循环SPON-1（脊椎蛋白-1）在心房颤动评定中的应用

摘要

本发明涉及一种用于评定受试者心房颤动的方法，所述方法包括以下步骤：测定来自所述受试者的样品中的SPON‑1的量，以及将所述SPON‑1的量与参考量进行比较，借此评定心房颤动。此外，本发明涉及用于基于所述SPON‑1的量预测脑卒中的方法。

说明书

技术领域

本发明涉及一种用于评定受试者心房颤动的方法，所述方法包括以下步骤：测定来自受试者的样品中的SPON-1的量，以及将SPON-1的量与参考量进行比较，借此评定心房颤动。此外，本发明涉及用于基于SPON-1的量预测脑卒中的方法。

背景技术

心房颤动(AF)是最常见的心律失常类型，也是老年人口中最普遍的病症之一。心房颤动的特征是不规则的心脏跳动并且通常以短暂的异常跳动开始，该短暂的异常跳动会随着时间的推移增加并且可能成为永久性病症。估计270-610万美国人患有心房颤动，并且全球约有3300万人患有心房颤动(Chugh S.S.等人，Circulation 2014；129：837-47)。

心律失常(诸如心房颤动)的诊断，通常涉及对心律失常原因的测定以及对心律失常的分类。根据美国心脏病学会(ACC)、美国心脏协会(AHA)和欧洲心脏病学会(ESC)的心房颤动分类指南主要基于简单性和临床相关性。第一类别称为“首次检测到AF”。此类患者最初被诊断为患有AF，并且可能已经具有或尚未具有先前未被检测到的发作。如果首次检测到的发作在不到一周的时间内自行停止，但随后又发生了另一次发作，则类别更改为“阵发性AF”。尽管此类别中患者的发作可持续长达7天，但在大多数阵发性AF病例中，发作将在不到24小时内停止。如果发作持续超过一周，则将其分类为“持续性AF”。如果这种发作无法停止，即通过电复律或药物复律无法停止，并且持续一年以上，则将分类更改为“永久性AF”。非常期望对心房颤动进行早期诊断，因为心房颤动是脑卒中和全身性栓塞的重要风险因素(Hart等人，Ann Intern Med 2007；146(12)：857-67；Go AS等人，JAMA 2001；285(18)：2370-5)。脑卒中作为高收入国家中损失失能调整的寿命年数的原因和作为全球范围内的死亡原因而排在缺血性心脏病之后的第二位。为了降低脑卒中的风险，抗凝治疗似乎是最合适的治疗。

非常期望能够用于评定心房颤动和预测脑卒中的生物标志物。

Latini R.等人(J Intern Med.2011 Feb；269(2)：160-71)在心房颤动患者中测量了各种循环生物标志物(hsTnT、NT-proBNP、MR-proANP、MR-proADM、和肽素(copeptin)和CT-内皮素原-1)。

脊椎蛋白-1(SPON-1)是一种细胞粘附蛋白，其促进脊髓和感觉神经元细胞的附着和体外神经突生长。可能有助于脊髓和PNS中轴突的生长和导向(通过相似性)。血管平滑肌细胞的主要因子。它是一种位于细胞外基质中的神经调节蛋白，且被证明在血管平滑肌细胞中轴突的生长和导向中发挥作用。(Klar等人，Cell，1992，第69卷，第95-110页)。SPON-1在骨关节炎中的作用已例如由Tan等人，BMC structural biology，2011，第11卷，第22页)描述。

Stenemo等人描述了Ulsam同期群中SPON-1基线水平与超声心动图左室收缩功能恶化的结果相关(Stenemo等人，2017，EJHF；20：1：55)。

Lind等人描述了在2群体同期群中随访数年后鉴定关于发展心房颤动的风险的生物标志物(Lind等人，Heart 2017；103：377-382)。测试了85中标志物，尤其是SPON-1。经证明，SPON-1与心房颤动风险没有显著关联。

需要一种可靠的方法以用于对心房颤动的评定，包括诊断心房颤动、对心房颤动患者的风险分层(诸如脑卒中的发生)以及评定心房颤动的严重程度。此外，还非常期望用于预测脑卒中的改进方法。

本发明的技术问题可以看作是提供满足上述需要的方法。本技术问题由权利要求书及下文所表征的实施例解决。

有利的是，在本发明的研究背景下发现，测定来自受试者的样品中的SPON-1的量可以改进对心房颤动的评定。由于本发明，可以例如诊断受试者是否患有心房颤动，或是否存在罹患脑卒中的风险。

发明内容

本发明涉及一种用于评定受试者心房颤动的方法，该方法包括以下步骤

a)在至少一个来自受试者的样品中，测定生物标志物SPON-1(脊椎蛋白1)的量及任选地选自由利钠肽、ESM-1(内皮细胞特异性分子)、Ang2(血管生成素2)和IGFBP7(胰岛素样生长因子结合蛋白7)组成的组的至少一种其他生物标志物的量，以及

b)将生物标志物SPON-1的量与SPON-1的参考量进行比较，并且任选地将该至少一种其他生物标志物的量与所述至少一种其他生物标志物的参考量进行比较，借此评定心房颤动。

本发明进一步涉及一种辅助对心房颤动的评定的方法，该方法包括以下步骤：

a)提供至少一个来自受试者的样品，

b)在步骤a)中提供的该至少一个样品中，测定生物标志物SPON-1(脊椎蛋白-1)的量及任选地选自由利钠肽、ESM-1(内皮细胞特异性分子)、Ang2和IGFBP7(胰岛素样生长因子结合蛋白7)组成的组的至少一种其他生物标志物的量，以及

c)向医师提供关于测定的生物标志物SPON-1的量的信息及任选地关于测定的至少一种其他生物标志物的量的信息，由此辅助所述对心房颤动的评定。

进一步地，本发明预期一种用于辅助对心房颤动的评定的方法，该方法包括：

a)提供对生物标志物SPON-1的检定及任选地对选自由利钠肽、ESM-1(内皮细胞特异性分子)、Ang2和IGFBP7(胰岛素样生长因子结合蛋白7)组成的组的其他生物标志物的至少一种进一步检定，以及

b)提供关于在对心房颤动的评定中使用通过所述一种或多种检定获得或可获得的检定结果的说明。

本发明还包括用于评定心房颤动的计算机实现方法，该方法包括：

a)在处理单元处接收关于SPON-1的量的值及任选地关于选自由利钠肽、ESM-1(内皮细胞特异性分子)、Ang2和IGFBP7(胰岛素样生长因子结合蛋白7)组成的组的至少一种其他生物标志物的量的至少一个其他值，其中所述SPON-1的量及任选地所述至少一种其他生物标志物的量已经在来自受试者的样品中测定，

b)通过所述处理单元将在步骤(a)中接收的一个或多个所述值与一个或多个参考进行比较，以及

c)基于所述比较步骤b)来评定心房颤动。

本发明进一步涉及一种用于预测受试者的脑卒中风险的方法，该方法包括以下步骤

(a)在至少一个来自受试者的样品中，测定生物标志物SPON-1(脊椎蛋白-1)的量及任选地选自由利钠肽、ESM-1(内皮细胞特异性分子)、Ang2(血管生成素2)和IGFBP7(胰岛素样生长因子结合蛋白7)组成的组的至少一种其他生物标志物的量，以及

(b)评定所述受试者的所述临床脑卒中风险评分，以及

(c)基于步骤a)和b)的结果预测所述脑卒中风险。

本发明进一步涉及一种用于提高受试者的临床脑卒中风险评分的预测准确性的方法，该方法包括以下步骤

a)在至少一个来自受试者的样品中，测定生物标志物SPON-1(脊椎蛋白-1)的量及任选地选自由利钠肽、ESM-1(内皮细胞特异性分子)、Ang2(血管生成素2)和IGFBP7(胰岛素样生长因子结合蛋白7)组成的组的至少一种其他生物标志物的量，其中受试者具有已知的临床脑卒中风险评分，以及

b)将SPON-1的量和/或一种或多种包含利钠肽、ESM-1、ANGT2、IGFBP7的生物标志物的量的值与临床脑卒中风险评分相结合，借此提高所述临床脑卒中风险评分的预测准确性。

本发明进一步涉及一种试剂盒，其包括与SPON-1特异性结合的试剂及至少一种选自由以下项组成的组的其他试剂：与利钠肽特异性结合的试剂、与ESM-1特异性结合的试剂、与Ang2特异性结合的试剂和与IGFBP7特异性结合的试剂。

此外，本发明涉及

i)生物标志物SPON-1及任选地选自由利钠肽、ESM-1(内皮细胞特异性分子)、Ang2和IGFBP7(胰岛素样生长因子结合蛋白7)组成的组的至少一种其他生物标志物，和/或

ii)至少一种与SPON-1特异性结合的试剂及任选地至少一种选自由以下项组成的组的其他试剂：与利钠肽特异性结合的试剂、与ESM-1特异性结合的试剂、与Ang2特异性结合的试剂和与IGFBP7特异性结合的试剂，

用于a)评定心房颤动，b)预测受试者的脑卒中风险，以及用于c)提高临床脑卒中风险评分的预测准确性的体外用途。

附图说明

图1：在标测研究中测量SPON-1：探索性AFib组：有心房颤动病史的患者接受开胸手术并进行阵发性AF、持续性AF或SR的心外膜标测(标测研究)。评定了循环SPON-1水平(上面：箱形图，下面：ROC-曲线)。

图2：在Beat AF研究中测量SPON-1：具有脑卒中结果的AFib组：患有不同类型的心房颤动阵发性AF、持续性AF和永久性AF的患者。评定了循环SPON-1水平。箱形图示出BEAT-AF研究中按AF类型的SPON-1分布。

图3：预测SPON-1相关的脑卒中风险(Beat AF研究)：Kaplan-Meier曲线示出在限定SPON-1值＜＝1.4NPX与＞1.4NPX的两个群组中的无脑卒中生存率。SPON-1滴度升高与脑卒中风险增加相关。SPON-1提高了若干临床风险评分的C指数。

图4：BEAT-AF研究中观察到的SPON-1值，按口服抗凝剂的摄取分开：与其余患者相比，使用利伐沙班的患者显示出较低的SPON-1浓度。

具体实施方式

本发明涉及一种用于评定受试者心房颤动的方法，该方法包括以下步骤

a)在至少一个来自受试者的样品中，测定生物标志物SPON-1(脊椎蛋白-1)的量，以及

b)将生物标志物SPON-1的量与SPON-1的参考量进行比较，借此评定心房颤动。

在本发明方法的一个实施例中，该方法进一步包括，在步骤a)中，在来自受试者的样品中，测定选自由利钠肽、ESM-1(内皮细胞特异性分子)、Ang2(血管生成素2)和IGFBP7(胰岛素样生长因子结合蛋白7)组成的组的至少一种其他生物标志物的量，以及在步骤b)中，将至少一种其他生物标志物的量与参考量进行比较。

因此，本发明涉及一种用于评定受试者心房颤动的方法，该方法包括以下步骤

a)在至少一个来自受试者的样品中，测定生物标志物SPON-1(脊椎蛋白-1)的量及任选地选自由利钠肽、ESM-1(内皮细胞特异性分子)、Ang2(血管生成素2)和IGFBP7(胰岛素样生长因子结合蛋白7)组成的组的至少一种其他生物标志物的量，以及

b)将生物标志物SPON-1的量与SPON-1的参考量进行比较，并且任选地将该至少一种其他生物标志物的量与所述至少一种其他生物标志物的参考量进行比较，借此评定心房颤动。

对心房颤动(AF)的评定应基于比较步骤b)的结果。

因此，本发明优选地包括以下步骤

a)在至少一个来自受试者的样品中，测定生物标志物SPON-1(脊椎蛋白-1)的量及任选地选自由利钠肽、ESM-1(内皮细胞特异性分子)、Ang2(血管生成素2)和IGFBP7(胰岛素样生长因子结合蛋白7)组成的组的至少一种其他生物标志物的量，

b)将生物标志物SPON-1的量与SPON-1的参考量进行比较，并且任选地将至少一种其他生物标志物的量与所述至少一种其他生物标志物的参考量进行比较，以及

c)基于比较步骤b)的结果来评定心房颤动。

根据本发明的方法包括基本上由上述步骤组成的方法或包括其他步骤的方法。此外，本发明的方法优选地是离体方法，更优选地是体外方法。此外，它还可以包括除上述明确提及的步骤之外的步骤。例如，其他步骤可涉及测定进一步的标志物和/或样品预处理或评估通过该方法获得的结果。该方法可以手动执行或由自动化辅助。优选地，步骤(a)、(b)和/或(c)可全部或部分地由自动化辅助，例如通过合适的机器人和感觉设备进行步骤(a)中的测定或步骤(b)中由计算机实现的计算。

