在线色谱法和电喷雾电离质谱仪

摘要

提供了用于使用在线色谱法和电喷雾电离质谱法表征蛋白质的方法和系统。

说明书

技术领域

本发明总体上涉及一种用于使用在线色谱法和电喷雾电离质谱法表征蛋白质生物制剂的方法。

背景技术

蛋白质生物制剂产品已作为用于治疗癌症、自身免疫性疾病、感染和心脏代谢病症的重要药物出现，并且它们代表医药工业中增长最快的产品类中的一种。

蛋白质生物制剂产品必须满足非常高的纯度标准。因此，可能重要的是在药物开发和生产的不同阶段期间监测并表征蛋白质生物制剂。用于表征此类蛋白质生物制剂的测定的分析方法应显示出足够的准确性和分辨率，以检测并定量所需产品。由于蛋白质生物制剂与其突变形式或修饰形式或裂解形式相比在结构和物理化学性质之间存在相似性，评估可能很困难。直接分析可能要求足够大量地分离产品以用于测定，这是不希望的，并且仅在所选定的情况下是可能的。

本领域长期迫切需要一种用于表征蛋白质生物制剂的方法和/或系统。

发明内容

蛋白质生物制剂产品的开发、制造和销售的增长导致对表征蛋白质生物制剂以及可能的杂质、结合化学计量及其总体组成的需求逐渐增加。

本文公开的示例性实施方案通过提供用于表征、鉴别和/或定量蛋白质生物制剂以及其可能的杂质、结合和总体组成的方法来满足上述需求。

本公开至少部分地提供了一种用于表征蛋白质的方法。在一个示例性实施方案中，用于表征蛋白质的方法包括使包含所述蛋白质的样品与具有色谱树脂的色谱系统接触，使用流动相洗涤所述树脂以提供包含所述蛋白质的洗脱液，以及使用电喷雾电离质谱仪表征所述洗脱液中的所述蛋白质。

在此实施方案的一个方面，用于表征蛋白质的方法可包括具有尺寸排阻色谱树脂的色谱系统

在此实施方案的一个方面，用于表征蛋白质的方法可包括将电喷雾电离质谱仪耦接至具有色谱树脂的色谱系统。

在此实施方案的一个方面，用于表征蛋白质的方法可包括将电喷雾电离质谱仪耦接至具有尺寸排阻色谱树脂的色谱系统。

在一个方面，用于表征蛋白质的方法可包括在天然条件下运行的电喷雾电离质谱仪。

在此实施方案的一个方面，用于表征蛋白质的方法可包括纳米电喷雾电离质谱仪。

在此实施方案的一个方面，用于表征蛋白质的方法可包括在天然条件下运行的纳米电喷雾电离质谱仪。

在此实施方案的一个方面，用于表征蛋白质的方法可包括至少一个三路分流器，以将电喷雾电离质谱仪耦接至具有树脂的色谱系统。

在此实施方案的一个方面，用于表征蛋白质的方法可包括至少一个三路分流器，以将紫外光检测器耦接至具有树脂的色谱系统。

在此实施方案的一个方面，用于表征蛋白质的方法可包括至少一个三路分流器，以将紫外光检测器和电喷雾电离质谱仪耦接至具有树脂的色谱系统。

在此实施方案的一个方面，用于表征蛋白质的方法可包括至少一个三路分流器，以将电喷雾电离质谱仪耦接至具有尺寸排阻色谱树脂的色谱系统。

在此实施方案的一个方面，用于表征蛋白质的方法可包括至少一个三路分流器，以将紫外光检测器耦接至具有尺寸排阻色谱树脂的色谱系统。

在此实施方案的一个方面，用于表征蛋白质的方法可包括至少一个三路分流器，以将紫外光检测器和电喷雾电离质谱仪耦接至具有尺寸排阻色谱树脂的色谱系统。

在此实施方案的一个方面，用于表征蛋白质的方法可包括使用流动相洗涤树脂以提供包含所述蛋白质的洗脱液，其中所述洗脱液通过至少一个三路分流器以约0.2mL/min至约0.4mL/min的流速引入到紫外光检测器中。

在此实施方案的一个方面，用于表征蛋白质的方法可包括包含挥发性盐的流动相。

在此实施方案的一个方面，用于表征蛋白质的方法可包括包含乙酸铵的流动相。

在此实施方案的一个方面，用于表征蛋白质的方法可包括具有小于约100mM乙酸铵的总浓度的流动相。

在此实施方案的一个方面，用于表征蛋白质的方法可包括用流动相以约0.2mL/min至约0.4mL/min的流速洗涤树脂。

在此实施方案的一个方面，用于表征蛋白质的方法可包括具有约6.8的pH的流动相。

在此实施方案的一个方面，用于表征蛋白质的方法可包括包含约10μg至约100μg蛋白质的量的蛋白质的样品。

在此实施方案的一个方面，用于表征蛋白质的方法可包括作为抗体的蛋白质。

在此实施方案的一个方面，用于表征蛋白质的方法可包括作为抗原-抗体复合物的蛋白质。

在此实施方案的一个方面，用于表征蛋白质的方法可包括作为抗体-药物缀合物的蛋白质。

在此实施方案的一个方面，用于表征蛋白质的方法可包括电喷雾电离质谱仪，其使用约10nL/min至约50nL/min的流速。

在此实施方案的一个方面，用于表征蛋白质的方法可包括电喷雾电离质谱仪，其电喷雾的喷雾电压为约0.8kV至约1.5kV。

在此实施方案的一个方面，用于表征的方法可包括鉴别蛋白质。

在此实施方案的一个方面，用于表征蛋白质的方法可包括定量蛋白质。

在此实施方案的一个方面，用于表征蛋白质的方法可包括定量蛋白质的相对丰度。

在此实施方案的一个方面，用于表征蛋白质的方法可包括具有至少两种蛋白质的样品。

本公开至少部分地提供了一种用于表征抗体-药物缀合物的方法。在一个示例性实施方案中，用于表征抗体-药物缀合物的方法包括使包含所述抗体-药物缀合物的样品与具有色谱树脂的色谱系统接触，使用流动相洗涤所述树脂以提供包含所述抗体-药物缀合物的洗脱液，以及使用电喷雾电离质谱仪表征所述洗脱液中的所述抗体-药物缀合物。

