一种两歧双歧杆菌BB-20及制备改善肤质、减少色斑产品的应用

摘要

本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种两歧双歧杆菌BB‑20及制备改善肤质、减少色斑产品的应用，所述两歧双歧杆菌BB‑20，分类命名为两歧双歧杆菌Bifidobacterium bifidum，已于2021年3月11日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC 21893。本发明菌株的胃酸屏障透过性好，对肠道表皮细胞的亲和力高，具有极好的定殖效果，特别适合口服给药，能够通过激活抗氧化等通路，增加体内超氧化物歧化酶相关基因的表达，提高机体的抗氧化水平，瓦解黑色素斑，改善肤质。

说明书

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种两歧双歧杆菌BB-20及制备改善肤质、减少色斑产品的应用。

背景技术

益生菌是通过定殖在人体内，改变宿主某一部位菌群组成的一类对宿主有益的活性微生物，具有巨大的医用价值。现有研究表明，益生菌在肠胃调节、抗氧化、降胆固醇、预防胃肠道癌症、免疫调节等方面均有确切疗效。

但是，益生菌的生物学功能不囿于其系统分类，即便同一种属的不同菌株之间都存在巨大的生物学差异。同时，常见商用菌株普遍存在摄入后定殖率不高，肠道表皮细胞吸附能力不强，益生作用不确定等因素。因此，能否研究筛选到益生功能最优越的菌株，明确其益生作用和治疗标靶成为目前微生态制剂行业急需解决的问题。

基于此，提供一种定殖率高、细胞亲和力强的两歧双歧杆菌便具有十分重要的意义。

发明内容

针对常见商用益生菌菌株普遍存在的摄入后定殖率不高、肠道表皮细胞吸附能力不强的问题，本发明提供一种两歧双歧杆菌Bifidobacterium bifidum新菌株及其应用，该菌株的胃酸屏障透过性好，结合肠溶性制剂方案，能够达成极高传送效率。

第一方面，本发明所提供的两歧双歧杆菌BB-20，分类命名为Bifidobacteriumbifidum，已于2021年3月11日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心（China GeneralMicrobiological Culture Collection Center，CGMCC），保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC 21893。

进一步的，所述两歧双歧杆菌BB-20分离自西藏那曲健康婴儿粪便。

第二方面，本发明提供一种两歧双歧杆菌BB-20的应用，所述应用为使用两歧双歧杆菌BB-20制备改善肤质、减少色斑产品，所述改善肤质、减少色斑产品为抗衰老产品、美白产品和/或色斑淡化产品。

进一步的，所述改善肤质、减少色斑产品为口服剂型。

进一步的，所述改善肤质、减少色斑产品含有两歧双歧杆菌BB-20菌粉。

进一步的，所述改善肤质、减少色斑产品中两歧双歧杆菌BB-20含量为0.5×10

进一步的，所述两歧双歧杆菌BB-20菌粉的制备方法为：

将两歧双歧杆菌BB-20接种于液态MRS培养基中培养，对所得发酵菌液进行离心、冻干，得两歧双歧杆菌BB-20菌粉。

进一步的，所述两歧双歧杆菌BB-20的培养条件为厌氧、35℃，培养时间为18h。

本发明的有益效果在于，

本发明提供一种定殖率高、细胞亲和力强的两歧双歧杆菌新菌株BB-20，该菌株的胃酸屏障透过性好，对肠道表皮细胞的亲和力高，具有极好的定殖效果，特别适合口服给药，能够通过激活抗氧化等通路，增加体内超氧化物歧化酶相关基因的表达，提高机体的抗氧化水平，瓦解黑色素斑，改善肤质。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，对于本领域普通技术人员而言，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为BB-20与模式菌株CICC-6071的指纹图谱；