根据本发明，应评定心房颤动。如本文所用，术语“评定心房颤动”优选地指诊断心房颤动、区分阵发性心房颤动和持续性心房颤动、预测与心房颤动相关的不良事件(例如脑卒中)的风险、鉴定应当接受心电图(ECG)检查的受试者或评定对心房颤动的治疗。

如本领域技术人员应理解的，本发明的评定通常不旨在对100％的待测受试者是正确的。该术语优选地要求能够对受试者的具有统计显著性的部分进行正确的评定(诸如本文所述治疗的诊断、区分、预测、鉴定或评定)。可以由本领域技术人员使用各种众所周知的统计评估工具(例如，确定置信区间、p值确定、学生t检验、Mann-Whitney检验等)在无需进一步努力的情况下测定某一部分是否是统计上显著的。详情见Dowdy和Wearden，Statistics for Research，John Wiley&Sons，New York 1983。优选的置信区间为至少90％、至少95％、至少97％、至少98％或至少99％。p值优选为0.4、0.1、0.05、0.01、0.005或0.0001。

根据本发明，表述“心房颤动的评定”理解为辅助对心房颤动的评定，并且因此理解为辅助诊断心房颤动、辅助区分阵发性心房颤动和持续性心房颤动、辅助预测与心房颤动相关的不良事件的风险、辅助鉴定应接受心电图(ECG)检查的受试者、或理解为辅助评定对心房颤动的治疗。原则上，最终诊断将由医师实施。

在本发明的一个优选实施例中，对心房颤动的评定是对心房颤动的诊断。据此，诊断受试者是否患有心房颤动。

因此，本发明设想了一种用于诊断受试者心房颤动的方法，该方法包括以下步骤

a)在来自受试者的样品中，测定SPON-1的量，以及

b)将SPON-1的量与参考量进行比较，借此诊断心房颤动。

在一个实施例中，前述方法包括以下步骤：

(a)在至少一个来自受试者的样品中，测定生物标志物SPON-1(脊椎蛋白-1)的量及任选地选自由利钠肽、ESM-1(内皮细胞特异性分子)、Ang2(血管生成素2)和IGFBP7(胰岛素样生长因子结合蛋白7)组成的组的至少一种其他生物标志物的量，以及

(b)将生物标志物SPON-1的量与SPON-1的参考量进行比较，并且任选地将至少一种其他生物标志物的量与所述至少一种其他生物标志物的参考量进行比较，借此诊断心房颤动。

优选地，与用于诊断心房颤动的方法有关的待测受试者是被怀疑患有心房颤动的受试者。然而，还可以预期，先前已经诊断出受试者患有AF，并且通过实施本发明的方法来确认先前的诊断。

在本发明的另一个优选实施例中，对心房颤动的评定是对阵发性心房颤动和持续性心房颤动的区分。据此，测定受试者是否患有阵发性心房颤动或持续性心房颤动。

因此，本发明设想了一种用于区分受试者的阵发性心房颤动和持续性心房颤动的方法，该方法包括以下步骤

a)在来自受试者的样品中，测定SPON-1的量，以及

b)将SPON-1的量与参考量进行比较，借此区分阵发性心房颤动和持续性心房颤动。

在一个实施例中，前述方法包括以下步骤：

a)在至少一个来自受试者的样品中，测定生物标志物SPON-1(脊椎蛋白-1)的量及任选地选自由利钠肽、ESM-1(内皮细胞特异性分子)、Ang2(血管生成素2)和IGFBP7(胰岛素样生长因子结合蛋白7)组成的组的至少一种其他生物标志物的量，以及

b)将生物标志物SPON-1的量与SPON-1的参考量进行比较，并且任选地将至少一种其他生物标志物的量与所述至少一种其他生物标志物的参考量进行比较，借此区分阵发性心房颤动和持续性心房颤动。

在本发明的另一个优选实施例中，对心房颤动的评定是对与心房颤动相关的不良事件(诸如脑卒中)的风险的预测。据此，预测受试者存在和/或不存在所述不良事件的风险。

因此，本发明设想了一种用于预测受试者中与心房颤动相关的不良事件的风险的方法，该方法包括以下步骤

a)在来自受试者的样品中，测定SPON-1的量，以及

b)将SPON-1的量与参考量进行比较，借此预测与心房颤动相关的不良事件的风险。

在一个实施例中，前述方法包括以下步骤：

a)在至少一个来自受试者的样品中，测定生物标志物SPON-1(脊椎蛋白-1)的量及任选地选自由利钠肽、ESM-1(内皮细胞特异性分子)、Ang2(血管生成素2)和IGFBP7(胰岛素样生长因子结合蛋白7)组成的组的至少一种其他生物标志物的量，以及

b)将生物标志物SPON-1的量与SPON-1的参考量进行比较，并且任选地将至少一种其他生物标志物的量与所述至少一种其他生物标志物的参考量进行比较，借此预测与心房颤动相关的不良事件的风险。

设想可以预测各种不良事件。可以预测的优选不良事件是脑卒中。

因此，本发明特别预期一种用于预测受试者的脑卒中风险的方法，该方法包括以下步骤

a)在来自受试者的样品中，测定SPON-1的量，以及

b)将SPON-1的量与参考量进行比较，借此预测脑卒中的风险。

前述方法可以进一步包括基于步骤b)的比较结果来预测脑卒中的步骤c)。因此，步骤a)、b)、c)优选如下：

a)在来自受试者的样品中，测定SPON-1的量，以及

b)将SPON-1的量与参考量进行比较，以及

c)基于步骤b)的比较结果来预测脑卒中

在本发明的另一个优选实施例中，对心房颤动的评定是对心房颤动的治疗的评定。

因此，本发明设想了一种用于评定对受试者心房颤动的治疗的方法，该方法包括以下步骤

a)在来自受试者的样品中，测定SPON-1的量，以及

b)将SPON-1的量与参考量进行比较，借此评定对心房颤动的治疗。

在一个实施例中，前述方法包括以下步骤：

a)在至少一个来自受试者的样品中，测定生物标志物SPON-1(脊椎蛋白-1)的量及任选地选自由利钠肽、ESM-1(内皮细胞特异性分子)、Ang2(血管生成素2)和IGFBP7(胰岛素样生长因子结合蛋白7)组成的组的至少一种其他生物标志物的量，以及

b)将生物标志物SPON-1的量与SPON-1的参考量进行比较，并且任选地将至少一种其他生物标志物的量与所述至少一种其他生物标志物的参考量进行比较，借此评定对心房颤动的治疗。

优选地，与前述区分、前述预测、及评定对心房颤动的治疗有关的受试者是患有心房颤动的受试者，特别是已知患有心房颤动(并因此具有已知的心房颤动病史)的受试者。然而，对于前述预测方法，还可以设想受试者没有已知的心房颤动病史。

在本发明的另一个优选实施例中，对心房颤动的评定是对应当接受心电图(ECG)检查的受试者的鉴定。据此，鉴定应当接受或不应当接受心电图检查的受试者。

该方法可包括以下步骤

a)在至少一个来自受试者的样品中，测定生物标志物SPON-1(脊椎蛋白-1)的量及任选地选自由利钠肽、ESM-1(内皮细胞特异性分子)、Ang2(血管生成素2)和IGFBP7(胰岛素样生长因子结合蛋白7)组成的组的至少一种其他生物标志物的量，以及

b)将生物标志物SPON-1的量与SPON-1的参考量进行比较，并且任选地将至少一种其他生物标志物的量与所述至少一种其他生物标志物的参考量进行比较，借此鉴定应当接受心电图检查的受试者。

优选地，与前述鉴定应当接受心电图检查的受试者的方法有关的受试者是没有已知的心房颤动病史的受试者。在本文的别处定义了表述“没有已知的心房颤动病史”。

在本发明的另一个优选实施例中，对心房颤动的评定是对受试者的抗凝治疗的效力的评定。据此，评定所述治疗的效力。

在本发明的另一个优选实施例中，对心房颤动的评定是预测受试者的脑卒中风险。据此，预测本文所指的受试者是否存在脑卒中风险。

在本发明的另一个优选实施例中，对心房颤动的评定是鉴定受试者是否符合施用至少一种抗凝药物的条件或是否符合增加至少一种抗凝药物的剂量的条件。据此，评定受试者是否符合所述施用和/或所述增加剂量的条件。

在本发明的另一个优选实施例中，对心房颤动的评定是监测抗凝治疗。据此，评定受试者是否对所述治疗有响应。

术语“心房颤动”(缩写为“AF”或“AFib”)在本领域中是众所周知的。如本文所用，该术语优选地指以心房不协调激活和随之导致心房机械功能恶化为特征的室上性快速心律失常。特别地，该术语指以快速且不规则的跳动为特征的不正常的心律。它涉及心脏的两个上腔室。在正常的心律中，窦房结产生的脉冲通过心脏传播，并引起心肌收缩和血液泵送。在心房颤动时，窦房结的规则电脉冲被无组织、快速的电脉冲所取代，该无组织、快速的电脉冲导致不规则的心跳。心房颤动的症状是心悸、晕厥、呼吸急促或胸痛。然而，大多数发作都没有症状。在心电图上，心房颤动的特征是由在振幅、形状和定时上变化的快速振荡或震颤波替代一致的P波，该振荡或震颤波与房室传导完整时的不规则、频繁的快速心室反应有关。

美国心脏病学会(ACC)、美国心脏协会(AHA)和欧洲心脏病学会(ESC)提出了以下分类体系(参见Fuster V.等人，Circulation 2006；114(7)：e257-354，本文件的全部内容通过引用合并于此，参见例如文件中的图3)：首次检测到AF、阵发性AF、持续性AF和永久性AF。

所有患有AF的人最初都属于被称为第一次检测到AF的类别。然而，该受试者可能有或可能没有先前未被检测到的发作。如果AF持续超过一年，特别是不会(或仅在医疗干预下)转复为窦性心律，则受试者患有永久性AF。如果AF持续超过7天，则受试者患有持续性AF。该受试者可能需要药物或电干预来终止心房颤动。优选地，持续性AF在发作时发生，但心律失常通常不会自发(即在没有医疗干预的情况下)转复为窦性心律。阵发性心房颤动优选地指持续至多7天的间歇性心房颤动发作。在大多数阵发性AF的病例中，发作持续小于24小时。心房颤动的发作是自发终止的，即在没有医疗干预的情况下终止。因此，阵发性心房颤动的发作优选自发终止，而持续性心房颤动优选不自发结束。优选地，持续性心房颤动需要通过电复律或药物复律终止，或需要其他程序诸如消融程序(Fuster V.等人，Circulation 2006；114(7)：e257-354)终止。持续性AF和阵发性AF两者均可能复发，借此通过ECG记录来区别阵发性AF和持续性AF：当患者已经发生2次或更多次发作时，AF被认为是复发性的。如果心律失常自发终止，则将AF(特别是复发性AF)指定为阵发性的。如果AF持续超过7天，则将其指定为持续性的。

在本发明的一个优选实施例中，术语“阵发性心房颤动”定义为自发终止的AF发作，其中所述发作持续少于24小时。在一个替代性的实施例中，自发终止的发作持续长达七天。

这里所指的“受试者”优选地是哺乳动物。哺乳动物包括但不限于驯养的动物(例如牛、绵羊、猫、犬和马)、灵长类动物(例如人和非人灵长类动物，诸如猴)、兔以及啮齿类动物(例如小鼠和大鼠)。优选地，该受试者是人受试者。

优选地，待测受试者为任何年龄，更优选地，待测受试者为50岁或更高年龄，更优选60岁或更高年龄，且最优选65岁或更高年龄。进一步地，设想待测受试者为70岁或更高年龄。