在此实施方案的一个方面，用于表征抗体-药物缀合物的方法可包括具有尺寸排阻色谱树脂的色谱系统

在此实施方案的一个方面，用于表征抗体-药物缀合物的方法可包括将电喷雾电离质谱仪耦接至具有色谱树脂的色谱系统。

在此实施方案的一个方面，用于表征抗体-药物缀合物的方法可包括将电喷雾电离质谱仪耦接至具有尺寸排阻色谱树脂的色谱系统。

在此实施方案的一个方面，用于表征抗体-药物缀合物的方法可包括在天然条件下的电喷雾电离质谱仪。

在此实施方案的一个方面，用于表征抗体-药物缀合物的方法可包括纳米电喷雾电离质谱仪。

在此实施方案的一个方面，用于表征抗体-药物缀合物的方法可包括在天然条件下运行的纳米电喷雾电离质谱仪。

在此实施方案的一个方面，用于表征抗体-药物缀合物的方法可包括至少一个三路分流器，以将电喷雾电离质谱仪耦接至具有树脂的色谱系统。

在此实施方案的一个方面，用于表征抗体-药物缀合物的方法可包括至少一个三路分流器，以将紫外光检测器耦接至具有树脂的色谱系统。

在此实施方案的一个方面，用于表征抗体-药物缀合物的方法可包括至少一个三路分流器，以将紫外光检测器和电喷雾电离质谱仪耦接至具有树脂的色谱系统。

在此实施方案的一个方面，用于表征抗体-药物缀合物的方法可包括至少一个三路分流器，以将电喷雾电离质谱仪耦接至具有尺寸排阻色谱树脂的色谱系统。

在此实施方案的一个方面，用于表征抗体-药物缀合物的方法可包括至少一个三路分流器，以将紫外光检测器耦接至具有尺寸排阻色谱树脂的色谱系统。

在此实施方案的一个方面，用于表征抗体-药物缀合物的方法可包括至少一个三路分流器，以将紫外光检测器和电喷雾电离质谱仪耦接至具有尺寸排阻色谱树脂的色谱系统。

在此实施方案的一个方面，用于表征抗体-药物缀合物的方法可包括使用流动相洗涤树脂以提供包含所述抗体-药物缀合物的洗脱液，其中所述洗脱液通过至少一个三路分流器以约0.2mL/min至约0.4mL/min的流速引入到紫外光检测器中。

在此实施方案的一个方面，用于表征抗体-药物缀合物的方法可包括包含挥发性盐的流动相。

在此实施方案的一个方面，用于表征抗体-药物缀合物的方法可包括包含乙酸铵的流动相。

在此实施方案的一个方面，用于表征抗体-药物缀合物的方法可包括具有小于约100mM乙酸铵的总浓度的流动相。

在此实施方案的一个方面，用于表征抗体-药物缀合物的方法可包括用流动相以约0.2mL/min至约0.4mL/min的流速洗涤树脂。

在此实施方案的一个方面，用于表征抗体-药物缀合物的方法可包括具有约6.8的pH的流动相。

在此实施方案的一个方面，用于表征抗体-药物缀合物的方法可包括包含约10μg至约100μg抗体-药物缀合物的量的蛋白质的样品。

在此实施方案的一个方面，用于表征抗体-药物缀合物的方法可包括使用流动相洗涤树脂以提供洗脱液，所述洗脱液以小于约50μl/min的流速引入到电喷雾电离质谱仪。

在此实施方案的一个方面，用于表征抗体-药物缀合物的方法可包括电喷雾电离质谱仪，其使用约10nL/min至约50nL/min的流速。

在此实施方案的一个方面，用于表征抗体-药物缀合物的方法可包括电喷雾电离质谱仪，其电喷雾的喷雾电压为约0.8kV至约1.5kV。

在此实施方案的一个方面，用于表征抗体-药物缀合物的方法可包括作为位点特异性抗体-药物缀合物的抗体-药物缀合物。

在此实施方案的一个方面，用于表征抗体-药物缀合物的方法可包括并非位点特异性抗体-药物缀合物的抗体-药物缀合物。

在此实施方案的一个方面，用于表征抗体-药物缀合物的方法可包括作为工程化的基于半胱氨酸的抗体-药物缀合物的抗体-药物缀合物。

在此实施方案的一个方面，用于表征抗体-药物缀合物的方法可包括作为非特异性的基于半胱氨酸的抗体-药物缀合物的抗体-药物缀合物。

在此实施方案的一个方面，用于表征抗体-药物缀合物的方法可包括表征药物与抗体比率。

在此实施方案的一个方面，用于表征抗体-药物缀合物的方法可包括鉴别抗体。

在此实施方案的一个方面，用于表征抗体-药物缀合物的方法可包括定量抗体。

本公开至少部分地提供了一种系统，其包括具有色谱树脂的色谱柱。在另一个示例性实施方案中，所述系统可包括具有色谱树脂的色谱柱，其中所述色谱柱能够接收流动相和包含蛋白质的样品；以及电喷雾电离质谱仪。

在此实施方案的一个方面，所述系统可包括具有尺寸排阻色谱树脂的色谱柱。

在此实施方案的一个方面，所述系统可包括能够与所述色谱柱耦接的电喷雾电离质谱仪。

在此实施方案的一个方面，所述系统可包括能够在天然条件下运行的电喷雾电离质谱仪。

在此实施方案的一个方面，所述系统可包括纳米电喷雾电离质谱仪。

在此实施方案的一个方面，所述系统可包括能够使用三路分流器耦接至质谱仪的色谱柱。

在此实施方案的一个方面，所述系统可包括能够使用三路分流器耦接至紫外光检测器的色谱柱。

在此实施方案的一个方面，所述系统可包括能够使用三路分流器耦接至紫外光检测器和质谱仪的色谱柱。

在此实施方案的一个方面，所述系统可能够表征抗体-药物缀合物的药物与抗体比率。

在此实施方案的一个方面，所述系统可能够表征蛋白质。

在此实施方案的一个方面，所述系统可能够表征抗原-抗体复合物。

附图说明

图1示出了从常规和天然电喷雾电离质谱法获得的谱图。

图2示出了能够表征蛋白质生物制剂的系统的示例性实施方案。

图3示出了能够表征蛋白质生物制剂的系统的示例性实施方案。

图4示出了根据一个示例性实施方案的能够表征蛋白质生物制剂的系统的设置。

图5A和5B示出了根据一个示例性实施方案的使用能够表征蛋白质生物制剂的系统对抗原-抗体复合物进行的分析。

图6示出了根据示例性实施方案表征的Bet v 1与Fab-1之间的抗原-抗体滴定结果。

图7A示出了根据示例性实施方案的Bet v 1与Fab-1之间的抗原-抗体相互作用作为在天然条件下通过紫外光检测器和天然电喷雾电离质谱仪获得的双重检测结果的质谱仪信号

图7B示出了根据示例性实施方案的Bet v 1与Fab-1之间的抗原-抗体相互作用作为在天然条件下通过紫外光检测器和天然电喷雾电离质谱仪获得的双重检测结果的紫外光信号结果。

图8A示出了根据示例性实施方案的通过在线SEC-纳米-ESI-MS仪器对位点特异性缀合半胱氨酸ADC-1进行的亲本mAb-1药物与抗体比率分析的原始谱图。

图8B示出了根据示例性实施方案的通过在线SEC-纳米-ESI-MS仪器对位点特异性缀合半胱氨酸ADC-1进行的ADC-1药物与抗体比率分析的原始谱图。

图8C示出了根据示例性实施方案的通过在线SEC-纳米-ESI-MS仪器对位点特异性缀合半胱氨酸ADC-1进行的亲本mAb-1药物与抗体比率分析的卷积谱图。

图8D示出了根据示例性实施方案的通过在线SEC-纳米-ESI-MS仪器对位点特异性缀合半胱氨酸ADC-1进行的ADC-1药物与抗体比率分析的卷积谱图。

图9示出了根据示例性实施方案的通过FabRICATOR消化和在线SEC-纳米-ESI-MS仪器对位点特异性缀合半胱氨酸mAb-1和ADC-1进行的药物与抗体比率分析。

图10A示出了根据示例性实施方案的通过在线SEC-纳米-ESI-MS仪器对位点特异性缀合半胱氨酸ADC-2进行的亲本mAb-2药物与抗体比率分析的原始谱图，其中N意指所述抗体没有聚糖，S意指糖基化发生在抗体的单链上，并且D意指糖基化发生在抗体的两条链上。