图2为两种菌株饲喂条件下雌性果蝇生存曲线；

图3为两种菌株饲喂条件下雌性果蝇抗氧化抗衰老相关基因表达。

具体实施方式

为了使本技术领域的人员更好地理解本发明中的技术方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。

实施例1 菌株的筛选和保藏

1、菌株来源

西藏那曲健康婴儿粪便。

2、分离方法

（1）健康婴儿粪便样品混合0.7%盐水，充分振荡混匀得到混合液体；

（2）使用接菌环蘸取混合液体，接种于含有TPY培养基的平板上划线培养，培养条件为厌氧、37℃、48h，挑选单菌落并收集；

（3）来自初代平板的菌落，在新的TPY平板上进行传代培养，培养条件为厌氧、37℃、72h，菌落形态稳定后停止传代；

（4）挑取单菌落接菌于液态MRS培养基中，培养条件为厌氧、37℃、18h，以备保藏和鉴定使用，并给予企业编号BB-20。

实施例2 菌株的鉴定（系统学）

将BB-20液体培养基菌悬液收集至灭菌离心管中，并清洗离心2次，使用天根细菌基因组提取试剂盒（DP302）进行基因组DNA的提取，提取完成后，利用通用引物进行16SrDNA的PCR试验，并对获得的扩增子产物进行测序，将测序结果与Gene Bank中相关序列进行blast比对；

所述通用引物包括：

27f：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，

1492r：5'-CTACGGCTACCTTGTT-3'。

该BB-20菌株的16S rDNA基因序列为：

CTTGGTGGTGAGAGTGGCGAACGGGTGAGTAATGCGTGACCGACCTGCCCCATGCTCCGGAATAGCTCCTGGAAACGGGTGGTAATGCCGGATGTTCCACATGATCGCATGTGATTGTGGGAAAGATTCTATCGGCGTGGGATGGGGTCGCGTCCTATCAGCTTGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCTTCGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGCGACCGGCCACATTGGGACTGAGATACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCGACGCCGCGTGAGGGATGGAGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTTGTTTGGGAGCAAGCCTTCGGGTGAGTGTACCTTTCGAATAAGCGCCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGCGCAAGCGTTATCCGGATTTATTGGGCGTAAAGGGCTCGTAGGCGGCTCGTCGCGTCCGGTGTGAAAGTCCATCGCTTAACGGTGGATCTGCGCCGGGTACGGGCGGGCTGGAGTGCGGTAGGGGAGACTGGAATTCCCGGTGTAACGGTGGAATGTGTAGATATCGGGAAGAACACCGATGGCGAAGGCAGGTCTCTGGGCCGTCACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGGTGGACGCTGGATGTGGGGCACGTTCCACGTGTTCCGTGTCGGAGCTAACGCGTTAAGCGTCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAAGAAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGCGGAGCATGCGGATTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTGGGCTTGACATGTTCCCGACGACGCCAGAGATGGCGTTTCCCTTCGGGGCGGGTTCACAGGTGGTGCATGGTCGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTCGCCCCGTGTTGCCAGCACGTTATGGTGGGAACTCACGGGGGACCGCCGGGGTTAACTCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAGATCATCATGCCCCTTACGTCCAGGGCTTCACGCATGCTACAATGGCCGGTACAGCGGGATGCGACATGGCGACATGGAGCGGATCCCTGAAAACCGGTCTCAGTTCGGATCGGAGCCTGCAACCCGGCTCCGTGAAGGCGGAGTCGCTAGTAATCGCGGATCAGCAACGCCGCGGTGAATGCGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCAAGTCATGAAAGTGGGCAGCACCCGAAGCCGGTGGCCTAACCCCTTGTGGGATGGAGCCGTCTAAGGTGAGGCTCGT。

实施例3 菌株的鉴定（基因图谱）

以实施例2得到BB-20基因组DNA为模板，通过细菌通用随机引物5'-GACGGATCAG-3'进行RAPD扩增，随后采用琼脂糖凝胶电泳（2%琼脂糖）对扩增产物进行检测，并与Bifidobacterium bifidum模式菌株（购买自中国工业微生物菌种保藏管理中心，编号：CICC-6071）的基因组结构进行比对。

