一种快速发展澳洲野生稻特异性分子标记的方法

摘要

本发明属于生物技术领域，目的是在不对澳洲野生稻全基因组测序的情况下，提供一种快速发展澳洲野生稻特异分子标记的方法。通过比对澳洲野生稻的BAC末端序列与栽培水稻品种序列之间的差异而设计一个特异性分子标记，原理是利用澳洲野生稻与栽培水稻品种序列间的缺失或者插入，在缺失或插入的序列两端设计引物。选取幼嫩的植株叶片，采用CTAB法提取基因组总DNA，根据琼脂糖凝胶电泳的结果验证分子标记是否在澳洲野生稻与所选水稻品种之间具有多态性。利用本发明的方法可以快速准确地鉴别澳洲野生稻与栽培水稻的多态性，且启动成本低、效率高、操作简单而且条带的特异性明显。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种快速发展澳洲野生稻特异性分子标记的方法。

背景技术

聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)技术是由美国PE Cetus公司的Kary Mullis在1983年首先建立的体外扩增目的基因的技术，该项技术可以在几个小时内将特定的DNA片段扩增数百万倍，因其便捷快速的特点，该技术在现代分子生物学研究中发挥了重要作用。

InDel标记(Insertion/Deletion markers)是根据基因组中的插入缺失位点，设计扩增这些位点的PCR引物。基于PCR技术的InDel标记因其功能强大、效率高、操作简单、成本低等优点被广泛应用于分子标记辅助选择育种、QTL定位以及物种鉴定，并且已经被成功的用于研究标记性状关联和遗传变异。

澳洲野生稻(O.australiensis)广泛分布于澳大利亚北部，是唯一属于EE基因组的水稻，其基因组大小约是普通水稻基因组的三倍大，共有24条染色体。其直链淀粉含量高，糊化粘度低，能抗白背飞虱和褐飞虱，抗白叶枯病和稻瘟病，高抗三化螟，且抗旱、耐热、耐盐，具有许多抵抗生物胁迫与非生物胁迫的优异性状。

而目前关于澳洲野生稻的相关研究较少，且因为其基因组太大，测序成本高，工作量大，耗费时间长，因此还未有关于澳洲野生稻全基因组测序的报道。通过开发出能快速鉴定澳洲野生稻特异性的分子标记，将对发掘和利用澳洲野生稻的有利性状起到重要的推进作用。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供一种在不对澳洲野生稻全基因组测序的情况下，快速发展澳洲野生稻特异分子标记的方法，该方法能够在短时间内大量发展澳洲野生稻的特异分子标记，且结果稳定、操作简单、效率高、启动成本低且条带的特异性明显。

一种澳洲野生稻特异性分子标记引物，引物序列如下：

正向引物序列：5’-CTCCTCTTCCACGACTGCTT-3’；

反向引物序列：5’-GGTTCATCTCGCTCTTCTCC-3’。

一种澳洲野生稻特异性分子标记引物的制备方法，将澳洲野生稻的BAC末端序列与另一已经全基因组测序水稻品种进行序列比对并设计引物，在缺失或插入的序列两端设计引物。

进一步的，所述已经全基因组测序水稻品种为日本晴。

进一步的，提取待检测水稻叶片的总DNA，并以此DNA为模板，利用所设计分子标记对样品进行PCR扩增；PCR反应结束后，对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳来验证分子标记的可利用性。

进一步的，采用CTAB法提取待测种质的幼嫩叶片DNA，所提取的DNA溶解于双蒸水中，4℃保存备用。

进一步的，PCR反应体系为：反应体积为20μL，其中包括：2×Taq Mix buffer 10μL，双蒸水6μL，10μm的引物E5-4 2μL，待测样品DNA 2Ml；PCR反应条件为：95℃4分钟；95℃30秒，55℃30秒，72℃30秒，35个循环；72℃10分钟。