图10B示出了根据示例性实施方案的通过在线SEC-纳米-ESI-MS仪器对位点特异性缀合半胱氨酸ADC-2进行的亲本mAb-2药物与抗体比率分析的卷积谱图，其中N意指所述抗体没有聚糖，S意指糖基化发生在抗体的单链上，并且D意指糖基化发生在抗体的两条链上。

图10C示出了根据示例性实施方案的通过在线SEC-纳米-ESI-MS仪器对位点特异性缀合半胱氨酸ADC-2进行的ADC-2药物与抗体比率分析的原始谱图，其中N意指所述抗体没有聚糖，S意指糖基化发生在抗体的单链上，并且D意指糖基化发生在抗体的两条链上。

图10D示出了根据示例性实施方案的通过在线SEC-纳米-ESI-MS仪器对位点特异性缀合半胱氨酸ADC-2进行的亲本ADC-2药物与抗体比率分析的卷积谱图，其中N意指所述抗体没有聚糖，S意指糖基化发生在抗体的单链上，并且D意指糖基化发生在抗体的两条链上。

具体实施方式

蛋白质生物制剂产品中蛋白质的鉴别和定量在产品的生产和开发期间非常重要。杂质的存在和蛋白质生物制剂产品的结合方法可能对于开发安全且有效的产品至关重要。因此，表征蛋白质生物制剂、其结合方法以及表征任何伴随杂质的稳健方法和/或工作流程可为有益的。

所述方法之一包括使用尺寸排阻色谱法(SEC)在生物技术工业中表征生物分子聚集和片段化(Hong Paule等人,Size-Exclusion Chromatography for the Analysis ofProtein Biotherapeutics and their Aggregates,35 JOURNAL OF LIQUIDCHROMATOGRAPHY AND RELATED TECHNOLOGY 2923-2950(2012))。SEC对分子的分离依赖于分子与固定相上的受控多孔结构的不同相互作用。由于SEC使用的缓冲条件可以保留溶液中蛋白质的天然结构，因此允许在不干扰其天然构象的情况下对生物分子进行表征。在可与SEC联合的各种检测模式中，质谱(MS)可以精确且准确地鉴别复杂样品中的各个组分。先前已报告了SEC和MS的组合，包括收集SEC峰，接着进行直接输注MS(

由于非共价蛋白质相互作用介导了如此广泛的生物功能，人们对开发有利于研究其结构、化学计量和动力学的方法越来越感兴趣。此类方法有助于研究自然界中广泛存在的非共价蛋白质相互作用，并协调蛋白质生物制剂与多种分子(包括其他蛋白质和肽、核酸、脂质以及无机和有机小分子)的相互作用。尺寸排阻色谱(SEC)允许从分子组分的异质混合物中分离生物分子，并且由于缓冲条件使蛋白质保持其天然构象，SEC为用于在分离期间保存非共价生物分子复合物的理想方法。在可与SEC分析联合的各种检测方法中，质谱(MS)允许可靠地鉴别和表征复杂混合物中的单个组分。然而，SEC中所用的高流速和非挥发性盐通常与下游MS分析不兼容。

考虑到现有方法的局限性，开发了一种用于使用在线色谱法和电喷雾电离MS平台来分析蛋白质生物制剂的有效且高效的方法。

除非另外描述，否则本文所用的所有技术和科学术语都具有与本发明所属领域中普通技术人员通常所理解的相同的含义。虽然在实践或测试中可使用类似或等同于本文所描述的那些方法和材料的任何方法和材料，但现在描述特定的方法和材料。提及的所有出版物特此以引用的方式并入。

术语“一个/种(a)”应理解为意指“至少一个/种”；并且术语“约”和“大约”应理解为允许如本领域普通技术人员将理解的标准变化；并且在提供范围时，则包括端点。

在一些示例性实施方案中，本公开提供了一种用于表征、鉴别和/或定量蛋白质生物制剂的方法。

如本文所用，“蛋白质生物制剂”包括完全或部分具有生物学性质的活性成分。在一些示例性实施方案中，蛋白质生物制剂可包括蛋白质、疫苗、过敏原、核酸、病毒、抗体-药物缀合物、细胞、基因、组织或其组合。在一些其他示例性实施方案中，蛋白质生物制剂可包括蛋白质、疫苗、过敏原、核酸、病毒、抗体-药物缀合物、细胞、基因、组织或其组合的重组版本、工程化版本、修饰版本、突变版本或截短版本。

如本文所用，术语“蛋白质”包括具有共价连接的酰胺键的任何氨基酸聚合物。蛋白质包含一个或多个氨基酸聚合物链，在本领域中通常称为“多肽”。“多肽”是指由氨基酸残基组成的聚合物、相关的天然存在的结构变体以及其通过肽键连接的合成的非天然存在的类似物、相关的天然存在的结构变体及其合成的非天然存在的类似物。“合成的肽或多肽”是指非天然存在的肽或多肽。合成的肽或多肽可例如使用自动化多肽合成仪来合成。各种固相肽合成方法为已知的。蛋白质可含有一种或多种多肽以形成单一功能的生物分子。蛋白质可包括生物治疗性蛋白质、用于研究或治疗的重组蛋白、trap蛋白和其他嵌合受体Fc融合蛋白、嵌合蛋白、抗体、单克隆抗体、多克隆抗体、人抗体和双特异性抗体中的任一种。在另一个示例性方面，蛋白质可包括抗体片段、纳米抗体、重组抗体嵌合体、细胞因子、趋化因子、肽激素等。蛋白质可使用基于重组细胞的生产系统来产生，诸如昆虫杆状病毒系统、酵母系统(例如毕赤酵母某种(Pichia sp.))、哺乳动物系统(例如CHO细胞和CHO衍生物，如CHO-K1细胞)。对于讨论生物治疗性蛋白质及其生产的综述，参见Ghaderi等人,"Production platforms for biotherapeutic glycoproteins。Occurrence,impact,andchallenges of non-human sialylation,"(BIOTECHNOL.GENET.ENG.REV.147-175(2012))。在一些示例性实施方案中，蛋白质包含修饰、加合物和其他共价连接的部分。这些修饰、加合物和部分包括例如亲和素、链霉亲和素、生物素、聚糖(例如，N-乙酰半乳糖胺、半乳糖、神经氨酸、N-乙酰葡萄糖胺、岩藻糖、甘露糖和其他单糖)、PEG、聚组氨酸、FLAG标签、麦芽糖结合蛋白(MBP)、几丁质结合蛋白(CBP)、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)myc表位、荧光标记和其他染料等。蛋白质可根据组成和溶解度来分类，并且因此可包括简单的蛋白质，诸如球状蛋白质和纤维状蛋白质；缀合蛋白，诸如核蛋白、糖蛋白、粘蛋白、色蛋白、磷蛋白、金属蛋白和脂蛋白；以及衍生蛋白，诸如初级衍生蛋白和次级衍生蛋白。

在一些示例性实施方案中，蛋白质可为抗体、双特异性抗体、多特异性抗体、抗体片段、单克隆抗体、宿主细胞蛋白或其组合。

如本文所用，术语“抗体”包括包含通过二硫键相互连接的四条多肽链(两条重(H)链和两条轻(L)链)的免疫球蛋白分子以及其多聚体(例如IgM)。每条重链包含重链可变区(本文中缩写为HCVR或V

