一种载脂蛋白J活性的测定方法

摘要

本发明提供了一种载脂蛋白J活性的测定方法，向谷胱甘肽S‑转移酶中加入适量的载脂蛋白J，通过测定谷胱甘肽S‑转移酶在热处理条件处理前、后的比活的变化来计算载脂蛋白J的活性。本发明首次利用载脂蛋白J能够抑制蛋白在加热后形成聚集和沉淀的特性，通过检测在加热前后谷胱甘肽S‑转移酶的活性变化，来测定载脂蛋白J的比活性，相关操作简单，精确度高。

说明书

技术领域

本发明涉及检测技术领域，特别涉及一种载脂蛋白J活性的测定方法。

背景技术

载脂蛋白J(ApoJ,又称clusterin)是一种多功能的糖蛋白，广泛存在于人体多种组织及体液中。载脂蛋白J是一种相对分子质量为75～80KDa的异质二聚体蛋白质，能够与人血浆高密度脂蛋白(HDL)和极高密度脂蛋白(VHDL)相结合。载脂蛋白J的功能复杂，参与包括补体功能的调节、抑制凋亡和炎症、参与脂质的运输等多种体内生理过程，目前已经发现载脂蛋白J在多种疾病过程中都有高度表达，如神经退行性病变、动脉粥样硬化、心肌梗死、肿瘤等。

分子伴侣是一类与其他蛋白不稳定构象相结合并使之稳定的蛋白，它们通过控制结合和释放来帮助被结合多肽在体内的折叠、组装、转运或降解等。1997年有报道称，载脂蛋白J启动子中的一个14bp的元件，其序列在脊椎动物中是严格保守的，被转录因子HSF1特异性识别，并能在瞬时表达分析中介导热休克诱导的转录，这说明载脂蛋白J是一种热休克蛋白。载脂蛋白J和小热休克蛋白(sHsps)是一类功能相似的分子伴侣蛋白，尽管它们之间缺乏明显的序列相似性。这两个分子伴侣蛋白都能有效地阻止目标蛋白在应激条件下的形成聚集和沉淀，如升高的温度、还原和氧化。研究表明，ApoJ蛋白可以抑制蛋白淀粉样变性聚集相关途径，这些淀粉样变性聚集蛋白包括谷胱甘肽S-转移酶(GST)等蛋白。例如在生理浓度下，载脂蛋白J能有效保护谷胱甘肽S-转移酶和过氧化氢酶不受热沉淀的影响，并能有效保护α-乳蛋白和牛血清白蛋白不受二硫苏糖醇还原沉淀的影响。除此之外，载脂蛋白J还能够抑制未稀释的人血清中应激诱导的蛋白质沉淀。载脂蛋白J通过不依赖ATP的机制发挥分子伴侣作用，不可逆地与应激蛋白结合形成可溶的高分子量复合物，保持受体蛋白空间稳定，减少由于环境因素导致受体蛋白错误折叠。在此过程中，它们作用于缓慢的、不折叠的蛋白质途径。这两种蛋白的构象动态和聚集状态可能对其伴侣功能起着至关重要的作用。亚基交换可能在调节伴侣作用中起重要作用；蛋白质的游离形式可能是体现伴侣活性的主要形态，而非聚集状态。

GST在生物体内是一种重要的解毒酶系，其催化外源或内源性毒素与谷胱甘肽结合，形成易溶于水或毒性较小的化合物排除体外，从而保护机体的正常功能。Amy R.Wyatt等人发现ApoJ蛋白能够显著性抑制GST因热处理而变性聚集，从而保持GST的空间构象。但是没有指出载脂蛋白J是否对GST的酶活性也有保护作用。Rebecca A等人提供一个定量描述蛋白热变性实验方法，即在高温处理环境中，GST将因热聚集变性形成蛋白错误折叠聚集，且蛋白聚集程度在360nm处有最大光吸收值。故而360nm吸光值可以反映GST聚集折叠程度或者热变性程度。GST活性测定原理是在GST的催化下1,2-二氯-4-硝基苯(CDNB)分子上的氯原子与谷胱甘肽上的巯基发生亲电反应，产物在340nm、344nm处有吸收，通过紫外分光光度计可以进行酶活测定。为验证载脂蛋白J保护GST活性，我们利用此方法检测加热后在载脂蛋白J存在的情况下，GST活性的变化，并在此基础上建立了一套用于测定载脂蛋白J活性的方法。

发明内容

有鉴于此，本发明旨在提出一种载脂蛋白J活性的测定方法，利用载脂蛋白J具有类似热激蛋白的分子伴侣功能能够抑制蛋白在加热后形成聚集和沉淀的作用，通过检测在加热处理过程中GST的活性变化情况来定义载脂蛋白J的活性，以解决目前尚没有快速、准确测定载脂蛋白J活性方法的问题。

