抗体12D12、2H2B、48F12、1E4C、1A9、3F5和3A7A结合ILT2的结构域D1中的表位，丧失与在ILT2的结构域1(D1结构域)中的残基34、36、76、82和84处具有氨基酸取代(取代E34A、R36A、Y76I、A82S、R84L)的突变体2的结合。

这些结果使得观察到，令人惊讶地，在阻断在细胞的表面表达的HLA-G或HLA-A2之间的相互作用方面有效并且结合ILT2的D1结构域上的相同区域的一些抗体不一定能够介导原代人NK细胞的细胞毒性的增加或恢复其细胞毒性。具体地，如图10B中所示出的，抗体1E4C、1A9和3A7A尽管与其它抗体来自相同的鼠类V基因组合(1E4C、1A9和3A7A来自与IGKV3-5*01组合的IGHV1-66*01或IGHV1-84*01基因)，但是与同种型对照抗体相比，都基本上缺乏活化原代NK细胞的能力。表位作图示出了这些抗体实际上与ILT2的D1结构域结合；这些抗体与表达含有ILT2的D1结构域的蛋白质(SEQ ID NO:46、50和53的蛋白质)的所有细胞结合，而不与表达缺乏D1结构域的ILT2蛋白(SEQ ID NO:47-49、51、52和54的蛋白质)的任何细胞结合，并且这些抗体示出了丧失与在ILT2的结构域1(D1结构域)中的残基34、36、76、82和84处具有氨基酸取代(取代E34A、R36A、Y76I、A82S、R84L)的突变体2的结合。

作为对为什么这些抗D1表位抗体没有发挥作用来增强原代NK细胞中NK细胞毒性进行的研究的一部分，观察到，对于活化原代NK细胞的几种抗体，还存在没有活化原代NK细胞的具有密切相关的可变区序列的其它抗体(尽管是有效的ILT2-HLA-G阻断剂)。因此，差异(尤其是CDR残基的差异)可能会影响抗体的亲和力。将具有源自相同可变区基因的CDR的抗体分组，并使用实例8的方法进一步表征其与人ILT2的单价结合亲和力。简而言之，将1μg/mL的抗ILT2抗体捕获到蛋白A芯片上，并将重组人ILT2蛋白以5μg/mL注射到捕获到的抗体上。对于空白扣除，再次进行循环，从而用运行缓冲液替换ILT2蛋白。按照制造商推荐的常规捕获动力学方案(通用电气医疗集团的Biacore，动力学向导)进行单价亲和力分析。结果示出在下表5中。阻断HLA-G和HLA-A2但没有增强原代人NK细胞的细胞毒性的抗体1E4C、1A9和3A7A快速接合ILT-2蛋白(表5中的ka)，然而其特征在于，与不能增强原代人NK细胞的细胞毒性的抗体相比，快速解离。具体地，1E4C、1A9和3A7A的特征在于2态反应，其中抗体在两个阶段(第一个快速“kd1”阶段和第二较慢“kd2”阶段)解离。1E4C、1A9和3A7A的第一阶段的特征在于kd大于1E-2。因此，在体外测定中，虽然强亲和力结合(在速率上)似乎可以足够阻断ILT2-HLA-G/A2相互作用，但是需要较低的解离速率来增强NK细胞毒性。通常也会观察不同的D1结构域表位抗体之间的KD的差异，尽管不如kd重要。结果示出，尽管抗D1结构域表位抗体能够有效地阻断ILT-2与其HLA配体的相互作用，但是增强原代NK细胞中的NK细胞毒性需要亲和力阈值。

抗体2A8A、2A9、2C4、2C8、2D8、2E2B、2E2C、2E8、2E11、2H2A、2H12、1A10D、3E5、3E7A、3E7B、3E9B、3F5、4C11B、4E3A、4E3B、4H3、5D9和6C6具有源自鼠类IGHV1-66*01基因的重链可变区/CDR和源自鼠类IGKV3-5*01基因的轻链可变区/CDR。1E4B具有源自鼠类IGHV1-66*01基因的重链可变区/CDR和源自鼠类IGKV3-4*01的轻链可变区/CDR。2H2B具有源自鼠类IGHV1-84*01基因的重链可变区/CDR和源自鼠类IGKV3-5*01基因的轻链可变区/CDR。活化原代NK细胞的抗体显示出在其VH和HCDR中与Kabat位置32-35、52A、54、55、56、57,58、60、65、95和101不同的位置处存在的可变残基和在其VL和LCDR中与Kabat位置24、25、26、27、27A、28、33、34、50、53、55、91、94和96不同的位置处存在的可变残基。

48F12具有源自鼠类IGHV2-3*01基因的重链可变区/CDR和源自鼠类IGKV10-96*02基因的轻链可变区/CDR。

增强NK细胞毒性的抗D1表位抗体12D12、2A8A、2A9、2C4、2C8、2D8、2E2B、2E2C、2E8、2E11、2H2A、2H2B、2H12、1A10D、1E4B、3E5、3E7A、3E7B、3E9B、3F5、4C11B、4E3A、4E3B、4H3、5D9、6C6或48F12的特征在于：丧失与表达在残基34、36、76、82和84处具有氨基酸取代(取代E34A、R36A、Y76I、A82S/R84L)的ILT2突变体2的细胞的结合；丧失与人ILT-6多肽的结合；以及1:1结合拟合和/或解离或脱离速率(kd(1/s))小于1E-2或1E-3(单价结合亲和力测定，如通过SPR测定的)。