如本文所用，“抗体片段”包括完整抗体的一部分，例如像抗体的抗原结合区或可变区。抗体片段的实例包括但不限于Fab片段、Fab'片段、F(ab')2片段、Fc片段、scFv片段、Fv片段、dsFv双抗体、dAb片段、Fd′片段、Fd片段和分离的互补决定区(CDR)区域，以及三抗体、四抗体、线性抗体、单链抗体分子和由抗体片段形成的多特异性抗体。Fv片段为免疫球蛋白重链和轻链可变区的组合，并且ScFv蛋白为重组单链多肽分子，其中免疫球蛋白轻链可变区和重链可变区通过肽接头连接。抗体片段可通过各种方式产生。例如，抗体片段可通过使完整抗体片段化来酶促或化学产生，且/或其可由编码部分抗体序列的基因重组产生。可替代地或另外，抗体片段可全部或部分合成产生。抗体片段可任选地包括单链抗体片段。可替代地或另外，抗体片段可包含例如通过二硫键连接在一起的多条链。抗体片段可任选地包括多分子复合物。

如本文所用，术语“单克隆抗体”不限于通过杂交瘤技术产生的抗体。单克隆抗体可通过本领域可获得的或已知的任何方式衍生自单个克隆，包括任何真核、原核或噬菌体克隆。可用于本公开的单克隆抗体可使用本领域已知的多种技术来制备，包括使用杂交瘤、重组和噬菌体展示技术或其组合。

如本文所用，术语“抗体-药物缀合物”或“ADC”可以是指通过具有不稳定键的接头连接至生物活性药物的抗体。ADC可包含若干个生物活性药物分子(或有效载荷)，这些分子可以共价连接到抗体氨基酸残基的侧链(Siler Panowski等人,Site-specific antibodydrug conjugates for cancer therapy,6MABS 34–45(2013))。用于ADC的抗体可能够以足够的亲和力结合，以选择性积累和持久保留在靶位点处。大多数ADC可具有在纳摩尔范围内的Kd值。有效载荷可具有在纳摩尔/皮摩尔范围内的效价并且可能够达到在ADC分布到靶组织中后可达到的细胞内浓度。最后，在有效载荷与抗体之间形成连接的接头可能够在循环中足够稳定以利用抗体部分的药代动力学特性(即长半衰期)并允许有效载荷在抗体分布到组织中时保持连接至抗体，一旦ADC被吸收到靶细胞中，也应允许生物活性药物d有效释放。

接头可为：在细胞加工期间不可裂解的接头和一旦ADC到达靶位点后就可裂解的接头。对于不可裂解的接头，在细胞内释放的生物活性药物包括有效载荷和接头的所有元件，所述元件在ADC在溶酶体内完全蛋白水解降解之后，仍连接至抗体的氨基酸残基，通常为赖氨酸或半胱氨酸残基。可裂解接头为其结构包含有效载荷与抗体上的氨基酸连接位点之间的裂解位点的那些接头。裂解机制可包括在酸性细胞内隔室中水解酸不稳定键、由细胞内蛋白酶或酯酶酶促裂解酰胺键或酯键以及由细胞内的还原性环境还原性裂解二硫键。

在一些特定实施方案中，本公开还提供了一种用于鉴定抗体-药物缀合物的药物与抗体比率(DAR)的方法。

ADC可通过与抗体的内源性氨基酸残基缀合来制备，从而仔细控制平均修饰度以产生最佳药物与抗体比率(DAR)。可以基于(a)最小化非缀合抗体的量和(b)避免混合物中的物质具有非常高DAR(这在制造和配制中可能由于疏水性更高且溶解度更低而成为问题，并可能导致药代动力学特性较差)来选择此比率。连接太少生物活性药物分子会导致疗效降低，而连接太多药物分子会使ADC不稳定且使药代动力学特性发生改变、血浆清除率增加、半衰期缩短和全身毒性增加。最佳DAR通常是不确定的，并且高度依赖于其他ADC变量；然而，更常见的是，ADC旨在获得接近4的DAR。生物活性药物与抗体的缀合的非限制性实例可包括生物活性药物与抗体上的赖氨酸或半胱氨酸残基的缀合。赖氨酸缀合可导致每个抗体有0-8个缀合的生物活性药物分子，并且可以在不同赖氨酸残基的重链和轻链上发生。生物活性药物与抗体的缀合的另一个非限制性实例可以包括在四个链间二硫键还原之后发生的半胱氨酸缀合，并且因此缀合仅限于八个暴露的巯基，并因此每个抗体连接的生物活性药物分子范围为0-8个。ADC混合物异质性的多样性为2倍，因为这些ADC物质在载药量和缀合位点方面不同。因此，每种物质可具有不同的特性，这可能导致广泛范围的体内PK特性。此外，ADC生产中的批次间一致性可能具有挑战性，并且可能需要勤奋的制造能力。

位点特异性抗体-药物缀合为克服这些挑战的一种方式，其中已知数量的生物活性药物分子始终缀合至限定位点。使异质性最小化并且ADC特性为更可预测，其中批次间的缀合物生产为一致的。药物与抗体比率(DAR)得到精确控制并且可以针对各种连接的生物活性药物进行定制，从而产生2-DAR或4-DAR位点特异性ADC。位点特异性缀合的非限制性实例包括通过工程化半胱氨酸残基、谷氨酰胺残基、非天然氨基酸(例如，对乙酰苯丙氨酸、N6-((2-叠氮乙氧基)羰基)-L-赖氨酸、对叠氮甲基-L-苯丙氨酸、硒代半胱氨酸)、聚糖或短肽标签将生物活性药物分子连接至抗体，如Qun Zhou在综述“Site-Specific AntibodyConjugation for ADC and Beyond”中所教导的，所述综述以引用的方式并入(Qun Zhou,Site-Specific Antibody Conjugation for ADC and Beyond,5 B

在一些示例性实施方案中，本公开提供了一种用于表征、鉴别和/或定量蛋白质生物制剂产品中的至少一种杂质的方法。

如本文所用，术语“杂质”可包括存在于蛋白质生物制剂产品中的任何不期望的蛋白质。杂质可包括过程相关杂质和产品相关杂质。杂质可以进一步具有部分表征或未鉴别的已知结构。过程相关杂质可来源于制造过程，并且可包括三个主要类别：细胞底物来源、细胞培养物来源和下游来源。细胞底物来源的杂质包括但不限于源自宿主生物的蛋白质和核酸(宿主细胞基因组、载体或总DNA)。细胞培养物来源的杂质包括但不限于诱导剂、抗生素、血清和其他培养基成分。下游来源的杂质包括但不限于酶、化学试剂和生物化学处理试剂(例如，溴化氰、胍、氧化剂和还原剂)、无机盐(例如，重金属、砷、非金属离子)、溶剂、载体、配体(例如单克隆抗体)和其他可浸出物。产品相关杂质(例如前体、某些降解产物)可为制造和/或储存期间产生的分子变体，其具有在活性、功效和安全性方面与所需产品相当的特性。此类变体在分离和表征方面可能需要大量的努力，以便鉴别一种或多种修饰的类型。产品相关杂质可包括截短形式、修饰形式和聚集体。截短形式由催化肽键裂解的水解酶或化学物质形成。修饰形式包括但不限于脱酰胺基形式、异构化形式、错配性S-S连接形式、氧化形式或改变的缀合形式(例如，糖基化、磷酸化)。修饰形式也可包括任何翻译后修饰形式。聚集体包括所需产物的二聚体和更高聚体。(Q6BSpecifications:Test Proceduresand Acceptance Criteria for Biotechnological/Biological Products,ICH 1999年8月,U.S.Dept.of Health and Humans Services)。