为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：

一种载脂蛋白J活性的测定方法，向GST中加入适量的载脂蛋白J，通过测定GST在热处理条件处理前、后的比活的变化来计算载脂蛋白J的活性。所述载脂蛋白J可以使天然载脂蛋白，也可以是重组表达的载脂蛋白。

进一步的，所述测定方法包括：S1、取载脂蛋白J和GST按至少3个不同比例混合均匀，补加PB缓冲液至一定体积；优选的，选择5-9个不同比例的载脂蛋白J和GST进行混合；更优选的，加入同一浓度的GST，按照GST浓度加入不同比例的载脂蛋白J进行混合；S2、升温进行热处理，例如40-80℃加热3-10min；S3、测定加热前、后GST的酶活并计算GST相应的比活；S4、根据测得的GST比活与载脂蛋白J的浓度关系进行拟合，按加热前GST初始比活的1/2即EC50对应载脂蛋白J的浓度为1unit/ml，计算载脂蛋白J的比活。

更进一步的，所述热处理条件为40-80℃加热3-30min。所述热处理条件可以是40℃、50℃、60℃、70℃、80℃水浴处理，加热时间可以是3min、5min、10min、20min或30min。

进一步的，步骤S3中GST酶活的测定方法为：

S31、向pH6.50.2M磷酸缓冲液加入0.25ml 20mM CDNB溶液及0.5ml 10mM GSH溶液，并加水稀释至V

S32、将配制好的底物反应液放置进行20-30℃预热；所述预热温度可以是20℃、22℃、24℃、26℃、28℃或30℃。

S33、取待测酶液加到预热的底物反应液中，开始计时，迅速吹打均匀后，各取V

S34、按如下公式计算GST的酶活：GST

更进一步的，GST比活的计算公式为：GST

进一步的，步骤S33中每次检测吸光度前震荡2s。也可以根据具体情况震荡1s或3s。

进一步的，步骤S4中根据测得的GST比活与载脂蛋白J的浓度关系进行拟合为以GST比活为y轴，载脂蛋白J的浓度为x轴，进行S型曲线拟合。

更进一步的，载脂蛋白J的酶活是指按GST活性EC50对应的载脂蛋白J的浓度的酶活定义为1unit/ml。

进一步的，步骤S1中PB缓冲液的浓度为20mM，pH7.4。

进一步的，步骤S2为60℃加热5min后冷却至室温。

优选的，采用试剂包含：1)PB缓冲溶液：pH 6.5的0.2M PB、pH 7.4的0.02M PB；2)载脂蛋白J及其溶剂；3)1mg/mlGST溶液，用20mM，pH7.4的PB缓冲液配制；4)1mg/ml的BSA(牛血清白蛋白)溶液，用20mM，pH7.4的PB缓冲液配制；5)20mM 1-氯2,4-二硝基苯溶液(CDNB)；6)10mM GSH溶液，临用前配制。在没有特殊说明的情况下，本申请所述试剂均为本领域技术人员按常规方法制备的试剂。

优选的，采用如下步骤进行测定：1)热聚集处理

A.将载脂蛋白J和GST按照不同的比例混合均匀，用20mM，pH7.4的PB缓冲液补至相同体积，吹打混合均匀；

B.保留部分加热前样品测波长360nm处OD值与GST酶活测定；

C.60℃加热5min，待加热完成后室温冷却；稍微离心，混合均匀后准备测波长360nm处OD值与GST活性检测。

上述GST酶活采用如下方法测定：

A.制底物反应液的配制：分别取5ml pH6.5,0.2M磷酸缓冲液,分别在加入0.25ml20mM CDNB溶液，0.5ml 10mM GSH溶液，并加水稀释至10ml，临用前配制；作为优选，使用时间超过1h后重新配制。

B.打开酶标仪，设置实验参数，温度25℃，波长340nm，检测前震荡2s，放入酶标板。

C.反应底物预热：打开金属浴或水浴锅，温度设定为25℃，将配制好的底物反应液放置于金属浴或水浴锅上预热，按需分配。作为优选，底物反应液使用时间≤1h。

D.GST本底酶活测定：取待测酶液加到预热好底物溶液中，开始计时，迅速吹打均匀后，各取200ul待测液，加到酶标板上的两个孔中。测定反应1分钟和若干分钟后的吸光值，记录数据。

