用于生产二十二碳六烯酸的网粘菌纲菌株

摘要

本申请涉及用于生产二十二碳六烯酸的网粘菌纲菌株。公开了产生具有增加的二十二碳六烯酸(DHA)含量的微生物油的改良的网粘菌纲菌株。相对于野生型菌株，所述菌株具有提高的生产率。还提供了具有增加的DHA含量的微生物油组合物。还包括改良用于生产脂质，如DHA的菌株的方法。

说明书

本申请是分案申请，原申请的申请日为2015年5月22日，申请 号为201580039706.1，发明名称为“用于生产二十二碳六烯酸的网粘 菌纲菌株”。

相关申请的交叉引用

本申请依照U.S.C.119(e)要求2014年5月22日提交的美国临时 专利申请号62/002,107的优先权益，该美国临时专利申请的全部内容 以引用的方式并入本文。

序列表

本申请含有对核酸序列的引用，所述核酸序列已经作为序列表文 本文件“SGI1710_2WO_Sequence_Listing_ST25.txt”随本文同时递交， 该序列表文本文件的文件大小是16千字节(kb)，于2015年5月 22日创建，依照37C.F.R.1.52(e)(iii)(5)以引用的方式整体并入。

技术领域

本发明部分地涉及可用于生产脂质、包括ω-3多不饱和脂肪酸 (ω-3PUFA)、如二十二碳六烯酸(DHA)的微生物菌株。本发明 还涉及用于选择和分离相对于祖代菌株具有提高的脂质生产率的衍 生菌株的方法。

背景技术

长链ω-3脂肪酸是目前主要源自于鱼油的人类膳食的必要部 分。由于过度捕捞以及鱼类资源的重金属污染所带来的问题，因此 需要已经在人类中显示出健康益处的ω-3脂肪酸，如二十碳五烯酸 (EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)的替代性可持续来源。

壶菌(Chytrid)(网粘菌纲(labyrinthylomycetes)的真核海洋 微生物)目前被用作DHA的来源，但是与鱼类来源的DHA相比， 壶菌生产的DHA的成本目前较高。可以使用具有提高的DHA产生 速率的菌株来降低生产DHA的成本。

发明内容

本文提供了可用于生产二十二碳六烯酸(DHA)的网粘菌纲微生 物的新型菌株、以及由这些菌株生产的油。本文提供的菌株还可以 用于分离衍生菌株，包括与祖代菌株相比，具有新的或改良的性 状，如增强的脂质产生、生长、营养利用、或化学耐受性的菌株。本文还提供了用于分离衍生菌株的方法，所述衍生菌株相对于祖代 菌株具有增强的性状，诸如但不限于脂质产生速率，所述方法是例 如经由诱变和/或在细胞恒稳器(cytostat)或恒化器中，任选地在选 择剂存在下选择而实现的。

在一个方面，本文提供了可用于产生DHA的新型网粘菌纲微生 物。所述网粘菌纲微生物可以是已经在2013年4月4日作为 NRRL-50836(橙黄壶菌属某种(Aurantiochytriumsp.)菌株NH-05783) 和NRRL-50837(橙黄壶菌属某种(Aurantiochytrium sp.)菌株 NH-06161)保藏在位于美国伊利诺伊州皮奥里亚的北大学街1815号 (邮编61604)(1815N.University Street,Peoria,IL 61604,USA)的 农业部农业研究院培养物保藏中心(Agricultural Research Service Culture Collection)(NRRL)的微生物；或可以是衍生自这些保藏菌 株中的任一者的菌株的微生物。如本文所提供的菌株可以包括18S rRNA基因，所述基因包括与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和/或SEQ ID NO:4具有至少95％、96％、97％、97.5％、98％、 98.1％、98.2％、98.3％、98.4％、98.5％、98.6％、98.7％、98.8％、98.9％、99.0％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、或99.9％同一性的序列；或可以包括18S rRNA基 因，所述基因包括与SEQID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、 和/或SEQ ID NO:8具有至少95％、96％、97％、97.5％、98％、 98.1％、98.2％、98.3％、98.4％、98.5％、98.6％、98.7％、98.8％、 98.9％、99.0％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、 99.7％、99.8％、或99.9％同一性的序列；或可以包括18S rRNA基 因，所述基因包括与SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQID NO:11、和/或SEQ ID NO:12具有至少95％、96％、97％、97.5％、 98％、98.1％、98.2％、98.3％、98.4％、98.5％、98.6％、98.7％、 98.8％、98.9％、99.0％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、 99.6％、99.7％、99.8％、或99.9％同一性的序列。

本文还包括通过任何方法衍生自NH-05783或NH-06161的菌株 的分离的微生物，所述方法包括但不限于在选择或不选择目标性状 的情况下传代培养、恒化器或细胞恒稳器选择、诱变、遗传工程 化、或其任何组合。

在各种实施方案中，包括NRRL-50836(菌株NH-05783)和 NRRL-50837(菌株NH-06161)以及由其衍生的菌株在内的本文提供 的菌株可以产生占脂肪酸的至少25％的DHA。举例来说，由包括衍 生菌株(例如突变菌株或变体菌株)的菌株产生的脂肪酸的至少25％、至少30％、至少35％、或至少40％可以是DHA。当在小规模 分批培养物中培养时，所述菌株可以按以下速率产生DHA：至少40 mg/L/h、至少45mg/L/h、至少50mg/L/h、至少100mg/L/h、至少 130mg/L/h、至少160mg/L/h、至少190mg/L/h、或至少200 mg/L/h。在一些实施方案中，当在摇瓶中作为25ml、50ml、100 ml、200ml、400ml、或500ml分批培养物培养时，所述菌株可以 按以下速率产生DHA：至少100mg/L/h、至少150mg/L/h、至少200 mg/L/h、至少250mg/L/h、至少300mg/L/h、或至少350mg/L/h。在 一些实施方案中，当在至少一升的发酵培养物中培养时，所述菌株 可以按以下速率产生DHA：至少100mg/L/h、至少150mg/L/h、至少200mg/L/h、至少250mg/L/h、至少300mg/L/h、至少350 mg/L/h、至少400mg/L/h、至少450mg/L/h、至少500mg/L/h、至少 600mg/L/h、至少700mg/L/h、或至少800mg/L/h。本文公开的菌株 和由其衍生的菌株可以产生脂质，其中DHA与二十二碳五烯酸 (C22:5n6；DPA)的比率是至少3.5:1、或至少约4.0:1。由如本文所 提供的微生物产生的二十二碳五烯酸(DPA)占脂肪酸的百分比可以 是例如少于12％或少于10％。菌株NH-05783、NH-06161、以及其衍生物可以产生油，其中脂肪酸的至少25％、30％、或35％是DHA， 并且脂肪酸的至少10％、至少12％、至少15％、至少20％、至少 25％、或至少30％是肉豆蔻酸。在一些实例中，脂肪酸的少于约 5％、少于约3％、或少于约2％是二十碳五烯酸(EPA)。此外，由 本文提供的菌株或其衍生物产生的油可以具有占脂肪酸的少于2％、 少于1％、或少于0.5％的花生四烯酸(ARA)。

在另一个方面，本文提供了网粘菌纲的分离的微生物和突变型 微生物以及由其衍生的突变体或变体，其中所述微生物具有18S rRNA基因，所述基因包含与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3以及SEQ ID NO:4具有至少95％、96％、97％、97.5％、98％、98.1％、98.2％、98.3％、98.4％、98.5％、98.6％、98.7％、98.8％、 98.9％、99.0％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、 99.7％、99.8％、或9.99％同一性的序列。所述菌株可用于产生ω-3脂 肪酸，例如DHA，并且可以产生脂质，其中所产生的脂质的脂肪酸 的至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、或至少 45％是DHA。在一些实例中，所述菌株可以被表征为属于破囊壶菌 属(Thraustochytrium)、裂殖壶菌属(Schizochytrium)或橙黄壶菌 (Aurantiochytrium)并且可以是野生型或天然菌株的突变体，其中所 述突变体比作为它们的来源的野生型菌株多产生至少20％、至少 30％、至少40％、或至少50％的DHA。可选地或另外地，在一些实 例中，所述菌株可以被表征为属于破囊壶菌属、裂殖壶菌属或橙黄 壶菌属并且可以是野生型或天然菌株的突变体，其中所述突变体比 作为它们的来源的野生型菌株多产生至少50％、至少100％、至少 200％、或至少300％的肉豆蔻酸。举例来说，突变型微生物可以产 生占它的总脂肪酸的至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、 或至少30％的肉豆蔻酸。所述菌株另外可以产生脂质，其中DHA与 DPA的比率是至少约3.5:1或至少约4.0:1。在一些实例中，当在小规 模的十二小时至二十四小时分批培养物，例如十四小时或二十三小 时分批培养物中培养时，所述菌株可以按以下速率产生DHA：至少 40mg/L/h、至少45mg/L/h、至少50mg/L/h、至少100mg/L/h、至少130mg/L/h、至少160mg/L/h、至少190mg/L/h或至少200mg/L/h。

在另一个方面，本文提供了网粘菌纲的分离的微生物和突变型 微生物，其中所述微生物具有18S rRNA基因，所述基因包含与SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7以及SEQ ID NO:8具有至少 95％、96％、97％、97.5％、98％、98.1％、98.2％、98.3％、98.4％、98.5％、98.6％、98.7％、98.8％、98.9％、99.0％、99.1％、99.2％、 99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、或9.99％同一性的 序列。所述菌株可用于产生ω-3脂肪酸，例如DHA，并且可以产生 脂质，其中所产生的脂质的脂肪酸的至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、或至少45％是DHA。在一些实例中， 所述菌株可以被表征为属于破囊壶菌属、裂殖壶菌属、或橙黄壶菌 并且可以是野生型或天然菌株的突变体，其中所述突变体比作为它 们的来源的野生型菌株多产生至少20％、至少30％、至少40％、或 至少50％的DHA。作为另外一种选择或除此之外，在一些实例中， 所述菌株可以被表征为属于破囊壶菌属、裂殖壶菌属、或橙黄壶菌 属并且可以是野生型或天然菌株的突变体，其中所述突变体比作为 它们的来源的野生型菌株多产生至少50％、至少100％、至少 200％、或至少300％的肉豆蔻酸。举例来说，突变型微生物可以产 生占它的总脂肪酸的至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、 或至少30％的肉豆蔻酸。所述菌株另外可以产生脂质，其中DHA与 DPA的比率是至少约3.5:1或至少约4.0:1。在一些实例中，当在小规 模的十二小时至二十四小时分批培养物，例如十四小时或二十三小 时分批培养物中培养时，所述菌株可以按以下速率产生DHA：至少 40mg/L/h、至少45mg/L/h、至少50mg/L/h、至少100mg/L/h、至少130mg/L/h、至少160mg/L/h、至少190mg/L/h、或至少200 mg/L/h。

在又另一个方面，本文提供了网粘菌纲的分离的微生物和突变 型微生物以及由其衍生的突变体或变体，其中所述微生物具有18S rRNA基因，所述基因包含与SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11以及SEQ ID NO:12具有至少95％、96％、97％、97.5％、98％、98.1％、98.2％、98.3％、98.4％、98.5％、98.6％、98.7％、 98.8％、98.9％、99.0％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、 99.6％、99.7％、99.8％、或99.9％同一性的序列。所述菌株可用于产 生ω-3脂肪酸，例如DHA，并且可以产生脂质，其中所产生的脂质 的脂肪酸的至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少 40％、或至少45％是DHA。在一些实例中，所述菌株可以被表征为 属于破囊壶菌属、裂殖壶菌属、或橙黄壶菌并且可以是野生型或天 然菌株的突变体，其中所述突变体比作为它们的来源的野生型菌株 多产生至少20％、至少30％、至少40％、或至少50％的DHA。作为 另外一种选择或除此之外，在一些实例中，所述菌株可以被表征为 属于破囊壶菌属、裂殖壶菌属、或橙黄壶菌属并且可以是野生型或 天然菌株的突变体，其中所述突变体比作为它们的来源的野生型菌 株多产生至少50％、至少100％、至少200％、或至少300％的肉豆蔻 酸。举例来说，突变型微生物可以产生占它的总脂肪酸的至少 10％、至少15％、至少20％、至少25％、或至少30％的肉豆蔻酸。所述菌株另外可以产生脂质，其中DHA与DPA的比率是至少约3.5:1 或至少约4.0:1。在一些实例中，当在小规模的十二小时至二十四小 时分批培养物，例如十四小时或二十三小时分批培养物中培养时， 所述菌株可以按以下速率产生DHA：至少40mg/L/h、至少45 mg/L/h、至少50mg/L/h、至少100mg/L/h、至少130mg/L/h、至少160mg/L/h、至少190mg/L/h、或至少200mg/L/h。

在另一个方面，本发明提供了一种突变型微生物，以占所产生 的总脂肪酸的百分比计，所述微生物相对于作为它的来源的菌株产 生增加量的肉豆蔻酸。举例来说，以占所产生的总脂肪酸的百分比 计，所述突变体可以比作为所述突变体的来源的菌株多产生至少 20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少70％、或至少100％的 肉豆蔻酸。在一些实例中，与作为所述突变体的来源的菌株相比， 以占所产生的总脂肪酸的百分比计，所述突变体可以产生至少2 倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、或至少6倍的肉豆蔻酸。所述 突变型微生物可以产生例如占它的脂肪酸的至少10％、至少15％、 至少20％、至少25％、或至少30％的肉豆蔻酸。在一些实例中，所 述微生物属于网粘菌纲。在一些实例中，所述微生物是破囊壶菌 属、裂殖壶菌属或橙黄壶菌属的物种。以占总脂肪酸的百分比计， 所述突变型微生物另外可以相对于作为它的来源的菌株产生更多的 DHA。本文还提供了一种突变型微生物，与由作为所述突变体的来 源的菌株所产生的肉豆蔻酸和DHA相比，以占总脂肪酸的百分比计，所述突变型微生物产生更多的肉豆蔻酸和更多的DHA。举例来 说，除了以占所产生的总脂肪酸的百分比计，与野生型或祖代菌株 相比，多产生至少50％或至少100％的肉豆蔻酸之外，以占所产生的 总脂肪酸的百分比计，所述突变体还可以比作为所述突变体的来源的菌株多产生至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少 70％、或至少100％的DHA。所述突变型微生物可以产生例如占它的 脂肪酸的至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、 至少35％或至少39％的DHA以及占它的脂肪酸的至少10％、至少 15％、至少20％、至少25％、或至少30％的肉豆蔻酸。在一些实例 中，突变型网粘菌纲菌株在小规模分批发酵培养物中按至少150 mg/L/h的速率产生DHA。举例来说，如本文所提供的突变型网粘菌 纲微生物可以在小规模培养物中按至少170mg/L/h的速率、按至少 190mg/L/h的速率、或按至少200mg/L/h的速率产生DHA。在各种 实例中，由如本文所提供的突变型微生物产生的总脂肪酸包含少于 2％的ARA，例如少于1％的ARA，并且可以包含少于3％的EPA， 例如少于1％的EPA。在一些实例中，由所述突变型微生物产生的 DHA与DPA的比率可以是至少4:1。

这些突变株可以是例如诸如网粘菌属(Labryinthula)、类网粘 菌属(Labryinthuloides)、破囊壶菌属、裂殖壶菌属、不动壶菌属 (Aplanochytrium)、橙黄壶菌属、日本壶菌属(Japonochytrium)、 矩圆壶菌属(Oblongichytrium)、迪普弗里思氏菌属(Diplophrys)、 或吾肯氏壶菌属(Ulkenia)的菌株。举例来说，如本文所提供的突变 株可以是破囊壶菌属、裂殖壶菌属、或橙黄壶菌属的菌株。在一些 实例中，所述微生物是破囊壶菌属、裂殖壶菌属或橙黄壶菌属的物 种。举例来说，产生占脂肪酸的更高百分比的DHA以及占脂肪酸的 更高百分比的肉豆蔻酸的突变株可以是橙黄壶菌属或裂殖壶菌属菌 株，所述菌株具有与以下序列中的任一个至少95％、至少96％、至 少97％、至少98％、至少98.1％、至少98.2％、至少98.3％、至少 98.4％、至少98.5％、至少98.6％、至少98.7％、至少98.8％、至少 98.9％、至少99％、至少99.1％、至少99.2％、至少99.3％、至少 99.4％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％、或至少 99.9％同一的18S rDNA序列：SEQID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ IDNO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO: 11、以及SEQ ID NO:12。

由突变型网粘菌纲菌株产生的总脂肪酸可以包括例如10％或更 少的DPA、9％或更少的DPA、8％或更少的DPA、7％或更少的 DPA、或6％或更少的DPA。由如本文所提供的突变型网粘菌纲菌株 产生的脂肪酸中DHA与DPA的比率可以是约3.5:1或更高，例如约 4:1或更高，例如约4.5:1或更高、约4.9:1或更高、或约5:1或更高。