进一步的，PCR产物在琼脂糖凝胶电泳上检测，用1×TAE作为电泳缓冲液，电泳恒定电压为120V；电泳30min后，在凝胶成像系统下观察并拍摄。

一种鉴别澳洲野生稻的方法，通过上述引物扩增水稻DNA，并根据扩增结果判断鉴定结果。

进一步的，在168bp处出现特异性扩增条带的品种为澳洲野生稻。

上述澳洲野生稻特异性分子标记引物在鉴定水稻中的应用。

本发明所述的一种能够快速发展澳洲野生稻特异分子标记的方法，其特征在于能够在不对澳洲野生稻全基因组测序的情况下，短时间内发展出许多所需要的能够检测澳洲野生稻特异性的分子标记。在发展特异性分子标记前，需要解决的技术问题包括：1)得到澳洲野生稻的BAC末端序列。2)配合研究的水稻品种的全基因组序列是已知的。3)了解设计引物的方法及原理。4)采集需要检测的水稻叶片。5)提取其叶片总DNA，并以此DNA为模板，利用所设计分子标记对样品进行PCR扩增。6)PCR反应结束后，对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳来验证分子标记的多态性。

本发明是根据澳洲野生稻的BAC末端序列与其他水稻品种序列之间的差异而设计一个特异性分子标记，属于Indel标记。设计该标记的原理是利用澳洲野生稻与其他水稻品种序列间的缺失或者插入，在缺失或插入的序列两端设计引物。以澳洲野生稻与栽培稻日本晴为例，将澳洲野生稻BAC末端序列与日本晴序列比对，在澳洲野生稻序列缺失部分的两端设计引物，此引物为第一次公开，序列如下：正向引物序列“5’-CTCCTCTTCCACGACTGCTT-3’”；

反向引物序列“5’-GGTTCATCTCGCTCTTCTCC-3’”。

然后验证该引物的特异性，包括1)采集澳洲野生稻与待鉴定的水稻品种叶片。2)提取步骤1)的总DNA。3)以叶片总DNA为模板，利用上述引物对待测样品进行PCR扩增。4)PCR反应结束后，对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳来验证分子标记的多态性。

到目前为止还没有一种能够快速发展澳洲野生稻特异分子标记的报道。本发明目的是能够在不对澳洲野生稻全基因组测序的情况下，提供一种澳洲野生稻特异分子标记引物的开发方法，该方法能够在短时间内大量发展澳洲野生稻的特异分子标记，且结果稳定、操作简单、效率高、启动成本低且条带的特异性明显。

附图说明

图1是NCBI网站Blast功能界面。上方箭头为输入已下载的澳洲野生稻BAC末端序列OA_ABa0039N09.f的位置；中部箭头所指的方框内为所选择的水稻品种名称，这里选择的是栽培稻粳稻；下方箭头为BLAST；

图2是比对之后的结果。箭头表示比对结果成功率最高的选项。

图3为经过比对之后的结果。横线代表根据比对结果设计的前引物及后引物。方框代表澳洲野生稻序列对比栽培稻粳稻品种日本晴序列中缺失的部分。

图4用E5-4(步骤4中的引物)对日本晴和澳洲野生稻进行检测的胶图。左边为2000的Marker；两个特异性条带分别为栽培稻粳稻品种日本晴和澳洲野生稻。

图5用E5-4(步骤4中的引物)对日本晴和澳洲野生稻及两者杂交发展的染色体片段代换系进行检测的胶图。第一个条带为日本晴；第二个条带为澳洲野生稻；后面的条带为澳洲野生稻与日本晴杂交再回交发展的染色体片段代换系。

具体实施方式

这里以发展澳洲野生稻与粳稻品种日本晴的特异分子标记举例。

1.已测序的澳洲野生稻BAC末端序列OA_ABa0039N09.f如下：

>OA_ABa0039N09.f

TGTGCTTTCTGCTGGTGGTGGTGTTCATGGTGGCGGCGGCGATGGCCGGAGCCGATCGCGAGCTGAAGGTTGGGTACTACGAGAAGACGTGCAAAGACGTGGAGAAGATTGTGAACTCCATCGTCGTGAACTCCGTCAAGGCCAACCGCGGCAAGGGTGCCGGCCTCGTCCGCCTCCTCTTCCACGACTGCTTCGTCAGGGTAAGGAGCTAGCTAGTAATTTGATCGATCACCATGCGTGCATGCAATACAATGCACGTAGAGCTCGCTAGGCATCAATGGTGGCGGCTTTGATGATTAATGGTTTGGTCGTCGTGCAGGGGTGTGACGCCTCCGTGCTGCTGGAGAAGAGCGAGATGAACCGGCGGCCGGAGAAGGAGTCTCCGGCGAACATCGGGATCCGGGGCATGGACGTGATCGACGCGATCAAGGCGGCGCTGGAGGCACGGTGCCCCAACACGGTGTCCTGCGCCGACATCATCGCCTACGCGGCGCGCGACGCGTCCAGGTACCTCAGCCGCGGGGGAGTCGACTTCGCCGTCCCCGCCGGCCGCCTCGACGGCGTGGTCTCCCGCAGCAGGGACGCCGACGTGTTCCTACCCGACCCCGCCGCCAACCTCACCGACCT(SEQ ID NO.1)。