此外，设想待测受试者为75岁或更高年龄。同样，该受试者可能在50岁与90岁之间。

在评定心房颤动的方法的一个优选实施例中，待测受试者应患有心房颤动。因此，受试者应具有已知的心房颤动病史。因此，在获得测试样品之前，受试者应经历过心房颤动发作，并且应已经例如通过ECG诊断出先前的心房颤动发作中的至少一次。例如，如果对心房颤动的评定是区分阵发性心房颤动和持续性心房颤动，或者如果对心房颤动的评定是预测与心房颤动相关的不良事件的风险，或者如果对心房颤动的评定是评定对心房颤动的治疗，则设想该受试者患有心房颤动。

在评定心房颤动的方法的另一个优选实施例中，例如，如果对心房颤动的评定是诊断心房颤动或鉴定应当接受心电图(ECG)检查的受试者，则待测受试者被怀疑患有心房颤动。

优选地，被怀疑患有心房颤动的受试者是在实施用于评定心房颤动的方法之前已经显示出心房颤动的至少一种症状的受试者。所述症状通常是短暂的，可能会在几秒钟内出现，并且可能会很快消失。心房颤动的症状包括头晕、晕厥、呼吸急促，以及特别是心悸。优选地，在获得样品之前的六个月内，受试者已经表现出心房颤动的至少一种症状。

另选地或附加地，被怀疑患有心房颤动的受试者应是70岁或更高年龄的受试者。

优选地，被怀疑患有心房颤动的受试者应没有已知的心房颤动病史。

根据本发明，没有已知的心房颤动病史的受试者优选是先前，即在实施本发明的方法之前(特别是在从受试者获得样品之前)，未诊断出患有心房颤动的受试者。然而，该受试者可能有或可能没有先前未诊断出的心房颤动发作。

优选地，术语“心房颤动”是指所有类型的心房颤动。因此，该术语优选涵盖阵发性心房颤动、持续性心房颤动或永久性心房颤动。

然而，在本发明的一个实施例中，待测受试者未患有永久性心房颤动。在该实施例中，术语“心房颤动”仅指阵发性心房颤动和持续性心房颤动。

然而，在本发明的另一个实施例中，待测受试者未患有阵发性心房颤动和永久性心房颤动。在该实施例中，术语“心房颤动”仅指持续性心房颤动。

当获得样品时，待测受试者可能会或可能不会经历心房颤动发作。因此，在对心房颤动的评定的优选实施例中(例如在心房颤动的诊断中)，当获得样品时，受试者没有经历心房颤动发作。在该实施例中，当获得样品时，受试者应具有正常的窦性心律(并应相应地处于窦性心律状态)。因此，即使在(暂时)无心房颤动的情况下，也可以诊断心房颤动。根据本发明的方法，本文所指的生物标志物的升高应在心房颤动发作后维持，并因此提供对患有心房颤动的受试者的诊断。优选地，在实施本发明的方法之后(或者更确切地说，在获得样品之后)，在约三天内、约一个月内、约三个月内或约6个月内诊断AF。在一个优选实施例中，在发作后约六个月内诊断心房颤动是可行的。在一个优选实施例中，在发作后约六个月内诊断心房颤动是可行的。因此，本文所指的对心房颤动的评定，特别是本文所指的与对心房颤动的评定有关的诊断、对风险的预测或区分，优选地在最后一次心房颤动发作后约三天后、更优选地约一个月后、甚至更优选地约三个月后、并且最优选地约六个月后进行。因此，设想优选地在最后一次心房颤动发作后约三天后、更优选地约一个月后、甚至更优选地约三个月后、并且最优选地约六个月后，获得待测样品。因此，对心房颤动的诊断优选还涵盖对心房颤动发作的诊断，该发作优选地在获得样品之前约三天内、更优选地约三个月内、并且最优选地约六个月内发生。

然而，还可以设想，当获得样品时(例如，关于脑卒中的预测)，受试者经历心房颤动发作。

术语“样品”是指体液样品、分离细胞样品或来自组织或器官样品。体液样品可以通过众所周知的技术获得，并且包括血液、血浆、血清、尿液、淋巴液、痰、腹水，或任何其他身体分泌物或其衍生物的样品。组织或器官样品可以通过例如活检从任何组织或器官获得。分离细胞可以通过诸如离心或细胞分选等分离技术从体液或组织或器官中获得。例如，可以从表达或产生生物标志物的那些细胞、组织或器官中获得细胞、组织或器官样品。样品可以是冷冻、新鲜、固定(例如福尔马林固定)、离心和/或包埋(例如石蜡包埋)的等。在评定样品中一种或多种生物标志物的量之前，细胞样品当然可以接受各种众所周知的收集后制备和贮存技术(例如核酸和/或蛋白质提取、固定、贮存、冷冻、超滤、浓缩、蒸发、离心等)。

在本发明的一个优选实施例中，样品是血液(即全血)、血清或血浆样品。血清是在使血液凝固后所获得的全血的液体级分。为了获得血清，通过离心去除血块并收集上清液。血浆是血液中无细胞的流体部分。为了获得血浆样品，将全血收集在抗凝处理过的试管(例如柠檬酸盐处理过的试管或EDTA处理过的试管)中。通过离心将细胞从样品中取出，并获得上清液(即血浆样品)。

如上所述，在获得样品时，受试者可能处于窦性心律状态或患有AF发作。

根据本发明，应测定生物标志物SPON1(脊椎蛋白-1)的量。该生物标志物也称为F-脊椎蛋白、f-脊椎蛋白和VSGP/F-脊椎蛋白(血管平滑肌细胞生长促进因子)。SPON1最初是在大鼠胚胎底板中发现的，大鼠胚胎底板是一种腹化结构，与发育中的脊椎动物神经系统中神经细胞形态和轴突生长的控制有关。SPON1是一种细胞外基质(ECM)蛋白，具有多个结构域，包括一个N端络丝蛋白(Reelin)结构域、一个脊椎蛋白结构域和六个血小板反应蛋白(thrombospondin)1型重复。已知该生物标志物在包括卵巢、肺、肾、前列腺和睾丸在内的多种器官中表达。

在一个实施例中，SPON1是人SPON1。人SPON1的长度为807个氨基酸。人SPON1的氨基酸序列是本领域中已知的，并且可通过Uniprot评定(对于该序列，请参见Q9HCB6-1)。人SPON1包含短信号肽(氨基酸1至28)，其在翻译后被裂解掉。

术语“利钠肽”包括心房利钠肽(ANP)型肽和脑利钠肽(BNP)型肽。因此，根据本发明的利钠肽包含ANP型肽和BNP型肽及其变体(参见，例如，Bonow RO.等人，Circulation1996；93：1946-1950)。

ANP型肽包含pre-proANP、proANP、NT-proANP和ANP。

BNP型肽包含pre-proBNP、proBNP、NT-proBNP和BNP。

前体原肽(pre-pro peptide)(在pre-proBNP的情况下为134个氨基酸)包含短信号肽，其被酶裂解掉以释放前导肽(pro peptide)(在proBNP的情况下为108个氨基酸)。将前导肽进一步裂解为N端前导肽(NT-pro肽，在NT-proBNP的情况下为76个氨基酸)和活性激素(在BNP的情况下为32个氨基酸，在ANP的情况下为28个氨基酸)。

根据本发明的优选利钠肽是NT-proANP、ANP、NT-proBNP、BNP。ANP和BNP是活性激素，并且具有比其各自的非活性对应物NT-proANP和NT-proBNP更短的半衰期。BNP在血液中代谢，而NT-proBNP作为完整分子在血液中循环，因此被肾脏清除。

根据本发明的最优选的利钠肽是NT-proBNP和BNP，特别是NT-proBNP。如以上简要讨论的，根据本发明所指的人NT-proBNP是一种多肽，其优选包含对应于人NT-proBNP分子的N端部分的长度为76个的氨基酸。人BNP和NT-proBNP的结构已经在现有技术例如WO 02/089657、WO 02/083913和Bonow RO.等人，New Insights into the cardiac natriureticpeptides.Circulation 1996；93：1946-1950中详细描述。优选地，如本文所用的人NT-proBNP是如EP 0 648 228 B1中公开的人NT-proBNP。

IGFBP-7(胰岛素样生长因子结合蛋白7)是由内皮细胞、血管平滑肌细胞、成纤维细胞和上皮细胞分泌的30kDa模块化糖蛋白(Ono，Y.等人，Biochem Biophys Res Comm 202(1994)1490-1496)。优选地，术语“IGFBP-7”是指人IGFBP-7。蛋白质的序列在本领域中是众所周知的，并且例如可通过UniProt(Q16270，IBP7_HUMAN)或通过GenBank(NP_001240764.1)获得。生物标志物IGFBP-7的详细定义如WO 2008/089994中所提供，该专利的全部内容以引用方式并入本文。IGFBP-7有两种同工型：同工型1和同工型2，它们是通过选择性剪接产生的。在本发明的一个实施例中，测量两种同工型的总量(对于该序列，参见UniProt数据库条目(Q16270-1和Q16270-2))。

生物标志物内皮细胞特异性分子1(缩写为ESM-1)是本领域众所周知的。该生物标志物通常也被称为内皮细胞特异性分子(endocan)。ESM-1是一种分泌蛋白，主要在人肺和肾组织的内皮细胞中表达。公共域数据表明，它也在甲状腺、肺和肾脏中表达，也可以在心脏组织中表达，参见例如蛋白质图谱数据库中ESM-1的条目(Uhlén M.等人，Science 2015；347(6220)：1260419)。此基因的表达受细胞因子调节。ESM-1是由20kDa成熟多肽和30kDa O联聚糖链组成的蛋白聚糖(Bechard D等人，J Biol Chem 2001；276(51)：48341-48349)。在本发明的一个优选实施例中，在来自受试者的样品中测定人ESM-1多肽的量。人ESM-1多肽的序列是本领域众所周知的(参见例如Lassale P.等人，J.Biol.Chem.1996；271：20458-20464，并且可以例如通过Uniprot数据库进行评定，参见条目Q9NQ30(ESM1_HUMMN))。通过选择性剪接产生ESM-1的两种同工型，即同工型1(具有Uniprot标识符Q9NQ30-1)和同工型2(具有Uniprot标识符Q9NQ30-2)。同工型1的长度为184个氨基酸。在同工型2中，同工型1的氨基酸101至150缺失。氨基酸1至19形成信号肽(其可能会被裂解掉)。

在一个优选实施例中，测定ESM-1多肽的同工型1的量，即具有如UniProt登录号Q9NQ30-1所示的序列的同工型1。

在另一个优选实施例中，测定ESM-1多肽的同工型2的量，即具有如UniProt登录号Q9NQ30-2所示的序列的同工型2。

在另一个优选实施例中，测定ESM-1多肽的同工型1和同工型2的量，即总ESM-1。

例如，可以使用针对ESM-1多肽的氨基酸85至184的单克隆抗体(诸如小鼠抗体)和/或使用山羊多克隆抗体来测定ESM-1的量。

生物标志物血管生成素-2(缩写为“Ang-2”，通常也称为ANGPT2)在本领域中是众所周知的。它是Ang-1和TIE2两者的天然存在的拮抗剂(参见例如Maisonpierre等人，Science 277(1997)55-60)。在没有ANG-1的情况下，该蛋白可诱导TEK/TIE2的酪氨酸磷酸化。在没有血管生成诱导因子(如VEGF)的情况下，ANG2介导的细胞基质接触的松动可诱导内皮细胞凋亡以及随之发生的血管退行。与VEGF协同作用，其可促进内皮细胞的迁移和增殖，从而作为允许的血管生成信号。人类血管生成素的序列在本领域中是众所周知的。Uniprot列出了血管生成素-2的三种同工型：同工型1(Uniprot标识符：O15123-1)、同工型2(标识符：O15123-2)和同工型3(O15123-3)。在一个优选实施例中，测定血管生成素-2的总量。总量优选为复合和游离血管生成素-2的量之和。

术语“测定”如本文所指的生物标志物(诸如SPON-1或利钠肽)的量是指生物标志物的定量，例如采用本文别处描述的适当检测方法来测量样品中生物标志物的水平。术语“测量”和“测定”在本文中可互换使用。

在一个实施例中，生物标志物的量是通过以下方式来测定的：使样品与特异性地结合生物标志物的试剂接触，从而在该试剂与所述生物标志物之间形成复合物，检测所形成的复合物的量，并由此测量所述生物标志物的量。