本发明的另一个方面是用于分离微生物菌株的一种或多种衍生 物或突变体的方法，所述衍生物或突变体相对于祖代微生物菌株具 有增加的脂质产生，所述方法包括：在参与脂质代谢的酶或因子的 至少一种抑制剂存在下将目标微生物菌株生物体在细胞恒稳器或恒 化器中培养；以及分离所述微生物菌株的表现出增加的脂质产生的 至少一种衍生物或突变体。增加的脂质产生可以是以下任一种：每 单位培养物体积产生的脂质的量增加；所产生的脂质占细胞干重的 百分比增加；每单位培养物体积产生的甘油三酯(TAG)的量增加； 所产生的TAG占细胞干重的百分比增加；每单位培养物体积产生的 FAME的量增加；所产生的FAME占细胞干重的百分比增加；每单 位培养物体积产生的一种或多种脂肪酸(例如C8、C10、C12、 C14、C16、或C18脂肪酸中的一种或多种)的量增加；以占细胞干 重的百分比计，所产生的一种或多种脂肪酸的量增加；以占所产生 的总脂肪酸(FAME)的百分比计，所产生的一种或多种脂肪酸的量 增加；每单位培养物体积产生的一种或多种PUFA(例如ARA、 EPA、或DHA中的一种或多种)的量增加；以占细胞干重的百分比 计，所产生的一种或多种PUFA的量增加；以占所产生的总脂肪酸 (FAME)的百分比计，所产生的一种或多种PUFA的量增加；由所 述分离的菌株产生的总脂质、TAG、FAME、一种或多种脂肪酸、 或一种或多种PUFA中的任一种的产生速率增加。可以在将目标菌 株在细胞恒稳器或恒化器中培养之后分离菌落，并且可以测试从所 述分离的菌落生长的分离的衍生菌株的上述值中的任一个。还可以 测试衍生菌株并且基于生长速率或生物质积聚来选择，例如包括在 培养物的脂质产生阶段期间的生长速率或生物质积聚。

在用脂质生物合成抑制剂选择目标微生物菌株的步骤之前或之 后，可以任选地在不包括脂质生物合成抑制剂的细胞恒稳器或恒化 器中选择菌株。在细胞恒稳器或恒化器中选择目标微生物菌株之 前，所述方法还可以任选地包括对所述菌株进行一种或多种诱变方 案，所述方案可以使用例如一种或多种化学诱变剂、UV光、或γ辐 照。此外，所述方法可以任选地包括在细胞恒稳器或恒化器培养物 中使用相同的脂质生物合成抑制剂或不同的脂质生物合成抑制剂依 次选择目标微生物菌株。举例来说，诱变程序以及随后的在参与脂 质代谢的酶或因子的至少一种抑制剂存在下进行的恒化器或细胞恒 稳器选择可以进行一次、两次、三次或更多次。

在本发明的另一个方面，可以将微生物用UV辐照处理并且针 对性状筛选，所述性状包括但不限于更高水平的总脂质、TAG、 PUFA、ω-3脂肪酸、或更高水平的一种或多种特定的脂肪酸，例如 像肉豆蔻酸、油酸、ARA、DHA、或EPA。可以在对菌株进行诱变 之后对微生物进行UV处理，其中所述诱变可以使用UV或另一种诱 变剂。在一些实例中，可以在诱变之后并且在UV处理之前针对目 标性状筛选或选择微生物。此外，可以另外地或可选地在UV处理 之后针对目标性状筛选或选择微生物。举例来说，可以对已经针对 增加的脂质产生选择的经过诱变的微生物进行UV辐照，随后针对 甚至更高的脂质产生水平选择或测试。可以任选地在恒化器或细胞 恒稳器中，在存在或不存在可以选择目标性状的化合物，例如抑制脂质生物合成的化合物的情况下选择经过UV处理的菌株。然后可 以测试在恒化器或细胞恒稳器中选择之后分离的菌株的目标性状的 增强，例如增加的脂质、增加的PUFA、增加的ARA、增加的 EPA、或增加的DHA，以分离相对于经过诱变的祖代菌株具有增加 的脂质、PUFA、ARA、EPA、或DHA产生水平或速率的衍生菌 株。

可以用于选择具有增强的脂质产生的衍生物的方法中的目标微 生物菌株可以是例如藻株、细菌菌株、真菌菌株、或不等鞭毛类菌 株。在一些实例中，所述微生物菌株是产油酵母的菌株，例如像念 珠菌属(Candida)、隐球菌属(Cryptococcus)、油脂酵母属(Lipomyces)、被孢霉属(Mortierella)、红冬孢酵母属 (Rhodosporidium)、红酵母属(Rhodotortula)、丝孢酵母属 (Trichosporon)或耶氏酵母属(Yarrowia)的菌株。在一些实例中， 所述微生物菌株是藻株，例如像葡萄藻属(Botryococcus)、小球藻 属(Chlorella)、小环藻属(Cyclotella)、杜氏藻属(Dunaliella)、 裸藻属(Euglena)、菱板藻属(Hantzschia)、红球藻属 (Haematococcus)、等鞭金藻属(Isochrisis)、蒜头藻属(Monodus)、 微拟球藻属(Nannochloropsis)、新绿藻属(Neochloris)、菱形藻 属(Nitzchia)、雪衣藻属(Parietochloris)、巴夫藻属(Pavlova) 或紫球藻属(Porphyridium)的藻株。在一些实例中，所述微生物菌 株是网粘菌菌株或破囊壶菌菌株。举例来说，所述菌株可以是网粘 菌属、类网粘菌属、破囊壶菌属、裂殖壶菌属、不动壶菌属、橙黄 壶菌属、日本壶菌属、矩圆壶菌属、迪普弗里思氏菌属或吾肯氏壶 菌属的物种。

本发明包括衍生自野生型菌株、实验室菌株、以及操纵菌株的 菌株，包括已经在细胞恒稳器或恒化器中经过选择的遗传工程化或 传统改良的菌株，所述细胞恒稳器或恒化器在培养基中包括在脂质 代谢中起作用的酶的抑制剂。还包括使用本文的方法衍生的随后经 过遗传工程化或通过传统方法进一步改良的菌株。所述菌株可用于 产生多不饱和脂肪酸，例如像DHA；以及包括诸如DHA的多不饱 和脂肪酸的油。所述菌株可以用于产生可以用作用于人类或动物的 营养产品的组分的生物质。

还提供了一种生物质，所述生物质包含如本文所提供的分离的 网粘菌纲菌株。在一些实例中，所述分离的菌株的干燥生物质的脂 肪酸的至少20重量％、至少25重量％、至少30重量％、或至少35 重量％是DHA。可选地或另外地，所述分离的菌株的干燥生物质的脂肪酸的至少6重量％、至少8重量％、至少10重量％、至少15重 量％、至少20重量％、或至少25重量％可以是肉豆蔻酸。在一些实 例中，分离的网粘菌纲生物质可以包含占所述生物质的细胞干重的 至少约10重量％、至少约20重量％、至少30重量％、至少40重 量％、至少50重量％、至少60重量％、或至少70重量％的脂肪酸， 并且所述脂肪酸的至少20重量％、至少25重量％、至少30重量％、 至少40重量％、或至少50重量％可以是ω-3脂肪酸。

本发明的又另一个方面是从如本文所提供的微生物或其衍生物 分离的微生物油，例如来自在培养如本文所提供的任何微生物之后 收获的整个培养物或生物质的微生物油。所述微生物油可以包括例 如至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、或至少40％的 DHA。在一些实施方案中，所述微生物油可以包括占它们的脂肪酸 的至少6％、至少8％、至少10％、至少15％、至少20％、至少 25％、或至少30％的肉豆蔻酸酯。在一些实施方案中，二十二碳六 烯酸与二十二碳五烯酸的比率可以等于或大于3.5:1或大于或等于约 4:1。在一些实施方案中，所述微生物油包含少于约5％、少于4％、 少于3％、少于2％、少于1％、或少于0.5％的EPA。在一些实施方 案中，所述微生物油包含少于约2％、少于1％、少于0.5％、或不可 检出量的ARA。

本发明还涉及一种食品、动物饲料产品、美容品、营养品、治疗 品或药物，其包含本发明的网粘菌纲微生物或生物质中的任一种或其 混合物。本发明还涉及一种用于动物或人类的食品、美容、或药物组 合物，其包含本发明的微生物油中的任一种。在一些实施方案中，所 述食品是婴儿配方食品。在一些实施方案中，所述食品是奶、饮料、 治疗性饮料、营养饮料或其组合。在一些实施方案中，所述食品是用 于动物或人类食品的添加剂。在一些实施方案中，所述食品是营养补 充剂。在一些实施方案中，所述食品是动物饲料。在一些实施方案中， 所述动物饲料是水产养殖饲料。在一些实施方案中，所述动物饲料是 家畜饲料、动物园动物饲料、耕畜饲料、家禽饲料、或其组合。

附图说明

图1是18S rDNA基因座的图，示出了具有被提供用于对所公开 的菌株表征的序列的片段的来源。

图2描绘了在脂质生物合成抑制剂浅蓝菌素存在下经过γ辐照的 WH-05554的细胞恒稳器培养物的生长特征。

图3A-C描绘了WH-05554和在包括脂质生物合成抑制剂的细胞 恒稳器中选择的衍生菌株的小规模分批培养物中在23小时培养期过 程中脂质的倍数变化。

图4是描绘了祖代菌株WH-05554和传统改良菌株NH-05783、 NH-06161以及NH-06181中的总脂肪酸的组成的示意图。来自小规 模发酵培养物的FAME分析证实改良菌株NH-05783具有增加的肉豆 蔻酸和DHA，并且衍生自改良菌株NH-05783的经过UV处理的菌株NH-06161和NH-06181表现出肉豆蔻酸和DHA的进一步增加。

图5是将菌株WH-05628和WH-05554放入具有橙黄壶菌属物种 的分组中的各种壶菌菌株的相关性的树图。

图6是描绘了由野生型菌株WH-05628(深色条柱)和传统改良 菌株NH-05783(浅色条柱)产生的各种类胡萝卜素的量的条形图。

图7A-L是一组来自显微术的照片，示出了本发明的网粘菌纲菌 株的细胞的形态。示出了在A)T＝0小时、B)T＝6小时、C)T＝24 小时、D)T＝30小时、E)T＝48小时、以及F)T＝72小时之时的传 统改良菌株NH-05783。示出了在G)T＝0小时、H)T＝6小时、I) T＝24小时、J)T＝30小时、K)T＝48小时、以及L)T＝72小时之时 的分离的野生型菌株WH-05628。

具体实施方式

除非另外定义，否则本文所使用的所有技术术语、符号以及其 他科学术语或专有名词意图具有本发明所属领域的技术人员所通常 理解的含义。在一些情况下，为了清楚起见和/或为了及时参考，在 本文中对具有通常所理解的含义的术语进行定义，并且在本文中包 括这些定义不应当一定被解释为代表相对于本领域中一般所理解的 含义存在实质性的差异。本文所描述或提到的许多技术和程序由本 领域技术人员很好地理解并且通常使用常规的方法加以利用。

除非上下文另外明确规定，否则单数形式“一个/种(a/an)”和“所 述”包括复数指代对象。举例来说，术语“一个细胞”包括一个或多个 细胞，包括其混合物。“A和/或B”在本文用于包括所有以下替代方 案：“A”、“B”、“A或B”以及“A和B”。

“约”意指在所提供的值加上或减去10％以内，或被四舍五入到 最接近的有效数字的值，在所有情况下均包括该所提供的值在内。 在提供范围的情况下，它们包括界限值在内。

在整个本公开中，各种信息来源是以引用的方式参考和/或并入 的。所述信息来源包括例如科学期刊文章、专利文献、教科书以及 万维网浏览器非活动页面地址。虽然对这些信息来源的引用清楚地 表明它们可以由本领域技术人员使用，但是本文引用的信息来源中 的每一个均具体地以引用的方式整体并入本文，无论是否具体提到 “以引用的方式并入”。

本申请中的标题仅仅是为了方便读者，并且不以任何方式限制 本发明或它的实施方案的范围。

新型网粘菌纲菌株

本文提供了网粘菌纲(在本文被称作“网粘菌”)的新型分离的菌 株，所述菌株具有产生多不饱和脂肪酸(PUFA)，特别是ω-3脂肪 酸，如二十二碳六烯酸(C22:6n3；DHA)的能力。所公开的真核微 生物是在被设计成区分具有高的DHA产生速率的菌株的筛选中被鉴定出的。本文提供的菌株是根据《布达佩斯条约(Budapest Treaty)》 在2013年4月4日由Synthetic Genomics公司保藏在位于美国伊利诺 伊州皮奥里亚的北大学街1815号(邮编61604)的农业部农业研究 院(ARS)培养物保藏中心(NRRL)。这些保藏物的保藏号是：NRRL-50836(菌株NH-05783)和NRRL-50837(菌株NH-06161)。

表1：微生物分离株和相应保藏号

网粘菌纲是属于不等鞭毛生物界(Stramenopiles)的纲并且包括 两个科，即破囊壶菌科(Thraustochytriaceae)和网粘菌科 (Labrynthuylaceae)。网粘菌纲内的属包括不动壶菌属、橙黄壶菌 属、迪普弗里思氏菌属、日本壶菌属、网粘菌属、类网粘菌属、矩 圆壶菌属、裂殖壶菌属、破囊壶菌属、以及吾肯氏壶菌属。

在一些实例中，本发明的微生物具有保藏菌株的所有鉴定特 征，特别是能够产生DHA的鉴定特征。本发明的特定微生物可以指 的是如上文所述的保藏微生物以及由其衍生的菌株。举例来说，本 文提供了作为以NRRL保藏号50836和NRRL保藏号50837保藏在 ARS培养物保藏中心的菌株的衍生物的微生物，其中所述衍生物产 生DHA。所述菌株可以产生占它们的总脂肪酸的至少25％、至少 30％、至少35％、至少40％、至少45％、或至少50％的DHA。所述 菌株另外可以产生占它们的总脂肪酸的至少6％、至少8％、至少 10％、至少12％、至少15％、或至少20％的肉豆蔻酸。

如本文所用的术语“脂质”指的是脂肪或油并且包括游离脂肪 酸；脂肪酸衍生物，如脂肪醇和蜡酯、萜类化合物、烃(例如烷烃和 烯烃)、固醇、以及脂肪酸的甘油酯，包括膜脂或贮存脂质，例如磷 脂、半乳糖脂、硫脂、三酰基甘油、二酰基甘油、以及单酰基甘 油。包括脂肪酸组分(例如包含源自于脂肪酸生物合成的酰基链)的 脂质包括例如磷脂、糖脂、半乳糖脂、硫脂、三酰基甘油、二酰基 甘油、以及单酰基甘油、鞘磷脂以及鞘糖脂、类二十烷酸、前列腺 素、血栓素、白三烯、消退素、保护素、异前列腺素、氧脂素 (oxylipin)。如本文所用的术语“总脂肪酸”包括作为这些和其他细 胞脂质的组分的脂肪酸(直链酰基部分)，它们可以被衍生成脂肪酸 甲酯(FAME)以用于如本领域已知和本文所描述的那样分析和定量。因此，在提到脂质或油的脂肪酸组成时，“脂肪酸百分比”、“脂 肪酸％”或“总脂肪酸％”以及“FAME百分比”或“FAME％”在本文可互 换使用。

多不饱和脂肪酸(“PUFA”)包括ω-3脂肪酸和ω-6脂肪酸。ω-3 脂肪酸包括但不限于二十二碳六烯酸(C22:6n3；DHA)和二十碳五 烯酸(C20:5n3；)EPA。ω-6脂肪酸包括但不限于花生四烯酸 (C20:4n6；ARA)和二十二碳五烯酸(C22:5n6；DPA)、γ-亚油酸 (C18:3n-6)、二十碳二烯酸(C20:2n-6)、以及二十碳三烯酸(C20:3 n-6)。ω-3脂肪酸还可以包括二十碳三烯酸(C20:3n3)、十八碳四 烯酸(C18:4n3)、二十碳四烯酸(C20:4n-3)、十八碳五烯酸(C18:5 n-3)。

对于野生型分离株WH-05554(SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、 SEQ ID NO:3、以及SEQID NO:4)、以及对于衍生菌株NH-05783 (SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、以及SEQ ID NO:8) 和NH-06161(SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、以及 SEQ ID NO:12)获得了提供18S基因区的独特序列的18S rRNA基因 的四个重叠片段。由于18S rRNA基因是多拷贝的，因此分别提供由 不同的序列运行确定的四个片段序列以避免呈现包括源自于不同基 因座的序列的嵌合序列。将所述片段定位到菌株NH-05783的18S rDNA基因座的示意图提供于图1中以用于说明的目的。

如本文所用，除非另外说明，否则在提到同一性百分比(％) 时，指的是使用以下各项进行的同源性的评价：(1)BLAST 2.0基 本BLAST同源性搜索，在使用标准默认参数的情况下使用blastp进 行氨基酸搜索以及使用blastn进行核酸搜索，其中在默认情况下针对 低复杂度区域过滤查询序列(描述于Altschul,S.F.,Madden,T.L., Schaaffer,A.A.,Zhang,J.,Zhang,Z.,Miller,W.以及Lipman,D.J. (1997)“Gapped BLAST and PSI-BLAST:a new generation of protein database search programs.”Nucleic Acids Res.25:3389-3402中，以引用 的方式整体并入本文)；(2)BLAST 2比对(使用下文所述的参数)；和/或(3)使用标准默认参数的PSI-BLAST(位置特异性迭代 BLAST)。应当指出的是，由于BLAST 2.0基本BLAST与BLAST 2 之间的标准参数存在一些差异，因此两个特定的序列可能使用 BLAST 2程序被认为是具有显著的同源性，而在BLAST 2.0基本 BLAST中，使用所述序列中的一个作为查询序列进行的搜索可能不 会在最佳匹配中鉴定出第二序列。此外，PSI-BLAST提供了“谱”搜 索的自动化的易于使用的型式，它是一种寻找序列同源性的灵敏方式。所述程序首先执行空位BLAST数据库搜索。PSI-BLAST程序使 用来自返回的任何显著比对的信息来构建位置特异性得分矩阵，所 述得分矩阵替换查询序列以进行下一轮的数据库搜索。因此，应当 了解的是，同一性百分比可以通过使用这些程序中的任一个来确 定。