经比对，BB-20与模式菌株（CICC-6071）基因组结构有所不同，属于同一细菌物种下不同菌株，结果见图1。

实施例4 胃酸屏障耐受试验

人工模拟胃酸及胆汁酸，检验BB-20的胃酸屏障透过性，以CICC-6071为参比菌株，并每组设置5个生物学重复，以验证其统计学显著性。

试验方法包括以下步骤：

（1）BB-20由冻存管活化，经5次复壮（10h）后，接种于10mL胃液模拟培养基中（TPY，pH3.0，盐酸调pH），培养2h；

（2）取3mL培养液，采用LIVE/DEAD BacLight™（Thermo）细菌活性检测试剂盒对细胞活性进行区分染色；

（3）在奥林巴斯BX51落射荧光显微镜下进行活死细胞观察和计数，根据公式存活率=2h活菌细胞数/初始活菌细胞数×100%，计算存活率。

结果显示，BB-20在pH3.0的液体培养基中，2小时后的存活率达到（102.4%±6%），显著（T-test，p<0.05）高于模式菌株CICC-6071（88.9%±8%），说明该菌株的胃酸屏障透过性好，结合肠溶性制剂方案，能够达成极高传送效率。

实施例5 肠道定殖和细胞亲和力试验

以Caco-2细胞模拟肠道表皮细胞环境，通过共培养试验，检测BB-20菌株的肠道上皮细胞的亲和能力，对照菌株为模式菌株CICC-6071，定殖试验设置5个生物学重复。

试验方法包括以下步骤：

（1）肠道细胞培养：1mL 0.05%Insulin处理将人体肠道细胞株Caco-2，5min后进行分离，采用吸光法定量其丰度后，分装于96孔细胞板（10000细胞/板），进入厌氧工作站培养；

（2）菌株制备：取BB-20以TPY液体培养基活化两次，3000g离心10min获得菌体，菌体转移至无菌PBS（pH7.2）缓冲液中清洗两次备用，向步骤（1）的细胞培养板中每孔加入20μL菌液培养1h待检；

（3）结合试验：以PBS缓冲液洗细胞培养板去除游离乳酸菌，向每个孔洞中加入100μL 10%福尔马林，静置细胞板0.5h；

（4）固定和染色：加入100μL结晶紫染色5min后，以少量75%酒精快速冲洗，去除细胞上的染色剂；

（5）计数和观察：将细胞培养板置于倒置相差显微镜下，挑选20个随机视野，挑选50个Caco-2细胞，观察其吸附的BB-20数量，计算平均值。

结果显示，本发明中涉及的两歧双歧杆菌BB-20的定殖力为（69%±12%），粘附力较强，显著（T-test，p<0.05）高于模式菌株CICC-6071（51%±9%），说明该菌株对肠道表皮细胞的亲和力高，具有极好的定殖效果，特别适合口服给药。

实施例6 抗氧化及实验动物全寿命周期评估

采用早衰型果蝇突变体，加速模拟雌性早衰，该果蝇突变体来自美国印第安纳Bloomington果蝇资源中心，

编号为35578，P{TRiP.GL00156}attP2，

基因型为y[1]sc[*]v[1]；P{y[+t7.7] v[+t1.8]=TRiP.GL00156}attP2，

生物学功能为果蝇衰老加速模型。

按如下组分配制基础培养基：蔗糖40g、酵母25g、玉米粉67g、大豆粉9g、琼脂粉10g、苯甲酸钠1g、对羟基苯甲酸甲酯0.25g和水1000mL。

试验方法包括以下步骤：

（1）果蝇培养：方法参照Whitecooper H. Fly Pushing：The Theory andPractice of Drosophila Genetics，Second Edition By Ralph J Greenspan[J].Quarterly Review of Biology，2004，36(3)：1139-1140；