本文所指的生物标志物(诸如SPON-1)可以使用本领域中通常已知的方法来检测。检测方法通常包括定量样品中生物标志物的量的方法(定量方法)。本领域技术人员通常已知以下方法中的何种适合于生物标志物的定性和/或定量检测。可以使用商购可得的Western和免疫分析，如ELISA、RIA、基于荧光和发光的免疫检定和邻近延伸检定法来方便地检定样品中的例如蛋白质。检测生物标志物的其他合适方法包括测量肽或多肽特有的物理或化学性质，诸如其精确的分子质量或NMR谱。所述方法包括，例如生物传感器、耦合到免疫检定的光学装置、生物芯片、分析装置(诸如质谱仪、NMR分析仪或色谱装置)。进一步地，方法包括基于微板ELISA的方法、全自动或机器人免疫检定(例如在Elecsys

对于本文所述的生物标志物蛋白的检测，可以使用这种检定形式的各种免疫检定技术，参见例如美国专利号4016043、4424279和4018653。这些技术包括非竞争性类型的单位点和双位点或“夹心”检定，以及传统的竞争性结合检定。这些检定还包括标记抗体与靶标生物标志物的直接结合。

采用电化学发光标签的方法是众所周知的。此类方法利用特殊金属复合物的借助于氧化实现激发态的能力，所述特殊金属复合物从该激发态衰变为基态，从而发出电化学发光。关于综述请参见Richter，M.M.，Chem.Rev.2004；104：3003-3036。

在一个实施例中，用于测量生物标志物的量的检测抗体(或其抗原结合片段)被钌化或铱化。因此，抗体(或其抗原结合片段)应包含钌标签。在一个实施例中，所述钌标签是联吡啶钌(II)复合物。或抗体(或其抗原结合片段)应包含铱标签。在一个实施例中，所述铱标签是如WO 2012/107419中所公开的复合物。

在用于测定SPON-1的夹心检定(sandwich assay)的一个实施例中，该检定包含特异性结合SPON-1的生物素化第一单克隆抗体(作为捕获抗体)；以及特异性结合SPON-1的第二单克隆抗体(作为检测抗体)的钌化F(ab′)2片段。两种抗体与样品中的SPON-1形成夹心免疫检定复合物。

在用于测定利钠肽的夹心检定的一个实施例中，该检定包含特异性结合利钠肽的生物素化第一单克隆抗体(作为捕获抗体)；以及特异性结合利钠肽的第二单克隆抗体(作为检测抗体)的钌化F(ab′)2片段。两种抗体与样品中的利钠肽形成夹心免疫检定复合物。

测量多肽(诸如SPON-1或利钠肽)的量可优选地包括以下步骤：(a)将多肽与特异性结合所述多肽的试剂接触，(b)(任选地)移除未结合的试剂，(c)测量结合的结合试剂的量，即在步骤(a)中形成的试剂的复合物的量。根据一个优选实施例，所述接触、移除和测量步骤可由分析器单元执行。根据一些实施例，所述步骤可由所述系统的单个分析器单元或由彼此可操作通信的多于一个分析器单元来执行。例如，根据一个特定实施例，本文所公开的所述系统可包括用于执行所述接触和移除步骤的第一分析器单元；以及第二分析器单元，所述第二分析器单元通过传输单元(例如，机械臂)可操作地连接到所述第一分析器单元，所述第二分析器单元执行所述测量步骤。

特异性地结合生物标志物的试剂(在此也称为“结合试剂”)可以共价或非共价地耦合到标签，从而允许检测和测量结合的试剂。可通过直接或间接方法进行标记。直接标记涉及将标签直接(共价或非共价)耦合到结合试剂。间接标记涉及二级结合试剂与第一结合试剂的结合(共价或非共价)。该二级结合试剂应特异性地与第一结合试剂结合。所述二级结合试剂可以与适当的标签耦合，且/或是三级结合试剂的与二级结合试剂结合的靶标(受体)。合适的二级和更高阶的结合试剂可包括抗体、二抗和众所周知的链霉亲和素-生物素体系(Vector Laboratories，Inc.)。结合试剂或底物也可以用本领域已知的一个或多个标签“标记”。此类标签可以是更高阶的结合试剂的靶标。合适的标签包括生物素、洋地黄毒苷、His标签、谷胱甘肽-S-转移酶、FLAG、GFP、myc标签、甲型流感病毒血凝素(HA)、麦芽糖结合蛋白等。在肽或多肽的情况下，该标签优选地位于N-末端和/或C-末端。合适的标签是可通过合适的检测方法检测到的任何标签。典型的标签包括金颗粒、乳胶珠粒、吖啶酯(acridan ester)、鲁米诺、钌复合物、铱复合物、酶活性标签、放射性标签、磁性标签(“例如磁珠”，包括顺磁标签和超顺磁标签)和荧光标签。酶活性标签包括例如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、荧光素酶，以及它们的衍生物。用于检测的合适底物包括二氨基联苯胺(DAB)、3，3′-5，5′-四甲基联苯胺、NBT-BCIP(4-硝基蓝四唑氯化物和5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸盐，可作为现成储备溶液从Roche Diagnostics购得)、CDP-Star

多肽的量也可以优选地如下测定：(a)将包含如本文别处所述的用于多肽的结合试剂的固体支持物与包含肽或多肽的样品接触，以及(b)测量与该支持物结合的肽或多肽的量。制造支持物的材料在本领域中是众所周知的，并且尤其包括商用柱材料、聚苯乙烯珠粒、乳胶珠粒、磁性珠粒、胶体金属颗粒、玻璃和/或硅片和表面、硝化纤维带、膜、片材、耐久细胞(duracytes)、反应盘的孔和壁、塑料管等。

在另一方面中，在测量形成的复合物的量之前，从结合试剂与至少一种标志物之间形成的复合物中移除样品。因此，在一个方面中，该结合试剂可固定在固体支持物上。在另一方面中，通过应用洗涤溶液，可以从固体支持物上形成的复合物中移除样品。

“夹心检定”是最有用和最常用的检定之一，包括夹心检定技术的许多变型。简单地说，在典型的检定中，未标记的(捕获)结合试剂被固定或可以固定在固体底物上，并且使待测样品与捕获结合试剂接触。在适当的孵育期后，即在一段足以允许形成结合试剂-生物标志物复合物的时间后，再添加用能够产生可检测信号的报告分子标记的第二(检测)结合试剂，以及孵育足以允许形成结合试剂-生物标志物-标记的结合试剂的另一复合物的时间。可将任何未反应的材料洗去，并且通过观察由与检测结合试剂结合的报告分子产生的信号来确定生物标志物的存在。结果可以通过简单观察可见信号来定性，或者可以通过与含有已知量的生物标志物的对照样品进行比较来定量。

典型夹心检定的孵育步骤可以根据需要和在适当时进行变化。此类变化包括例如同时孵育，其中将两种或更多种结合试剂和生物标志物共孵育。例如，将待分析的样品和标记的结合试剂同时添加到固定的捕获结合试剂中。也可以首先孵育待分析的样品和标记的结合试剂，然后添加结合到固相或能够结合到固相的抗体。

特定结合试剂与生物标志物之间形成的复合物应与样品中存在的生物标志物的量成比例。应理解的是，将要应用的结合试剂的特异性和/或敏感性限定了样品中包含的能够被特异性结合的至少一种标志物的比例程度。也可在本文其他地方找到关于可以如何进行测量的进一步细节。形成的复合物的量应转化为生物标志物的量，从而反映样品中真实存在的量。

术语“结合试剂”、“特异性结合试剂”、“分析物特异性结合试剂”、“检测剂”和“与生物标志物特异性结合的试剂”在本文中可互换使用。优选地，它涉及这样的试剂，所述试剂包含特异性结合对应的生物标志物的结合部分。“结合试剂”、“检测剂”、“试剂”的实例是核酸探针、核酸引物、DNA分子、RNA分子、适体、抗体、抗体片段、肽、肽核酸(PNA)或化合物。优选的试剂是特异性结合待测定生物标志物的抗体。本文的术语“抗体”以最广泛的含义使用，并且包括各种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)和抗体片段，只要它们表现出所需的抗原结合活性(即其抗原结合片段)即可。优选地，该抗体是多克隆抗体(或其抗原结合片段)。更优选地，该抗体是单克隆抗体(或因此抗原结合片段，此外，如本文别处所述，设想使用在SPON-1的不同位置处结合的两种单克隆抗体(在夹心免疫检定中)。因此，将至少一种抗体用于测定SPON-1的量。

在一个实施例中，该至少一种抗体是小鼠单克隆抗体。在另一个实施例中，该至少一种抗体是兔单克隆抗体。在其他实施例中，该抗体是山羊多克隆抗体。在又一个实施例中，该抗体是绵羊多克隆抗体。

术语“特异性结合”或“特异性地结合”是指结合对分子在它们没有与其他分子显著结合的条件下表现为彼此结合的结合反应。当提及蛋白质或肽作为生物标志物时，术语“特异性结合”或“特异性地结合”优选地指结合试剂以至少10

在一个实施例中，本发明的方法基于检测包含人SPON-1和非人或嵌合SPON-1特异性结合试剂的蛋白复合物。在此类实施例中，本发明继续阐述一种用于评定受试者心房颤动的方法，所述方法包括以下步骤：(a)将来自所述受试者的样品与非人SPON-1特异性结合试剂一起温育，(b)测量(a)中形成的SPON-1特异性结合试剂与SPON-1之间的复合物，以及(c)将测定量的复合物与参考量进行比较。复合物的量等于或高于参考量指示诊断出心房颤动(并因此而存在心房颤动)、存在持续性心房颤动、受试者应接受ECG检查或受试者存在不良事件的风险。复合物的量低于或等于参考量指示不存在心房颤动、存在阵发性心房颤动、受试者不应接受ECG检查或受试者不存在不良事件的风险。

如本文所用的术语“量”包括本文提及的生物标志物(诸如SPON-1或利钠肽)的绝对量、所述生物标志物的相对量或浓度以及与其相关或可从其推导的任何值或参数。此类值或参数包括来自通过直接测量从所述肽获得的所有具体物理或化学性质的强度信号值，例如质谱或NMR谱中的强度值。此外，所包含的是通过在本说明书其他地方指定的间接测量获得的所有值或参数，例如，响应于肽或从特异性结合的配体获得的强度信号而从生物读出系统测定的反应量。应理解的是，与上述量或参数相关的值也可以通过所有标准数学运算获得。

如本文所用的术语“比较”是指将来自受试者的样品中的生物标志物(诸如SPON-1和利钠肽(诸如NT-proBNP或BNP))的量与本说明书别处指定的生物标志物的参考量进行比较。应理解的是，如本文所用的比较通常指对应的参数或值的比较，例如，将绝对量与绝对参考量进行比较，而将浓度与参考浓度进行比较，或将从样品中的生物标志物获得的强度信号与从第一样品获得的相同类型的强度信号进行比较。可手动或计算机辅助进行比较。因此，可以由计算装置进行比较。例如，可以将来自受试者的样品中生物标志物的测定或检测量的值与参考量相互比较，并且可以由执行比较算法的计算机程序自动执行所述比较。执行上述评估的计算机程序将以适当的输出格式提供所需的评定。对于计算机辅助比较，可将所测定的量的值与由计算机程序存储在数据库中的与适当参考相对应的值进行比较。计算机程序可进一步评估比较的结果，即以适当的输出格式自动提供所需的评定。对于计算机辅助比较，可将所测定的量的值与由计算机程序存储在数据库中的与适当参考相对应的值进行比较。计算机程序可进一步评估比较的结果，即以适当的输出格式自动提供所需的评定。

根据本发明，应将生物标志物SPON-1的量和任选地至少一种其他生物标志物(例如利钠肽)的量与参考值进行比较。参考值优选为参考量。术语“参考量”被技术人员很好地理解。应当理解，参考量应允许本文所述的心房颤动评定。例如，关于用于诊断心房颤动的方法，参考量优选地指这样的量，所述量允许将受试者分配到(i)患有心房颤动的受试者的组，或(ii)未患有心房颤动的受试者的组。可从待与测试样品一起(即同时或随后)分析的第一样品确定适当的参考量。

应当理解的是，SPON-1的量与SPON-1的参考量进行比较，而至少一种其他生物标志物(例如利钠肽)与所述至少一种其他生物标志物(例如利钠肽)的参考量进行比较。如果测定了两种或更多种标志物的量，则也可以设想基于所述两种或更多种标志物的量(例如SPON-1的量和利钠肽的量)来计算综合评分。在随后的步骤中，将评分与参考评分进行比较。