举例来说，可以使用BLAST 2序列将两个特定的序列相互比 对，如Tatusova和Madden,(1999),“Blast 2sequences--a new tool for comparing protein andnucleotide sequences”,FEMS Microbiol Lett. 174:247-250中所述，该文献以引用的方式整体并入本文。BLAST 2 序列比对是在blastp或blastn中使用BLAST 2.0算法进行以在这两个 序列之间进行空位BLAST搜索(BLAST 2.0)，从而允许在所得的 比对中引入空位(缺失和插入)。在本文为了清楚起见，使用如下的 标准默认参数进行BLAST 2序列比对：对于blastn，使用0 BLOSUM62矩阵：匹配得分＝1；错配罚分＝-2；开放空位罚分(5) 和延伸空位罚分(2)；空位x_下降(50)；期望(10)字长(11) 过滤器(开)。对于blastp，使用0BLOSUM62矩阵：开放空位罚分 (11)和延伸空位罚分(1)；空位x_下降(50)；期望(10)字长 (3)过滤器(开)。

具有本文所提供的序列的片段沿着18S rRNA基因的相同区域延 伸，但是相对于18S rRNA基因序列开始和终止于不同的碱基位置 处。举例来说，SEQ ID NO 1、5以及9均对应于图1的“片段1”，但 是具有不同的长度，并且可以开始和/或终止于不同的位置；SEQ IDNO 2、6以及10均对应于图1的“片段2”，但是可以具有不同的长 度，从而开始和终止于不同的位置；SEQ ID NO 3、7以及11均对应 于图1的“片段3”，但是可以具有不同的长度，并且可以开始和/或终 止于不同的位置；并且SEQ ID NO 4、8以及12均对应于图1的“片 段4”，但是可以具有不同的长度，从而开始和终止于不同的位置。 因此，对应于18S rRNA基因的相同片段的这些序列之间的同一性％ 可以基于BLAST比对开始(或终止)的位置来计算，所述位置可以 与一个序列的第一个核苷酸相距10个、20个、50个、75个、100 个、或200个核苷酸以内，并且可以与一个序列的第一个核苷酸相 距10个、20个、50个、75个、100个或200个核苷酸以内。类似 地，当相对于如本文所提供的SEQ ID NO:1-12评估其他序列的同一 性％时，同一性％可以开始和终止于两个片段之间的BLAST比对开 始和终止的位置。优选地，本文指定的同一性％是在SEQ ID NO: 1-12中任一个的至少200个、至少300个、或至少400个连续核苷酸 的范围内，并且更优选地，在SEQ ID NO:1-12中任一个的至少500 个核苷酸的范围内。

本发明提供了不等鞭毛类网粘菌纲的突变型微生物，所述微生 物具有18S核糖体RNA基因，所述基因包括与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、或SEQ ID NO:4具有至少95％、96％、 97％、97.5％、98％、98.1％、98.2％、98.3％、98.4％、98.5％、 98.6％、98.7％、98.8％、98.9％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、 99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、或99.9％同一性的序列。在 一些实例中，所述突变型微生物具有18S核糖体RNA基因，所述基 因包括与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3以及SEQ ID NO:4具有至少95％、96％、97％、97.5％、98％、98.1％、98.2％、 98.3％、98.4％、98.5％、98.6％、98.7％、98.8％、98.9％、99％、 99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、或 99.9％同一性的序列。所述微生物优选地可以产生微生物油，其中所 产生的油的脂肪酸的至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、 至少40％、约40％、或至少45％是DHA，并且优选地可以在不存在 脂质生物合成抑制剂的情况下产生微生物油，其中所产生的微生物油的脂肪酸的至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少 40％、约40％、或至少45％是DHA。所述突变型微生物可以另外产 生例如微生物油，其中脂肪酸的至少6％、至少8％、至少10％、至 少12％、至少15％、至少20％、至少25％、或至少30％是肉豆蔻 酸，并且优选地可以在不存在脂质生物合成抑制剂的情况下产生脂 质，其中所产生的微生物油的脂肪酸的至少20％、至少25％、至少 30％、至少35％、至少40％、约40％、或至少45％是DHA。在一些实例中，所述微生物产生微生物油，其中脂肪酸的少于50％、少于 40％、少于30％、或少于20％是棕榈酸。举例来说，与棕榈酸相 比，所述突变型微生物可以产生占它的总脂肪酸的更高百分比的肉 豆蔻酸。在一些实例中，所述突变型微生物在小规模分批培养物中 可以按至少45毫克/升/小时的速率产生DHA。在一些实例中，所述 菌株优选地可以在孵育了约12小时至约24小时的具有2ml-10ml范 围的体积，例如4ml-8ml体积，如5ml-6ml体积的分批培养物中按 以下速率产生DHA：至少45mg/L/h、约50mg/L/h、至少50 mg/L/h、至少100mg/L/h、至少130mg/L/h、至少160mg/L/h、至少 190mg/L/h、或至少200mg/L/h。在优选的实例中，所述菌株可以产 生脂质，其中DHA与二十二碳五烯酸(DPA)的比率是至少约3.5:1 或至少约4.0:1。所述微生物优选地可以产生脂质，其中脂肪酸的少 于5％、少于2％、少于1％、或少于约0.5％是EPA。此外，所述微 生物优选地产生脂质，其中脂肪酸的少于2％、少于1％、少于约 0.5％、或少于约0.2％是ARA。

本发明还提供了不等鞭毛类网粘菌纲的突变型微生物，所述微 生物具有18S核糖体RNA基因，所述基因包括与SEQ ID NO:5、 SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、或SEQ ID NO:8具有至少95％、 96％、97％、97.5％、98％、98.1％、98.2％、98.3％、98.4％、98.5％、98.6％、98.7％、98.8％、98.9％、99％、99.1％、99.2％、 99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、或99.9％同一性的 序列。在一些实例中，所述突变型微生物具有18S核糖体RNA基因，所述基因包括与SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、 以及SEQ ID NO:8具有至少95％、96％、97％、97.5％、98％、 98.1％、98.2％、98.3％、98.4％、98.5％、98.6％、98.7％、98.8％、 98.9％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、 99.7％、99.8％、或99.9％同一性的序列。所述微生物优选地可以产 生微生物油，其中所产生的油的脂肪酸的至少20％、至少25％、至 少30％、至少35％、至少40％、约40％、或至少45％是DHA，并且优选地可以在不存在脂质生物合成抑制剂的情况下产生微生物油， 其中所产生的微生物油的脂肪酸的至少20％、至少25％、至少 30％、至少35％、至少40％、约40％、或至少45％是DHA。所述突 变型微生物可以另外产生例如微生物油，其中脂肪酸的至少6％、至 少8％、至少10％、至少12％、至少15％、至少20％、至少25％、或 至少30％是肉豆蔻酸，并且优选地可以在不存在脂质生物合成抑制 剂的情况下产生脂质，其中所产生的微生物油的脂肪酸的至少 20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、约40％、或至 少45％是DHA。在一些实例中，所述微生物产生微生物油，其中脂 肪酸的少于50％、少于40％、少于30％、或少于20％是棕榈酸。举 例来说，与棕榈酸相比，所述突变型微生物可以产生占它的总脂肪 酸的更高百分比的肉豆蔻酸。在一些实例中，所述突变型微生物在 小规模分批培养物中可以按至少45毫克/升/小时的速率产生DHA。 在一些实例中，所述菌株优选地可以在孵育了约12小时至约24小时 的具有2ml-10ml范围的体积，例如4ml-8ml体积，如5ml-6ml体 积的分批培养物中按以下速率产生DHA：至少45mg/L/h、约50 mg/L/h、至少50mg/L/h、至少100mg/L/h、至少130mg/L/h、至少 160mg/L/h、至少190mg/L/h、或至少200mg/L/h。在优选的实例 中，所述菌株可以产生脂质，其中DHA与二十二碳五烯酸(DPA) 的比率是至少约3.5:1或至少约4.0:1。所述微生物优选地可以产生脂 质，其中脂肪酸的少于5％、少于2％、少于1％、或少于约0.5％是 EPA。此外，所述微生物优选地产生脂质，其中脂肪酸的少于2％、 少于1％、少于约0.5％、或少于约0.2％是ARA。在一些实例中，所 述突变型微生物是NH-05783(NRRL-50836)或由其衍生的菌株。

本发明还提供了不等鞭毛类网粘菌纲的突变型微生物，所述微 生物具有18S核糖体RNA基因，所述基因包括与SEQ ID NO:9、 SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12具有至少95％、 96％、97％、97.5％、98％、98.1％、98.2％、98.3％、98.4％、 98.5％、98.6％、98.7％、98.8％、98.9％、99％、99.1％、99.2％、 99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、或99.9％同一性的 序列。在一些实例中，所述突变型微生物具有18S核糖体RNA基 因，所述基因包括与SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、以及SEQ ID NO:12具有至少95％、96％、97％、97.5％、 98％、98.1％、98.2％、98.3％、98.4％、98.5％、98.6％、98.7％、 98.8％、98.9％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、 99.6％、99.7％、99.8％、或99.9％同一性的序列。所述微生物优选地 可以产生微生物油，其中所产生的油的脂肪酸的至少20％、至少 25％、至少30％、至少35％、至少40％、约40％、或至少45％是 DHA，并且优选地可以在不存在脂质生物合成抑制剂的情况下产生 微生物油，其中所产生的微生物油的脂肪酸的至少20％、至少 25％、至少30％、至少35％、至少40％、约40％、或至少45％是 DHA。所述突变型微生物可以另外产生例如微生物油，其中脂肪酸 的至少6％、至少8％、至少10％、至少12％、至少15％、至少 20％、至少25％、或至少30％是肉豆蔻酸，并且优选地可以在不存 在脂质生物合成抑制剂的情况下产生脂质，其中所产生的微生物油 的脂肪酸的至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少 40％、约40％、或至少45％是DHA。在一些实例中，所述微生物产 生微生物油，其中脂肪酸的少于50％、少于40％、少于30％、或少 于20％是棕榈酸。举例来说，与棕榈酸相比，所述突变型微生物可 以产生占它的总脂肪酸的更高百分比的肉豆蔻酸。在一些实例中， 所述突变型微生物在小规模分批培养物中可以按至少45毫克/升/小 时的速率产生DHA。在一些实例中，所述菌株优选地可以在孵育了 约12小时至约24小时的具有2ml-10ml范围的体积，例如4ml-8ml 体积，如5ml-6ml体积的分批培养物中按以下速率产生DHA：至少 45mg/L/h、约50mg/L/h、至少50mg/L/h、至少100mg/L/h、至少 130mg/L/h、至少160mg/L/h、至少190mg/L/h、或至少200mg/L/h。在优选的实例中，所述菌株可以产生脂质，其中DHA与二 十二碳五烯酸(DPA)的比率是至少约3.5:1或至少约4.0:1。所述微 生物优选地可以产生脂质，其中脂肪酸的少于5％、少于2％、少于 1％、或少于约0.5％是EPA。此外，所述微生物优选地产生脂质，其 中脂肪酸的少于2％、少于1％、少于约0.5％、或少于约0.2％是 ARA。在一些实例中，所述突变型微生物是NH-06161 (NRRL-50837)或由其衍生的菌株。

在提到菌株时，术语“衍生物”涵盖了菌株或它的子代的突变体 和变体。因此，例如，野生型菌株的衍生菌株可以直接衍生自野生 型或天然菌株，或可以衍生自本身是从野生型或天然菌株衍生(直接 或间接)的菌株。

在各种实施方案中，本文提供的突变株在具有至少100ml、至 少200ml、至少500ml、或至少1升的体积的培养物中可以产生至少 50mg/L/h、至少100mg/L/h、至少150mg/L/h、至少200mg/L/h、至 少250mg/L/h、至少300mg/L/h、至少350mg/L/h、或至少400 mg/L/h的DHA。

本发明还提供了突变型网粘菌纲菌株，其中所述菌株是突变 体，以占由所述菌株产生的总脂肪酸的百分比计，所述突变体相对 于作为它们的来源的野生型或祖代菌株具有增加的肉豆蔻酸。这些 突变株可以是例如诸如网粘菌属、类网粘菌属、破囊壶菌属、裂殖壶菌属、不动壶菌属、橙黄壶菌属、日本壶菌属、矩圆壶菌属、迪 普弗里思氏菌属、或吾肯氏壶菌属的菌株。举例来说，如本文所提 供的突变株可以是破囊壶菌属、裂殖壶菌属、或橙黄壶菌属的菌 株。举例来说，产生占脂肪酸的更高百分比的肉豆蔻酸的突变株可 以是橙黄壶菌属或裂殖壶菌属菌株，所述菌株具有与以下序列中的 任一个至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少98.5％、至 少99％、至少99.1％、至少99.2％、至少99.3％、至少99.4％、至少 99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％、至少99.9％、或 100％同一的18S rDNA序列：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、以及SEQID NO:12。在突变型网粘菌纲微生物中，当与由 作为它的来源的菌株产生的肉豆蔻酸的百分比相比较时，肉豆蔻酸 占所产生的总脂肪酸的百分比可以增加50％或更多。在各种实例中，在突变体中，与作为它的来源的菌株相比，肉豆蔻酸占所产生 的总脂肪酸的百分比增加了至少100％。

在各种实例中，如本文所提供的突变型网粘菌纲菌株可以产生 脂肪酸，其中总脂肪酸的至少10％、至少20％、或至少30％是肉豆 蔻酸，与由作为所述菌株的来源的菌株产生的肉豆蔻酸相比，所述 菌株产生占总脂肪酸的更高百分比的肉豆蔻酸。所述菌株可以对三 氯生和/或浅蓝菌素具有抗性。所述微生物优选地可以在培养物中不 存在脂质生物合成抑制剂的情况下产生脂质，其中所产生的脂肪酸 的至少10％、至少20％、至少25％、或至少30％是肉豆蔻酸。以占 总脂肪酸的百分比计，所述菌株另外可以产生更多的PUFA。

举例来说，本发明还提供了突变型网粘菌纲菌株，其中所述菌 株是突变体，相对于作为它们的来源的野生型菌株，所述突变体具 有以占所产生的总脂肪酸的百分比计增加的DHA并且另外具有以占 所产生的总脂肪酸的百分比计增加的肉豆蔻酸。举例来说，在突变 型网粘菌纲微生物中，当与由作为它的来源的菌株产生的DHA的百 分比和肉豆蔻酸的百分比相比较时，DHA占所产生的总脂肪酸的百 分比可以增加20％或更多并且肉豆蔻酸占所产生的总脂肪酸的百分 比可以增加50％或更多。在各种实例中，在突变体中，与作为它的 来源的菌株相比，DHA占所产生的总脂肪酸的百分比增加了至少 30％并且肉豆蔻酸占所产生的总脂肪酸的百分比增加了至少100％。 所述菌株可以对脂肪酸合酶抑制剂，如浅蓝菌素和/或三氯生具有抗 性。

在各种实例中，如本文所提供的突变型网粘菌纲菌株可以产生 脂肪酸，其中总脂肪酸的至少25％、至少30％、至少35％、或至少 39％是二十二碳六烯酸(DHA)并且总脂肪酸的至少10％、至少 20％、或至少30％是肉豆蔻酸，与由作为它的来源的菌株产生的 DHA和肉豆蔻酸相比，所述菌株产生占总脂肪酸的更高百分比的 DHA和占总脂肪酸的更高百分比的肉豆蔻酸。如本文所提供的突变 型网粘菌纲菌株可以在培养物中不存在脂质生物合成抑制剂的情况 下产生脂肪酸，其中总脂肪酸的至少25％、至少30％、至少35％、 或至少39％是二十二碳六烯酸(DHA)并且总脂肪酸的至少10％、 至少20％、或至少30％是肉豆蔻酸，与由作为它的来源的菌株产生 的DHA和肉豆蔻酸相比，所述菌株产生占总脂肪酸的更高百分比的 DHA和占总脂肪酸的更高百分比的肉豆蔻酸。如本文所提供的突变 型网粘菌纲菌株在小规模分批发酵培养物中可以按以下速率产生 DHA：至少150mg/L/h、至少160mg/L/h、至少170mg/L/h、至少 180mg/L/h、至少190mg/L/h、至少200mg/L/h、或至少210 mg/L/h。如本文所提供的突变型网粘菌纲菌株可以按比作为它的来 源的菌株更高的速率产生DHA。