表5

实例13：抗体增强NK细胞介导的ADDC

通过对来自人肿瘤细胞的NK细胞、ILT2阳性NK细胞和ILT2阴性NK细胞上的CD137表达进行流式细胞术通过分析来测定抗ILT2抗体对NK细胞活化的效应。

靶肿瘤细胞是其中ILT-2被沉默的WIL2-NS肿瘤靶细胞。将效应细胞(从人类健康供体中纯化的新鲜NK细胞)和肿瘤靶细胞以比率1:1混合。CD137测定是在96U孔板中以完整RPMI，200μL终/孔完成的。使用的抗体包含浓度为10μg/mL的抗ILT-2抗体12D12、18E1和26D8、同种型对照抗体以及浓度为0.001μg/mL的利妥昔单抗。将抗体与效应细胞在37℃下预温育30分钟，并且然后将靶细胞在37℃下共温育过夜。以下步骤：以400g旋转3分钟；用染色缓冲液(SB)洗涤两次；添加50μL的染色Ab混合体(抗CD3太平洋蓝(Pacific blue)-BD生物科学公司；抗CD56-PE-Vio770-美天旎生物技术公司；抗CD137-APC-美天旎生物技术公司；抗ILT2-PE-克隆HP-F1，e生物科学公司)；在4℃下温育30分钟；用SB洗涤两次；用Cellfix(贝迪公司)重悬沉淀物；并用FACS Canto II流式细胞仪(贝迪公司)显示荧光。阴性对照是NK细胞对单独的和在存在同种型对照的情况下的靶细胞。

抗ILT2抗体能够介导由利妥昔单抗介导的NK细胞毒性的强增加。令人惊讶地，抗ILT2抗体和利妥昔单抗的组合导致总NK细胞活化的活化比任一种药剂本身能够介导的活化强。图11A示出了在五个人类供体中，在没有或没有抗ILT2抗体的情况下与利妥昔单抗和肿瘤靶细胞一起温育后，NK细胞的活化相较于单独的利妥昔单抗(与培养基相比)的增加倍数。抗ILT2抗体12D12、18E1和26D8中的每一种导致由利妥昔单抗单独介导的NK细胞毒性的增加。组合增加了利妥昔单抗在LILRB1+NK细胞群和整个NK细胞群中的NK细胞毒性。

通过对来自人肿瘤细胞的NK细胞、ILT2阳性NK细胞和ILT2阴性NK细胞上的CD137表达进行流式细胞术通过分析来测定抗ILT2抗体对NK细胞活化的效应。

肿瘤靶细胞是HN(人口腔鳞状细胞癌，

如通过流式细胞术测定的，发现HNSCC肿瘤细胞始终对HLA-G和HLA-A2呈阴性，如图12中所示出的。然而，尽管不存在ILT2的主要已知配体，抗ILT2抗体能够介导由西妥昔单抗介导的NK细胞毒性的强增加。抗ILT2抗体能够介导由西妥昔单抗介导的NK细胞毒性的强增加。令人惊讶地，抗ILT2抗体和西妥昔单抗的组合导致总NK细胞活化的活化比任一种药剂本身能够介导的活化强得多。图11B示出了在三个人类供体中，在有或没有抗ILT2抗体的情况下与西妥昔单抗和HN肿瘤靶细胞一起温育后，NK细胞的活化相较于单独的西妥昔单抗(与培养基相比)的增加倍数。图11C示出了在三个人类供体中，在有或没有抗ILT2抗体的情况下与西妥昔单抗和FaDu肿瘤靶细胞一起温育后，NK细胞的活化相较于单独的西妥昔单抗(与培养基相比)的增加倍数。图11D示出了在三个人类供体中，在有或没有抗ILT2抗体的情况下与西妥昔单抗和Cal27肿瘤靶细胞一起温育后，NK细胞的活化相较于单独的西妥昔单抗(与培养基相比)的增加倍数。抗ILT2抗体12D12、18E1和26D8中的每一种导致由西妥昔单抗单独介导的NK细胞毒性的增加。组合增加了西妥昔单抗在LILRB1+NK细胞群和整个NK细胞群中的NK细胞毒性。

实例14：巨噬细胞介导的ADCP的增强。

测试抗体增强抗体依赖性细胞吞噬作用的能力。

简而言之，在平底96孔板(40000个细胞/孔)中的补充有100ng/mL的M-CSF的完全RPMI中培养6到7天后，从健康供体获得单核细胞衍生的巨噬细胞。在不含酚红的RPMI中进行抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)实验，以避免干扰用于标记靶细胞的染料。在添加抗体和靶细胞之前，将巨噬细胞在没有FBS的RPMI中饥饿2小时。在巨噬细胞上添加一定剂量范围的利妥昔单抗(10-1-0.1μg/mL)和固定剂量的抗ILT2或对照抗体(10μg/mL)。使用ph-Rodo Red试剂(其在被巨噬细胞吞噬后在细胞内小泡中在酸性pH下发出荧光)标记30000个细胞/孔的表达HLA-A2的靶细胞，将其添加到巨噬细胞，并在Incucyte-S3成像器中温育3到6小时。每30分钟获取一次图像。使用总红色对象积分强度(RCU×μm

然后，与单独的利妥昔单抗相比，测试商业抗ILT2抗体GHI/75(小鼠IgG2b同种型)和其具有通过引入L234A/L235E/G237A/A330S/P331S突变为被修饰以基本上消除人FcγR结合的人IgG1 Fc结构域的变体(“HUB3”)增强利妥昔单抗介导的巨噬细胞对表达HLA-A2的B细胞的吞噬的能力。

结果示出在图13中。阻断ILT2的抗体GHI/75(商业抗体，小鼠IgG2b同种型)增强了巨噬细胞中由抗CD20抗体利妥昔单抗介导的对表达HLA-A2的B细胞(B104细胞)的ADCP。相比之下，包括L234A/L235E/G237A/A330S/P331S突变的人IgG1 Fc修饰的GHI/75变体(图12中的HUB3)示出了增强由利妥昔单抗介导的ADCP的能力的降低。

因此，抗ILT2抗体的Fc结构域与FcγR之间的相互作用可以在观察到的巨噬细胞介导的细胞死亡中发挥重要作用。这提供了通过维持或包含结合FcγR的Fc结构域(例如，天然IgG1结构域)来调节抗ILT2抗体介导ADCP的能力以便介导ADCP的可能性。