原则上，可以基于给定生物标志物的平均值或均值，通过施加标准统计方法来计算如上文所指定的受试者同期群的参考量。特别地，测试(诸如旨在诊断发生事件或未发生事件的方法)的准确性通过其接收器操作特性(ROC)而被最好地描述(特别地参见ZweigMH.等人，Clin.Chem.1993；39：561-577)。ROC曲线图是在观察到的整个数据范围内连续改变决策阈值所产生的所有敏感性对比特异性对的曲线。诊断方法的临床性能取决于其准确性，即其能够正确地将受试者分配到某一预后或诊断中。ROC曲线通过将适用于区分的整个阈值范围的敏感性对比1-特异性绘制成曲线而显示了两种分布之间的重叠。y轴上是敏感性，或真阳性分数，其被定义为真阳性测试结果数与真阳性测试结果数和假阴性测试结果数之积的比率。其仅从受影响的子组计算。x轴上是假阳性分数，或1-特异性，其被定义为假阳性结果数与真阴性结果数和假阳性结果数之积的比率。这是一个特异性指数，并且完全由未受影响的子组计算得出。由于真阳性分数和假阳性分数是完全分开计算的，所以通过使用来自两个不同子组的测试结果，ROC曲线与同期群中事件的患病率无关。ROC曲线上的每一点代表与特定决策阈值对应的敏感性/1-特异性对。有完全区别(两种结果分布没有重叠)的测试具有穿过左上角的ROC曲线，其中真阳性分数为1.0或100％(完全敏感性)，并且假阳性分数为0(完全特异性)。无区别(两个组的结果分布相同)的测试的理论曲线是从左下角到右上角的45°对角线。大多数曲线落在这两个极端之间。如果ROC曲线完全落到低于45°对角线，则可以通过将“阳性”的标准从“大于”逆转为“小于”或反之亦然来轻松纠正。定性地，曲线越接近左上角，则测试的总体准确度就越高。根据期望的置信区间，可以从ROC曲线导出阈值，从而允许分别在适当的敏感性和特异性平衡下对给定事件进行诊断。因此，优选地，通过确立如上所述的所述同期群的ROC并由此导出阈值量，可以生成用于本发明方法的参考，即允许评定心房颤动的阈值。根据诊断方法所需的敏感性和特异性，ROC曲线允许得出合适的阈值。应理解的是，最佳敏感性是不包括患有心房颤动的受试者(即排除)所需要的，而最佳特异性是针对据评定为患有心房颤动的受试者(即确定)所设想的。在一个实施例中，本发明的方法允许预测受试者存在与心房颤动相关的不良事件(诸如心房颤动和/或脑卒中的发生或复发)的风险。

在一个优选实施例中，本文的术语“参考量”是指预定值。所述预定值应允许评定心房颤动并因此诊断心房颤动、区分阵发性心房颤动和持续性心房颤动、预测与心房颤动相关的不良事件的风险、鉴定应当接受心电图(ECG)检查的受试者、或评定对心房颤动的治疗。应理解的是，参考量可以基于评定的类型而不同。例如，用于区分AF的SPON-1参考量通常会高于用于诊断AF的参考量。然而，技术人员将会考虑到这一点。

如上所述，术语“评定心房颤动”优选地指诊断心房颤动、区分阵发性心房颤动和持续性心房颤动、预测与心房颤动相关的不良事件的风险、鉴定应接受心电图(ECG)检查的受试者、或评定对心房颤动的治疗。在下文中，将更详细地描述本发明的方法的这些实施例。以上定义相应地适用。

如本文所用，术语“诊断”意为评定根据本发明的方法所指的受试者是否患有心房颤动(AF)。在一个优选实施例中，诊断出受试者患有阵发性AF。在一个替代性的实施例中，诊断出受试者未患有AF。

根据本发明，可以诊断所有类型的AF。因此，心房颤动可以是阵发性AF、持续性AF或永久性AF。优选地，特别是在未患有永久性AF的受试者中，诊断出阵发性或持续性心房颤动。

对受试者是否患有AF的实际诊断可以包括其他步骤，诸如确认诊断(例如，通过ECG例如Holter-ECG确认)。因此，本发明允许评定患者患有心房颤动的可能性。SPON-1的量高于参考量的受试者可能患有心房颤动，而SPON-1的量低于(或等于)参考量的受试者则不太可能患有心房颤动。因此，在本发明的上下文中，术语“诊断”还涵盖辅助医师评定受试者是否患有心房颤动。

优选地，来自测试受试者的样品中的SPON-1的量(和任选地至少一种其他生物标志物诸如ESM-1、Ang-2、IGFBP7和/或利钠肽的量)与参考量相比(或与多个参考量相比)增加指示受试者患有心房颤动，且/或来自受试者的样品中的SPON-1的量(和任选地至少一种其他生物标志物诸如ESM-1、Ang-2、IGFBP7和/或利钠肽的量)与参考量相比(或与多个参考量相比)减少指示受试者未患有心房颤动。

在一个优选实施例中，参考量，即SPON-1的参考量，以及如果测定的话，至少一种其他生物标志物的参考量，应允许区分患有心房颤动的受试者和未患有心房颤动的受试者。优选地，所述参考量是预定值。

在一个实施例中，本发明的方法允许诊断出受试者患有心房颤动。优选地，如果SPON-1的量(和任选地至少一种其他生物标志物诸如ESM-1、Ang-2、IGFBP7和/或利钠肽的量)高于参考量，则受试者患有AF。在一个实施例中，如果SPON-1的量高于参考量的某个百分位(例如，第99百分位)参考上限(URL)，则受试者患有AF。

在诊断心房颤动的方法的一个实施例中，所述方法进一步包括基于诊断结果而建议和/或开始心房颤动治疗的步骤。优选地，如果诊断出受试者患有AF，则建议或开始治疗。对心房颤动的优选治疗在本文别处公开(例如抗凝治疗)。

如本文所用，术语“区分”是指将受试者的阵发性心房颤动和持续性心房颤动区别开来。如本文所用，该术语优选地包括区分诊断受试者的阵发性心房颤动和持续性心房颤动。因此，本发明的方法允许评定患有心房颤动的受试者是否患有阵发性心房颤动或持续性心房颤动。实际的区分可以包括其他步骤，诸如对该区分的确认。因此，在本发明的上下文中，术语“区分”还涵盖辅助医师区分阵发性AF和持续性AF。

优选地，来自受试者的样品中的SPON-1的量(和任选地至少一种其他生物标志物诸如ESM-1、Ang-2、IGFBP7和/或利钠肽的量)与参考量相比(或与多个参考量相比)增加指示受试者患有持续性心房颤动，且/或来自受试者的样品中的SPON-1的量(和任选地至少一种其他生物标志物诸如ESM-1、Ang-2、IGFBP7和/或利钠肽的量)与参考量相比(或与多个参考量相比)减少(或相等)指示受试者患有阵发性心房颤动。与非AF受试者的参考量相比，在两种AF类型(阵发性和持续性)中，SPON-1的量均增加。

在一个优选实施例中，参考量应允许区分患有阵发性心房颤动的受试者和患有持续性心房颤动的受试者。优选地，所述参考量是预定值。

在上述区分阵发性心房颤动和持续性心房颤动的方法的实施例中，受试者未患有永久性心房颤动。

本发明的方法还设想了一种用于预测不良事件的风险的方法。

在一个实施例中，本文所述的不良事件的风险可以是对与心房颤动相关的任何不良事件的预测。优选地，所述不良事件选自心房颤动的复发(例如心脏复律后心房颤动的复发)和脑卒中。因此，应预测受试者(患有心房颤动的受试者)将来遭受不良事件(诸如脑卒中或心房颤动复发)的风险。

此外，设想所述与心房颤动有关的不良事件是没有已知的心房颤动病史的受试者心房颤动的发生。

在一个特别优选的实施例中，预测脑卒中的风险。

因此，本发明用于预测受试者的脑卒中风险的方法，该方法包括以下步骤

a)在来自受试者的样品中，测定SPON-1的量，以及

b)将SPON-1的量与参考量进行比较，借此预测脑卒中的风险。

特别地，本发明涉及一种用于预测受试者的脑卒中风险的方法，该方法包括以下步骤

(a)在至少一个来自受试者的样品中，测定生物标志物SPON-1(脊椎蛋白-1)的量及任选地选自由利钠肽、ESM-1(内皮细胞特异性分子)、Ang2(血管生成素2)和IGFBP7(胰岛素样生长因子结合蛋白7)组成的组的至少一种其他生物标志物的量，以及

(b)将生物标志物SPON-1的量与SPON-1的参考量进行比较，并且任选地将至少一种其他生物标志物的量与所述至少一种其他生物标志物的参考量进行比较，借此预测脑卒中风险。

优选地，如本文所用的术语“预测风险”是指评定受试者将遭受本文中所指不良事件(例如，脑卒中)的概率。典型地，预测受试者是存在罹患所述不良事件的风险(因此风险升高)还是不存在罹患所述不良事件的风险(因此风险降低)。因此，本发明的方法允许区分存在罹患所述不良事件的风险的受试者和不存在罹患所述不良事件风险的受试者。进一步地，设想本发明的方法允许区分存在降低的、平均的或升高的风险的受试者。

如上所述，应预测在一定时间窗口内遭受所述不良事件的风险(和概率)。在本发明的一个优选实施例中，预测窗口为约三个月、约六个月或特别是约一年的时段。因此，预测的是短期风险。

在另一个优选实施例中，预测窗口为约五年(例如，用于预测脑卒中)的时段。此外，预测窗口可为约六年(例如用于预测脑卒中)的时段。另选地，预测窗口可为约10年。此外，设想预测窗口为1年至3年的时段。因此，预测的是1至3年内罹患脑卒中的风险。此外，设想预测窗口为1年至10年的时段。因此，预测的是1至10年内罹患脑卒中的风险。

优选地，从完成本发明的方法起计算所述预测窗口。更优选地，从获得待测样品的时间点计算所述预测窗口。如本领域技术人员应理解的，风险预测通常不旨在对100％的受试者是正确的。然而，该术语要求能够以适当且正确的方式对受试者的具有统计显著性的部分进行预测。可以由本领域技术人员使用各种众所周知的统计评估工具(例如，确定置信区间、p值确定、学生t检验、Mann-Whitney检验等)在无需进一步努力的情况下测定某一部分是否是统计上显著的。详情见Dowdy和Wearden，Statistics for Research，John Wiley&Sons，New York 1983。优选的置信区间为至少90％、至少95％、至少97％、至少98％或至少99％。p值优选为0.1、0.05、0.01、0.005或0.0001。

在一个优选实施例中，表述“预测罹患所述不良事件的风险”是指待通过本发明的方法分析的受试者被分配到存在罹患所述不良事件的风险的受试者组中，或被分配到不存在罹患所述不良事件(例如脑卒中)的风险的受试者组中。因此，预测受试者存在或不存在罹患所述不良事件的风险。如本文所用，“存在罹患所述不良事件的风险的受试者”优选地具有升高的罹患所述不良事件的风险(优选在预测窗口内)。优选地，与受试者同期群中的平均风险相比，所述风险是升高的。如本文所用，“不存在罹患所述不良事件的风险的受试者”优选地具有降低的罹患所述不良事件的风险(优选在预测窗口内)。优选地，与受试者同期群中的平均风险相比，所述风险是降低的。优选在约一年的预测窗口内，存在罹患所述不良事件的风险的受试者优选地具有至少20％或更优选地至少30％的罹患所述不良事件诸如心房颤动的复发或发生的风险。优选在一年的预测窗口内，不存在罹患所述不良事件的风险的受试者优选地具有低于12％、更优选地低于10％的罹患所述不良事件的风险。

关于脑卒中的预测，优选在约五年或特别是约六年的预测窗口内，存在罹患所述不良事件的风险的受试者优选地具有至少10％或更优选地至少13％的罹患所述不良事件的风险。优选在约五年、或特别是约六年的预测窗口内，不存在罹患所述不良事件的风险的受试者优选地具有低于10％、或更优选地低于8％、或最优选地低于5％的罹患所述不良事件的风险。如果受试者未接受抗凝治疗，则风险可能更高。技术人员会考虑到这一点。