由突变型网粘菌纲菌株产生的总脂肪酸可以包括例如10％或更 少的DPA、9％或更少的DPA、8％或更少的DPA、7％或更少的 DPA、10％或更少的DPA、或6％或更少的DPA。由如本文所提供的 突变型网粘菌纲菌株产生的脂肪酸中DHA与DPA的比率可以是约 4:1或更高，例如约4.5:1或更高、约4.9:1或更高、或约5:1。

本发明还包括一种分离的网粘菌纲生物质，所述生物质包含如 本文所提供的突变型网粘菌纲微生物。在一些实施方案中，所述生 物质的细胞干重的至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至 少60％、至少70％、或至少80％是脂肪酸。在一些实施方案中，所述生物质包含占脂肪酸的至少20重量％、至少30重量％、至少40 重量％、至少50重量％、至少60重量％、至少70重量％、或至少80 重量％的DHA。在一些实施方案中，所述生物质包含占脂肪酸的至 少6重量％、至少8重量％、至少10重量％、至少12重量％、至少 15重量％、至少20重量％、至少25重量％、或至少30重量％的肉豆 蔻酸。在一些实施方案中，所述生物质包含占脂肪酸的6重量％或更 少、5重量％或更少、4重量％或更少、3重量％或更少、2重量％或 更少、1重量％或更少、或0.55重量％或更少的EPA。在一些实施方 案中，所述生物质基本上不含EPA。在一些实施方案中，所述生物 质包含占脂肪酸的约0.5重量％至约1重量％、约0.5重量％至约2重 量％、约0.5重量％至约5重量％、约0.5重量％至约6重量％、约1 重量％至约5重量％、约1重量％至约6重量％、约2重量％至约5 重量％、或约2重量％至约6重量％、或约2重量％至约10重量％的 DPA。

微生物油

本发明还涉及一种由本文提供的微生物产生的微生物油。尽管 本发明的微生物油可以是源自于微生物的任何油，包括例如：从微 生物的生物质中提取而不经过进一步加工的粗制油；通过用诸如精 制、漂白、和/或除臭的进一步加工步骤处理粗制微生物油所获得的 精制油；通过稀释粗制的或精制的微生物油所获得的稀释的微生物 油；或例如通过用另外的纯化方法处理粗制的或精制的微生物油以 提高油中脂肪酸(如DHA)的浓度所获得的富集油，但是除非另外 说明，否则如本文所公开的微生物油是从生物体或生物体的生物质 中提取而没有经过进一步加工的粗制油。举例来说，可以例如通过 使用溶剂对裂解或未裂解的细胞进行提取来获得粗制油，所述溶剂 诸如但不限于有机溶剂或水可混溶溶剂，包括烃，如己烷；醇，如 甲醇；氯仿；二氯甲烷等。

如本文所公开的粗制油的脂肪酸含量通常是通过如本文的实例 中所述的脂肪酸甲酯(FAME)分析来确定的。在提到细胞脂质或微 生物油的脂肪酸含量时，如本文所用的“脂肪酸”(以及其他脂肪酸术 语，如“ω-3脂肪酸”、“PUFA”、“DHA”、“肉豆蔻酸”等)除了游离脂 肪酸之外还指的是脂质背景下的脂肪酸(例如作为酯化或另外以生化 方式缀合到其他化学部分的酰基链)，诸如但不限于甘油三酯、甘油 二酯、和甘油一酯、蜡酯、以及极性脂质，如磷脂。因此，微生物 油的总脂肪酸中诸如DHA的特定脂肪酸物质的百分比包括存在于例 如甘油脂和磷脂中的脂肪酸并且表示为占总脂肪酸的百分比或 “FAME脂质百分比”。

在一些实施方案中，所述微生物油包含至少20重量％、至少25 重量％、至少30重量％、至少35重量％、至少40重量％、至少45 重量％、至少50重量％、至少55重量％、至少60重量％、至少65 重量％、至少70重量％、至少75重量％、或至少80重量％的DHA。 在一些实例中，所述微生物油可以含有占脂质的脂肪酸的至少 10％、至少20％、或至少30％的肉豆蔻酸。在一些实施方案中，所 述微生物油包含占FAME的约10％或更少、约9％或更少、约8％或 更少、约7％或更少、约6％或更少、约5％或更少、约4％或更少、 约3％或更少、约2％或更少、或约1％或更少的EPA。在一些实施方 案中，所述微生物油基本上不含EPA。在一些实施方案中，所述微 生物油包含占FAME的约0.5％至约1％、约0.5％至约2％、约0.5％ 至约2.5％、约0.5％至约3％、约0.5％至约3.5％、约0.5％至约5％、 约0.5％至约6％、约1％至约2％、约2％至约3％、约2％至约3.5％、 约1％至约2.5％、约1％至约3％、约1％至约3.5％、约1％至约5％、 或约1％至约6％的DPA n6。在一些实施方案中，所述微生物油包含等于或大于约4:1、至少5:1、或至少6:1的DHA与DPA n6的重量 比。

脂质产生

可以使用本发明的一种或多种分离的网粘菌纲微生物或其衍生 物产生脂质。用于接种、培养网粘菌以及从网粘菌回收生物质的各 种发酵参数是本领域已知的，如美国专利号5,130,242；US 6.582,941；US 8,207,363；US 6,607,900；US 6,607,900；以及美国专利申请公布US20080155705中所描述，所有这些文献以引用的方式 整体并入本文。

可以使用用于培养网粘菌纲微生物的任何培养基。举例来说， 用于培养网粘菌的配方可以见于美国专利8,207,363中，并且还提供 于本文的实例中。培养基可以任选地含有天然海水或人工海水，所 述海水可以最终培养基制剂的例如1％至99％的稀释度存在。用于网 粘菌纲微生物的培养基包括用于微生物的至少一种碳源。可以存在 于培养基中的碳源的实例包括但不限于葡萄糖、果糖、半乳糖、L- 岩藻糖(源自于半乳糖)、乳糖、乳果糖、麦芽糖、麦芽三糖、木 糖、蔗糖、可溶性淀粉、糊精(源自于玉米)和α-环糊精(源自于淀粉)、糖原、明胶、糖蜜、玉米浆、m-肌醇(源自于玉米浆)、葡糖 胺、葡聚糖、脂肪、油、甘油、乙酸盐(例如乙酸钠、乙酸钾)、乙 酸、甘露糖醇、乙醇、半乳糖醛酸(源自于果胶)、纤维二糖(源自 于纤维素)以及多元醇，如麦芽糖醇、赤藓糖醇、阿东糖醇以及油 酸，如甘油和tween80以及氨基糖，如N-乙酰基-D-半乳糖胺、N- 乙酰基-D-葡糖胺以及N-乙酰基-β-D-甘露糖胺。培养基可以包括氮 源，所述氮源可以是例如无机氮源，如乙酸铵、硫酸铵、氯化铵、 或硝酸铵。可选地或另外地，培养基中所提供的氮源可以是有机氮 源，包括作为非限制性实例的蛋白胨、酵母提取物、多聚蛋白胨、 麦芽提取物、大豆粉、肉类提取物、鱼粉、酪蛋白氨基酸、玉米 浆、谷氨酸盐、或脲。培养基还包括磷酸盐形式，如磷酸钾或磷酸 钠；以及无机盐、酸、或碱，例如像硫酸铵、氢氧化铵、氯化镁、 硫酸镁、氢氧化钾、碳酸氢钠、硼酸、柠檬酸、磷酸、原钒酸钠、 铬酸钾、氯化钾、氯化钠、硫酸钠、钼酸钠、亚硒酸、硫酸镍、硫 酸铜、硫酸锌、氯化钴、氯化铁、氯化锰、以及氯化钙，它们可以 提供营养素，包括微量营养素。一种或多种螯合化合物(例如乙二胺 四乙酸、柠檬酸或柠檬酸盐)也可以存在于培养基中。此外，一种或 多种维生素，诸如但不限于盐酸吡哆醇、盐酸硫胺素、泛酸钙、对 氨基苯甲酸、核黄素、烟酸、生物素、叶酸以及维生素B

在一些实施方案中，以饱和度的百分比计，培养基包含至少 5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少 60％、至少70％、至少80％、或至少90％的溶解氧。在一些实施方 案中，以饱和度的百分比计，培养基包含约5％至约20％、约5％至 约50％、约5％至约100％、约10％至约20％、约10％至约50％、约 10％至约100％、约20％至约50％、或约20％至约100％的溶解氧。

发酵体积可以是任何可行的体积。在一些实施方案中，发酵体 积(培养物的体积)是至少约1升或至少约2升、至少约5升、至少 约10升、至少约50升、至少约100升、至少约200升、至少约500 升、至少约1000升、至少约10,000升、至少约20,000升、至少约 50,000升、至少约100,000升、至少约150,000升、至少约200,000 升、或至少约250,000升。在一些实施方案中，发酵体积是约1升至 约300,000升、约2升、约10升、约50升、约100升、约200升、 约500升、约1000升、约10,000升、约20,000升、约50,000升、 约100,000升、约150,000升、约200,000升、约250,000升、或约 300,000升。

可以在以下温度下进行发酵：约15℃至约40℃，例如约17℃至 约35℃、或约18℃至约35℃、或约20℃至约32℃、或约22℃至约 30℃。举例来说，可以在以下温度下进行至少一个阶段的发酵：约 17℃、约18℃、约19℃、约20℃、约21℃、约22℃、约23℃、约 24℃、约25℃、约26℃、约27℃、约28℃、约29℃、约30℃、约 31℃、约32℃、约33℃、约34℃、或约35℃。培养基可以具有约4.0至约8.5的pH值，例如，培养基可以具有以下pH值：约4.2至 约8.0、或约pH 4.5至约pH 7.8、或约5.0至约7.5，例如可以在培养 基中在以下pH值下进行发酵：约pH 4.5至约pH 5.0、约pH 5.0至约 pH 5.5、约pH 5.5至约pH 6.0、约pH 6.0至约pH 6.5、约pH 6.5至 约pH 7.0、约pH 7.0至约pH 7.5、约pH 7.5至约pH 8.0、或约pH 8.0 至约pH8.5。

可以在4℃至40℃，优选地18℃至35℃的温度下，通过通气振 荡培养、振荡培养、静止培养、分批培养、补料分批培养、连续培 养、滚动分批培养、或波动培养等进行培养1天至30天、1天至21 天、1天至15天、1天至12天、1天至9天、1天至7天、或1天至 5天。在各种培养法中，可以存在两个或更多个培养期(例如生长期 和脂质产生期)，这些培养期在例如温度、溶解氧浓度、搅拌或搅动 程度、一种或多种营养素的可用性等方面可以是不同的。

在一些实施方案中，在包含碳源、氮源以及营养素来源的约pH 4.5至约pH 8.0的培养基中，在约15℃至约35℃下，在培养期间， 如本文所提供的分离的网粘菌的培养物具有至少约2克/升/天、至少 约4克/升/天、或至少约8克/升/天的ω-3脂肪酸生产率。在一些实施 方案中，在包含碳源、氮源以及其他营养素来源的约pH 4.5至约pH 7.5的培养基中，在约20℃至约35℃下，在培养期间，分离的网粘菌 培养物具有约1克/升/天至约30克/升/天、约2克/升/天至约25克/ 升/天、约2克/升/天至约25克/升/天、约3克/升/天至约20克/升/天、 或约4克/升/天至约20克/升/天的ω-3脂肪酸生产率。

提取

可以使用多种程序来回收各种培养基中来自发酵的所得的细胞 生物质，如通过过滤或离心。然后可以将细胞洗涤、冷冻、冻干、 或喷雾干燥，并且储存在非氧化气氛下以消除氧的存在，之后并入 到加工食品或饲料产品中。

可以通过例如经由研磨、超声处理、或任何其他适当的手段破 碎或破坏所收集的细胞生物质，然后使用诸如氯仿、己烷、二氯甲 烷、甲醇、乙醇的溶剂或经由超临界流体提取手段进行提取来获得 含有DHA的脂质。可以通过将脂质水解并且通过使用诸如尿素加合或分馏、柱色谱的传统方法或通过超临界流体分级分离浓缩高度不 饱和的级分来进一步浓缩ω-3多不饱和脂肪酸。还可以将细胞破碎 或裂解，并且将脂质提取到植物油或动物油(例如鱼油)中。可以通 过常规用于精制植物油的公知工艺(例如通过化学精制或物理精制) 来精制提取的油。这些精制工艺从提取的油中去除杂质，之后它们 作为食用油被使用或出售。在精制之后，所述油可以直接用作饲料 或食品添加剂以生产ω-3和/或ω-6富集产品。或者，所述油可以如 下文所述被进一步加工和纯化，然后用于上述应用以及药物应用 中。

在用于生产富集(浓缩)的ω-3或ω-6油的另一种方法中，可以 通过公知的技术使所收获的细胞生物质(新鲜的或干燥的)破裂或透 化，所述技术诸如超声处理、液体剪切破坏方法、珠粒研磨、在高 压下压制、冷冻-解冻、或酶消化细胞壁。通过使用诸如己烷、氯仿、乙醚或甲醇的溶剂或溶剂的混合物来提取来自破裂的细胞的脂 质。去除溶剂并且通过使用用于将甘油三酯转化成游离脂肪酸或脂 肪酸酯的公知的方法中的任一种来使脂质水解，所述方法包括碱水 解、酸水解、或酶水解。在水解完成后，将非皂化性化合物提取到 溶剂，如乙醚、己烷或氯仿中并且去除。然后通过添加酸将剩余溶 液酸化，并且将游离脂肪酸提取到诸如己烷、乙醚或氯仿的溶剂 中。然后可以将含有游离脂肪酸的溶剂溶液冷却到低到足以使非 PUFA化合物结晶的温度，然后可以经由过滤、离心或沉降将这些化 合物去除。对剩余的PUFA化合物进行浓缩并且用作人类的营养补 充剂、用作食品添加剂、或用作药物应用。

产品

本发明的组合物包括但不限于食品、药物组合物、美容品、以 及工业组合物。

可以包括如本文所提供的微生物油的食品包括固体组合物和液 体组合物这两者。食品可以是动物或人类食品的添加剂。食品包括 但不限于常见食品；液体产品，包括奶、饮料、治疗性饮料、以及 营养饮料；功能性食品；补充剂；营养食品；婴儿配方食品，包括用于早产儿的配方食品；用于妊娠期或哺乳期女性的食品；成人食 品；老年食品；以及动物食品。

本发明的网粘菌生物质或微生物油可以直接用作添加剂或作为 添加剂包括在以下一种或多种内：油、起酥油、涂抹食品、其他脂 肪成分、饮料、沙司、乳基或大豆基食品(如奶、酸奶、奶酪以及冰 淇淋)、烘烤食品、营养产品，例如作为营养补充剂(呈胶囊或片剂 形式)、维生素补充剂、膳食补充剂、粉状饮料、成品或半成品粉状 食品、以及其组合。

在一些实施方案中，所述组合物是动物饲料，包括但不限于用 于水生动物和陆生动物的饲料。在一些实施方案中，所述组合物是 肉或产品由人类食用的任何动物的饲料或饲料补充剂，如产生肉、 蛋、或奶供人类食用的任何动物。当喂养这些动物时，可以将诸如LC-PUFA的营养素并入到这些动物的肉、奶、蛋或其他产品中以提 高它们的这些营养素的含量。

在一些实施方案中，所述组合物是药物组合物。合适的药物组 合物包括但不限于抗炎组合物、用于治疗冠状动脉性心脏病的药 物、用于治疗动脉硬化症的药物、化疗剂、活性赋形剂、骨质疏松 症药物、抗抑郁剂、抗惊厥剂、抗幽门螺杆菌药物、用于治疗神经 变性疾病的药物、用于治疗退行性肝病的药物、抗生素、降低胆固 醇的组合物、以及降低甘油三酯的组合物。在一些实施方案中，所 述组合物是医疗食品。医疗食品包括呈在医师监督下被食用或外部 施用的组合物的形式并且意图用于病况的特定膳食管理的食品，对 于所述病况，基于公认的科学原理，通过医学评价建立了独特的营 养需求。

所述微生物油可以被配制成剂型。剂型可以包括但不限于片 剂、胶囊、扁囊剂、小丸、丸剂、粉剂以及颗粒剂、以及肠胃外剂 型，所述肠胃外剂型包括但不限于溶液、悬浮液、乳液、以及干 粉，它们包含有效量的微生物油。本领域还已知的是，这些制剂还 可以含有药学上可接受的稀释剂、填充剂、崩解剂、粘合剂、润滑 剂、表面活性剂、疏水性媒介物、水溶性媒介物、乳化剂、缓冲 剂、湿润剂、保湿剂、增溶剂、防腐剂等。施用形式可以包括但不限于片剂、糖衣丸、胶囊、囊片、以及丸剂，它们含有微生物油以 及一种或多种合适的药学上可接受的载体。