2.在NCBI网站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov)输入已下载的澳洲野生稻BAC末端序列OA_ABa0039N09.f，日本晴在国际水稻基因组计划中作为典型粳稻基因组供体，已经完成全基因组测序，其序列信息被公认为现有作物基因组序列中质量最高的，通常在基因测序中主要用作参考基因组。因此此处选择粳稻品种日本晴的序列，如图1。使用网站的Blast功能将澳洲野生稻BAC末端序列OA_ABa0039N09.f与粳稻日本晴序列做一个比对，比对结果如图2，选择序列匹配度最高的第一个选项。发现澳洲野生稻的BAC末端序列相比日本晴的序列缺失了22个碱基，缺失位点如图3方框部分。

3.利用澳洲野生稻与日本晴序列间22个碱基的缺失，使用Primer Premier 5软件在缺失的序列两端设计引物，注意要将缺失的区域包含在左引和右引之间。如图3横线部分。

4.这里将设计的引物定名为E5-4，引物序列如下：

正向引物序列“5’-CTCCTCTTCCACGACTGCTT-3’”(SEQ ID NO.2)；

反向引物序列“5’-GGTTCATCTCGCTCTTCTCC-3’”(SEQ ID NO.3)。

5.采集澳洲野生稻与粳稻品种日本晴的叶片，采用CTAB法提取基因组总DNA。所提取的DNA溶解于双蒸水中，4℃保存备用。

6.以步骤4中的引物和步骤5中提取的总DNA为模板，利用上述引物组合对待测样品进行PCR扩增，PCR反应体系为：反应体积为20μL，其中包括：2×TaqMix buffer 10μL，双蒸水6μL，10μm的引物E5-4 2μL，待测样品DNA 2μL；PCR反应条件为：95℃4分钟；95℃30秒，55℃30秒，72℃30秒，35个循环；72℃10分钟；

7.PCR反应结束后，对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳(琼脂糖凝胶；9g琼脂糖+300mL1×TAE)，用1×TAE作为电泳缓冲液，电泳恒定电压为120V。

8.条带分析：

拍摄：电泳30min后，在凝胶成像系统下观察拍摄。

分析：如图4，在168bp处出现澳洲野生稻的特异性扩增条带，在188bp处出现粳稻品种日本晴的特异性扩增条带，两个水稻品种之间具有多态性。图5是利用该标记对日本晴和澳洲野生稻及两者杂交发展的染色体片段代换系进行检测的结果。此方法能够在短时间内快速大量的发展澳洲野生稻的特异分子标记，且结果稳定、操作简单快捷、高效而且成本低。将对发掘和利用澳洲野生稻有利性状起到重要的推进作用。

序列表

<110> 扬州大学

<120> 一种快速发展澳洲野生稻特异性分子标记的方法

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 627

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tgtgctttct gctggtggtg gtgttcatgg tggcggcggc gatggccgga gccgatcgcg 60

agctgaaggt tgggtactac gagaagacgt gcaaagacgt ggagaagatt gtgaactcca 120

tcgtcgtgaa ctccgtcaag gccaaccgcg gcaagggtgc cggcctcgtc cgcctcctct 180

tccacgactg cttcgtcagg gtaaggagct agctagtaat ttgatcgatc accatgcgtg 240

catgcaatac aatgcacgta gagctcgcta ggcatcaatg gtggcggctt tgatgattaa 300

tggtttggtc gtcgtgcagg ggtgtgacgc ctccgtgctg ctggagaaga gcgagatgaa 360

ccggcggccg gagaaggagt ctccggcgaa catcgggatc cggggcatgg acgtgatcga 420

cgcgatcaag gcggcgctgg aggcacggtg ccccaacacg gtgtcctgcg ccgacatcat 480

cgcctacgcg gcgcgcgacg cgtccaggta cctcagccgc gggggagtcg acttcgccgt 540

ccccgccggc cgcctcgacg gcgtggtctc ccgcagcagg gacgccgacg tgttcctacc 600

cgaccccgcc gccaacctca ccgacct 627

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ctcctcttcc acgactgctt 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ggttcatctc gctcttctcc 20