如本文所用，通用术语“翻译后修饰”或“PTM”是指多肽在其核糖体合成期间(共翻译修饰)或之后(翻译后修饰)经历的共价修饰。PTM通常通过特定的酶或酶途径引入。许多PTM发生在蛋白质主链内的特定特征性蛋白质序列(签名序列)位点。已记录了数百个PTM，并且这些修饰总是影响蛋白质的结构或功能的一些方面(Walsh,G.“Proteins”(2014)第二版本,由Wiley and Sons,Ltd.出版,ISBN:9780470669853)。各种翻译后修饰包括但不限于裂解、N末端延伸、蛋白质降解、N末端的酰化、生物素化(用生物素使赖氨酸残基酰化)、C末端的酰胺化、糖基化、碘化、辅基的共价连接、乙酰化(通常在蛋白质的N末端处添加乙酰基)、烷基化(通常在赖氨酸或精氨酸残基处添加烷基(例如甲基、乙基、丙基))、甲基化、腺苷酸化、ADP-核糖基化、在多肽链内或多肽链之间的共价交联、磺化、异戊二烯化、维生素C依赖性修饰(脯氨酸和赖氨酸羟基化和羧基末端酰胺化)、维生素K依赖性修饰(其中维生素K为谷氨酸残基羧化过程中的辅助因子，从而导致形成γ-羧基谷氨酸(glu残基))、谷氨酰化(谷氨酸残基的共价键)、甘氨酰化(glycylation)(甘氨酸残基的共价键)、糖基化(将糖基加到天冬酰胺、羟赖氨酸、丝氨酸或苏氨酸，从而产生糖蛋白)、异戊二烯基化(添加类异戊二烯基团，诸如法尼醇和香叶基香叶醇)、脂基化(连接脂酸酯官能团)、磷酸泛锡基化(添加来自辅酶A的4'-磷酸泛亚锡基部分，诸如在脂肪酸、聚酮化合物、非核糖体肽和亮氨酸生物合成中)、磷酸化(通常向丝氨酸、酪氨酸、苏氨酸或组氨酸添加磷酸基团)和硫酸化(通常向酪氨酸残基添加硫酸酯基团)。改变氨基酸化学性质的翻译后修饰包括但不限于瓜氨酸化(通过脱氨基将精氨酸转化为瓜氨酸)和脱酰胺基(将谷氨酰胺转化为谷氨酸或将天冬酰胺转化为天冬氨酸)。涉及结构变化的翻译后修饰包括但不限于形成二硫键(两个半胱氨酸氨基酸的共价连接)和蛋白水解裂解(蛋白质在肽键处的裂解)。某些翻译后修饰涉及添加其他蛋白质或肽，例如ISG化(与ISG15蛋白(干扰素刺激基因)共价连接)、SUMO化(与SUMO蛋白(小泛素相关性修饰物)共价连接)和泛素化(与蛋白质泛素共价连接)。对于由UniProt展示的PTM的更详细受控词表，参见European Bioinformatics InstituteProteinInformation ResourceSIB Swiss Institute of Bioinformatics、E

如本文所用，术语“所需产品”是指具有所需结构、功能或功效特征的蛋白质生物制剂。

在一些示例性实施方案中，本公开还提供了一种用于表征蛋白质生物制剂的结合的方法。例如，抗体可以通过高度特异性、高亲和力的非共价相互作用来结合抗原，所述相互作用为能够开发靶向疾病特异性抗原的治疗多种疾病的治疗性抗体(Andrew C.Chan和Paul J.Carter,Therapeutic antibodies for autoimmunity and inflammation,10N

在一些示例性实施方案中，本公开还提供了一种用于鉴定抗原-抗体复合物中的抗体与抗原的结合比率的方法。

在一些特定示例性实施方案中，本公开还提供了一种用于鉴别与抗体结合的抗原的方法。在一些其他示例性实施方案中，所述方法可包括确定抗原和/或抗体的裂解版本、修饰版本或突变版本是否负责形成抗原-抗体复合物。

在一些示例性实施方案中，本公开还提供了一种用于定量溶液中单个蛋白质的相对丰度的方法。

在一些示例性实施方案中，用于表征、鉴别和/或定量蛋白质生物制剂、其可能的杂质、结合或组成的方法可包括使包含所述蛋白质生物制剂的样品与具有色谱树脂的色谱系统接触。

如本文所用，术语“色谱法”是指一种过程，其中由于化学实体在固定液相或固相周围或上方流动时的差异分布，可将由液体或气体携带的化学混合物分离成组分。色谱法的非限制性实例包括传统反相色谱法(RP)、离子交换色谱法(IEX)、混合模式色谱法和正相色谱法(NP)。

如本文所用，术语“混合模式色谱法(MMC)”或“多模式色谱法”包括其中溶质通过超过一种相互作用模式或机制与固定相相互作用的色谱法。MMC可用作传统反相色谱(RP)、离子交换色谱(IEX)和正相色谱(NP)的替代或补充工具。与分别以疏水相互作用、亲水相互作用和离子相互作用为主要相互作用模式的RP、NP和IEX色谱不同，混合模式色谱可采用这些相互作用模式中两种或更多种的组合。混合模式色谱介质可提供无法通过单一模式色谱法重现的独特选择性。与基于亲和力的方法相比，混合模式色谱也可提供潜在的成本节约和操作灵活性。

在一些示例性实施方案中，色谱法可以是尺寸排阻色谱法。

如本文所用，术语“SEC色谱树脂”或“SEC色谱介质”可互换使用，并且可包括在SEC中使用的从所需产物分离杂质(例如，对于双特异性抗体产物为同源二聚体污染物)的任何种类的固相。树脂的体积、待使用的柱的长度和直径以及动态容量和流速可取决于几个参数，诸如待处理的流体体积、待经受过程的流体中蛋白质的浓度。

在一些示例性实施方案中，用于表征、鉴别和/或定量蛋白质生物制剂、其可能的杂质、结合或组成的方法可包括使包含所述蛋白质的样品与具有尺寸排阻色谱树脂的色谱系统接触，使用流动相洗涤所述尺寸排阻色谱树脂以提供包含所述蛋白质的洗脱液，以及使用电喷雾电离质谱仪表征所述洗脱液中的所述蛋白质。

如本文所用，术语“质谱仪”包括能够鉴别特定分子物质并测量其准确质量的装置。所述术语意在包括可在其中洗脱多肽或肽以进行检测和/或表征的任何分子检测器。质谱仪可包括三个主要部分：离子源、质量分析器和检测器。离子源的作用是产生气相离子。可将分析物的原子、分子或簇转移到气相中并同时进行电离(如电喷雾电离)。离子源的选择在很大程度上取决于应用。

如本文所用，术语“电喷雾电离”或“ESI”是指喷雾电离的过程，其中溶液中的阳离子或阴离子通过形成高电荷液滴流并在大气压下使其去溶剂来转移到气相中，所述液滴流通过在含有溶液的电喷雾针尖端与反电极之间施加电势差来产生。由溶液中的电解质离子生产气相离子通常需要三个主要步骤。这些步骤为：(a)在ES注入尖端产生带电荷液滴；(b)由于溶剂蒸发而使带电荷液滴收缩，并且液滴反复崩解，从而形成能够产生气相离子的高电荷小液滴；以及(c)由非常小的高电荷液滴产生气相离子的机制。阶段(a)-(c)通常发生在设备的大气压区域。