对于口服施用，所述微生物油可以与本领域公知的药学上可接 受的载体组合。这些载体使得本发明的微生物油能够被配制成片 剂、丸剂、糖衣丸、胶囊、液体、凝胶、糖浆、浆液、悬浮液等， 以用于由待被治疗的受试者口服摄入。在一些实施方案中，所述剂 型是片剂、丸剂或囊片。用于口服使用的药物制剂可以通过添加固 体赋形剂，任选地研磨所得混合物，并且如果需要的话，在添加合 适的辅剂之后对颗粒的混合物进行加工以获得片剂或糖衣丸核心来 获得。合适的赋形剂包括但不限于填充剂，如糖，包括但不限于乳 糖、蔗糖、甘露糖醇以及山梨糖醇；纤维素制剂，诸如但不限于玉 米淀粉、小麦淀粉、米淀粉、马铃薯淀粉、明胶、黄蓍胶、甲基纤 维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠；以及聚乙烯吡咯烷酮 (PVP)。如果需要的话，可以添加崩解剂，诸如但不限于交联聚乙 烯吡咯烷酮、琼脂、或藻酸或其盐，如藻酸钠。可以口服使用的药 物制剂包括但不限于由明胶制成的推入配合式胶囊(push-fit capsule) 以及由明胶和增塑剂(如甘油或山梨糖醇)制成的软密封胶囊。

在另外的实施方案中，所述组合物是美容产品或个人护理产 品。美容产品和个人护理产品包括但不限于乳液、霜膏、洗剂、面 膜、肥皂、洗发剂、剃须膏、洗涤剂、面霜、调理剂、化妆品、沐 浴剂以及分散液。美容剂可以是药物或非药物。

用于分离菌株衍生物的方法

本文还提供了用于分离具有提高的脂质生产率的微生物菌株的 方法，其中所述方法包括：将祖代菌株的微生物在包括培养基的细 胞恒稳器或恒化器中培养，所述培养基包括抑制参与脂质代谢的酶 的活性的至少一种化合物，以提供抑制剂选择的群体；以及从所述 抑制剂选择的群体中分离相对于祖代微生物菌株具有提高的脂质生 产率的微生物以提供具有提高的脂质生产率的衍生菌株。提高的脂 质生产率包括但不限于任何一类脂质或特定脂质的总产量或产生速 率增加，所述脂质包括但不限于：总脂质、中性脂质、FAME脂质 (“FAME”)、总脂肪酸、任何脂肪酸或脂肪酸衍生物(例如一种或 多种脂肪酸、脂肪醇、脂肪酸酯、蜡酯、烷烃、或烯烃)、甘油三酯 (TAG)、不饱和脂肪酸、油酸、ω-3脂肪酸、DHA、EPA、ω-6脂 肪酸、ARA、饱和脂肪酸、棕榈酸、肉豆蔻酸等。在一些实例中， 在细胞恒稳器中进行培养以提供细胞恒稳器选择的群体。在一些实 例中，在细胞恒稳器或恒化器中培养之前，对所述微生物进行诱变 程序。在一些实例中，在参与脂质生物合成的酶或因子的抑制剂存 在下培养所述微生物之前，在不存在脂质生物合成抑制剂的情况下 将所述微生物在细胞恒稳器或恒化器中培养，并且可以选择具有改 良的生长特性的一种或多种微生物。在一些实例中，可以在诱变程 序之后将经受诱变程序的微生物用UV辐照处理。诱变后UV处理可 以在细胞恒稳器或恒化器培养之前进行，或可以在已经在包括参与 脂质生物合成的酶或因子的抑制剂的细胞恒稳器或恒化器中对经过 诱变的群体进行选择之后进行，以使得用UV处理经过诱变的微生 物的经过抑制剂选择的群体。在一些实例中，选择是在脂质生物合 成抑制剂存在下进行的，并且可以例如在细胞恒稳器或恒化器中进 行。

可以对微生物或菌株进行多个诱变程序，任选地但是优选地在 每一个诱变程序之后，在包括抑制参与脂质代谢的酶或因子的活性 的至少一种化合物的细胞恒稳器或恒化器中培养。在进行多个诱变 程序的情况下，可以任选地在一个、多于一个、或所有的诱变程序 之后对微生物进行UV辐照。

因此，本文提供了用于分离具有提高的脂质生产率的微生物菌 株的方法，其中所述方法包括：对祖代菌株的微生物进行诱变程 序；在参与脂质生物合成的酶或因子的抑制剂存在下将所述经过诱 变的微生物在细胞恒稳器或恒化器中培养以提供抑制剂选择的经过 诱变的群体；以及从所述抑制剂选择的经过诱变的群体中分离相对 于所述祖代菌株的微生物具有提高的脂质生产率的衍生菌株的至少 一种微生物。在某些实例中，所述方法可以包括：对祖代菌株的微 生物进行诱变程序；在参与脂质生物合成的酶或因子的抑制剂存在 下将所述经过诱变的微生物在细胞恒稳器或恒化器中培养一段时 间，期间所述微生物进行多次细胞分裂，以提供微生物的经过抑制 剂选择的群体；对至少一种经过诱变的微生物进行UV辐照；以及 分离所述祖代微生物菌株的相对于所述祖代菌株具有提高的脂质生产率的衍生菌株的至少一种微生物。可以在包括参与脂质生物合成 的酶或因子的抑制剂的细胞恒稳器或恒化器中选择之前和/或之后用 UV辐照处理经过诱变的微生物。在存在或不存在参与脂质生物合成 的酶或因子的抑制剂的情况下在细胞恒稳器或恒化器中进行的选择 也可以在UV处理之后进行。

在另外的方面，本文提供了用于改良经过诱变的菌株的性状的 方法，其中在诱变程序之后对祖代菌株的微生物进行UV处理。在 不将本发明限于任何具体机制的情况下，UV处理可以增强经过诱变 的菌株的性状。UV处理可以在诱变之后并且在针对目标性状进行选 择或筛选之前或之后进行。在一些实例中，针对目标性状进行的选 择可以包括在细胞恒稳器或恒化器中选择。可选地或另外地，针对 目标性状进行的选择或筛选可以包括生长测定(包括测试对一种或多 种化合物的抗性)、生化分析、遗传分析、或表型、细胞、或生化测 定。

在一些实例中，针对目标性状进行的选择或筛选在UV处理之 前进行。针对目标性状进行的选择可以任选地包括将经过诱变的微 生物在细胞恒稳器或恒化器中培养。在一些实例中，针对目标性状 进行的选择可以包括将经过诱变的微生物在包括抑制野生型细胞生 长或例如抑制参与脂质代谢的酶或因子的活性的至少一种化合物的 细胞恒稳器或恒化器中培养。经过诱变的微生物可以可选地或另外 地例如通过生化分析或细胞测定或生化测定来筛选或表征以评估目 标性状，例如与任何化合物或任何组或类别的化合物相关的生产 率、对化合物的抗性、耐温性、生长速率等。

可以对微生物或菌株进行多个诱变程序，任选地但是优选地可 以在每一个诱变程序之后进行UV处理，并且任选地在多个诱变程 序之后，在UV处理之前和/或之后针对目标性状选择微生物。

可以对目标任何微生物菌株进行本文提供的方法，并且所述菌 株可以是作为非限制性实例的不等鞭毛类、藻类、真菌、或细菌。 针对目标性状，包括但不限于增加的脂质产生所选择的菌株可以是 重组菌株或非重组菌株。举例来说，所述菌株可以是已知不产生显 著量或大量的目标脂质，但是可以被工程化以表达提高脂质产生或 引起特定的脂质或脂质类别产生的一种或多种基因的物种。经过UV 处理的微生物可以来自分离的单细胞，或可以是已经受诱变程序的 细胞群体。在诱变程序(可以是例如用诱变化合物、γ辐照、或UV辐照处理)后经过UV处理的微生物可以是在选择程序之前已经受一 个或多个诱变程序和/或一个或多个筛选或选择程序的微生物。

用于本文的方法中的微生物可以包括任何微生物，包括原核生 物和真核生物。在所述方法用于获得具有增强的脂质产生的菌株的 情况下，天然积聚脂质的物种可以是优选的，尽管本发明不限于这 样的物种。在一些实例中，用于本文的方法中的任一种中的微生物 可以是网粘菌纲的不等鞭毛类菌株，并且可以是例如破囊壶菌或网 粘菌，如不动壶菌属、橙黄壶菌属、迪普弗里思氏菌属、日本壶菌 属、网粘菌属、类网粘菌属、矩圆壶菌属、裂殖壶菌属、破囊壶菌 属或吾肯氏壶菌属中的任一种的物种。

在另外的实例中，微生物可以是藻类，例如像微藻，例如像选 自以下属的物种：弯杆藻属(Achnanthes)、茧形藻属(Amphiprora)、 月形藻属(Amphora)、纤维藻属(Ankistrodesmus)、星胞藻属(A steromonas)、黄金色藻属(Boekelovia)、波利氏藻属(Bolidomona s)、包特氏藻属(Borodinella)、气球藻属(Botrydium)、葡萄藻 属、淡水小荀球藻属(Bracteococcus)、角毛藻属(Chaetoceros)、 卡特藻属(Carteria)、衣藻属(Chlamydomonas)、绿球藻属(Chl orococcum)、绿梭藻属(Chlorogonium)、小球藻属、蓝隐藻属(C hroomonas)、金球藻属(Chrysosphaera)、球钙板藻属(Cricospha era)、隐甲藻属(Crypthecodinium)、隐藻属(Cryptomonas)、小 环藻属、杜氏藻属、后棘藻属(Ellipsoidon)、球石藻属(Emiliania)、 独球藻属(Eremosphaera)、衣迪斯藻属(Ernodesmius)、裸藻属、 真眼点藻属(Eustigmatos)、伏氏藻属(Franceia)、脆杆藻属(Fragilaria)、拟脆杆藻属(Fragilaropsis)、丽丝藻属(Gloeothamnio n)、红球藻属、嗜盐藻属(Halocafeteria)、菱板藻属、异弯藻属(H eterosigma)、膜胞藻属(Hymenomonas)、等鞭金藻属、鳞孔藻属 (Lepocinclis)、微星藻属(Micractinium)、蒜头藻属、单针藻属(Monoraphidium)、微绿球藻属、微拟球藻属、舟形藻属(Navicula)、 新绿藻属、肾鞭藻属(Nephrochloris)、肾藻属(Nephroselmis)、 菱形藻属、棕鞭藻属(Ochromonas)、鞘藻属(Oedogonium)、卵 胞藻属(Oocystis)、青绿藻属(Ostreococcus)、巴夫藻属、拟小球 藻属(Parachlorella)、雪衣藻属、巴喧氏藻属(Pascheria)、金藻 属(Pelagomonas)、褐指藻属(Phaeodactylum)、扁裸藻属(Phag us)、微微型绿藻属(Picochlorum)、扁藻属(Platymonas)、颗石 藻属(Pleurochrysis)、联球藻属(Pleurococcus)、原藻属(Prototheca)、拟绿球藻属(Pseudochlorella)、拟新绿藻属(Pseudoneoch loris)、拟角星鼓藻属(Pseudostaurastrum)、塔胞藻属(Pyramimo nas)、桑椹藻属(Pyrobotrys)、栅列藻属(Scenedesmus)、裂衣藻 属(Schizochlamydella)、骨条藻属(Skeletonema)、水绵藻属(Spyrogyra)、裂丝藻属(Stichococcus)、四粒藻属(Tetrachlorella)、 四爿藻属(Tetraselmis)、海链藻属(Thalassiosira)、黄丝藻属(T ribonema)、无隔藻属(Vaucheria)、鲜绿球藻属(Viridiella)、魏 氏藻属(Vischeria)、以及团藻属(Volvox)。举例来说，可以使用 硅藻，诸如但不限于小环藻属、褐指藻属、或海链藻属的物种。或 者，可以使用涡鞭毛藻(dinoflagellate)，如隐甲藻。或者，在本文 提供的方法中可以使用真眼点藻，如蒜头藻属或微拟球藻属的物 种。

在另外的其他实例中，针对目标性状，如增强的脂质产生所选 择的微生物可以是重组真菌或非重组真菌，例如像曲霉属 (Aspergillus)、被孢霉属、毛霉属(Mucor)、酵母菌属 (Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、或毕赤酵 母属(Pichia)的物种。在一些实例中，针对增加的脂质产生所选择 的微生物是产油酵母，例如以下各项的物种：念珠菌属、隐球菌 属、小克银汉霉菌属(Cunninghamella)、油脂酵母属、红冬孢酵母属、红酵母属、枝霉属(Thamnidium)、丝孢酵母属、或耶氏酵母 属。可以被考虑用于针对增加的脂质产生加以选择的产油真菌的物 种的非限制性实例包括构巢曲霉(Aspergillusnidulans)、弯曲隐球 酵母(Cryptococcus curvatus)、刺孢小克银汉霉(Cunninghamellaechinulata)、汉逊德巴利酵母(Debaryomyces hansenii)、亨斯氏地 霉(Geotrichumhisteridarum)、普通地霉(Geotrichum vulgare)、 东方油脂酵母(Lipomycesorientalis)、斯氏油脂酵母(Lipomyces starkeyi)、子囊菌油脂酵母(Lipomycestetrasporus)、高山被孢霉 (Mortierella alpine)、拉曼被孢霉(Mortierellaramanniana)、球红 冬孢酵母(Rhodosporidium sphaerocarpum)、橙黄红酵母(Rhodotorula aurantiaca)、粘红酵母(Rhodotorula glutinis)、胶红 酵母(Rhodotorulamucilaginosa)、特普氏红酵母(Rhodotorula terpendoidalis)、圆红酵母(Rhodotorulatoruloides)、浅红掷孢酵母 (Sporobolomyces alborubescens)、栉枝霉(Thamnidiumctenidium)、 雅致枝霉(Thamnidium elegans)、德尔布有孢圆酵母(Torulasporadelbruechii)、比兰德丝孢酵母(Trichosporon behrend)、芸苔丝孢 酵母(Trichosporonbrassicae)、丝孢酵母属某种CBS 7617、家丝孢 酵母(Trichosporon domesticum)、娄氏丝孢酵母(Trichosporon loubieri)、圆形丝孢酵母(Trichosporon montevideense)、以及解脂 耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)。

针对目标性状，如增加的脂质产生所选择的菌株还可以是重组 细菌或非重组细菌。举例来说，可以针对增加的脂质产生加以选择 的已知产生甘油三酯的细菌可以包括不动杆菌属(Acinetobacter)、 分枝杆菌属(Mycobacterium)、诺卡氏菌属(Nocardia)、红球菌属 (Rhodococcus)、希瓦氏菌属(Shewanella)以及链霉菌属 (Streptomyces)的物种。可以被考虑的蓝藻细菌属包括阿格藻属 (Agmenellum)、鱼腥藻属(Anabaena)、项圈藻属(Anabaenopsis)、 组囊藻属(Anacystis)、束丝藻属(Aphanizomenon)、节旋藻属(Arthrospira)、星厘藻属(Asterocapsa)、博氏藻属(Borzia)、 眉藻属(Calothrix)、管胞藻属(Chamaesiphon)、色球藻属 (Chroococcus)、拟绿胶藻属(Chlorogloeopsis)、拟甲色球藻属 (Chroococcidiopsis)、色球藻属、发毛针藻属(Crinalium)、蓝藻 细菌属(Cyanobacterium)、蓝菌属(Cyanobium)、蓝囊胞菌属 (Cyanocystis)、蓝螺藻属(Cyanospira)、蓝杆藻属(Cyanothece)、 拟柱胞藻属(Cylindrospermopsis)、筒孢藻属(Cylindrospermum)、 蓝纤维藻属(Dactylococcopsis)、皮果藻属(Dermocarpella)、侧生藻属(Fischerella)、弗氏藻属(Fremyella)、吉特勒氏藻属 (Geitleria)、吉特勒氏线状藻属(Geitlerinema)、粘杆菌属(Gloeobacter)、粘球藻属(Gloeocapsa)、粘杆藻属(Gloeothece)、 盐螺旋藻属(Halospirulina)、英加藻属(Iyengariella)、瘦鞘丝藻 属(Leptolyngbya)、湖生蓝丝藻属(Limnothrix)、鞘丝藻属 (Lyngbya)、微鞘藻属(Microcoleus)、微囊藻属(Microcystis)、 粘囊藻属(Myxosarcina)、节球藻属(Nodularia)、念珠藻属 (Nostoc)、拟珠藻属(Nostochopsis)、颤藻属(Oscillatoria)、席藻属(Phormidium)、浮丝藻属(Planktothrix)、宽球藻属 (Pleurocapsa)、原绿球藻属(Prochlorococcus)、原绿藻属 (Prochloron)、原绿发藻属(Prochlorothrix)、假鱼腥藻属(Pseudanabaena)、胶须藻属(Rivularia)、裂须藻属(Schizothrix)、 双歧藻属(Scytonema)、螺旋藻属(Spirulina)、斯塔尼尔氏菌属 (Stanieria)、斯塔尔氏菌属(Starria)、真枝藻属(Stigonema)、 束藻属(Symploca)、聚球藻属(Synechococcus)、集胞藻属 (Synechocystis)、单歧藻属(Tolypothrix)、束毛藻属 (Trichodesmium)、常丝藻属(Tychonema)以及异球藻属 (Xenococcus)。

细胞恒稳器和恒化器选择

本发明包括用于选择对脂质生物合成抑制剂或影响脂质生物合 成的其他化合物具有提高的耐受性的变体的方法。选择程序可以使 用恒化器或细胞恒稳器来选择对抑制脂质生物合成的化合物具有提 高的耐受性的一种或多种衍生物或突变体，同时富集培养物中在选 择条件下生长最快的变体。