（2）给药和观测：选取雌性果蝇400头，平均分为CICC-6071组和BB-20组，每组分别装于10根含有2mL培养基的果蝇管中，每根果蝇管内有20头果蝇，每5日换培养基，每日观测记录果蝇死亡数目，培养条件为：25℃、12h/12h光暗节律交替，60%湿度；

其中CICC-6071组的培养基为基础培养基+CICC6071冻干粉1×10

（3）抗衰老和能量代谢相关基因表达检测：选取雌性果蝇600头，平均分为三组，分别为对照组、CICC-6071组和BB-20组，每组分别装于10根含有2mL培养基的果蝇管中，每根果蝇管内有20头果蝇，每5日换培养基，培养条件为：25℃、12h/12h光暗节律交替，60%湿度；

其中对照组的培养基为基础培养基，CICC-6071组的培养基为基础培养基+CICC6071冻干粉1×10

培养30天后采用荧光定量PCR法，对参试果蝇在给予BB-20和CICC-6071后的抗氧化、衰老等相关基因的表达进行检测，基于此考察BB-20对雌性果蝇的抗衰老作用，荧光定量PCR检测涉及的基因和引物对如表1所示。

试验结果如表2、图2、图3所示。结果表明，本发明中涉及的两歧双歧杆菌BB-20能够显著增加突变体果蝇的寿命（Log-rank test p=0.3001），与参比菌株CICC-6071相比，能够显著改善突变体果蝇60日存活率；

其次，该菌株能够显著提高雌性果蝇机体抗氧化水平，相比对照组，饲喂BB-20菌株的雌性果蝇，sod2基因呈现2.8倍表达上调（p=0.007），同期参试的模式菌株CICC-6071未呈现类似的生物学功能；

同时，相比模式菌株CICC-6071，BB-20对雌性果蝇的抗衰老基因和能量代谢速率（Srl和ATPsyn-d）的提升效果也有显著提高。

表1 荧光定量PCR检测涉及的基因和引物对

表2 两种益生菌饲喂条件下果蝇寿命曲线Log-rank检验

实施例7 一种改善肤质、减少色斑产品

一种改善肤质、减少色斑产品，含有两歧双歧杆菌BB-20菌粉，两歧双歧杆菌BB-20含量为1.0×10

（1）健康婴儿粪便样品混合0.7%盐水，充分振荡混匀得到混合液体；

（2）使用接菌环蘸取混合液体，接种于含有TPY培养基的平板上划线培养，培养条件为厌氧、37℃、48h，挑选单菌落并收集；

（3）来自初代平板的菌落，在新的TPY平板上进行传代培养，培养条件为厌氧、37℃、72h，菌落形态稳定后停止传代；

（4）挑取单菌落接种于液态MRS培养基中，培养条件为厌氧、35℃、18h；

（5）对步骤（4）的发酵菌液进行离心、冻干，得到两歧双歧杆菌BB-20菌粉。

实施例8 美白效果及色斑淡化效果评估

随机选择100名志愿者（男女各50名，年龄在30~50岁之间），其中男志愿者随机分为BB-20组和CICC-6071组，女志愿者随机分为BB-20组和CICC-6071组，各实验组人数相同，BB-20组试用实施例7制备的改善肤质、减少色斑产品，CICC-6071组试用含有CICC-6071的制剂，该制剂的制备方法与实施例7相同，每天每人使用剂量为2g（规格：1.0×10

表3 服用益生菌制剂50日皮肤黑色素色斑平均改善统计

注：*p<0.05表示具有相关性；*p<0.01表示显著具有相关性。

结果表明，BB-20能够通过激活抗氧化等通路，增加体内超氧化物歧化酶相关基因的表达，提高机体的抗氧化水平，瓦解黑色素斑，改善肤质；大队列志愿者试验数据显示，以该菌株菌粉为核心成分的改善肤质、减少色斑产品，对女性肤质的改善作用尤其明显，通过50日连续服用，参试女性志愿者的色素淡化水平显著高于模式菌株；同时，BB-20菌株对男性肤质的改善和色斑的去除也具有显著效果。