如本文所用，术语“电喷雾注入装置”是指与用于蛋白质质量分析的质谱仪兼容的电喷雾电离系统。在电喷雾电离中，电喷雾针的孔口靠近谱图仪的入口孔口。可以将包含感兴趣蛋白质的样品泵送穿过注射器针。注射器针孔口与通向质量分析器的孔口之间的电势形成溶液的喷雾(“电喷雾”)。电喷雾可以在大气压下进行，并提供溶液的高电荷液滴。电喷雾注入装置可以包括电喷雾发射器、雾化气体和/或ESI电源。可以任选地使所述装置自动化，以执行样品抽吸、样品分配、样品递送和/或用于喷涂样品。

在一些示例性实施方案中，电喷雾电离质谱仪可为纳米电喷雾电离质谱仪。

如本文所用，术语“纳米电喷雾”或“纳米喷雾”是指在通常不使用外部溶剂递送的情况下在非常低的溶剂流速(通常每分钟数百纳升样品溶液或更低)下的电喷雾电离。形成纳米电喷雾的电喷雾注入装置可使用静态纳米电喷雾发射器或动态纳米电喷雾发射器。静态纳米电喷雾发射器在延长的时间段内对小样品(分析物)溶液体积进行连续分析。动态纳米电喷雾发射器使用毛细管柱和溶剂递送系统对混合物进行色谱分离，然后通过质谱仪进行分析。

如本文所用，术语“质量分析器”包括可根据质量分离物质(即，原子、分子或簇)的装置。可用于快速蛋白质测序的质量分析器的非限制实例为飞行时间(TOF)、扇形磁场/扇形电场、四极滤质器(Q)、四极离子阱(QIT)、轨道阱、傅立叶变换离子回旋共振(FTICR)以及还有加速器质谱(AMS)技术。

在一些示例性实施方案中，质谱法可以在天然条件下进行。

如本文所用，术语“天然条件”或“天然MS”或“天然ESI-MS”可包括在保留分析物中的非共价相互作用的条件下进行质谱分析。对于关于天然MS的详细评论，参见以下综述：Elisabetta Boeri Erba&Carlo Petosa,The emerging role of native massspectrometry in characterizing the structure and dynamics of macromolecularcomplexes,24 P

表1.

在一些示例性实施方案中，质谱仪可为串联质谱仪。

如本文所用，术语“串联质谱法”包括通过使用质量选择和质量分离的多个阶段获得关于样品分子的结构信息的技术。先决条件是样品分子可被转移到气相中并被完整电离，并且可在第一质量选择步骤之后以某种可预测且可控制的方式诱导它们分解。多阶段MS/MS或MS

由质谱仪鉴定的肽可用作代表完整蛋白质及其翻译后修饰的替代物。它们可以用于通过将实验和理论MS/MS数据相关联来进行蛋白质表征，所述理论数据由蛋白质序列数据库中可能的肽产生。表征可包括但不限于对蛋白质片段的氨基酸进行测序、确定蛋白质测序、确定蛋白质从头测序、定位翻译后修饰、或鉴别翻译后修饰、或相似性分析、或其组合。

如本文所用，术语“数据库”是指生物信息学工具，其提供针对数据库中的所有可能序列搜索未解释的MS-MS谱图的可能性。此类工具的非限制性实例为Mascot(http://www.matrixscience.com)、Spectrum Mill(http://www.chem.agilent.com)、PLGS(http://www.waters.com)、PEAKS(http://www.bioinformaticssolutions.com)、Proteinpilot(http://download.appliedbiosystems.com//proteinpilot)、Phenyx(http://www.phenyx-ms.com)、Sorcerer(http://www.sagenresearch.com)、OMSSA(http://www.pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/omssa/)、X！Tandem(http://www.thegpm.org/TANDEM/)、Protein Prospector(http://www.http://prospector.ucsf.edu/prospector/mshome.htm)、Byonic(https://www.proteinmetrics.com/products/byonic)或Sequest(http://fields.scripps.edu/sequest)。

示例性实施方案

本文所公开的实施方案提供了用于快速表征样品中的蛋白质的组合物、方法和系统。

本公开提供了一种用于表征蛋白质的方法，其包括使包含所述蛋白质的样品与具有色谱树脂的色谱系统接触，使用流动相洗涤所述树脂以提供包含所述蛋白质的洗脱液，以及使用电喷雾电离质谱仪表征所述洗脱液中的所述蛋白质。

本公开提供了一种用于表征抗体-药物缀合物的方法，其包括使包含所述抗体-药物缀合物的样品与具有色谱树脂的色谱系统接触，使用流动相洗涤所述树脂以提供包含所述抗体-药物缀合物的洗脱液，以及使用电喷雾电离质谱仪表征所述洗脱液中的所述抗体-药物缀合物。

本公开提供了一种用于表征抗原-抗体复合物的方法，其包括使包含所述抗原-抗体复合物的样品与具有色谱树脂的色谱系统接触，使用流动相洗涤所述树脂以提供包含所述抗原-抗体复合物的洗脱液，以及使用电喷雾电离质谱仪表征所述洗脱液中的所述抗原-抗体复合物。

在一些示例性实施方案中，所述色谱系统可以包括传统反相色谱(RP)、离子交换色谱(IEX)或正相色谱(NP)。

在一些示例性实施方案中，色谱树脂可以选自亲和色谱树脂、阴离子交换树脂、阳离子交换树脂、亲和树脂、混合模式色谱树脂、疏水相互作用色谱树脂或尺寸排阻色谱树脂。

在一些示例性实施方案中，电喷雾电离质谱仪可为纳米电喷雾电离质谱仪。

在一些示例性实施方案中，电喷雾电离质谱仪可以耦接至具有色谱树脂的色谱系统。

在一些示例性实施方案中，电喷雾电离质谱仪可以在天然条件下运行。

在一些示例性实施方案中，色谱系统可以使用三路分流器耦接至电喷雾电离质谱仪。

在一些示例性实施方案中，色谱系统可以使用三路分流器耦接至紫外光检测器。

在一些示例性实施方案中，色谱系统可以使用三路分流器耦接至电喷雾电离质谱仪和紫外光检测器。

在一些示例性实施方案中，色谱系统可以使用三路分流器耦接至电喷雾电离质谱仪和紫外光检测器，其中电喷雾电离质谱仪为纳米电喷雾电离质谱仪。

在一些示例性实施方案中，色谱系统可以使用三路分流器耦接至电喷雾电离质谱仪和紫外光检测器，其中质谱仪为在天然条件下运行的电喷雾电离质谱仪。

在一些示例性实施方案中，色谱系统可以使用三路分流器耦接至电喷雾电离质谱仪和紫外光检测器，其中电喷雾电离质谱仪为在天然条件下的纳米电喷雾电离质谱仪。

在一些示例性实施方案中，通过洗涤树脂得到的包含蛋白质或抗原-抗体复合物或抗体-药物缀合物的洗脱液通过至少一个三路分流器以约0.2mL/min至约0.4mL/min的流速引入到紫外光检测器中。