恒化器是包括培养基的生物反应器，所述培养基可以是例如选 择培养基(例如包括损害或限制非抗性细胞或非营养源利用细胞的生 长的化合物或营养源的培养基)，其中培养基中的一种营养素以有限 量存在。培养物生长直到限制性营养素的水平下降到其中细胞分裂 减慢的水平为止。新鲜培养基的恒定内流被维持在等于细胞培养物 的恒定外流的速率。以这种方式，培养物被连续稀释并且连续生长(分裂)，其中培养物的生长(细胞分裂速率)与培养物稀释速率直 接相关。因此，细胞分裂速率可以通过调整培养物稀释速率来调 节，并且在选择条件下具有生长优势的变体在培养物中富集，这是 因为更差生长的细胞经由培养物的连续稀释而被“洗去”。

细胞恒稳器类似于恒化器，不同的是不允许培养物接近营养限 制(培养物被维持在低于将发生营养限制时的密度的密度)，并且基 于培养物的细胞密度来进行细胞恒稳器的稀释，定期或甚至连续监 测培养物的细胞密度，例如通过可以集成到细胞恒稳器设备的流式 细胞仪来监测(参见例如美国专利号7,901,937)。由于细胞恒稳器 培养物不接近营养限制(或经受可能影响生长的发酵产物的任何显著 的积聚)，因此细胞恒稳器培养物被认为是处在生长的稳态。如同在 恒化器培养物中那样，在包括选择培养基的细胞恒稳器中，在选择 条件下具有最佳的生长速率的细胞在培养物中富集，这是因为培养 物的不良生长的变体经由培养物稀释而变得越来越稀少。在细胞恒 稳器中，突变体快速增加它们在培养物中的表达，这是因为营养素 不是限制性的以使得具有生长优势的突变体更快地分裂而不受营养 素耗竭的周期性阻碍。此外，由于相对于细胞分裂速率来校准稀释 速率，因此使细胞增殖而没有过度稀释直到细胞开始达到一定的密 度，这一般是由培养物中抗性突变体的出现所引起。其中稀释与培 养物的细胞密度直接相关的这一连续的富集工艺极大地缩短了选择 由细胞恒稳器条件支持的变体的时间。

尽管诸如壶菌和产油酵母的微生物的脂质产生在营养限制(通常 是氮限制)期间在不发生细胞分裂时被高度诱导，但是已发现依赖于 更高的细胞分裂速率以分离目标突变体的恒化器/细胞恒稳器选择工 艺仍然可以成功地用于分离具有增强的脂质产生的突变体。

如本文所用的“抑制”意指通过任何手段降低酶或其他因子的活 性。“参与脂质代谢的因子”意指任何分子，在细胞中所述分子的存 在或量使得能够进行、诱导、抑制、增加、或减少脂质生物合成。 参与的因子可以是蛋白质或肽，包括例如引导或增加参与脂质生物合成或降解的酶的生物合成的蛋白质；或调节参与脂质生物合成或 降解的其他蛋白质酶的活性的蛋白质，例如转录因子、激酶或磷酸 酶；或蛋白质或肽酶抑制因子或变构调节因子。参与脂质代谢的因 子还可以是例如载体蛋白或转运蛋白。参与脂质代谢的因子不必是蛋白质或肽，但是可以是例如小分子辅因子、途径中间体、转录诱 导或阻遏化合物、或直接或间接影响蛋白质的活性的脂质或核苷酸 辅因子等。

恒化器或细胞恒稳器可以包括作为一种或多种抑制剂的例如苹 果酸、一种或多种脂肪酸、酶抑制剂、或影响脂质产生的其他化合 物，例如像没食子酸烷基酯、没食子酸丙酯、辣椒素、浅蓝菌素、 姜黄素、环丙烯、二苯胺、哒草伏(norflurazon)、哒嗪酮、稀禾定(sethoxydim)、甲苯甲酸、三氯生、吡氟氯禾灵(haloxyfop)、禾 草灵(diclofop)、精噁唑禾草灵(fenoxaprop)、精喹禾灵 (quizalofop)、6-氨基烟酰胺、苹果酸酯、一种或多种脂肪酸(例如 油酸)、芥花油、花生油、或芝麻素或芝麻酚。可以使用可以影响脂 质生物合成的化合物中的任一种或组合。在一些实施方案中，可以 在恒化器或细胞恒稳器培养物中提供脂肪酸合酶(FAS)或其组分的 抑制剂。举例来说，抑制剂可以是FAS的脱水酶、烯酰基ACP还原酶、或β-酮酰基合酶活性的抑制剂。羟基酰基载体蛋白脱水酶(“脱 水酶”或“DH”)抑制剂包括3-癸炔酰基-N-乙酰基-半胱胺(3-癸炔酰 基-NAC)和其衍生物(Ishikawa等人(2012)J.Amer.Chem.Soc. 134:769-772)。烯酰基ACP还原酶(“ER”)活性的抑制剂包括作为 非限制性实例的二氮杂硼烷、三氯生以及异烟肼。β-酮酰基-ACP合 酶(“KAS”)活性的抑制剂包括作为非限制性实例的浅蓝菌素、硫乳 霉素、以及SBPT04(Kingry等人(2012)J.Bacteriol.195:351-358)。 酶乙酰辅酶A羧化酶(ACC酶)酶的抑制剂包括但不限于吡氟氯禾 灵、禾草灵、精噁唑禾草灵、精喹禾灵、BP1、TOFA、以及索阿芬 A(soraphen A)(Becker等人(2007))。

还考虑脂肪酸去饱和酶和脂肪酸延长酶的抑制剂，例如像脂肪 酸去饱和酶抑制剂，如芝麻素或姜黄素(US 8,349,595)；或脂肪酸 延长酶抑制剂，如环草特(cycloate)、硫代氨基甲酸酯、以及亚砜。

在一些实例中，可以在恒化器或细胞恒稳器中使用三氯生作为 抑制剂。在一些实例中，可以在恒化器或细胞恒稳器中使用浅蓝菌 素作为抑制剂。此外，可以任选地在不存在参与脂质代谢的酶或其 他因子的抑制剂的情况下在恒化器或细胞恒稳器中培养目标任何菌 株，如从野外分离的菌株或从培养物保藏中心获得的菌株以选择具 有比原始菌株更快的生长的分离株。这样的选择可以在选择对抑制 剂化合物具有抗性的突变体之前或之后进行。

在存在或不存在脂质生物合成抑制剂的情况下在细胞恒稳器或 恒化器中进行的选择可以持续任何时间段，所述时间段允许多个连 续的细胞分裂周期并且可以取决于生物体的生长速率。恒化器或细 胞恒稳器可以具有任何体积容量。对于诸如真菌和壶菌的微生物菌 株来说，例如，可以在具有以下发酵罐体积容量的恒化器或细胞恒 稳器中进行培养：约25mL至约10L，并且可以是200mL至约5 L、或约300mL至约2L、或约400mL至约1L。培养期可以持续任 何长度的时间，例如像从一天到几个月。优选地，对于真菌和壶 菌，在恒化器或细胞恒稳器中的培养期持续超过一天的时间段，例 如约2天至约30天、或约3天至约20天、或约4天至约15天的时 间段。在一些实施方案中，细胞恒稳器选择是优选的。在一些实施 方案中，在细胞恒稳器中，培养期可以例如是约3天至约10天。

可以通过从培养了任何时间段的培养物稀释涂铺或进行流式细 胞术来分离微生物的单个菌落，并且可以针对任何所期望的特性筛 选所得的一种或多种分离株。

举例来说，可以测试分离株的以下任一种或任何组合：增加的 生长速率、增加的生物质积聚、增加的脂质或脂肪酸产生速率、增 加的甘油三酯产生速率、增加的总脂质积聚、增加的FAME积聚、 增加的甘油三酯积聚、增加的FAME产生速率、增加的DHA产生速 率、增加的DHA积聚、增加的DHA占脂肪酸的百分比、增加的 DHA与DPA的比率等。可以使用用于测定脂质或脂肪酸量的任何可 行的方法，包括使用亲脂性染料(例如氟硼荧(bodipy)或尼罗红(Nile red))或FAME分析。可以在任何培养条件下进行测试，包括上文 所列的在测试之前可以用于培养菌株的那些，例如使用特定的碳源 或氮源或浓度、盐浓度、温度、pH值等。

如本文所用的“突变体”包括已经在基因中发生突变，即变化的 微生物。突变体可以天然存在(即可以自发地出现)或可以被诱导， 例如使用化学剂(包括药物)、γ辐照、或紫外光诱导。术语变体通 常用于涵盖自发出现的突变体，例如具有相对于作为它的来源的菌 株(祖代菌株)不同的稳定并且可遗传的性状的分离株，尽管引起一 个或多个独特性状的突变或甚至一种或多种基因或一种或多种蛋白 质的性质可能是未知的。“衍生”菌株是作为已经传代培养并且与祖 代菌株分开维持的祖代菌株的后代的菌株。衍生物可以是变体或突 变株，例如，相对于祖代菌株具有一个或多个独特的可遗传的性状 的变体或突变株。衍生菌株还可以是已经被遗传工程化以包括至少 一个非天然基因，例如像编码代谢酶、调节因子(例如转录因子、转 录激活因子、变构蛋白、转运蛋白等)的非天然基因的菌株。

诱变

本发明包括本文提供的菌株中的任一种的变体，其中变体可以 是突变体，如天然存在的突变体、或由许多诱变技术中的任一种产 生的突变体，所述技术诸如但不限于化学诱变、γ辐照、UV辐照、 或分子生物学技术，使用引入到细胞中的可以用于(直接或间接)改变微生物细胞的基因座的核酸构建体，诸如但不限于插入诱变、定 点诱变、基因置换或基因切除。在本发明中还包括用于选择微生物 菌株的变体(包括突变体)的方法，其中所述方法可以包括一个或多 个诱变步骤，诸如但不限于本文提供的那些。

用于产生微生物菌株的突变体的方法是公知的。举例来说，γ辐 照、UV辐照、以及用许多可能的化学诱变剂(例如5-溴脱氧尿苷、 甲磺酸乙酯(EMS)、甲磺酸甲酯(MMS)、硫酸二乙酯(DES)、 亚硝基胍(NTG)、ICR化合物等)中的任一种进行的处理或用诸如 引起染色体断裂的烯二炔抗生素(例如博来霉素(bleomycin)、阿 霉素(adriamycin)、新制癌菌素(neocarzinostatin))进行的处理是 已经用于对藻类、真菌、以及壶菌进行诱变的方法(参见例如美国专 利8,232,090；美国专利申请20120088831；美国专利申请 20100285557；美国专利申请20120258498)。在物理诱变剂中有包 含放射性辐射、γ射线以及x射线的电磁辐射、电离辐射、紫外光或 高温。许多化学诱变剂也是本领域已知的，包括但不限于嵌入剂、 烷化剂、脱氨剂、碱基类似物。嵌入剂包括作为非限制性实例的吖 啶衍生物或菲啶衍生物，如溴化乙锭(也被称为2,7-二氨基-10-乙基 -6-苯基溴化菲锭或3,8-二氨基-5-乙基-6-苯基溴化菲锭)。烷化剂的 非限制性实例包括亚硝基胍衍生物(例如N-甲基-N'-硝基-亚硝基 胍)、甲磺酸乙酯(EMS)、乙磺酸乙酯、硫酸二乙酯(DES)、甲 磺酸甲酯(MMS)、亚硝酸、或HNO

诱变还可以使用分子生物学技术，包括将外源性核酸分子引入 到目标微生物细胞中。举例来说，被引入到细胞中的外源性核酸分 子可以通过随机整合或靶向整合而整合到基因座中，从而影响当中 插入有外来DNA的基因或与被插入基因组中的外来DNA靠近的基 因的表达(例如美国专利7,019,122；美国专利8,216,844)。外源性 核酸分子可以例如包括转座元件或其组分，例如像可以由转座酶和/ 或编码转座酶的基因识别的反向重复序列，或外源性核酸分子可以 至少部分基于病毒，如整合病毒，例如逆转录病毒。

可以根据任何已知的方法使待接受诱变的微生物暴露于诱变剂 或突变诱导剂。一般来说，可以通过在适当的时间内和适当的条件 下使目标微生物菌株的适量的细胞暴露于诱变剂或突变诱导剂来进 行诱变。常常，进行一次或多次初步实验，其中使目标微生物菌株 暴露于诱变剂或突变诱导基因以确定有效产生突变体并且不杀死过 多数量的细胞的浓度范围。这样的程序是本领域公知的。举例来 说，基于经由这些实验所获得的结果，可以证实允许细胞活力在约 0.5％至约95％、或约1％至约90％、或约2％至约80％、或约5％至约 70％、或约10％至约50％的浓度和/或暴露持续时间可以用于诱变程 序。细胞暴露于诱变剂的时间取决于所使用的诱变剂的性质。细胞 与诱变剂接触的时间可以是例如约1分钟至约24小时、或约30分钟 至约6小时、或约1.0小时至约3.0小时。可取的是，进行一系列简 单的测试以在用诱变剂进行各种处理之后测定接受诱变的细胞的存 活率。

为了举例而不是限制的目的，可以通过使待接受诱变的细胞以 每毫升10

在用化学诱变剂处理后，可以将细胞用无菌水或培养基洗涤至 少一次或稀释到不包括诱变剂的培养基中。在选择剂存在下在细胞 恒稳器或恒化器中培养之前，可以在不存在诱变剂的情况下以及在 不存在任何选择剂的情况下在恢复期中培养细胞。

在可以持续约几天至几周的细胞恒稳器或恒化器培养期之后， 可以将细胞在稀释下涂铺或对细胞进行分选以用于单菌落分离。可 以在液体培养物中培养菌落，例如以测试脂质的产生或生长速率。

两个或更多个诱变程序和细胞恒稳器或恒化器选择程序可以一 前一后进行。连续的细胞恒稳器或恒化器孵育可以包括不同的抑制 剂(例如抑制途径中的不同酶的脂质生物合成抑制剂)。诱变程序可 以使用相同的或不同的诱变剂。在一个具体的实例中，将已经受一 个或多个诱变程序的细胞进一步用UV处理并且在不包括脂质生物 合成抑制剂的细胞恒稳器中选择。

UV处理

本文提供了用于提高微生物的性能的方法，所述方法是通过用 UV光处理微生物，培养经过UV处理的微生物，并且针对所期望的 性状筛选而实现的。“提高……的性能”意指例如提高生长速率、提 高生产率、增强对化学品、pH值、盐的抗性或耐受性等。可以在诱 变程序，例如使用化学品或γ辐照的诱变程序之后进行UV辐照，或 可以在单独的UV诱变步骤之后用UV处理微生物。任选地，可以在 诱变步骤之后并且在使细胞暴露于UV辐射之前进行选择。

举例来说，可以进行诱变程序，并且可以针对一定的性状的存 在或程度对已经接受诱变剂处理的细胞群体进行选择，所述性状例 如像更高的生长速率、更高的产物产生速率、所产生的一种或多种 特定产物的绝对量或相对量、细胞对化合物或生长条件的抗性或耐 受性等。随后用UV辐照处理在筛选中被选为具有所期望的性状的 细胞。优选地，然后再次针对所述性状的存在或程度测试细胞以鉴 定具有增强的改良的性状的克隆，所述性状例如像更高的生长速 率、更高的产物产生速率、更大的对化合物或生长条件的抗性或耐受性等。

在UV辐照后并且在选择之前，任选地使细胞避光。举例来 说，可以在UV处理后涂铺细胞并且可以将平板保持在暗处，如柜 中，或可以包裹在不透光材料中。可以将细胞在暗处保持半小时至 三十天，例如一小时至两周、或两小时至一周。

在不将本发明的范围限于任何具体机制的情况下，推测表现出 不同于野生型的一定性状的分离的突变体或变体在UV处理后可以 表现出增强的性状。

UV处理可以使用公知的UV诱变方法，并且可以使用例如UV 灯或用于核酸和蛋白质UV交联的交联装置，并且处理的强度和持 续时间可以被调整以使得例如约0.1％至约99.99％的细胞由所述处理 杀死，例如接受UV处理的微生物的群体的至少0.5％、至少1％、至 少2％、至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至 少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、 至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、或至少99％可以由所 述处理杀死。可以使用约100μJ/cm

可以任选地在UV处理之后将经过UV处理的微生物在暗处孵育 约15分钟至约两周或更长，例如约30分钟至约一周的时间。可以在 维持在暗处之后对细胞群体进行选择，并且任选地但是优选地，可 以在维持在暗处，然后再培养一段时间之后进行选择。举例来说，可以将细胞用UV处理，在暗处孵育，然后选择或筛选，例如可以 通过在可以任选地包括选择化合物，例如像脂质生物合成抑制剂的 细胞恒稳器或恒化器中培养来对经过UV处理的细胞进行选择。或 者，在UV处理之后，可以将细胞维持在亮处而不提供暗孵育期。 可以在UV处理之后立即对细胞进行选择，或可以在选择之前进行 “生长”培养期。在UV处理之后进行的培养期可以任选地在细胞恒稳 器或恒化器中在存在或不存在选择化合物的情况下进行，以使得在 生长期间选择具有最佳的生长特征的细胞。