定义：在25℃、pH6.5时，底物CDNB及GSH的终浓度均为1mmol/L条件下每分钟催化1umolCDNB与GSH结合为一个酶活性单位。

GST

GST

其中，上述公式中参数如下：ΔA

将上述参数代入后可得：

GST

GST

2)载脂蛋白J活力单位的计算

以测得GST比活为y轴，载脂蛋白J的浓度为x轴，做S型拟合曲线。载脂蛋白J活力单位的定义：按GST比活的1/2为EC50，所述EC50对应的载脂蛋白J的浓度的酶活定义为1unit/ml，按公式换算得到载脂蛋白J的比活：1/Cpr(x)＝1/x(U/mg)，其中x代表载脂蛋白J浓度。

相对于现有技术，本发明所述的载脂蛋白J活性的测定方法具有以下优势：

(1)本发明所述的测定方法首次利用载脂蛋白J具有类似热激蛋白的分子伴侣功能能够抑制蛋白在加热后形成聚集和沉淀的作用，通过检测加入一定量的载脂蛋白J在加热处理前、后谷胱甘肽S-转移酶的活性变化，来定义载脂蛋白J的活性。

(2)本发明创新性的公开一种载脂蛋白J的测定方法，能够定量反映载不同来源、不同批次载脂蛋白J的质量差异，所述的测定方法便于操作、精确度高。

所述的载脂蛋白J活性的测定方法在测定天然/重组载脂蛋白J活性中的运用。

附图说明

图1实施例1中不同载脂蛋白J浓度下GST热聚集效果图；

图2为实施例1中GST比活与载脂蛋白J浓度的拟合图；

图3为实施例2中GST比活与载脂蛋白J浓度的拟合图。

具体实施方式

下面结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案作进一步描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有付出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

实施例1：检测重组人载脂蛋白J的活性

1.1溶液配制：

配制上述所有溶液，牛源GST酶及BSA自sigma公司购入；

重组载脂蛋白J溶剂(GSH缓冲液)配制：用20mM，pH7.4的PB缓冲液，加入58.8g的二水合柠檬酸钠，1.54g的GSH和0.61g的L-Cys，用NaOH/HCL调节pH值至7.4，最后用20mM，pH7.4的PB缓冲液定容1L体积；

重组载脂蛋白J为本公司某个批次产品浓度为：1.53mg/ml。

1.2热聚集实验

1)按照实验需求配制不同比例反应点，加样表示例如下：

样品终浓度比例表(1:1)

操作表例如(GST:载脂蛋白J)

备注：此处载脂蛋白J浓度为1.53mg/ml，BSA浓度为1.0mg/ml，GST为1mg/ml；

根据不同的比例配制GST：载脂蛋白J、GST：BSA溶液后，混合均匀，留下一部分检测OD360及加热前GST活性，剩余部分测加热处理；

60℃加热5min，待加热完成后室温冷却；

稍微离心，如100-3000rpm离心3min，混合均匀后测OD

以载脂蛋白J浓度为X轴，OD

1.3GST活性检测

样品为上面热聚集实验中保留的加热前及加热后样品

酶活测定底物反应液配制：分别取5ml pH6.5，0.2M磷酸缓冲液,分别在加入0.25ml 20mM CDNB溶液，0.5ml 10mM GSH溶液，并加水稀释至10ml；

按12.5ul待测酶液加487.5ul底物反应液的比例加样，混合均匀，酶标板上每孔加入200ul反应液；

检测反应1min和5min后波长340nm处OD值，测定各个比例点加热前后的GST活性；

记录数据，并按照公式计算：V样＝0.0005mL，GST终浓度为0.1875mg/ml

GST

GST

载脂蛋白J活性计算：如图2所示，按照GST比活为Y轴，载脂蛋白J的使用量为X轴，将加热处理后的GST活性数据用Origin做S型曲线图。以GST加热前测定初始比活的1/2为EC50，根据S型曲线对应的拟合公式：y＝A

按活力定义可知：当载脂蛋白J浓度为0.153mg/ml时活力为1unit/ml，按公式换算，该载脂蛋白J的比活为1/0.153＝6.5U/mg；

实施例2：检测重组人载脂蛋白J的活性

取另一批次载脂蛋白J样品，蛋白浓度2.2mg/ml；样品按实施例1相同的方法设置不同浓度比例，进行热处理及GST测酶活；

如图3所示，按照GST比活为Y轴，载脂蛋白J的不同浓度为X轴，将加热处理后的GST活性数据用Origin做S型曲线图。以加热前GST的初始比活的1/2为EC50，根据曲线的拟合公式得到EC50对应的X轴上的浓度值为0.099199mg/ml；

按活力定义，当载脂蛋白J浓度为0.099199mg/ml时对应的载脂蛋白J的活力为1unit/ml，按公式换算的到该载脂蛋白J的比活为1/0.099199＝10.08U/mg。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。