在一些示例性实施方案中，用于洗涤的流动相具有约0.2mL/min至约0.4mL/min的流速。

在一些示例性实施方案中，流动相可包含挥发性盐。在一些特定实施方案中，流动相可包含乙酸铵、碳酸氢铵或甲酸铵或其组合。

在一些示例性实施方案中，所用流动相可以与质谱仪兼容。

在一些示例性实施方案中，流动相可具有约6.0-8.0的pH。

在一些示例性实施方案中，样品可以约10μg至约100μg蛋白质或抗原-抗体复合物或抗体-药物缀合物的量使用。

在一些示例性实施方案中，电喷雾电离质谱仪中的流速可为约10nL/min至约50nL/min。

在一些示例性实施方案中，电喷雾电离质谱仪可具有约0.8kV至约1.5kV的喷雾电压。

在一些示例性实施方案中，表征可包括鉴别和/或定量蛋白质。在一个方面，表征可包括蛋白质测序、蛋白质从头测序、鉴别翻译后修饰或相似性分析或其组合。在另一个方面，表征可包括定量蛋白质的相对丰度。

在一些示例性实施方案中，表征可包括鉴别和/或定量抗体-药物缀合物中的抗体。在一个方面，表征可包括蛋白质测序、蛋白质从头测序、鉴别翻译后修饰或相似性分析或其组合。在另一个方面，表征可包括定量抗体-药物缀合物中抗体的相对丰度。

在一些示例性实施方案中，表征可包括鉴别和/或定量抗原-抗体复合物中的抗体和/或抗原。在一个方面，表征可包括对抗体或抗原进行的蛋白质测序、蛋白质从头测序、鉴别翻译后修饰或相似性分析或其组合。在另一方面，表征可以包括定量抗原-抗体复合物中的抗体和/或抗原的相对丰度。

在一些示例性实施方案中，样品可包含至少两种蛋白质。

在一些示例性实施方案中，抗体-药物缀合物可包括位点特异性ADC或非位点特异性ADC。在一个方面，抗体-药物缀合物可包括通过抗体上的半胱氨酸或赖氨酸残基连接的非位点特异性ADC。在另一个方面，抗体-药物缀合物可包括通过天然氨基酸、非天然氨基酸、聚糖、短肽标签或其组合连接的位点特异性ADC。

在一些示例性实施方案中，电喷雾电离质谱仪可为串联质谱仪。

在一些示例性实施方案中，蛋白质可为治疗性抗体、抗体、单克隆抗体、多克隆抗体、双特异性抗体、抗体片段、融合蛋白或其组合。在一个方面，抗体片段可包括Fab片段、Fab'片段、F(ab')2片段、scFv片段、Fv片段、dsFv双抗体、dAb片段、Fd′片段、Fd片段和分离的互补决定区(CDR)区域、三抗体、四抗体、线性抗体、单链抗体分子和由抗体片段形成的多特异性抗体。

在一些示例性实施方案中，蛋白质可为抗体的消化产物。消化产物可通过水解剂形成。消化产物可为产品相关杂质。

在一些示例性实施方案中，蛋白质可为生物制剂中存在的产品相关杂质。

在一些示例性实施方案中，蛋白质可具有在约4.5至约9.0范围内的pI。在一个方面，蛋白质可具有以下pI：约4.5、约5.0、约5.5、约5.6、约5.7、约5.8、约5.9、约6.0、约6.1、约6.2、约6.3、约6.4、约6.5、约6.6、约6.7、约6.8、约6.9、约7.0、约7.1、约7.2、约7.3、约7.4、约7.5、约7.6、约7.7、约7.8、约7.9、约8.0、约8.1、约8.2、约8.3、约8.4、约8.5、约8.6、约8.7、约8.8、约8.9或约9.0。

在一个示例性实施方案中，样品可包含至少两种蛋白质。

应当理解，所述方法不限于上述蛋白质、杂质和柱中的任一种，并且可通过任何合适的方式进行用于鉴别或定量的方法。

在一些示例性实施方案中，本公开提供了一种系统，所述系统可包括具有色谱树脂的色谱柱100，其中所述色谱柱能够接收流动相和包含蛋白质的样品；以及电喷雾电离质谱仪110(参见图2)。

在一些示例性实施方案中，色谱柱100可具有选自以下的树脂：疏水相互作用色谱树脂、阴离子交换树脂、阴离子交换树脂、亲和色谱树脂、尺寸排阻色谱树脂、混合模式树脂或其组合。

在一些示例性实施方案中，电喷雾电离质谱仪110可能够与所述色谱柱100耦接。

在一些示例性实施方案中，电喷雾电离质谱仪110可能够在天然条件下运行。

在一些示例性实施方案中，电喷雾电离质谱仪110可为纳米电喷雾电离质谱仪。

在一些示例性实施方案中，电喷雾电离质谱仪110可为在天然条件下运行的纳米电喷雾电离质谱仪。

在一些示例性实施方案中，色谱柱100可能够使用三路分流器120耦接至电喷雾电离质谱仪100。

在一些示例性实施方案中，色谱柱100可能够使用三路分流器120耦接至紫外光检测器130。

在一些示例性实施方案中，色谱柱100可能够使用三路分流器120耦接至紫外光检测器130和电喷雾电离质谱仪110。

在一些示例性实施方案中，三路分流器120可能够不成比例地分流以允许从色谱柱100流动到紫外光检测器130和电喷雾电离质谱仪110。

在一些示例性实施方案中，所述系统可能够表征抗体-药物缀合物的药物与抗体比率。

在一些示例性实施方案中，所述系统可能够表征蛋白质。

在一些示例性实施方案中，所述系统可能够表征抗原-抗体复合物。

在图3中展示的系统的一个示例性实施方案中，柱后三路分流器用于启动UV/MS双重检测。低体积级分可以引导至MS，而高体积级分可以转移至UV检测器。检测几乎共享相同的保留时间。可以收集来自UV检测器的级分以进行样品回收。

图4中示出了根据一个示例性实施方案的设置的另一个图。

应当理解，所述系统不限于上述蛋白质、色谱柱、质谱仪、抗体-药物缀合物、抗原-抗体复合物中的任一种。

用数字和/或字母连续标记如本文提供的方法步骤并不意味着将方法或其任何实施方案局限于特定的指示顺序。

不同的出版物(包括专利、专利申请、公布的专利申请、登录号、技术文献和学术文章)在整个说明书中引用。这些引用的参考文献各自整体并出于所有目的以引用的方式并入本文。

通过参考以下实施例，将更充分地理解本公开，提供所述实施例以更详细地描述本公开。它们旨在说明而不应解释为限制本公开的范围。

实施例

方法和试剂。水购自Honeywell(Muskegon,MI)。乙酸铵购自Sigma-Aldrich(StLouis,MO)。1M Tris-HCl,pH 7.5购自Teknova(Hollister,CA)。熔融石英管(内径(ID)150μm，外径(OD)360μm)、3路连接器和套管购自IDEX(Oak Harbor,WA)。PicoTip EMITTERSilicaTip(FS360-20-10-D-20-7CT)购自New Objective(Woburn,MA)。ACQUITY UPLCProtein BEH SEC柱(

在线SEC-纳米-ESI-MS分析。ACQUITY UPLC I类系统(Waters,Milford,MA)耦接至Q Exactive HF混合四极轨道阱质谱仪(Thermo Scientific,Bremen,Germany)，以用于所有在线SEC-纳米-ESI-MS分析。ACQUITY UPLC Protein BEH SEC柱(

数据分析。Protein Metrics Intact Mass软件用于原始数据去卷积。ThermoXcalibur Qual Browser用于提取离子色谱图分析。Microsoft Excel用于对ADC进行DAR计算。