在一些实施方案中，可以在进行第一个、第二个、第三个、或 后续的诱变程序以及任选地但是优选地，筛选或选择，如细胞恒稳 器或恒化器选择之后对细胞进行UV处理。举例来说，可以将细胞 用诱变剂，如化学诱变剂或γ辐照或UV辐照处理，然后在恒化器或 细胞恒稳器(优选地，在目标性状是脂质产生的情况下，包括参与脂 质生物合成的酶或因子的抑制剂)中选择。可以筛选或选择具有所期 望的性状的来自一个或多个诱变和选择程序的分离株，所述性状例 如像提高的生长速率或脂质产生速率、或增强的对特定化学品的抗性或耐受性等，可以例如如本文所述用UV处理所述分离株，然后 (任选地但是优选地，在暗孵育期后)任选地在可以包括或可以不包 括抑制剂或选择剂的细胞恒稳器或恒化器中选择以分离相对于先前 诱变的菌株具有增强特性(例如像脂质生物合成)的突变体。在一个替代方案中，也可以在第一个、第二个、第三个、或后续的诱变程 序和选择之后将细胞用UV处理，然后涂铺到包括抑制脂质生物合 成的化合物的平板上以分离具有增强的性状，如增强的脂质产生的 突变体。

可以在任何诱变程序，例如使用化学品或γ辐照的诱变程序之 后进行UV辐照，或可以在单独的UV诱变步骤之后用UV处理微生 物。任选地，可以在诱变步骤之后并且在使细胞暴露于UV辐射之 前进行选择。举例来说，在使用多个诱变步骤的菌株分离工艺中， UV处理可以在仅一个、一些、或所有诱变程序之后进行。

作为上文所述的实施方案中的任一个的补充方案或替代方案， 本文提供了以下实施方案：

实施方案1是一种突变型网粘菌纲微生物，所述微生物产生至 少20％的DHA、至少25％的DHA、至少30％的DHA、至少35％的 DHA、或至少38％的DHA，其中以下情况中的一个或多个是真实 的：

所述突变型微生物在小规模培养物中按至少125mg/L/h、至少 150mg/L/h、至少170mg/L/h、或至少190mg/L/h的速率产生DHA；

由所述突变型微生物产生的总脂肪酸包含10％或更少的二十二 碳五烯酸(DPA)，并且任选地至少1％、至少2％、或至少3％的 DPA；

由所述微生物产生的DHA与DPA的比率是至少3.5:1或至少 4:1，并且任选地小于10:1的DHA:DPA；

由所述突变型微生物产生的总脂肪酸包含少于2％或少于1％的 花生四烯酸(ARA)，并且任选地0％的ARA；

由所述突变型微生物产生的总脂肪酸包含少于1％或少于0.5％的 二十碳五烯酸(EPA)，并且任选地多于0％的EPA；以及

由所述突变型微生物产生的总脂肪酸包含至少10％、至少 12％、至少20％、至少25％、或至少30％的肉豆蔻酸，并且任选地 少于60％或少于50％的肉豆蔻酸。

实施方案2是根据实施方案2的突变型网粘菌纲微生物，其中所 述突变型微生物是传统衍生的突变体，任选地其中所述突变体是通 过使用电离辐射、γ射线、x射线、紫外光、或化学诱变剂进行诱变 而获得的。

实施方案3是根据实施方案3的突变型网粘菌纲微生物，其中所 述突变型微生物是通过分子遗传技术产生的，任选地其中所述分子 遗传技术选自插入诱变、转位元件、同源重组以产生缺失、插入、 破坏、或基因置换；TALEN、CRISPR/cas系统、锌指核酸酶、 RNAi、反义RNA构建体、以及核糖酶。

实施方案4是根据实施方案1至3中的任一个的突变型网粘菌纲 微生物，其中所述突变型微生物包含与选自以下序列的核苷酸序列 具有至少95％、至少96％、至少97％、至少97.5％、至少98％、至少98.5％、至少99％、至少99.1％、至少99.2％、至少99.3％、至少99.4％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％、或至少 99.9％同一性的18SrDNA序列：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO: 11、以及SEQ ID NO:12。

实施方案5是根据实施方案1至3中的任一个的突变型网粘菌纲 微生物，其中所述突变型微生物包含与选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3以及SEQ ID NO:4的核苷酸序列具有至少 95％、至少96％、至少97％、至少97.5％、至少98％、至少98.5％、 至少99％、至少99.1％、至少99.2％、至少99.3％、至少99.4％、至 少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％、或至少99.9％同一 性的18SrDNA序列；以及

包含与选自SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8的核苷酸序列具有至少95％、至少96％、至少97％、至少 97.5％、至少98％、至少98.5％、至少99％、至少99.1％、至少 99.2％、至少99.3％、至少99.4％、至少99.5％、至少99.6％、至少 99.7％、至少99.8％、或至少99.9％同一性的18SrDNA序列；以及

包含与选自SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11以 及SEQ ID NO:12的核苷酸序列具有至少95％、至少96％、至少 97％、至少97.5％、至少98％、至少98.5％、至少99％、至少 99.1％、至少99.2％、至少99.3％、至少99.4％、至少99.5％、至少 99.6％、至少99.7％、至少99.8％、或至少99.9％同一性的18SrDNA 序列。

实施方案6是根据实施方案1至6中的任一个的突变型网粘菌纲 微生物，其中所述突变型网粘菌纲微生物是属于网粘菌属、类网粘 菌属、破囊壶菌属、裂殖壶菌属、不动壶菌属、橙黄壶菌属、日本 壶菌属、迪普弗里思氏菌属或吾肯氏壶菌属中的任一个的物种。

实施方案7是以NRRL号50836保藏的菌株的突变型网粘菌纲微 生物、或其衍生物。

实施方案8是以NRRL号50837保藏的菌株的突变型网粘菌纲微 生物、或其衍生物。

实施方案9是一种微生物生物质，所述微生物生物质包含实施 方案1至18中任一个的分离的网粘菌纲微生物。

实施方案10是一种产品，所述产品包含根据实施方案9的微生 物生物质。

实施方案11是一种微生物油，其中所述微生物油的总脂肪酸的 至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、或至少38％是DHA并 且所述微生物油的脂肪酸的至少10％、至少12％、至少15％、或至 少20％是肉豆蔻酸，进一步其中满足以下情况中的一个或多个：DHA与DPA的比率是至少3.5:1或至少4:1，总脂肪酸的10％或更少 包含DPA；总脂肪酸的2％或更少或1％或更少包含ARA，以及总脂 肪酸的1％或更少或0.5％或更少包含EPA。

实施方案12是根据技术方案1的微生物油，其中所述微生物油 是从突变型微生物中分离的，任选地其中所述微生物是传统衍生的 或遗传工程化的。

实施方案13是一种产品，所述产品包含根据实施方案13或实施 方案14的微生物油，任选地其中所述产品是食品、动物饲料产品、 美容产品、或药物产品。

实施方案14是一种用于分离具有提高的脂质生产率的突变型微 生物菌株的方法，所述方法包括：将祖代菌株的微生物在包括培养 基的细胞恒稳器或恒化器中培养，所述培养基包括抑制参与脂质代 谢的酶的活性的至少一种化合物，以提供抑制剂选择的群体；以及 从所述抑制剂选择的群体中分离相对于所述祖代微生物菌株具有提 高的脂质生产率的微生物以提供具有提高的脂质生产率的衍生菌 株，任选地其中所述培养的至少一部分是在参与脂质生物合成的酶 或因子的抑制剂存在下进行的。

实施方案15是实施方案14的方法，其中对所述微生物进行诱变 程序。

实施例

实施例1：分离野生型网粘菌纲菌株。

启动了一项分离数百种微生物以评估脂质产生的收集项目。基 于经由法律许可的途径以及生物体类别的已知生物学鉴定用于采样 的野生型菌株分离群落生境。群落生境被分类为公海、河口、沿海 泻湖、红树林泻湖、潮水池、高盐地、淡水或水产养殖场。采样地 点的纬度跨越了从温带、亚热带到热带的范围。所收集的水样品包 括2升的直接样品。在一些情况下，使用10μm网进行浮游生物拖 网。从2010年到2012年收集了总共466个环境样品。温度在4℃至 61℃的范围，并且pH值在2.45至9.18的范围。溶解氧在0％至204％ 空气饱和度的范围内并且盐度在0ppt至105ppt的范围内。将所有样 品现场接种到125f/2培养基(组成：75mg/L NaNO

将接种的富集物在15℃至30℃的温度范围孵育并且随后涂铺到 含有抗生素的SWGYP或f/2琼脂上。将分离的菌落回收，在 SWGYP或f/2培养基中扩增并且进行18s rDNA的PCR扩增以确定 分离的微生物的分类学身份。

实施例2：比较分离的菌株的脂质生产率

使用Micro24微型生物反应器系统(Pall Life Sciences,Port Washington,NY)针对脂质生产率筛选分离的网粘菌纲菌株。简单地 说，形成6ml培养物，所述培养物含有培养基，所述培养基含有5 g/l酵母提取物、1.65g/l(NH

在测试阶段结束时，收获细胞并且分析等分试样的生物质和 FAME。对于生物质评估，将4ml的发酵液吸移到预称重的15ml锥 形离心管中。将含有培养物等分试样的管以3220×g离心20分钟，并 且倾出上清液。然后将沉淀物在-80℃下冷冻过夜，继而冷冻干燥16-24小时。对在内部有干燥的沉淀物的锥形离心管进行称重，并且 通过减去空管的重量来计算冻干的沉淀物的重量。通过除以等分试 样体积(4ml)将冻干的沉淀物重量标准化以获得每毫升培养物的生 物质的值。通过标准方法，使用气相色谱评估脂肪酸甲酯(FAME)以分析培养物的一式三份50μL-200μL体积等分试样的脂肪酸含 量。将培养物等分试样在1×PBS中1:10稀释，之后等分并且干燥以 用于FAME样品制备。将样品经由HT-4X GeneVac干燥并且储存在 -20℃直到准备用于脂肪酸甲酯分析为止。对于提取，将0.5mL于甲 醇中5M的氢氧化钾和0.2mL含有25ppm丁基化羟基甲苯的四氢呋 喃添加到样品中。随后，添加40μL的甲酯内标混合物，所述混合物 在正庚烷中包括2mg/mL的C11:0游离脂肪酸、2mg/mL C13:0甘油 三酯以及2mg/mL C23:0脂肪酸。在添加约0.5mL的425μm-600μm 酸洗涤玻璃珠粒之后，将样品在1200rpm下在GenoGrinder中放置7 分钟。然后将样品在80℃下加热5分钟，并且这之后在多管涡旋混 合器上在2500rpm下5分钟。然后将含有14％三氟化硼的甲醇添加到样品中并且使它们回到80℃加热块，持续30分钟。然后将样品再 次以2500rpm涡旋5分钟。最后，添加2mL的正庚烷和0.5mL的5 M氯化钠并且将样品以2500rpm最后一次涡旋5分钟。将样品剧烈 振荡以确保乳液。然后将管架以1000rpm离心1分钟，之后通过与 装备有火焰离子化检测器的7890Agilent GC配对的Gerstel MPS自动 进样器对顶层进行采样。

在这一筛选中，野生型菌株“886”和“1602”被选择为高DHA产 生菌株，如通过所产生的总FAME脂质的DHA％和DHA生产率(计 算为每升每小时产生的mg DHA)所确定(表2)。所述菌株被重新 命名为WH-5628(“886”)和WH-5554(“1602”)。

表2：在小规模发酵中网粘菌纲分离株的生产率

实施例3：细胞恒稳器选择具有提高的生长速率的壶菌变体。

使用菌株1602(WH-05554)接种具有基本培养基的0.5L细胞 恒稳器，所述基本培养基含有17g/l的速溶海洋盐(Aquatic Eco Systems，Apopka，FL)、10g/l右旋糖、1.65g/l硫酸铵、1g/l的磷 酸二氢钾以及0.5g/l氯化钾。细胞恒稳器由Infors发酵罐(Bottmingen/Basel,Switzerland)、MSP连续流式细胞分析准备系统 (flowcytoprep)(Shoreview,MN)以及Accuri细胞计数器组成。将 发酵保持在30℃下，并且通过添加0.5M氢氧化钠和0.5M磷酸使 pH在pH 5.8保持稳定。在5天的过程中将细胞浓度在每毫升500,000个细胞下保持恒定。稀释速率最初是0.1/小时，但是在第4天和第5 天期间增加到超过0.5/小时。在第5天，中断发酵，并且将发酵罐培 养物的等分试样涂铺。在将平板在30℃孵育之后，选择菌落并且从 单个菌落分离所得菌株1602-RR01。在1L发酵罐(New Brunswick) 中菌株1602-RR01的生长速率比亲本1602菌株高约20％(表3)， 并且它因此用作基线菌株用于后续的诱变实验。

表3：原始1602分离株和细胞恒稳器选择的衍生菌株的生长速 率。

实施例4：选择快速生长的浅蓝菌素抗性壶菌菌株。

在单独的处理中，使用四个剂量的γ辐射(25Gy、75Gy、100 Gy以及150Gy)来对菌株1602-RR01(菌株WH-5554的针对快速生 长所选择的分离株(实施例3))的400×10

在24小时Micro24培养期结束时，取出培养物的等分试样以评 估生物质和脂肪酸(FAME脂质)，如实施例3中所提供。观测到几 种衍生菌株相对于原始菌株1602具有增加的FAME/TOC，以及占总 有机碳的更高百分比的DHA。

在培养期间TOC、FAME脂质以及DHA的倍数变化提供于图3 中。证实在24小时培养期内几种衍生菌株比1602祖代菌株具有在总 有机碳、FAME脂质以及DHA方面更快的增加。克隆 1602-RR02-20-2(从20μg/ml浅蓝菌素琼脂平板分离)在Micro24发 酵罐中表现最好，表现出特别好的FAME和DHA生产率。这种浅蓝 菌素抗性菌株在更大体积的发酵中，在生物质和DHA生产率这两方 面也胜过野生型菌株，并且被给予名称NH-5574。

实施例5：选择快速生长的三氯生抗性壶菌菌株。

在单独的处理中，使用五个剂量的γ辐射(25Gy、75Gy、100 Gy、150Gy以及250Gy)来对菌株NH-5574(在实施例4中针对浅 蓝菌素抗性所选择的菌株)的400×10

表4：在小规模发酵中网粘菌纲分离株的生产率

对由菌株WH-5554和NH-5783产生的脂肪酸的独立分析的描绘 提供于图4中，示出了NH-5783与祖代菌株相比具有占FAME的更 高百分比的DHA(31％相较于26％)，而菌株NH-5783(4.01)中 DHA与DPA的比率与野生型祖代菌株WH-5554(4.37)中的比率大 致相同。还值得注意的是，在NH-5783中肉豆蔻酸显著增加，它占 FAME的百分比是野生型祖代菌株WH-5554中的百分比的超过两 倍。

实施例6：UV处理DHA产生的进一步增强的菌株

将在实施例5中分离的NH-5783菌株的4亿个细胞涂铺到四个 20cm×20cm琼脂平板上并且使细胞贴壁2小时。使这四个平板暴露 于四个剂量的UV辐射(3000μJ/cm

表5：菌株的脂肪酸组成

实施例7：野生型分离菌株WH-5554和传统改良的衍生菌株的 脂质生产率的比较。

使用Micro24微型生物反应器系统(Pall Life Sciences,Port Washington,NY)针对DHA生产率筛选传统改良的菌株。简单地 说，使用6ml含有培养基的培养物，所述培养基含有1.65g/l (NH

使用来自摇瓶的每一种菌株的对数中期培养物将6ml培养物相 对于1.4的起始OD740归一化。将Micro24发酵物在30℃下在600 rpm搅拌下孵育23小时。将每一种菌株在一式两份培养物中发酵。 溶解氧浓度是饱和度的10％。在发酵开始和结束时，收获细胞并且分析等分试样的TOC、FAME、葡萄糖以及铵。来自传统改良菌株 的Micro24小规模发酵数据的实例示于表6中。经过两次诱变和细胞 恒稳器选择的菌株NH-5783相对于它的祖代菌株WH-5554具有显著 增加的DHA占脂肪酸的百分比以及DHA生产率。NH-5783的经过 UV处理的衍生物(NH-6161和NH-61681)表现出DHA占FAME 的百分比和DHA产生速率的进一步显著增加。

表6：在小规模发酵中传统改良的菌株的DHA生产率。

实施例8：分离的菌株的系统发育。

根据Tsui等人(Molecular Phylogenetics and Evolution 50:129-140 (2007))研究三个基因座，即18SrDNA、肌动蛋白以及β-微管蛋白以 建立系统发育树。在分析中包括所有的破囊壶菌参考属，除了博科 斯氏菌属某种(Biocosoeca sp.)和Caecitellus某种(Caecitellus sp) 以外。对于每一个基因座，进行四种树构建方法：最大似然法、最 大简约法、最小进化法以及邻接法。为了方便起见，在图5中只提 供了用于18S rDNA序列的最严格方法(最大似然法)。成对距离结 果证实了菌株WH-5554与WH-5628之间的密切关系。与这些菌株的 亲缘关系最近的似乎是红树林橙黄壶菌(Aurantiochytrium mangrovei) (基原异名：红树林裂殖壶菌(Schizochytrium mangrovei))。裂殖 壶菌属某种ATCC 20888也与菌株WH-5554和WH-5628密切相关， 尽管不如红树林橙黄壶菌那么密切相关。