值得注意的是，在服用初期，模式菌株CICC-6071呈现了较高的致腹泻性，BB-20菌株致腹泻率则显著低于模式菌株，具有更高的可适应性。

尽管通过参考附图并结合优选实施例的方式对本发明进行了详细描述，但本发明并不限于此。在不脱离本发明的精神和实质的前提下，本领域普通技术人员可以对本发明的实施例进行各种等效的修改或替换，而这些修改或替换都应在本发明的涵盖范围内/任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以权利要求所述的保护范围为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 山东中科嘉亿生物工程有限公司

<120> 一种两歧双歧杆菌BB-20及制备改善肤质、减少色斑产品的应用

<130> 2021

<160> 12

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

agagtttgat cctggctcag 20

<210> 2

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<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

ctacggctac cttgtt 16

<210> 3

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<212> DNA

<213> Bifidobacterium bifidum

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cttggtggtg agagtggcga acgggtgagt aatgcgtgac cgacctgccc catgctccgg 60

aatagctcct ggaaacgggt ggtaatgccg gatgttccac atgatcgcat gtgattgtgg 120

gaaagattct atcggcgtgg gatggggtcg cgtcctatca gcttgttggt gaggtaacgg 180

ctcaccaagg cttcgacggg tagccggcct gagagggcga ccggccacat tgggactgag 240

atacggccca gactcctacg ggaggcagca gtggggaata ttgcacaatg ggcgcaagcc 300

tgatgcagcg acgccgcgtg agggatggag gccttcgggt tgtaaacctc ttttgtttgg 360

gagcaagcct tcgggtgagt gtacctttcg aataagcgcc ggctaactac gtgccagcag 420

ccgcggtaat acgtagggcg caagcgttat ccggatttat tgggcgtaaa gggctcgtag 480

gcggctcgtc gcgtccggtg tgaaagtcca tcgcttaacg gtggatctgc gccgggtacg 540

ggcgggctgg agtgcggtag gggagactgg aattcccggt gtaacggtgg aatgtgtaga 600

tatcgggaag aacaccgatg gcgaaggcag gtctctgggc cgtcactgac gctgaggagc 660

gaaagcgtgg ggagcgaaca ggattagata ccctggtagt ccacgccgta aacggtggac 720

gctggatgtg gggcacgttc cacgtgttcc gtgtcggagc taacgcgtta agcgtcccgc 780

ctggggagta cggccgcaag gctaaaactc aaagaaattg acgggggccc gcacaagcgg 840

cggagcatgc ggattaattc gatgcaacgc gaagaacctt acctgggctt gacatgttcc 900

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gttgccagca cgttatggtg ggaactcacg ggggaccgcc ggggttaact cggaggaagg 1080

tggggatgac gtcagatcat catgcccctt acgtccaggg cttcacgcat gctacaatgg 1140

ccggtacagc gggatgcgac atggcgacat ggagcggatc cctgaaaacc ggtctcagtt 1200

cggatcggag cctgcaaccc ggctccgtga aggcggagtc gctagtaatc gcggatcagc 1260

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ggcagcaccc gaagccggtg gcctaacccc ttgtgggatg gagccgtcta aggtgaggct 1380

cgt 1383

<210> 4

<211> 10

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

gacggatcag 10

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<211> 19

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 5

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<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 6

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<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

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<212> DNA

<213> 人工合成

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<212> DNA

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<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 10

gggaccgcga gctgatggtt 20

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<212> DNA

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cacaatgtgg tgggtcagg 19

<210> 12

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 12

ggcaccatga ccagcatt 18