实例15：尿路上皮癌中的ILT2

通过对来自人类尿路上皮癌患者的总NK细胞、ILT2阳性NK细胞和ILT2阴性NK细胞上的CD137表达进行流式细胞术通过分析来测定抗ILT2抗体对NK细胞活化的效应。

效应细胞是原代NK细胞(从人类尿路上皮癌供体中纯化的新鲜NK细胞，使用前在37℃下温育过夜)，并将靶细胞(表达HLA-A2的B细胞系参考B104)以比率1:1混合。CD137测定是在96U孔板中以完整RPMI，200μL终/孔完成的。将抗体与效应细胞在37℃下预温育30分钟，并且然后将靶细胞在37℃下共温育过夜。以下步骤：以500g旋转3分钟；用染色缓冲液(SB)洗涤两次；添加50μL的染色Ab混合体(抗CD3太平洋蓝(Pacific blue)-BD生物科学公司；抗CD56-PE-Vio770-美天旎生物技术公司；抗CD137-APC-美天旎生物技术公司；抗ILT2-PE-克隆HP-F1，e生物科学公司)；在4℃下温育30分钟；用SB洗涤两次；用SB重悬沉淀物；并用Canto II(HTS)显示荧光。阴性对照是NK细胞对单独的和在存在同种型对照的情况下的靶细胞。

图14示出了来自尿路上皮癌患者的表达CD137的ILT2阳性(右图)和ILT2阴性(中间图)NK细胞与抗ILT2抗体12D12、18E1和26D8和表达HLA-A2的B细胞一起温育后的％。抗ILT2抗体12D12、18E1和26D8中的每一个使得NK细胞毒性增加多于2倍。

实例16：透明细胞肾癌中的ILT2

基于不同类型癌症的关键基因组变化的多维图，使用癌症基因组图谱(CancerGenome Atlas，国家癌症研究所和国家人类基因组研究所之间的合作)对ILT2基因表达研究进行了研究。考虑到疾病阶段和时间，考虑了表达水平(指示为高或低)。对于ILT2和肾透明细胞肾细胞癌(CCRCC)患者根据Cox回归的p值分为3组(高、中和低ILT2基因表达)(每组必须含有至少10％的患者)。为3组中的每组绘制存活概率曲线。在CCRCC样品中观察到低、中和高ILT2表达之间的统计学存活率差异，其中高表达ILT2表现出较低的存活率。图15示出了低ILT2表达样品(顶部线)、中ILT2表达样品(中间线)和高ILT2表达样品(底部线)。结果示出增加的ILT2表达与较低的存活概率相关。与中和低ILT2表达样品相比，高ILT2表达样品与较低的存活概率相关。

本文引用的所有参考文献，包含出版物、专利申请和专利均特此通过引用整体并入，并且其程度如同每个参考文献被单独地且具体地指示以通过引用并入并且在本文中整体阐述(在法律允许的最大范围内)一样，不论是否单独提供了本文其它地方参考的特定文件的并入。

除非本文中另有所指或明显与上下文相矛盾，否则在描述本发明的上下文中使用的术语“一个/一种(a/an)”和“所述(the)”以及类似的指代词应被解释为涵盖单数和复数两者。

除非另有说明，否则本文提供的所有精确值均代表对应的近似值(例如，关于特定因子或测量提供的所有确切示例性值可以被视为还提供对应的近似测量，由“约”修饰，在适当的情况下)。

本发明使用如“包括”、“具有”、“包含”或“含有”等术语的本文对任何方面或实施例的描述旨在提供对本发明的“由所述一个或多个特定元素组成”、“基本上由所述一个或多个特定元素组成”或“基本上包括所述一个或多个特定元素”的类似方面或实施例的支持，除非另有说明或明确与上下文矛盾(例如，本文描述的包括特定元素的组合物应理解为还描述由所述元素组成的组合物，除非另有说明或明确与上下文矛盾)。

在此提供的任何和所有实例或示例性语言(例如，“诸如”)的使用仅旨在更好地描述本发明并且不对本发明的范围构成限制，除非另外指示。说明书中的任何语言都不应当解释为指示任何未要求保护的要素为实践本发明所必需的。