优选地，来自受试者的样品中的SPON-1的量(和任选地至少一种其他生物标志物诸如ESM-1、Ang-2、IGFBP7和/或利钠肽的量)与参考量相比(或与多个参考量相比)增加指示受试者存在与心房颤动相关的不良事件的风险，且/或来自受试者的样品中的SPON-1的量(和任选地至少一种其他生物标志物诸如ESM-1、Ang-2、IGFBP7和/或利钠肽的量)与参考量相比(或与多个参考量相比)减少(或相等)指示受试者不存在与心房颤动相关的不良事件的风险。

在一个优选实施例中，参考量(或多个参考量)应允许区分存在本文所指不良事件的风险的受试者和不存在所述不良事件的风险的受试者。优选地，所述参考量是预定值。

待预测的不良事件优选地是脑卒中。术语“脑卒中”在本领域是众所周知的。如本文所用，该术语优选地指缺血性脑卒中，特别是指脑缺血性脑卒中。通过本发明的方法预测的脑卒中应是由于流向大脑或其部分的血流量减少所致，该血流量减少导致脑细胞供氧不足。特别地，由于脑细胞死亡，脑卒中会导致不可逆转的组织损伤。脑卒中的症状在本领域是众所周知的。例如，脑卒中症状包括面部、手臂或腿部突然麻木或无力(特别是在身体的一侧)、突然意识混乱、说话或理解困难、一只或两只眼睛突然看不到，以及突然行走困难、头晕、失去平衡或协调。缺血性脑卒中可能是由动脉粥样硬化血栓形成或大脑主动脉栓塞、由凝血障碍或非肿瘤性血管疾病、或由导致总血流量减少的心脏缺血引起的。缺血性脑卒中优选地选自由动脉粥样硬化性血栓性脑卒中、心源性脑卒中和腔隙性脑卒中组成的组。优选地，要预测的脑卒中是急性缺血性脑卒中，特别是心源性脑卒中。心房颤动可引起心源性脑卒中(通常也称为栓塞性或血栓栓塞性脑卒中)。

优选地，所述脑卒中应与心房颤动相关。更优选地，所述脑卒中应由心房颤动引起。然而，还可以设想受试者没有心房颤动病史。

优选地，如果脑卒中与心房颤动的发作之间存在时间关系，则脑卒中与心房颤动相关。更优选地，如果脑卒中是由心房颤动引起的，则脑卒中与心房颤动相关。最优选地，如果脑卒中可能是由心房颤动引起的，则脑卒中与心房颤动相关。例如，心房颤动可引起心源性脑卒中(通常也称为栓塞性或血栓栓塞性脑卒中)。优选地，可以通过口服抗凝治疗来预防与AF相关的脑卒中。同样优选地，如果待测受试者患有心房颤动和/或具有已知的心房颤动病史，则认为脑卒中与心房颤动有关。同样，在一个实施例中，如果怀疑受试者患有心房颤动，则可认为脑卒中与心房颤动有关。

术语“脑卒中”优选地不包括出血性脑卒中。

在前述预测不良事件(例如脑卒中)的方法的一个优选实施例中，待测受试者患有心房颤动。更优选地，该受试者具有已知的心房颤动病史。根据用于预测不良事件的方法，受试者优选患有永久性心房颤动，更优选患有持续性心房颤动，且最优选患有阵发性心房颤动。

在预测不良事件的方法的一个实施例中，当获得样品时，患有心房颤动的受试者经历心房颤动发作。在预测不良事件的方法的另一个实施例中，当获得样品时，患有心房颤动的受试者没有经历心房颤动发作(并因此应具有正常的窦性心律)。此外，待预测其风险的受试者可能正在接受抗凝治疗。

在预测不良事件的方法的另一个实施例中，待测受试者没有已知的心房颤动病史。特别地，设想受试者未患有心房颤动。

本发明的方法可以辅助个性化医疗。在一个优选实施例中，如果已鉴定受试者存在罹患脑卒中的风险，用于预测受试者的脑卒中风险的方法进一步包括i)建议抗凝治疗的步骤，或ii)建议强化抗凝治疗的步骤。

在另一个优选实施例中，如果(通过本发明的方法)已鉴定该受试者存在罹患脑卒中的风险，用于预测受试者的脑卒中风险的方法进一步包括i)开始抗凝治疗的步骤，或ii)强化抗凝治疗的步骤。

如果测试受试者正在接受抗凝治疗，并且如果(通过本发明的方法)已鉴定该受试者不存在罹患脑卒中的风险，则可以减少抗凝治疗的剂量。因此，可以建议减少剂量。通过减少剂量，可以减少遭受副作用(例如出血)的风险。

如本文所用的术语“建议”是指确立可应用于受试者的治疗方案。然而，应该理解的是该术语并不包括应用实际治疗。建议的治疗取决于通过本发明的方法提供的结果。

特别地，以下规定适用：

如果待测受试者未接受抗凝治疗，则如果已确定受试者有脑卒中风险，就建议开始抗凝治疗。因此，应开始抗凝治疗。

如果待测受试者已接受抗凝治疗，则如果已鉴定受试者有脑卒中风险，就建议强化抗凝治疗。因此，应强化抗凝治疗。

在一个优选实施例中，通过增加抗凝剂的剂量(即，当前施用的促凝剂的剂量)来强化抗凝治疗。

在一个特别优选的实施例中，通过增加用更有效的抗凝剂替代当前施用的抗凝剂来强化抗凝治疗。因此，建议更换抗凝剂。

据描述，与维生素K拮抗剂华法林相比，用口服抗凝剂阿哌沙班实现了高风险患者中的更好预防，如Hijazi等人，The Lancet 2016 387，2302-2311所示(图4)。

因此，设想待测受试者是用维生素K拮抗剂(诸如华法林或双香豆素)治疗的受试者。如果已确定受试者有患脑卒中的风险(通过本发明的方法，建议用口服抗凝剂(特别是达比加群、利伐沙班或阿哌沙班)替代维生素K拮抗剂。根据用维生素K拮抗剂的治疗中止，开始用口服抗凝剂进行治疗。

根据本发明的方法的该实施例，应评定待使用生物标志物测试的受试者是否应接受心电图(ECG)检查，即心电图评定。应进行所述评定以用于诊断，即检测所述受试者是否存在AF。

如本文所用，术语“鉴定受试者”优选地指使用所产生的与受试者的样品中的SPON-1的量(及任选地至少一种其他生物标志物的量)有关的信息或数据来鉴定应接受ECG检查的受试者。所鉴定的受试者患有AF的可能性增加。进行ECG评定作为确认。

心电图(简称ECG)是通过合适的ECG记录心脏电活动的过程。ECG设备记录由心脏产生的电信号，这些信号在全身传播到皮肤。通过使测试受试者的皮肤与ECG设备所包含的电极接触来实现电信号的记录。获取该记录的过程是非侵入性的且无风险。进行ECG以用于诊断心房颤动，即用于评定测试受试者是否存在心房颤动。在本发明的方法的实施例中，ECG设备是单导联设备(例如单导联手持式ECG设备)。在另一个优选实施例中，ECG设备是12导联心电图设备，例如Holter监测仪。

优选地，来自测试受试者的样品中的SPON-1的量(和任选地至少一种其他生物标志物诸如ESM-1、Ang-2、IGFBP7和/或利钠肽的量)与参考量相比(或与多个参考量相比)增加指示受试者应接受ECG检查，且/或来自受试者的样品中的SPON-1的量(和任选地至少一种其他生物标志物诸如ESM-1、Ang-2、IGFBP7和/或利钠肽的量)与参考量相比(或与多个参考量相比)减少(或相等)指示受试者不应接受ECG检查。

在一个优选实施例中，参考量应允许区分应接受ECG检查的受试者和不应接受ECG检查的受试者。优选地，所述参考量是预定值。

如本文所用，术语“评定对心房颤动的治疗”优选地指评定旨在治疗心房颤动的治疗。特别地，应评定治疗的效力。在一个优选实施例中，所述治疗是抗凝治疗。因此，本发明涵盖用于评定抗凝治疗的方法。

待评定的治疗可以是任何旨在处理心房颤动的治疗。优选地，所述治疗选自由以下项组成的组：施用至少一种抗凝剂、节律控制、心率控制、复律和消融。所述治疗是本领域中众所周知的，并且例如在Fuster V等人Circulation 2011；123：e269-e367中综述，该文献的全部内容以引用方式合并于本文。

在一个实施例中，治疗是施用至少一种抗凝剂，即抗凝治疗。抗凝治疗优选为旨在降低所述受试者的抗凝风险的治疗。施用至少一种抗凝剂应旨在减少或预防血液凝固和相关的脑卒中。

在一个优选实施例中，至少一种抗凝剂(即，抗凝治疗)选自由以下项组成的组：肝素、香豆素衍生物(即维生素K拮抗剂)(特别是华法林或双香豆素)、口服抗凝剂(特别是达比加群(dabigatran)、利伐沙班(rivaroxaban)或阿哌沙班(apixaban))、组织因子途径抑制剂(TFPI)、抗凝血酶III、因子IXa抑制剂、因子Xa抑制剂、因子Va和VIIIa的抑制剂以及凝血酶抑制剂(抗IIa型)。因此，设想受试者服用上述药物中的至少一种。

在优选的实施例中，该抗凝剂是维生素K拮抗剂，诸如华法林或双香豆素。维生素K拮抗剂，诸如华法林或双香豆素价格较低，但是因为治疗不方便、繁琐，而且往往不可靠，并且治疗时间在治疗范围内波动，所以需要更好的患者依从性。NOAC(新的口服抗凝剂)包括直接因子Xa抑制剂(阿哌沙班、利伐沙班、达瑞沙班(darexaban)、依度沙班(edoxaban))、直接凝血酶抑制剂(达比加群)和PAR-1拮抗剂(沃拉帕沙(vorapaxar)、阿托帕沙(atopaxar))。

在另一个优选实施例中，抗凝剂为口服抗凝剂，特别是阿哌沙班、利伐沙班、达瑞沙班、依度沙班、达比加群、沃拉帕沙或阿托帕沙。

因此，待测受试者可在测试时(即收到样品时)用口服抗凝剂或维生素K拮抗剂进行治疗。

在一个优选实施例中，评定对心房颤动的治疗是监测所述治疗。在该实施例中，参考量优选地是较早获得的样品(即，在步骤a中的测试样品之前获得的样品)中的SPON-1的量。

任选地，除SPON-1的量外，测定本文所指的至少一种其他生物标志物的量。

因此，本发明涉及一种用于监测对受试者心房颤动的治疗的方法，例如监测抗凝治疗的方法，所述受试者优选地患有心房颤动，其中所述方法包括以下步骤

(a)在来自受试者的第一样品中，测定生物标志物SPON-1(脊椎蛋白-1)的量及任选地选自由利钠肽、ESM-1(内皮细胞特异性分子)、Ang2(血管生成素2)和IGFBP7(胰岛素样生长因子结合蛋白7)组成的组的至少一种其他生物标志物的量，

(b)在来自受试者的第二样品中，测定生物标志物SPON-1(脊椎蛋白-1)的量及任选地选自由利钠肽、ESM-1(内皮细胞特异性分子)、Ang2(血管生成素2)和IGFBP7(胰岛素样生长因子结合蛋白7)组成的组的至少一种其他生物标志物的量，其中所述第二样品已在获得所述第一样品之后获得，

(c)将第一样品中的SPON-1的量与第二样品中的SPON-1的量进行比较，并且任选地将第一样品中的所述至少一种其他生物标志物的量与所述第二样品中的所述至少一种其他生物标志物的量进行比较，由此监测治疗，例如抗凝治疗。

在上述方法的一个实施例中，受试者患有心房颤动。在上述方法的另一个实施例中，受试者未患有心房颤动。

如本文所用，术语“监测”优选地涉及评定如本文别处所指的治疗的效果。因此，监测治疗(例如抗凝治疗)的效力。

前述方法可以包括基于在步骤c)中执行的比较步骤的结果来监测治疗的其他步骤。如本领域技术人员应理解的，风险预测通常不旨在对100％的受试者是正确的。然而，该术语要求能够以适当且正确的方式对受试者的具有统计显著性的部分进行预测。因此，实际监测可以包括其他步骤，诸如确认。