实施例1.使用在线SEC-纳米-ESI-MS研究抗原-抗体相互作用

为了开发有效的抗体治疗剂，了解抗体结合如何影响靶蛋白的功能至关重要。

1.1在线SEC-纳米-ESI-MS仪器

SEC和MS技术通常用于表征蛋白质样品。SEC允许在使蛋白质结构变化最小化的条件下分离和表征蛋白质，而MS允许鉴别复杂样品中的单个组分。将SEC和MS的单个功能组合到单一平台中是非常期望的，但已证明是具有挑战性的，因为用于SEC分析的高流速和非挥发性盐与天然MS不兼容。为了克服此限制，通过使用柱后T型分流器分流来自SEC的洗脱液流来减少进入MS的溶剂和盐的摄入量(参见图3)。装置的图片示出在图4中。然后通过SilicaTip将T型分流器连接到MS，并通过熔融石英管并联连接到UV检测器。此安排能够对SEC洗脱液进行同时双重UV/MS检测。通过改变熔融石英管的长度和直径，可以调节通过SilicaTip进入MS的流速(例如较长/较窄的管可产生更高的阻力，从而导致通向SilicaTip和MS的流量增加)。采用4.6mm SEC柱使用0.3mL/min流速分离蛋白质样品。连接T型分流器和UV检测器且长度为140cm、内径为150μm的熔融石英管产生通向SilicaTip的约1μL/min理想流速。熔融石英管的长度和直径也使得UV和MS能够近乎同步地检测分子。

1.2抗原-抗体复合物

在天然MS条件下在先前报告的抗体(Qian Zhang等人,Epitope Mapping by HDX-MS Elucidates the Surface Coverage of Antigens Associated with High BlockingEfficiency of Antibodies to Birch Pollen Allergen,90 A

除了裸形式以外，如图5所示，对于Bet v 1观察到两种主要的糖基化形式，包括G2S1F和G2S2F。在与等摩尔量的Fab-1抗体一起孵育后，所有三种Bet v 1形式(裸形式、G2S1F和G2S2F)都结合Fab-1，作为一个抗原与一个Fab的复合物。在图5A中，单独Bet v 1抗原的去卷积天然MS谱图揭示了三种不同的Bet v 1物质：裸Bet v 1和两种主要的糖基化形式Bet v 1G2S1F和Bet v 1G2S2F。将Bet v 1抗原与等摩尔量的Bet v 1Fab-1抗体一起孵育证明，所有三种Bet v 1形式(裸形式、G2S1F和G2S2F)与Fab-1以一个抗原与一个Fab的比率形成复合物(图5B)。似乎糖基化不影响抗体/抗原复合物的形成，因为所有Bet v 1形式的MS信号的相对丰度在未结合条件与Fab-1结合条件之间是相似的。

为了进一步表征抗原-抗体相互作用，在MS和UV双检测平台上进行滴定实验。如图6所示，通过UV检查Bet v 1与Fab-1的几种不同比率。单独的Bet v 1(黑色)在8.5min时洗脱，而单独的Fab-1(蓝绿色)和Bet v 1:Fab-1复合物分别在9.8min和7.9min时洗脱。Bet v1:Fab-1复合物的化学计量揭示了1:1结合比率。对于过量的抗原或抗体，未观察到额外的化学计量。此外，将Bet v 1抗原与Fab-1以精确的1比1摩尔比混合可使游离抗原和抗体(蓝色)的量最小化。

虽然UV峰可表示溶液中单个蛋白质的相对丰度，但MS允许鉴别复杂样品中的单个组分。通过UV和MS双重检测，可以确定在同一UV峰内或跨不同UV峰共洗脱的所有物质。如图7所示，对7.9分钟洗脱的UV峰的MS分析揭示了由Fab-1与三种不同Bet v 1物质(裸物质、G2S1F和G2S2F)中的每一种结合所形成的三种不同复合物。发现在Fab-1与糖基化的Bet v1物质形成复合物之后洗脱出Fab-1:裸物质复合物，这可能归因于由聚糖所提供的更大流体动力学半径。使UV与MS之间的检测延迟最小化能够从UV检测器收集级分以进行样品回收。此方法尤其可用于确定抗原和/或抗体的裂解版本、修饰版本或突变版本是否保留结合而无需纯化所研究蛋白质的特定形式。

实施例2.使用在线SEC-纳米-ESI-MS表征半胱氨酸ADC

抗体药物缀合物(ADC)为高度强效的治疗剂，其可通过与抗体缀合将小分子药物特异性递送至靶组织(

1.1在线SEC-纳米-ESI-MS仪器

使用如1.1中所示的仪器。

1.2基于半胱氨酸的位点特异性缀合ADC

使用在线SEC-纳米-ESI-MS系统评估基于半胱氨酸的位点特异性缀合ADC的DAR。mAb重链上链间半胱氨酸的突变在mAb的轻链上引入了两个未配对的半胱氨酸，它们与药物缀合以产生DAR 2抗体物质。如图8所示，亲本mAb-1和ADC-1的原始谱图和去卷积谱图表明ADC样品中仅存在DAR 2形式。图8A-8C中的去卷积谱图显示各种聚糖存在于亲本mAb-1和缀合的ADC-1两者上。与非糖基化mAb-1一起，部分和完全糖基化mAb-1物质(具有G0F、G1F和G2F的各种组合)都与2种药物缀合。这些结果通过分析fabricator消化的mAb-1和ADC-1得到证实，如图9所示。已测试一些具有类似缀合化学的ADC，并且其仅显示DAR 2形式(数据未示出)。

1.3非位点特异性半胱氨酸缀合的ADC

除了分析位点特异性ADC以外，还研究了与部分还原mAb的链间半胱氨酸缀合的药物的DAR。使用类似化学方法产生的非位点特异性半胱氨酸缀合的ADC的原始谱图和去卷积谱图示出在图10中。用具有正常糖基化的未修饰亲本抗体产生ADC-2。亲本mAb-2(图10A-10B)和ADC-2(图10C-10D)的原始谱图和去卷积谱图显示ADC-2的DAR值在2-8之间变化。去卷积谱图还显示存在于mAb-2(图10B)和ADC-2(图10D)上的各种聚糖。

开发了使用双重紫外(UV)和MS检测的在线SEC-纳米电喷雾电离(纳米-ESI)-MS平台。此平台的效用通过检查非共价蛋白质相互作用，通过使用所述平台表征由滴定实验产生的抗原-抗体复合物并确定基于半胱氨酸的抗体-药物缀合物(ADC)的药物与抗体比率(DAR)来验证。此平台可容易修改，并且因此可适用于分析其他天然MS项目，例如单克隆抗体(mAb)电荷变体或大型聚集蛋白质复合物的表征。

三路分流器用于将SEC洗脱液不成比例地分流到MS和UV检测器，其中低体积级分引导到MS，而高体积级分引导到UV检测器。当前平台通过UV和天然MS实现互补双重检测且具有级分收集的可能性，并且可应用于抗原-抗体复合物的表征和链间半胱氨酸缀合ADC的DAR分析。对此在线SEC-纳米-ESI-MS平台的进一步修改(例如更改柱化学或使用QExactive UHMR仪器)将使其适用于其他应用，例如分析电荷变体或非常大的蛋白质复合物。本文所述的方法开启了将高盐分离技术(即HIC、WCX)与基于质谱的检测组合的可能性。总之，在线SEC-纳米-ESI-MS平台可广泛应用于分析用于各种应用的蛋白质生物制剂。