表7

序列表

<110> 先天制药公司

<120> 白细胞免疫球蛋白样受体2中和性抗体

<130> LILRB1

<150> 62/784,862

<151> 2018-12-26

<160> 213

<170> PatentIn版本3.5

<210> 1

<211> 650

<212> PRT

<213> 智人

<400> 1

Met Thr Pro Ile Leu Thr Val Leu Ile Cys Leu Gly Leu Ser Leu Gly

1 5 10 15

Pro Arg Thr His Val Gln Ala Gly His Leu Pro Lys Pro Thr Leu Trp

20 25 30

Ala Glu Pro Gly Ser Val Ile Thr Gln Gly Ser Pro Val Thr Leu Arg

35 40 45

Cys Gln Gly Gly Gln Glu Thr Gln Glu Tyr Arg Leu Tyr Arg Glu Lys

50 55 60

Lys Thr Ala Leu Trp Ile Thr Arg Ile Pro Gln Glu Leu Val Lys Lys

65 70 75 80

Gly Gln Phe Pro Ile Pro Ser Ile Thr Trp Glu His Ala Gly Arg Tyr

85 90 95

Arg Cys Tyr Tyr Gly Ser Asp Thr Ala Gly Arg Ser Glu Ser Ser Asp

100 105 110

Pro Leu Glu Leu Val Val Thr Gly Ala Tyr Ile Lys Pro Thr Leu Ser

115 120 125

Ala Gln Pro Ser Pro Val Val Asn Ser Gly Gly Asn Val Ile Leu Gln

130 135 140

Cys Asp Ser Gln Val Ala Phe Asp Gly Phe Ser Leu Cys Lys Glu Gly

145 150 155 160

Glu Asp Glu His Pro Gln Cys Leu Asn Ser Gln Pro His Ala Arg Gly

165 170 175

Ser Ser Arg Ala Ile Phe Ser Val Gly Pro Val Ser Pro Ser Arg Arg

180 185 190

Trp Trp Tyr Arg Cys Tyr Ala Tyr Asp Ser Asn Ser Pro Tyr Glu Trp

195 200 205

Ser Leu Pro Ser Asp Leu Leu Glu Leu Leu Val Leu Gly Val Ser Lys

210 215 220

Lys Pro Ser Leu Ser Val Gln Pro Gly Pro Ile Val Ala Pro Glu Glu

225 230 235 240

Thr Leu Thr Leu Gln Cys Gly Ser Asp Ala Gly Tyr Asn Arg Phe Val

245 250 255

Leu Tyr Lys Asp Gly Glu Arg Asp Phe Leu Gln Leu Ala Gly Ala Gln

260 265 270

Pro Gln Ala Gly Leu Ser Gln Ala Asn Phe Thr Leu Gly Pro Val Ser

275 280 285

Arg Ser Tyr Gly Gly Gln Tyr Arg Cys Tyr Gly Ala His Asn Leu Ser

290 295 300

Ser Glu Trp Ser Ala Pro Ser Asp Pro Leu Asp Ile Leu Ile Ala Gly

305 310 315 320

Gln Phe Tyr Asp Arg Val Ser Leu Ser Val Gln Pro Gly Pro Thr Val

325 330 335

Ala Ser Gly Glu Asn Val Thr Leu Leu Cys Gln Ser Gln Gly Trp Met

340 345 350

Gln Thr Phe Leu Leu Thr Lys Glu Gly Ala Ala Asp Asp Pro Trp Arg

355 360 365

Leu Arg Ser Thr Tyr Gln Ser Gln Lys Tyr Gln Ala Glu Phe Pro Met

370 375 380

Gly Pro Val Thr Ser Ala His Ala Gly Thr Tyr Arg Cys Tyr Gly Ser

385 390 395 400

Gln Ser Ser Lys Pro Tyr Leu Leu Thr His Pro Ser Asp Pro Leu Glu

405 410 415

Leu Val Val Ser Gly Pro Ser Gly Gly Pro Ser Ser Pro Thr Thr Gly

420 425 430

Pro Thr Ser Thr Ser Gly Pro Glu Asp Gln Pro Leu Thr Pro Thr Gly

435 440 445

Ser Asp Pro Gln Ser Gly Leu Gly Arg His Leu Gly Val Val Ile Gly

450 455 460

Ile Leu Val Ala Val Ile Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Phe

465 470 475 480

Leu Ile Leu Arg His Arg Arg Gln Gly Lys His Trp Thr Ser Thr Gln

485 490 495

Arg Lys Ala Asp Phe Gln His Pro Ala Gly Ala Val Gly Pro Glu Pro

500 505 510

Thr Asp Arg Gly Leu Gln Trp Arg Ser Ser Pro Ala Ala Asp Ala Gln

515 520 525

Glu Glu Asn Leu Tyr Ala Ala Val Lys His Thr Gln Pro Glu Asp Gly

530 535 540

Val Glu Met Asp Thr Arg Ser Pro His Asp Glu Asp Pro Gln Ala Val

545 550 555 560

Thr Tyr Ala Glu Val Lys His Ser Arg Pro Arg Arg Glu Met Ala Ser

565 570 575

Pro Pro Ser Pro Leu Ser Gly Glu Phe Leu Asp Thr Lys Asp Arg Gln

580 585 590

Ala Glu Glu Asp Arg Gln Met Asp Thr Glu Ala Ala Ala Ser Glu Ala

595 600 605

Pro Gln Asp Val Thr Tyr Ala Gln Leu His Ser Leu Thr Leu Arg Arg

610 615 620

Glu Ala Thr Glu Pro Pro Pro Ser Gln Glu Gly Pro Ser Pro Ala Val

625 630 635 640

Pro Ser Ile Tyr Ala Thr Leu Ala Ile His

645 650

<210> 2

<211> 627

<212> PRT

<213> 智人

<400> 2

Gly His Leu Pro Lys Pro Thr Leu Trp Ala Glu Pro Gly Ser Val Ile

1 5 10 15

Thr Gln Gly Ser Pro Val Thr Leu Arg Cys Gln Gly Gly Gln Glu Thr

20 25 30

Gln Glu Tyr Arg Leu Tyr Arg Glu Lys Lys Thr Ala Leu Trp Ile Thr

35 40 45

Arg Ile Pro Gln Glu Leu Val Lys Lys Gly Gln Phe Pro Ile Pro Ser

50 55 60

Ile Thr Trp Glu His Ala Gly Arg Tyr Arg Cys Tyr Tyr Gly Ser Asp

65 70 75 80

Thr Ala Gly Arg Ser Glu Ser Ser Asp Pro Leu Glu Leu Val Val Thr

85 90 95

Gly Ala Tyr Ile Lys Pro Thr Leu Ser Ala Gln Pro Ser Pro Val Val

100 105 110

Asn Ser Gly Gly Asn Val Ile Leu Gln Cys Asp Ser Gln Val Ala Phe

115 120 125

Asp Gly Phe Ser Leu Cys Lys Glu Gly Glu Asp Glu His Pro Gln Cys

130 135 140

Leu Asn Ser Gln Pro His Ala Arg Gly Ser Ser Arg Ala Ile Phe Ser

145 150 155 160

Val Gly Pro Val Ser Pro Ser Arg Arg Trp Trp Tyr Arg Cys Tyr Ala

165 170 175

Tyr Asp Ser Asn Ser Pro Tyr Glu Trp Ser Leu Pro Ser Asp Leu Leu

180 185 190

Glu Leu Leu Val Leu Gly Val Ser Lys Lys Pro Ser Leu Ser Val Gln

195 200 205

Pro Gly Pro Ile Val Ala Pro Glu Glu Thr Leu Thr Leu Gln Cys Gly

210 215 220

Ser Asp Ala Gly Tyr Asn Arg Phe Val Leu Tyr Lys Asp Gly Glu Arg

225 230 235 240

Asp Phe Leu Gln Leu Ala Gly Ala Gln Pro Gln Ala Gly Leu Ser Gln

245 250 255

Ala Asn Phe Thr Leu Gly Pro Val Ser Arg Ser Tyr Gly Gly Gln Tyr

260 265 270

Arg Cys Tyr Gly Ala His Asn Leu Ser Ser Glu Trp Ser Ala Pro Ser

275 280 285

Asp Pro Leu Asp Ile Leu Ile Ala Gly Gln Phe Tyr Asp Arg Val Ser

290 295 300

Leu Ser Val Gln Pro Gly Pro Thr Val Ala Ser Gly Glu Asn Val Thr

305 310 315 320