基于这三个遗传基因座的条形码空位(barcoding gap)差异，本 文被命名为WH-5554和WH-5628并且以NRRL-50834(菌株 WH-5554)和NRRL-50835(菌株WH-5628)保藏在ARS培养物保 藏中心的新分离株被提出为橙黄壶菌属物种。成对距离结果证实了 菌株WH-5554与WH-5628之间的密切关系。

新分离的菌株的脂质谱证实了这一点。Yokoyama和Honda (Mycoscience 48:199-211(2007))将橙黄壶菌属物种定义为具有占 FAME脂质的5％或更少的花生四烯酸(ARA)以及占FAME脂质高 达约80％的DHA。相反，裂殖壶菌属物种具有占FAME的约20％的 ARA含量。表7提供了从NH-6161分离的粗制微生物油的脂肪酸组 成的分析结果。

表7：粗制微生物油中的脂肪酸(FAME％)

此外，对分离菌株WH-5628和衍生自分离菌株WH-5554的菌株 NH-5783(参见实施例6)的类胡萝卜素的分析证实这两种菌株均产 生类胡萝卜素海胆酮、角黄素、绿蝇黄质(phoenicoxanthin)以及虾 青素(表8和图6)，这些物质是橙黄壶菌属物种的特征，但是在裂 殖壶菌属物种中是缺少的(Yokoyama和Honda(2007))。

表8：网粘菌纲分离株的类胡萝卜素含量

最后，在营养生长期间用显微镜观测分离菌株WH-5628和 WH-5554衍生的菌株NH-5783的细胞(图7)。与由Yokoyama和 Honda(2007)对橙黄壶菌属的形态描述相一致，WH-5628和NH-5783 的营养细胞被发现分散成单细胞并且没有发现呈裂殖壶菌属的特征 性大聚集体的形式。在15℃下在液体培养基中繁殖的培养物在繁殖 60小时之后明显有色素沉着，这是与将NH-5783(以及延伸开来， 亲本菌株WH-5554)和WH-5628这两者鉴定为橙黄壶菌属而不是裂 殖壶菌属相一致的表型。

序列

SEQ ID NO:1

DNA

橙黄壶菌属某种

来自菌株WH-05554的18S rDNA片段1

SEQ ID NO:2

DNA

橙黄壶菌属某种

来自菌株WH-05554的18S rDNA片段2

SEQ ID NO:3

DNA

橙黄壶菌属某种

来自菌株WH-05554的18S rDNA片段3

SEQ ID NO:4

DNA

橙黄壶菌属某种

来自菌株WH-05554的18S rDNA片段4

SEQ ID NO:5

DNA

橙黄壶菌属某种

来自菌株NH-05783的18S rDNA片段1

SEQ ID NO:6

DNA

橙黄壶菌属某种

来自菌株NH-05783的18S rDNA片段2

SEQ ID NO:7

DNA

橙黄壶菌属某种

来自菌株NH-05783的18S rDNA片段3

SEQ ID NO:8

DNA

橙黄壶菌属某种

来自菌株NH-05783的18S rDNA片段4

SEQ ID NO:9

DNA

橙黄壶菌属某种

来自菌株NH-06161的18S rDNA片段1

SEQ ID NO:10

DNA

橙黄壶菌属某种

来自菌株NH-06161的18S rDNA片段2

SEQ ID NO:11

DNA

橙黄壶菌属某种

来自菌株NH-06161的18S rDNA片段3

SEQ ID NO:12

DNA

橙黄壶菌属某种

来自菌株NH-06161的18S rDNA片段4

序列表

<110> 合成基因组股份有限公司

R·R·拉达科维斯

M·L·尚帕涅

G·V·托莱多

J·沃德

<120> 用于生产二十二碳六烯酸的网粘菌纲菌株

<130> SGI1710-2WO

<150> US 62/002,107

<151> 2014-05-22

<160> 12

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 724

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 橙黄壶菌属某种

来自菌株WH-05554的18S rDNA片段1

<220>

<221> 不能用任何其它的特征关键词表述的具有生物学意义的区域；新的或少见的特征

<222> (641)..(641)

<223> n是a、c、g或t

<400> 1

tccgcaggtt cacctacgga aaccttgtta cgacttcacc ttcctctaaa caataagatt 60

cacccgagtt ctgcctctgt ccaaaaatta atccaaacag aaacatccca tggtttcatc 120

ggaccgttca atcggtaggt gcgacgggcg gtgtgtacaa agggcaggga cgtattcaat 180

gcaagctgat gacttgcgtt tactaggaat tcctcgttgg agattaataa ttgcaaaaat 240

ctagccccag cacgatgagc gttccaagga ttagccaggc cttccgacca agcactcaat 300

tccattaaaa tagaattaaa acccgatgaa cccatcagtg tagcgcgcgt gcggcccaga 360

acatctaagg gcatcacaga cctgttattg cctcgaactt cctgcccgta aaccggacat 420

gtccctctaa gaagttaaaa acgtactatg ttgccatacc acgcactatt tagtaggccg 480

aggtctcgtt cgttaacgga attaaccaga caaatcactc caccaactaa gaacggccat 540

gcaccaccac ccatagaatc atgaaagagc tctcaatctg tcaatcctac ctatgtctgg 600

acctggtaag ttttcccgtg ttgagtcaaa ttaagccgca ngctccactc ctggtggtgc 660

ccttccgtca attcctttaa gtttcagcct tgcgaccata ctccccccgg aacccaaaga 720

cttt 724

<210> 2

<211> 955

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 橙黄壶菌属某种

来自菌株WH-05554的18S rDNA片段2

<220>

<221> 不能用任何其它的特征关键词表述的具有生物学意义的区域；新的或少见的特征

<222> (124)..(124)

<223> n是a、c、g或t

<400> 2

tctagcccca gcacgatgag cgttccaagg attagccagc cttccgacca agcactcaat 60

tccaaaaaat agaattaaaa cccgatgaac ccatcagtgt agcgcgcgtg cggcccagaa 120

catntaaggg catcacagac ctgttattgc ctcgaacttc ctgcccgtaa accggacatg 180

tccctctaag aagtaaaaac gtactatgtt gccataccac gcactattta gtaggccgag 240

gtctcgttcg ttaacggaat taaccagaca aatcactcca ccaactaaga acggccatgc 300

accaccaccc atagaatcat gaaagagctc tcaatctgtc aatcctacct atgtctggac 360

ctggtaagtt ttcccgtgtt gagtcaaatt aagccgcagg ctccactcct ggtggtgccc 420

ttccgtcaat tcctttaagt ttcagccttg cgaccatact ccccccggaa cccaaagact 480

ttgatttctc atgtgctgct gctgaggccc atagaataaa gcacccaaca atcgcaagtc 540

ggcatcgttt acggtctaga ctacgatggt atctaatcat cttcgatccc cagactttcg 600

ttcttgatta atgaaaacat gcttggtaaa tgccttcgct ctagttcgtc tttcggaaat 660

ccaagaattt cacctctagc tcctaaatac gaataccccc aactgttcct attaaccatt 720

actcaggcgt gcaaaccaac aaaatagcac ccaagtccta tcttatcatc ccataataaa 780

cataccggtc atacgacctg cttggaacac tctgctttga ttacagtgaa agatttctca 840

tcaataaaga aaagaaaaag atggccaagg caacacagac aatcaatccc cattcaggga 900

aagcaccggt cgcccatgcc agaaattcaa ctacgagctt tttaactgca acaac 955

<210> 3

<211> 902

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 橙黄壶菌属某种

来自菌株WH-05554的18S rDNA片段3

<400> 3

tttgatttct catgtgctgc tgctgaggcc catataaaaa agcacccaac aatcgcaagt 60

cggcatcgtt tacggtctag actacgatgg tatctaatca tcttcgatcc ccagactttc 120

gttcttgatt aatgaaaaca tgcttggtaa atgccttcgc tctagttcgt ctttcggaaa 180

tccaagaatt tcacctctag ctcctaaata cgaatacccc caactgttcc tattaaccat 240

tactcaggcg tgcaaaccaa caaaatagca cccaagtcct atcttatcat cccataataa 300

acataccggt catacgacct gcttggaaca ctctgctttg attacagtga aagatttctc 360

cccaataaag aaaagaaaaa gatggccaag gcaacacaga caatcaatcc ccattcaggg 420

aaagcaccgg tcgcccatgc cagaaattca actacgagct ttttaactgc aacaacttta 480

gcatatgctt ctggagctgg aattaccgcg gctgctggca ccagacttgc cctccagttg 540

atcctcgatg agggttttac attgctctca ttccgatagc aaaacgcata cacgcttcgc 600

atcgatattt ctcgtcacta cctcgtggag tccacagtgg gtaatttacg cgcctgctgc 660

tatccttgga tatggtagcc gtctctcagg ctccctctcc ggagtcgagc cctaactctc 720

cgtcacccgt tatagtcacc gtagtccaat acactaccgt cgacaactga tggggcagaa 780

actcaaacga ttcatcgacc aaaaatagtc aatctgctca attatcatga ttcaccaata 840

aaatcggctt caatctaata agtgcagccc catacagggc tcttacagca tgtattattt 900

cc 902

<210> 4

<211> 711

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 橙黄壶菌属某种

来自菌株WH-05554的18S rDNA片段4

<400> 4

actctgcttt gattacagtg aaagatctca taccaaaaaa tagcatgaga aagatggcca 60

aggcaacaca gacaatcaat ccccattcag ggaaagcacc ggtcgcccat gccagaaatt 120

caactacgag ctttttaact gcaacaactt tagcatatgc ttctggagct ggaattaccg 180

cggctgctgg caccagactt gccctccagt tgatcctcga tgagggtttt acattgctct 240

cattccgata gcaaaacgca tacacgcttc gcatcgatat ttctcgtcac tacctcgtgg 300

agtccacagt gggtaattta cgcgcctgct gctatccttg gatatggtag ccgtctctca 360

ggctccctct ccggagtcga gccctaactc tccgtcaccc gttatagtca ccgtagtcca 420

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caatctgctc aattatcatg attcaccaat aaaatcggct tcaatctaat aagtgcagcc 540

ccgtacaggg ctcttacagc atgtattatt tccagaatta ctgcaggtat ccatataaaa 600

gaaactaccg aagaaattat tactgatata atgagccgtt cgcagtctca cagtacaatc 660

gcttatactt acacatgcat ggcttaatct ttgagacaag catatgacta c 711

<210> 5

<211> 672

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 橙黄壶菌属某种

来自菌株NH-05783的18S rDNA片段1

<220>

<221> 不能用任何其它的特征关键词表述的具有生物学意义的区域；新的或少见的特征

<222> (638)..(638)

<223> n是a、c、g或t

<400> 5

tccgcaggtt cacctacgga aaccttgtta cgacttcacc ttcctctaaa caataagatt 60

cacccgagtt ctgcctctgt ccaaaaatca atccaaacag aaacatccca tggtttcatc 120

ggaccgttca atcggtaggt gcgacgggcg gtgtgtacaa agggcaggga cgtattcaat 180

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tccaaaaatg aaattaaaac ccgatgaacc catcagtgta gcgcgcgtgc ggcccagaac 360

atctaagggc atcacagacc tgttattgcc tcgaacttcc tgcccgtaaa ccggacatgt 420

ccctctaaga agtaaaaacg tactatgttg ccataccacg cactatttag taggccgagg 480

tctcgttcgt taacggaatt aaccagacaa atcactccac caactaagaa cggccatgca 540

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tggtaagttt tcccgtgttg agtcaaatta agccgcangc tccactcctg gtggtgccct 660

tccgtcaatt cc 672

<210> 6

<211> 897

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 橙黄壶菌属某种

来自菌株NH-05783的18S rDNA片段2

<400> 6

cactcaattc caaaaatgaa attaaaaccc gatgaaccca tcagtgtagc gcgcgtgcgg 60

cccagaacat ctaagggcat cacagacctg ttattgcctc gaacttcctg cccgtaaacc 120

ggacatgtcc ctctaagaag taaaaacgta ctatgttgcc ataccacgca ctatttagta 180

ggccgaggtc tcgttcgtta acggaattaa ccagacaaat cactccacca actaagaacg 240

gccatgcacc accacccata gaatcatgaa agagctctca atctgtcaat cctacctatg 300

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caagtcggca tcgtttacgg tctagactac gatggtatct aatcatcttc gatccccaga 540

ctttcgttct tgattaatga aaacatgctt ggtaaatgcc ttcgctctag ttcgtctttc 600

ggaaatccaa gaatttcacc tctagctcct aaatacgaat acccccaact gttcctatta 660

accattactc aggcgtgcaa accaacaaaa tagcacccaa gtcctatctt atcatcccat 720

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<210> 7

<211> 975

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 橙黄壶菌属某种

来自菌株NH-05783的18S rDNA片段3

<220>

<221> 不能用任何其它的特征关键词表述的具有生物学意义的区域；新的或少见的特征

<222> (912)..(913)

<223> n是a、c、g或t

<400> 7

tttgatttct catgtgctgc tgctgaggcc cataaataaa gcacccaaca atcgcaagtc 60

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cctataaaga aaagaaaaag atggccaagg caacacagac aatcaatccc cattcaggga 420

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atccttggat atggtagccg tctctcaggc tccctctccg gagtcgagcc ctaactctcc 720

gtcacccgtt atagtcaccg tagtccaata cactaccgtc gacaactgat ggggcagaaa 780

ctcaaacgat tcatcgacaa aaatagtcaa tctgctcaat tatcatgatt caccaataaa 840

atcggcttca atctaataag tgcagcccca tacagggctc ttacagcatg tattatttcc 900

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gccgttcgca gtctc 975

<210> 8

<211> 637

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 橙黄壶菌属某种

来自菌株NH-05783的18S rDNA片段4

<400> 8

atcaatcccc attcagggaa agcaccggtc gcccatgcca gaaattcaac tacgagcttt 60

ttaactgcaa caactttagc atatgcttct ggagctggaa ttaccgcggc tgctggcacc 120

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acaactgatg gggcagaaac tcaaacgatt catcgactaa aaaagtcaat ctgctcaatt 420

atcatgattc accaataaaa tcggcttcaa tctaataagt gcagccccat acagggctct 480

tacagcatgt attatttcca gaattactgc aggtatccat ataaaagaaa ctaccgaaga 540

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<210> 9

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 橙黄壶菌属某种

来自菌株NH-06161的18S rDNA片段1

<220>

<221> 不能用任何其它的特征关键词表述的具有生物学意义的区域；新的或少见的特征

<222> (639)..(639)

<223> n是a、c、g或t

<400> 9

tccgcaggtt cacctacgga aaccttgtta cgacttcacc ttcctctaaa caataagatt 60

cacccgagtt ctgcctctgt ccaaaaatca atccaaacag aaacatccca tggtttcatc 120

ggaccgttca atcggtaggt gcgacgggcg gtgtgtacaa agggcaggga cgtattcaat 180

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<210> 10

<211> 907

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 橙黄壶菌属某种

来自菌株NH-06161的18S rDNA片段2

<400> 10

cgaccaagca ctcaattcca aaaattgaaa ttaaaacccg atgaacccat cagtgtagcg 60

cgcgtgcggc ccagaacatc taagggcatc acagacctgt tattgcctcg aacttcctgc 120

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 橙黄壶菌属某种

来自菌株NH-06161的18S rDNA片段3

<400> 11

aagactttga tttctcatgt gctgctgctg aggcccatat aataaagcac ccaacaatcg 60

caagtcggca tcgtttacgg tctagactac gatggtatct aatcatcttc gatccccaga 120

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ctctccgtca cccgttatag tcaccgtagt ccaatacact accgtcgaca actgatgggg 780

cagaaactca aacgattcat cgactcaaaa agtcaatctg ctcaattatc atgattcacc 840

aataaaatcg gcttcaatct aataagtgca gccccataca gggctcttac agcatgtatt 900

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<210> 12

<211> 708

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 橙黄壶菌属某种

来自菌株NH-06161的18S rDNA片段4

<400> 12

tctgctttga ttacagtgaa aagatctcat accaaaatag catgagaaag atggccaagg 60

caacacagac aatcaatccc cattcaggga aagcaccggt cgcccatgcc agaaattcaa 120

ctacgagctt tttaactgca acaactttag catatgcttc tggagctgga attaccgcgg 180

ctgctggcac cagacttgcc ctccagttga tcctcgatga gggttttaca ttgctctcat 240

tccgatagca aaacgcatac acgcttcgca tcgatatttc tcgtcactac ctcgtggagt 300

ccacagtggg taatttacgc gcctgctgct atccttggat atggtagccg tctctcaggc 360

tccctctccg gagtcgagcc ctaactctcc gtcacccgtt atagtcaccg tagtccaata 420

cactaccgtc gacaactgat ggggcagaaa ctcaaacgat tcatcgacca aaaaagtcaa 480

tctgctcaat tatcatgatt caccaataaa atcggcttca atctaataag tgcagcccca 540

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tatacttaca catgcatggc ttaatctttg agacaagcat atgactac 708