优选地，通过实施本发明的方法，可以评定受试者是否对所述治疗有响应。在获得第一样品和第二样品之间，如果受试者的病症得到改善，则受试者对治疗有响应。优选地，在获得第一样品和第二样品之间，如果受试者的病症恶化，则受试者对治疗没有响应。

另选地，对抗凝治疗有响应的受试者优选为在获得第一样品和第二样品之间脑卒中风险降低的受试者。对抗凝治疗没有响应的受试者优选为在获得第一样品和第二样品之间脑卒中风险增加或保持不变的受试者。例如，可以通过评定受试者的临床脑卒中风险评分来测定脑卒中风险是增加、降低还是保持不变。优选的评分在本文别处公开。

优选地，在开始所述治疗之前获得第一样品。更优选地，在开始所述治疗之前的一周内，特别是两周内获得样品。然而，还预期可以在所述治疗开始之后(但是在获得第二样品之前)获得第一样品。在这种情况下，对正在进行的治疗进行监测。

因此，第二样品应在获得第一样品之后获得。应理解的是，第二样品应在所述治疗开始后获得。

此外，特别预期的是，在获得第一样品之后的一段合理的时间之后获得第二样品。应理解的是，本文所指的生物标志物的量不会立即(例如在1分钟或1小时内)改变。因此，在该上下文中，“合理的”是指获得第一样品和第二样品之间的间隔，该间隔允许生物标志物进行调整。因此，第二样品优选地在获得所述第一样品之后至少一个月、至少三个月、或者特别是在获得所述第一样品之后至少六个月获得。

优选地，第二样品中的生物标志物的量，即SPON-1和任选地利钠肽的量与第一样品中的生物标志物的量相比减少、更优选地显著减少、且最优选地在统计上显著减少，指示受试者对治疗有响应。因此，治疗是有效的。同样优选地，SPON-1的浓度没有变化或第二样品中的生物标志物的量与第一样品中的生物标志物的量相比增加、更优选地显著增加、且最优选地在统计上显著增加，指示受试者对治疗没有响应。因此，治疗是无效的。

术语“显著”和“在统计上显著”是本领域技术人员已知的。因此，本领域技术人员可以使用各种众所周知的统计评估工具在无需进一步努力的情况下测定增加或减少是显著的还是在统计上显著的。例如，显著的增加或减少是至少10％，特别是至少20％的增加或减少。

通常，如果治疗降低了受试者复发心房颤动的风险，则认为该受试者对治疗有响应。如果治疗没有降低受试者复发心房颤动的风险，则认为该受试者对治疗没有响应。

在一个实施例中，如果受试者对治疗没有响应，则增加治疗强度。此外，设想如果受试者对治疗有响应，则降低治疗强度。另选地，如果受试者对治疗有响应，则能够以相同强度继续治疗。

例如，可以通过增加所施用药物的剂量来增加治疗强度。例如，可以通过减少所施用药物的剂量来降低治疗强度。由此，有可能避免不希望的不良副作用，例如出血。如果以相同强度继续治疗，则施用的药物和剂量可保持不变。关于增加抗凝治疗的强度，参见例如本文别处的解释，诸如与评定受试者抗凝治疗的效力有关的解释。

在另一个优选实施例中，评定对心房颤动的治疗是指导对心房颤动的治疗。如本文所用，术语“指导”优选地涉及基于治疗期间对生物标志物即SPON-1的测定来调节治疗强度，诸如增加或减少口服抗凝治疗的剂量。

在进一步的优选实施例中，评定对心房颤动的治疗是对心房颤动治疗的分层。因此，应鉴定符合某种心房颤动治疗的条件的受试者。如本文所用，术语“分层”优选地涉及基于特定的风险、所鉴定的分子途径和/或特定药物或程序的预期效力来选择适当的治疗。根据检测到的风险，涉及很少或没有心律失常的症状的特定患者将符合控制心室率、心脏复律或消融的条件，否则他们将仅接受抗血栓治疗。

本文以上给出的定义和解释比照适用于以下内容(除非另有说明)。

本发明进一步涉及一种辅助对心房颤动的评定的方法，所述方法包括以下步骤：

a)提供至少一个来自受试者的样品，

b)在步骤a)中提供的所述至少一个样品中，测定生物标志物SPON-1(脊椎蛋白-1)的量及任选地选自由利钠肽、ESM-1(内皮细胞特异性分子)、Ang2和IGFBP7(胰岛素样生长因子结合蛋白7)组成的组的至少一种其他生物标志物的量，以及

c)向医师提供关于测定的生物标志物SPON-1的量的信息及任选地关于测定的至少一种其他生物标志物的量的信息，由此辅助所述对心房颤动的评定。

医师应为主治医师，即要求测定生物标志物的医师。上述方法应帮助主治医师评定心房颤动。因此，该方法不涵盖以上所指的与评定心房颤动的方法有关的诊断、预测、监测、区分、鉴定。

上述样品获得方法的步骤a)不包括从受试者处提取样品。优选地，通过接收来自所述受试者的样品来获得该样品。因此，可以递送样品。

在一个实施例中，上述方法是辅助预测脑卒中的方法，所述方法包括以下步骤：

a)提供至少一个来自与评定心房颤动的方法有关，特别是与预测心房颤动的方法有关的本文所指的受试者的样品，

b)测定生物标志物SPON-1的量及选自由利钠肽、ESM-1(内皮细胞特异性分子)、Ang2和IGFBP7(胰岛素样生长因子结合蛋白7)组成的组的至少一种其他生物标志物的量，以及

c)向医师提供关于测定的生物标志物SPON-1的量的信息及任选地关于测定的至少一种其他生物标志物的量的信息，由此辅助预测脑卒中。

本发明进一步涉及一种方法，该方法包括：

a)提供对生物标志物SPON-1的检定及任选地对选自由利钠肽、ESM-1(内皮细胞特异性分子)、Ang2和IGFBP7(胰岛素样生长因子结合蛋白7)组成的组的其他生物标志物的至少一种进一步检定，以及

b)提供关于在对心房颤动的评定中使用通过所述一种或多种检定获得或可获得的检定结果的说明。

前述方法的目的优选地是辅助对心房颤动的评定。

说明应包含实施评定如上所述的心房颤动的方法的方案。此外，说明应包含至少一个用于SPON-1参考量的值及任选地至少一个用于利钠肽参考量的值。

“检定”优选是适于测定生物标志物的量的试剂盒。术语“试剂盒”在下文中解释。例如，所述试剂盒应包含至少一种用于生物标志物SPON-1的检测剂及任选地至少一种选自由以下项组成的组的其他试剂：与利钠肽特异性结合的试剂、与ESM-1特异性结合的试剂、与Ang2特异性结合的试剂和与IGFBP7特异性结合的试剂。因此，可以存在一种至四种检测剂。这一种至四种生物标志物的检测剂可在单个试剂盒或单独的试剂盒中提供。

通过所述测试获得或可获得的测试结果是一个或多个生物标志物的量的值。

在一个实施例中，步骤b)包括提供关于在脑卒中的预测(如本文别处所述)中使用通过所述一个或多个测试获得或可获得的测试结果的说明。

本发明进一步涉及用于评定心房颤动的计算机实现方法，该方法包括

a)在处理单元处接收关于SPON-1的量的值及任选地关于选自由利钠肽、ESM-1(内皮细胞特异性分子)、Ang2和IGFBP7(胰岛素样生长因子结合蛋白7)组成的组的至少一种其他生物标志物的量的至少一个其他值，其中所述SPON-1的量及任选地所述至少一种其他生物标志物的量已经在来自受试者的样品中测定，

b)通过所述处理单元将在步骤(a)中接收的一个或多个所述值与一个或多个参考进行比较，以及

c)基于所述比较步骤b)来评定心房颤动。

上述方法是计算机实现方法。优选地，计算机实现方法的所有步骤由计算机(或计算机网络)的一个或多个处理单元执行。因此，步骤(c)中的评定由处理单元实施。优选地，所述评定基于步骤(b)的结果。

如本文别处所述，步骤(a)中接收的一个或多个值应从测定来自受试者的生物标志物的量中得出。优选地，该值是生物标志物浓度的值。该值通常将由处理单元通过将该值上载或发送到处理单元来接收。另选地，通过经由用户界面输入该值，可由处理单元接收该值。

在前述方法的实施例中，步骤(b)中提出的一个或多个参考是从存储器确立的。优选地，从存储器确立所述参考的值。

在本发明的前述计算机实现方法的实施例中，步骤c)中进行的评定的结果经由显示器提供，该显示器配置为呈现结果。

在本发明的前述计算机实现方法的实施例中，该方法可以包括进一步的步骤，该进一步的步骤将关于在步骤c)中进行的评定的信息传输到受试者的电子病历中。

如上文所述，本文所指的生物标志物的测定允许预测脑卒中风险，例如(但不限于)与心房颤动相关的脑卒中风险。

在本发明的基础研究中，进一步证明，SPON-1(及本文所指的其他生物标志物)的测定允许提高受试者的临床脑卒中风险评分的预测准确性。因此，与单独的SPON-1的测定或临床脑卒中风险评分的测定相比，临床脑卒中风险评分的测定与SPON-1的测定结合可以甚至更可靠地预测脑卒中。

因此，用于预测脑卒中风险的方法可进一步包括SPON-1的量与临床脑卒中风险评分的结合。基于SPON-1的量与临床风险评分的结合，预测测试受试者的脑卒中风险。

在前述方法的实施例中，该方法进一步包括SPON-1的量与参考量的比较。在这种情况下，比较结果与临床脑卒中风险评分相结合。

因此，本发明特别涉及用于预测受试者的脑卒中风险的方法，该方法包括以下步骤

a)在来自受试者的样品中，测定SPON-1的量，以及

b)将SPON-1的量的值与临床脑卒中风险评分的值相结合，借此预测所述受试者的脑卒中风险。

根据该方法，设想受试者是具有已知临床脑卒中风险评分的受试者。因此，临床脑卒中风险评分的值是受试者已知的。

在一个优选实施例中，前述方法的步骤a)和b)如下：

a)在至少一个来自受试者的样品中，测定生物标志物SPON-1(脊椎蛋白-1)的量及任选地选自由利钠肽、ESM-1(内皮细胞特异性分子)、Ang2(血管生成素2)和IGFBP7(胰岛素样生长因子结合蛋白7)组成的组的至少一种其他生物标志物的量，其中受试者具有已知的临床脑卒中风险评分，以及

b)将SPON-1的量和/或所述一种或多种包含利钠肽、ESM-1、Ang2、IGFBP7的生物标志物的量的值与临床脑卒中风险评分相结合，借此预测所述受试者的脑卒中风险。

或者，该方法可包括获得或提供临床脑卒中风险评分的值。

优选地，该值是数字。在一个实施例中，临床脑卒中风险评分是通过医生可用的基于临床的工具中的一种生成的。优选地，值是通过测定受试者的临床脑卒中风险评分的值而提供的。更优选地，该值是从患者记录数据库和受试者的病史获得的。因此，评分的值也可以使用该受试者的历史数据或公布的数据来确定。

根据本发明，将SPON-1(及任选地其他标志物)的量与临床脑卒中风险评分相结合。这意味着优选地，将SPON-1的量的值与临床脑卒中风险评分相结合。因此，将这些值有效结合以预测受试者罹患脑卒中的风险。通过结合该值，可以计算单个值，该单个值本身可用于预测。

临床脑卒中风险评分在本领域中是众所周知的。例如，所述评分在Kirchhof P.等人(European Heart Journal 2016；37：2893-2962)中进行了描述，其全部公开内容通过引用并入本文。在一个实施例中，评分是CHA

本发明的方法还可包括评定临床风险评分的步骤。据此，通过以下步骤预测罹患脑卒中的风险

(a)在至少一个来自受试者的样品中，测定生物标志物SPON1的量及任选地选自由利钠肽、ESM-1(内皮细胞特异性分子)、Ang2(血管生成素2)和IGFBP7(胰岛素样生长因子结合蛋白7)组成的组的至少一种其他生物标志物的量，以及