Leu Leu Cys Gln Ser Gln Gly Trp Met Gln Thr Phe Leu Leu Thr Lys

325 330 335

Glu Gly Ala Ala Asp Asp Pro Trp Arg Leu Arg Ser Thr Tyr Gln Ser

340 345 350

Gln Lys Tyr Gln Ala Glu Phe Pro Met Gly Pro Val Thr Ser Ala His

355 360 365

Ala Gly Thr Tyr Arg Cys Tyr Gly Ser Gln Ser Ser Lys Pro Tyr Leu

370 375 380

Leu Thr His Pro Ser Asp Pro Leu Glu Leu Val Val Ser Gly Pro Ser

385 390 395 400

Gly Gly Pro Ser Ser Pro Thr Thr Gly Pro Thr Ser Thr Ser Gly Pro

405 410 415

Glu Asp Gln Pro Leu Thr Pro Thr Gly Ser Asp Pro Gln Ser Gly Leu

420 425 430

Gly Arg His Leu Gly Val Val Ile Gly Ile Leu Val Ala Val Ile Leu

435 440 445

Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Phe Leu Ile Leu Arg His Arg Arg

450 455 460

Gln Gly Lys His Trp Thr Ser Thr Gln Arg Lys Ala Asp Phe Gln His

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Pro Ala Gly Ala Val Gly Pro Glu Pro Thr Asp Arg Gly Leu Gln Trp

485 490 495

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500 505 510

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515 520 525

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565 570 575

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610 615 620

Ala Ile His

625

<210> 3

<211> 435

<212> PRT

<213> 智人

<400> 3

Gly His Leu Pro Lys Pro Thr Leu Trp Ala Glu Pro Gly Ser Val Ile

1 5 10 15

Ile Gln Gly Ser Pro Val Thr Leu Arg Cys Gln Gly Ser Leu Gln Ala

20 25 30

Glu Glu Tyr His Leu Tyr Arg Glu Asn Lys Ser Ala Ser Trp Val Arg

35 40 45

Arg Ile Gln Glu Pro Gly Lys Asn Gly Gln Phe Pro Ile Pro Ser Ile

50 55 60

Thr Trp Glu His Ala Gly Arg Tyr His Cys Gln Tyr Tyr Ser His Asn

65 70 75 80

His Ser Ser Glu Tyr Ser Asp Pro Leu Glu Leu Val Val Thr Gly Ala

85 90 95

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100 105 110

Gly Gly Asn Val Thr Leu Gln Cys Val Ser Gln Val Ala Phe Asp Gly

115 120 125

Phe Ile Leu Cys Lys Glu Gly Glu Asp Glu His Pro Gln Arg Leu Asn

130 135 140

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145 150 155 160

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165 170 175

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<213> 智人

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<213> 智人

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355

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<211> 117

<212> PRT

<213> 小家鼠

<400> 12

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu His

20 25 30

Thr Ile His Trp Ile Lys Gln Arg Ser Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Trp Phe Tyr Pro Gly Ser Gly Ser Met Lys Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Val Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Thr Arg Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg His Thr Asn Trp Asp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr

100 105 110

Leu Thr Val Ser Ser

115

<210> 13

<211> 111

<212> PRT

<213> 小家鼠

<400> 13

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Gly

20 25 30

Gly Asp Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Ile Pro Ala

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Leu Thr Leu Asn Ile His

65 70 75 80

Pro Val Glu Glu Asp Asp Ala Ala Met Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn

85 90 95

Glu Glu Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 14

<211> 5

<212> PRT

<213> 小家鼠

<400> 14

Glu His Thr Ile His

1 5

<210> 15

<211> 17

<212> PRT

<213> 小家鼠

<400> 15

Trp Phe Tyr Pro Gly Ser Gly Ser Met Lys Tyr Asn Glu Lys Phe Lys

1 5 10 15

Asp

<210> 16

<211> 8

<212> PRT

<213> 小家鼠

<400> 16

His Thr Asn Trp Asp Phe Asp Tyr

1 5

<210> 17

<211> 15

<212> PRT

<213> 小家鼠

<400> 17

Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Gly Gly Asp Ser Tyr Met Asn

1 5 10 15

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<212> PRT

<213> 小家鼠

<400> 18

Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser

1 5

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<212> PRT

<213> 小家鼠

<400> 19

Gln Gln Ser Asn Glu Glu Pro Trp Thr

1 5

<210> 20

<211> 117

<212> PRT

<213> 小家鼠

<400> 20

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Arg Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ala His

20 25 30

Thr Ile His Trp Val Lys Gln Arg Ser Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Trp Leu Tyr Pro Gly Ser Gly Ser Ile Lys Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Val Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Arg Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg His Thr Asn Trp Asp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr

100 105 110

Leu Thr Val Ser Ser

115

<210> 21

<211> 111

<212> PRT

<213> 小家鼠

<400> 21

Asn Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Gly

20 25 30

Gly Ala Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Ile Pro Ala

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Leu Thr Leu Asn Ile His

65 70 75 80

Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Met Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn

85 90 95

Glu Glu Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 22

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<212> PRT

<213> 小家鼠

<400> 22

Ala His Thr Ile His

1 5

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<211> 17

<212> PRT

<213> 小家鼠

<400> 23

Trp Leu Tyr Pro Gly Ser Gly Ser Ile Lys Tyr Asn Glu Lys Phe Lys

1 5 10 15

Asp

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<212> PRT

<213> 小家鼠

<400> 24

His Thr Asn Trp Asp Phe Asp Tyr

1 5

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<212> PRT

<213> 小家鼠

<400> 25

Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Gly Gly Ala Ser Tyr Met Asn

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<211> 7

<212> PRT

<213> 小家鼠

<400> 26

Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser

1 5

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<212> PRT

<213> 小家鼠

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1 5

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<212> PRT

<213> 小家鼠

<400> 28

Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

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Ser Val Arg Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

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Gly Val Ile Asp Pro Ser Asp Ser Tyr Thr Ser Tyr Asn Gln Asn Phe

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<210> 29

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<212> PRT

<213> 小家鼠

<400> 29

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Val Ser Val Gly

1 5 10 15

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Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Val

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Tyr Ala Ala Thr Asn Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Arg Ser Gly Thr Gln Tyr Ser Leu Lys Ile Asn Ser Leu Gln Ser

65 70 75 80

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100 105

<210> 30

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<212> PRT

<213> 小家鼠

<400> 30

Ser Tyr Trp Val His

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<212> PRT

<213> 小家鼠

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Val Ile Asp Pro Ser Asp Ser Tyr Thr Ser Tyr Asn Gln Asn Phe Lys

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Gly

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<212> PRT

<213> 小家鼠

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Gly Glu Arg Tyr Asp Gly Asp Tyr Phe Ala Met Asp Tyr

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<212> PRT

<213> 小家鼠

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Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Asn Leu Ala

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<212> PRT

<213> 小家鼠

<400> 34

Ala Ala Thr Asn Leu Ala Asp

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<211> 9

<212> PRT

<213> 小家鼠

<400> 35

Gln His Phe Trp Asn Thr Pro Arg Thr

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<211> 118

<212> PRT

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<400> 36

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Ser Val Thr Val Ser Ser

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<210> 37

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<212> PRT

<213> 小家鼠

<400> 37

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1 5 10 15

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<210> 38

<211> 120

<212> PRT

<213> 小家鼠

<400> 38

Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln

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Ser Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Gly

20 25 30

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65 70 75 80

Leu Lys Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys

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100 105 110

Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser

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<210> 39

<211> 112

<212> PRT

<213> 小家鼠

<400> 39

Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Thr

20 25 30

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65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Ile Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly

85 90 95

Ser His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 40

<211> 117

<212> PRT

<213> 小家鼠

<400> 40

Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln

1 5 10 15

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20 25 30

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Gly Val Ile Trp Gly Asp Gly Asn Thr Asn Tyr His Ser Ala Leu Ile

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115

<210> 41

<211> 108

<212> PRT

<213> 小家鼠

<400> 41

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Gly Thr Ala

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Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile

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65 70 75 80

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Gly Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

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<210> 42

<211> 330

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 具有取代的智人

<400> 42

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

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65 70 75 80

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<210> 43

<211> 330

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 具有取代的智人

<400> 43

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1 5 10 15

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Pro Ala Pro Glu Phe Glu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

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Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

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His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

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Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu

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Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

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260 265 270

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275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

325 330

<210> 44

<211> 330

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 具有取代的智人

<400> 44

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

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Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

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65 70 75 80

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Pro Ala Pro Glu Ala Glu Gly Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

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Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

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195 200 205

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210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu

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Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

325 330

<210> 45

<211> 330

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 具有取代的智人

<400> 45

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

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Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Ala Leu Pro Ala Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu

225 230 235 240

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

325 330

<210> 46

<211> 138

<212> PRT

<213> 智人

<400> 46

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1 5 10 15

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20 25 30

Ser Val Ile Thr Gln Gly Ser Pro Val Thr Leu Arg Cys Gln Gly Gly

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Val Val Thr Gly Ala Gly Ala Leu Gln Ser Thr Ala Ser Leu Phe Val

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Val Ser Leu Ser Leu Leu His Leu Tyr Ser

130 135

<210> 47

<211> 141

<212> PRT

<213> 智人

<400> 47

Thr Gly Val His Ser Gly Lys Pro Ile Pro Asn Pro Leu Leu Gly Leu

1 5 10 15

Asp Ser Thr Tyr Ile Lys Pro Thr Leu Ser Ala Gln Pro Ser Pro Val

20 25 30

Val Asn Ser Gly Gly Asn Val Ile Leu Gln Cys Asp Ser Gln Val Ala

35 40 45

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50 55 60

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65 70 75 80

Ser Val Gly Pro Val Ser Pro Ser Arg Arg Trp Trp Tyr Arg Cys Tyr

85 90 95

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100 105 110

Leu Glu Leu Leu Val Leu Gly Val Gly Ala Leu Gln Ser Thr Ala Ser

115 120 125

Leu Phe Val Val Ser Leu Ser Leu Leu His Leu Tyr Ser

130 135 140

<210> 48

<211> 139

<212> PRT

<213> 智人

<400> 48

Thr Gly Val His Ser Gly Lys Pro Ile Pro Asn Pro Leu Leu Gly Leu

1 5 10 15

Asp Ser Thr Ser Lys Lys Pro Ser Leu Ser Val Gln Pro Gly Pro Ile

20 25 30

Val Ala Pro Glu Glu Thr Leu Thr Leu Gln Cys Gly Ser Asp Ala Gly

35 40 45

Tyr Asn Arg Phe Val Leu Tyr Lys Asp Gly Glu Arg Asp Phe Leu Gln

50 55 60

Leu Ala Gly Ala Gln Pro Gln Ala Gly Leu Ser Gln Ala Asn Phe Thr

65 70 75 80

Leu Gly Pro Val Ser Arg Ser Tyr Gly Gly Gln Tyr Arg Cys Tyr Gly

85 90 95

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<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 合成的

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<210> 81

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<212> PRT

<213> 小家鼠

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Thr Ser Val Thr Val Ser Ser

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<212> PRT

<213> 小家鼠

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<212> PRT

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<212> PRT

<213> 小家鼠

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<212> PRT

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<212> PRT

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<212> PRT

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<212> PRT

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<212> PRT

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<212> PRT

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<212> PRT

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<212> PRT

<213> 小家鼠

<400> 110

Asp Ile Leu Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

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<211> 119

<212> PRT

<213> 小家鼠

<400> 111

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Val

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<213> 小家鼠

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<212> PRT

<213> 小家鼠

<400> 149

Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ser

1 5

<210> 150

<211> 9

<212> PRT

<213> 小家鼠

<400> 150

Gln Gln Ser Asn Glu Asp Pro Phe Thr

1 5

<210> 151

<211> 5

<212> PRT

<213> 小家鼠

<400> 151

Asn Tyr Tyr Val Gln

1 5

<210> 152

<211> 17

<212> PRT

<213> 小家鼠

<400> 152

Trp Ile Phe Pro Gly Ser Gly Glu Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys

1 5 10 15

Ala

<210> 153

<211> 9

<212> PRT

<213> 小家鼠

<400> 153

Gln Gln Thr Asn Glu Asp Pro Phe Thr

1 5

<210> 154

<211> 5

<212> PRT

<213> 小家鼠

<400> 154

Asn Tyr Tyr Met Gln

1 5

<210> 155

<211> 17

<212> PRT

<213> 小家鼠

<400> 155

Trp Ile Phe Pro Gly Gly Gly Glu Ser Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 156

<211> 15

<212> PRT

<213> 小家鼠

<400> 156

Ile Pro Ser Glu Ser Ile Asp Ser Tyr Gly Ile Ser Phe Met His

1 5 10 15

<210> 157

<211> 5

<212> PRT

<213> 小家鼠

<400> 157

Asn Tyr Tyr Ile Gln

1 5

<210> 158

<211> 17

<212> PRT

<213> 小家鼠

<400> 158

Trp Ile Phe Pro Gly Asn Gly Glu Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 159

<211> 15

<212> PRT

<213> 小家鼠

<400> 159

Arg Ala Asn Glu Ser Ile Asp Ser Tyr Gly Ile Ser Phe Met His

1 5 10 15

<210> 160

<211> 7

<212> PRT

<213> 小家鼠

<400> 160

Arg Ala Ser Asn Leu Asp Ser

1 5

<210> 161

<211> 17

<212> PRT

<213> 小家鼠

<400> 161

Trp Ile Phe Pro Gly Ser Gly Glu Ser Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 162

<211> 15

<212> PRT

<213> 小家鼠

<400> 162

Ile Pro Ser Glu Ser Ile Asp Ser Tyr Gly Ile Ser Phe Met His

1 5 10 15

<210> 163

<211> 5

<212> PRT

<213> 小家鼠

<400> 163

Asn Tyr Tyr Ile His

1 5

<210> 164

<211> 17

<212> PRT

<213> 小家鼠

<400> 164

Trp Ile Phe Pro Gly Ser Gly Glu Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys

1 5 10 15

Val

<210> 165

<211> 15

<212> PRT

<213> 小家鼠

<400> 165

Arg Ala Ser Glu Ser Ile Asp Ser Tyr Gly Ile Ser Phe Met His

1 5 10 15

<210> 166

<211> 17

<212> PRT

<213> 小家鼠

<400> 166

Trp Ile Phe Pro Gly Ser Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 167

<211> 15

<212> PRT

<213> 小家鼠

<400> 167

Arg Val Ser Glu Ser Ile Asp Ser Tyr Gly Ile Ser Phe Met His

1 5 10 15

<210> 168

<211> 7

<212> PRT

<213> 小家鼠

<400> 168

Arg Ala Ser Thr Leu Glu Ser

1 5

<210> 169

<211> 17

<212> PRT

<213> 小家鼠

<400> 169

Trp Ile Phe Pro Gly Asn Gly Glu Thr Asn Tyr Ser Glu Lys Phe Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 170

<211> 10

<212> PRT

<213> 小家鼠

<400> 170

Thr Trp Asn Tyr Asp Ala Arg Trp Val Tyr

1 5 10

<210> 171

<211> 15

<212> PRT

<213> 小家鼠

<400> 171

Arg Ala Ser Asp Gly Ile Asp Ser Tyr Gly Ile Ser Phe Met His

1 5 10 15

<210> 172

<211> 7

<212> PRT

<213> 小家鼠

<400> 172

Arg Ala Ser Ile Leu Glu Ser

1 5

<210> 173

<211> 17

<212> PRT

<213> 小家鼠

<400> 173

Trp Ile Phe Pro Gly Asn Gly Glu Thr Asn Tyr Ser Glu Lys Phe Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 174