(b)评定所述受试者的所述临床脑卒中风险评分，以及

(c)基于步骤a)和b)的结果预测所述脑卒中风险。

本发明进一步涉及一种用于提高受试者的临床脑卒中风险评分的预测准确性的方法，该方法包括以下步骤

a)测定样品中的SPON-1的量，以及

b)将SPON-1的量的值与临床脑卒中风险评分相结合，借此提高所述临床脑卒中风险评分的预测准确性。

该方法可包括进一步的步骤：c)基于步骤b)的结果提高所述临床脑卒中风险评分的预测准确性。

在一个优选实施例中，前述方法的步骤a)和b)如下：

c)在至少一个来自受试者的样品中，测定生物标志物SPON-1(脊椎蛋白-1)的量及任选地选自由利钠肽、ESM-1(内皮细胞特异性分子)、Ang2(血管生成素2)和IGFBP7(胰岛素样生长因子结合蛋白7)组成的组的至少一种其他生物标志物的量，其中受试者具有已知的临床脑卒中风险评分，以及

d)将SPON-1的量和/或一种或多种包含利钠肽、ESM-1、Ang2、IGFBP7的生物标志物的量的值与临床脑卒中风险评分相结合，借此提高所述临床脑卒中风险评分的预测准确性。

本文中给出的与评定心房颤动的方法有关的定义和解释，特别是预测不良事件(诸如脑卒中)的风险的定义和解释优选地同样适用于上述方法。例如，设想受试者是具有已知临床脑卒中风险评分的受试者。或者，该方法可包括获得或提供临床脑卒中风险评分的值。

根据本发明，将SPON-1的量与临床脑卒中风险评分相结合。这意味着优选地，将SPON-1的量的值与临床脑卒中风险评分相结合。因此，将这些值有效结合，以提高所述临床脑卒中风险评分的预测准确性。

此外，本发明涉及

i)生物标志物SPON-1及任选地选自由利钠肽、ESM-1(内皮细胞特异性分子)、Ang2和IGFBP7(胰岛素样生长因子结合蛋白7)组成的组的至少一种其他生物标志物，和/或

ii)至少一种与SPON-1特异性结合的试剂及任选地至少一种选自由以下项组成的组的其他试剂：与利钠肽特异性结合的试剂、与ESM-1特异性结合的试剂、与Ang2特异性结合的试剂和与IGFBP7特异性结合的试剂，

用于a)评定心房颤动，b)预测受试者的脑卒中风险，以及用于c)提高临床脑卒中风险评分的预测准确性的用途(特别是体外用途，例如，在来自受试者的样品中)。

优选地，前述用途是体外用途。此外，检测剂优选为和抗体，诸如单克隆抗体(或其抗原结合片段)。

本发明还涉及一种试剂盒。在一个实施例中，本发明的试剂盒包含与SPON-1特异性结合的试剂及至少一种选自由以下项组成的组的其他试剂：与利钠肽特异性结合的试剂、与ESM-1特异性结合的试剂、与Ang2特异性结合的试剂和与IGFBP7特异性结合的试剂。

优选地，所述试剂盒适于实施本发明的方法，即用于评定心房颤动的方法。任选地，所述试剂盒包括用于实施所述方法的说明。

如本文所用，术语“试剂盒”是指前述组分的集合，优选地，该前述组分是分开提供或在单个容器内提供的。该容器还包括用于实施本发明方法的说明。这些说明可以是手册的形式，或者可以由计算机程序代码提供，该计算机程序代码能够实施在本发明的方法中所指的计算和比较，并且当在计算机或数据处理设备上实现时相应地确立评定或诊断。计算机程序代码可提供于数据存储介质或设备诸如光学存储介质(例如，光盘)上或直接提供于计算机或数据处理设备上。此外，试剂盒可优选地包含标准量的生物标志物SPON-1，用于校准目的。在一个优选实施例中，试剂盒进一步包含标准量的本文所指的至少一种其他生物标志物(诸如利钠肽、或ESM-1)，用于校准目的。

在一个实施例中，所述试剂盒用于评定心房颤动或用于预测体外风险。

实例

本发明仅通过以下实例来说明。无论如何，所述实例不得以限制本发明范围的方式进行解释。

实例1：用循环SPON-1评定AF

MAPPING(标测)研究涉及接受开胸手术的患者。在麻醉和手术之前获得样品。使用具有多电极阵列的高密度心外膜标测(高密度标测)对患者进行电生理学表征。

已在16例持续性心房颤动患者和30例对照中测定了循环SPON-1水平，以达到最佳(年龄、性别、合并症)匹配。在MAPPING研究的样品中测定了SPON-1。

在30例窦性心律(SR)患者和16例持续性心房颤动(persAF)患者中执行测量。

图1示出与SR患者相比，persAF患者的SPON-1显著升高(AUC0.87)。图1中的箱形图示出SR患者与persAF患者的SPON-1分布对比。ROC曲线示出SPON-1与区分SR患者与persAF患者的诊断能力对比。因此，SPON-1可用于辅助诊断persAF。升高的SPON-1值将会指示更高的persAF可能性。

此外，在BEAT-AF研究中(在实例2中描述)，SPON-1浓度与心房颤动的严重程度相关。图2示出BEAT-AF研究中按AF类型的SPON-1分布。

实例2：对脑卒中的预测

分析方法

在患有记录的心房颤动的患者的前瞻性多中心登记中评定了循环SPON-1预测脑卒中发生风险的能力(Conen D.，Forum Med Suisse 2012；12：860-862)。使用如Borgan(2000)所述的分层病例同期群设计来测量SPON-1。

对于在随访期间经历脑卒中(“事件”)的70例患者中的每一例，选择1例匹配的对照。根据年龄、性别、高血压病史、心房颤动类型和心力衰竭病史(CHF病史)的人口统计学和临床信息来匹配对照。

有事件的67例患者和没有事件的66例患者可获得SPON-1结果。

使用Olink平台测量SPON-1，因此没有绝对浓度值可用以及可报告。结果将以任意信号标度(NPX)报告。

为了定量SPON-1的单变量预后值，使用成比例危险模型来分析脑卒中结果。

用由SPON-1给出的预后信息的两种不同组合来评定SPON-1的单变量预后效能。

第一成比例危险模型包括以中位数(1.4NPX)二值化的SPON-1，因此将SPON-1低于或等于该中位数的患者的风险与SPON-1高于该中位数的患者的风险进行比较。

第二成比例危险模型包括原始的SPON-1水平，但转换为log2标度。执行log2转换是为了实现更好的模型校准。

由于来自病例对照同期群的原始成比例危险模型的估计将存在偏差(由于病例与对照的比例发生了变化)，因此使用了加权成比例危险模型。权重基于Mark(2006)中描述的为病例对照同期群选择的用于每个患者的逆概率。

为了基于二分法基线SPON-1测量值(＜＝1.4NPX与＞1.4NPX)得到对两组中绝对生存率的估计值，创建了加权版本的Kaplan-Meier图，如Mark(2006)所述。

为了评定SPON-1的预后值是否独立于已知的临床和人口统计学风险因素，计算加权比例cox模型，该模型还包括以下变量：年龄、性别、CHF病史、高血压病史、脑卒中/TIA/血栓栓塞病史、血管疾病史和糖尿病史。

为了评定SPON-1提高现有的脑卒中预后风险评分的能力，通过SPON-1(经log2转换的)扩展了CHADS

将CHADS

表1示出两个单变量加权成比例危险模型的结果，该模型包括经二值化或经log2转换的SPON-1。

在这两个模型中，经历脑卒中的风险与SPON-1的基线值之间的关联非常显著。

二值化的SPON-1的危险比意味着基线SPON-1＞＝1.4NPX的患者组的脑卒中风险比基线SPON-1＜1.4NPX的患者组的脑卒中风险高1.51倍。在示出Kaplan-Meier曲线的图3中也可以看到这一点，该曲线描述随着时间的推移，患者存活到脑卒中事件发生的概率。

但是，p值高于0.05，这可能表明在这种情况下二值化是次优的。

包括作为经log2转换的线性风险预测因子的SPON-1的成比例危险模型的结果表明，经log2转换的值SPON-1与脑卒中风险成比例。危险比5.22可以解释为SPON-1增加2倍与脑卒中风险增加5.22有关。

值得关注的是，在此背景下，SPON-1水平与某些口服抗凝剂(OAK)的摄入相关。图4显示，与其余患者相比，使用利伐沙班的患者显示出较低的SPON-1浓度。但是，也有一些服用利伐沙班的患者的SPON-1值高于1.4NPX。这可能指示SPON-1可用于监测OAK摄入的有效性。

表1：包括经二值化和log2转换的SPON-1的单变量加权成比例危险模型的结果。

表2示出包括SPON-1(经log2转换的)的成比例危险模型与临床和人口统计学变量相结合的结果。这清楚地示出，如果调整相关临床和人口统计学变量的预后效应，则SPON-1的预后效应保持稳定。

表2：包括SPON-1及相关的临床和人口统计学变量的多变量成比例危险模型。

表3示出加权成比例危险模型的结果，该模型结合了CHADS

表3：结合CHADS

表4示出加权成比例危险模型的结果，该模型结合了CHA

表4：结合CHA

表5示出加权成比例危险模型的结果，该模型结合了ABC评分与SPON-1(经log2转换的)。此外，在该模型中，SPON-1可将预后信息添加到风险评分中。

表5：结合ABC评分与SPON-1(经log2转换的)的加权成比例危险模型

表6示出单独的SPON-1(log2)、CHA

可以看出，SPON-1的加入提高了所有三种风险模型的c指数。CHADS

表6示出在病例同期群选择中，单独的NTproBNP、单独的ESM-1、单独的Ang-2、单独的IGFBP-7、CHA

在此背景中，值得关注的是，SPON-1与既定标志物(NTproBNP和ChadsVasc)的相关性以及与ESM-1的相关性很低：a)SPON-1与NTproBNP，相关系数＝0.44，b)SPON-1与ESM1，相关系数＝0.37，c)SPON-1与CHADsVASc，相关系数＝0.25。这些数据表明，SPON-1提供了补充信息，并且与单独使用每种标志物相比，SPON-1和/或NTproBNP和/或ESM1和/或CHADsVASc标志物的组合可以改进对脑卒中高风险患者的检测。

表6：SPON-1、CHADS

病例研究

对于了解和减少没有心房颤动的患者的缺血性脑卒中风险的关注日益提高(YaoX等人，Am Heart J.2018 May；199：137-143)。鉴定存在高脑卒中风险的患者对于将这些患者纳入药物研究(口服抗凝治疗)以及确立最有处理策略至关重要。例如，对于存在高脑卒中风险的患者在何种CHA2DS2-VASc水平下应接受口服抗凝治疗以及以何种剂量服用，均没有足够的临床指导(Yao X等人，Am Heart J.2018 May；199：137-143)。例如，CHA2DS2-VASc评分还预测没有心房颤动但绝对事件发生率较低的患者的缺血性脑卒中的发生率(Mitchell LB等人，Heart.2014；100：1524-30)，因此，额外的脑卒中风险标志物(例如SPON-1)有助于评定脑卒中风险并就口服抗凝治疗提供指导。

一名70岁的男性高血压患者，窦性心律无心房颤动病史。在从患者获得的EDTA血浆样品中测定SPON-1。临床信息(高龄和高血压)表明有一定的脑卒中风险，而且经测量，SPON-1值高于参考值(指示高脑卒中风险)。结果，患者获准接受抗凝治疗。

一名75岁的无心房颤动病史的女性患者要求在医生办公室进行检查。患者呈窦性心律，然而诊断为结构性心脏病。由于脑卒中病史和较高的CHA2DS2-VASc总评分，该患者接受直接口服抗凝治疗(低剂量)。为了在第二次就诊时确定残余脑卒中风险并推断出药物剂量的最终变化，在从患者获得的血清样品中测量SPON-1。观察到的SPON-1值高于参考值。升高的SPON-1滴度结合其他风险参数(脑卒中病史)指示高于出血风险的较高残余脑卒中风险(使用其他临床信息进行评定)。结果，增加了抗凝治疗的剂量。

一名68岁的肥胖女性患者，患有糖尿病和心力衰竭，射血分数降低，表现出呼吸急促的急性症状。在先前的就诊中，患者没有心房颤动病史。根据高的CHA2DS2-VASC总体风险评分，即使没有心房颤动，医师也决定开始口服抗凝治疗(低剂量)。在抗凝开始之前和之后测定SPON-1水平。患者想知道抗凝治疗是否有效以及是否仍然必要。为了详细说明当前的脑卒中风险，在从患者获得的EDTA样品中测定SPON-1。观察到的SPON-1值低于参考值。降低的SPON-1滴度指示抗凝治疗有效且继续进行抗凝治疗。