<211> 15

<212> PRT

<213> 小家鼠

<400> 174

Arg Ala Ser Asp Gly Ile Asp Ser Tyr Gly Ile Ser Phe Met His

1 5 10 15

<210> 175

<211> 9

<212> PRT

<213> 小家鼠

<400> 175

Gln Gln Thr Asn Glu Ala Pro Phe Thr

1 5

<210> 176

<211> 5

<212> PRT

<213> 小家鼠

<400> 176

Asn Tyr Tyr Ile Asn

1 5

<210> 177

<211> 17

<212> PRT

<213> 小家鼠

<400> 177

Trp Ile Phe Pro Gly Asn Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 178

<211> 11

<212> PRT

<213> 小家鼠

<400> 178

Arg Ala Ser Glu Ser Ile Asp Ser Tyr Met Ser

1 5 10

<210> 179

<211> 7

<212> PRT

<213> 小家鼠

<400> 179

Gly Ala Ser Asn Leu Glu Ser

1 5

<210> 180

<211> 9

<212> PRT

<213> 小家鼠

<400> 180

Gln Gln Ser Asn Glu Asp Pro Trp Thr

1 5

<210> 181

<211> 15

<212> PRT

<213> 小家鼠

<400> 181

Arg Pro Ser Glu Asn Ile Asp Ser Tyr Gly Ile Ser Phe Met His

1 5 10 15

<210> 182

<211> 17

<212> PRT

<213> 小家鼠

<400> 182

Trp Ile Phe Pro Gly Thr Gly Glu Thr Asn Phe Asn Glu Lys Phe Lys

1 5 10 15

Val

<210> 183

<211> 10

<212> PRT

<213> 小家鼠

<400> 183

Ser Trp Asn Tyr Asp Ala Arg Trp Gly Tyr

1 5 10

<210> 184

<211> 15

<212> PRT

<213> 小家鼠

<400> 184

Arg Ala Ser Glu Ser Ile Asp Ser Phe Gly Ile Ser Phe Met His

1 5 10 15

<210> 185

<211> 9

<212> PRT

<213> 小家鼠

<400> 185

Gln Gln Ser Asn Glu Ala Pro Phe Thr

1 5

<210> 186

<211> 17

<212> PRT

<213> 小家鼠

<400> 186

Trp Ile Phe Pro Gly Ser Gly Glu Thr Asn Phe Asn Glu Lys Phe Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 187

<211> 15

<212> PRT

<213> 小家鼠

<400> 187

Arg Ala Ser Glu Ser Ile Asp Ser Tyr Gly Ile Ser Phe Met His

1 5 10 15

<210> 188

<211> 17

<212> PRT

<213> 小家鼠

<400> 188

Trp Ile Phe Pro Gly Ser Gly Glu Thr Asn Phe Asn Glu Lys Phe Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 189

<211> 15

<212> PRT

<213> 小家鼠

<400> 189

Arg Ala Ser Glu Ser Ile Asp Ser Tyr Gly Ile Ser Phe Met His

1 5 10 15

<210> 190

<211> 7

<212> PRT

<213> 小家鼠

<400> 190

Arg Ala Ser Asn Leu Val Ser

1 5

<210> 191

<211> 17

<212> PRT

<213> 小家鼠

<400> 191

Trp Ile Phe Pro Gly Ser Gly Glu Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 192

<211> 15

<212> PRT

<213> 小家鼠

<400> 192

Arg Ala Ser Glu Thr Ile Asp Ser Tyr Gly Ile Ser Phe Met His

1 5 10 15

<210> 193

<211> 17

<212> PRT

<213> 小家鼠

<400> 193

Trp Ile Phe Pro Gly Asn Asn Glu Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 194

<211> 15

<212> PRT

<213> 小家鼠

<400> 194

Arg Ala Ser Glu Ile Ile Asp Ser Tyr Gly Ile Ser Phe Met His

1 5 10 15

<210> 195

<211> 17

<212> PRT

<213> 小家鼠

<400> 195

Trp Ile Phe Pro Gly Ser Gly Glu Thr Asn Tyr Ser Glu Lys Phe Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 196

<211> 15

<212> PRT

<213> 小家鼠

<400> 196

Arg Ala Ser Glu Ser Ile Asp Ser Tyr Gly Ile Ser Phe Met His

1 5 10 15

<210> 197

<211> 17

<212> PRT

<213> 小家鼠

<400> 197

Trp Ile Phe Pro Gly Ser Gly Glu Thr Asn Tyr Asn Glu Asn Phe Lys

1 5 10 15

Ala

<210> 198

<211> 17

<212> PRT

<213> 小家鼠

<400> 198

Trp Ile Phe Pro Gly Ser Gly Glu Thr Asn Tyr Asn Glu Asn Phe Arg

1 5 10 15

Ala

<210> 199

<211> 15

<212> PRT

<213> 小家鼠

<400> 199

Arg Pro Ser Glu Asn Ile Asp Ser Tyr Gly Ile Ser Phe Met His

1 5 10 15

<210> 200

<211> 17

<212> PRT

<213> 小家鼠

<400> 200

Trp Ile Phe Pro Gly Ser Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 201

<211> 15

<212> PRT

<213> 小家鼠

<400> 201

Arg Val Ser Glu Ser Ile Asp Ser Tyr Gly Ile Ser Phe Met His

1 5 10 15

<210> 202

<211> 17

<212> PRT

<213> 小家鼠

<400> 202

Trp Ile Phe Leu Gly Ser Gly Glu Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 203

<211> 15

<212> PRT

<213> 小家鼠

<400> 203

Arg Ala Ser Glu Ser Ile Asp Ser Tyr Gly Ile Ser Phe Ile His

1 5 10 15

<210> 204

<211> 17

<212> PRT

<213> 小家鼠

<400> 204

Trp Ile Phe Pro Gly Ser Gly Glu Thr Asn Tyr Asn Glu Arg Phe Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 205

<211> 15

<212> PRT

<213> 小家鼠

<400> 205

Arg Ala Ser Glu Ser Ile Asp Ser Tyr Gly Ile Ser Phe Met His

1 5 10 15

<210> 206

<211> 17

<212> PRT

<213> 小家鼠

<400> 206

Trp Ile Phe Pro Gly Ser Gly Glu Thr Asn Phe Asn Glu Lys Phe Lys

1 5 10 15

Val

<210> 207

<211> 15

<212> PRT

<213> 小家鼠

<400> 207

Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Ser Tyr Gly Ile Ser Phe Met His

1 5 10 15

<210> 208

<211> 5

<212> PRT

<213> 小家鼠

<400> 208

Ser Tyr Gly Val Ser

1 5

<210> 209

<211> 16

<212> PRT

<213> 小家鼠

<400> 209

Ile Ile Trp Gly Asp Gly Ser Thr Asn Tyr His Ser Ala Leu Val Ser

1 5 10 15

<210> 210

<211> 10

<212> PRT

<213> 小家鼠

<400> 210

Pro Asn Trp Asp Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr

1 5 10

<210> 211

<211> 11

<212> PRT

<213> 小家鼠

<400> 211

Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr Leu Asn

1 5 10

<210> 212

<211> 7

<212> PRT

<213> 小家鼠

<400> 212

Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser

1 5

<210> 213

<211> 9

<212> PRT

<213> 小家鼠

<400> 213

Gln Gln Gly Ile Thr Leu Pro Leu Thr

1 5