脂蛋白代谢中活性蛋白的结构与功能 1.载脂蛋白AV（apoAV）的功能;2.载脂蛋白AV（apoAV）基因多态性与冠心病

摘要

本文主要研究了两方面内容：第一部分：载脂蛋白AV对细胞和模型动物甘油三酯代谢的影响 流行病学研究表明高甘油三酯血症(hypertriglyceridemia，HTG)是冠心病(coronaryarterydisease，CAD)的独立危险因素。HTG常伴有向心性肥胖，胰岛素抵抗所致的糖耐量异常，以及血浆HDL-C的降低和小而密LDL的升高，因此被认为是整体的糖、脂及能量代谢紊乱的标记而受到越来越多的重视。 载脂蛋白AV(apolipoproteinAV，apoAV)是2001年发现的新基因。ApoAV基因敲除小鼠的血浆甘油三酯(TG)水平约是正常对照的四倍，相反，转入人ApoAV基因的小鼠，其血浆TG水平下降66％，提示apoAV可能参与体内TG的代谢，成为迄今为止发现的对血浆TG水平影响最明显的生理因子之一。ApoAV基因突变导致的功能缺陷可引起严重的HTG。ApoAV降低TG的具体机制尚不清楚，推测可能对内源性VLDL－TG的生成速率和体内TGRLs的分解速率均有影响。 LPL基因敲除小鼠和ApoE基因敲除小鼠是研究脂蛋白代谢和高脂血症形成机制的两种有用的动物模型，前者由于TG分解的障碍表现为极度的HTG；后者则因肝脏对脂蛋白及其残粒的摄取减少而表现为严重的高胆固醇血症和轻度的HTG。 本研究对上述两种不同发病机制的HTG动物模型进行腺病毒介导的人ApoAV转基因治疗，比较了转基因对动物脂质代谢的影响，试图了解apoAV高表达以后是否可以改善LPL和ApoE功能缺陷所引起的小鼠血脂谱的异常升高，在此基础上进一步探讨其降脂作用的可能机理。希望上述对apoAV的功能研究，能有助于全面、深入的认识和了解HTG和心血管相关疾病的形成机理，并对临床治疗HTG和CAD提供新的思路。 我们克隆了人ApoAVcDNA的编码区，采用体外连接的方法构建重组腺病毒载体pAd-hApoAV，在HEK293A细胞中进行包装成功的获得了表达人ApoAV的重组腺病毒Ad-hApoAV。用此重组腺病毒感染HepG2细胞，real-timeRT-PCR法和Western印记法分别从mRNA水平和蛋白水平检测到了人ApoAV基因的高表达。与被表达人碱性磷酸酶的重组腺病毒(Ad-hAP)感染的对照组相比，酶法测定细胞内TG水平和总胆固醇水平无明显变化，但real-timeRT-PCR法检测到肝脏内TG合成的关键酶——二酯酰甘油乙酰转移酶1(diacylglycerolacyltrans－ferase1，DGAT1)和肝脂酶(hepaticlipase，HL)的表达被显著抑制。进一步，我们采用腺病毒介导的基因转移的方法，研究了apoAV对HTG模型动物脂质代谢的影响。将LPL基因敲除小鼠和ApoE基因敲除小鼠进行分组(LPL-/-小鼠每组n=3，ApoE-/-小鼠每组n=6)。实验组尾静脉注射2×109ifu的Ad-hApoAV，对照组注射等剂量的Ad-hAP。感染后第7天，从mRNA水平和蛋白水平在Ad-hApoAV组动物的肝脏中均检测到了人ApoAV的表达。酶法测定血浆TG和总胆固醇水平发现，人ApoAV转基因可以使LPL-/-小鼠的TG水平下降78％(P=0.02)、总胆固醇水平下降66％(P=0.03)；PEG法分离HDL后测定HDL-C水平无明显改变(P=0.35)。用放射性同位素标记法测定LPL和HL的活性，进一步证实LPL-/-小鼠体内存在LPL功能的缺陷，活性几乎为0；而且Ad-hApoAV组LPL活性和HL活性与对照组相比并无明显差异。腺病毒介导的hApoAV转基因可以同样的显著改变ApoE-/-小鼠的血浆脂质谱：Ad-ApoAV组血浆TG水平下降了72％(P=0.001)，总胆固醇水平下降了57％(P＜0.001)，HDL-C水平无明显改变(P=0.62)。hApoAV的表达不影响ApoE-/-小鼠血浆LPL和HL的活性。我们还使用real-timeRT-PCR的方法分析了apoAV的组织表达谱，在11种组织(脑、脂肪、胆囊、心脏、小肠、肾、肝脏、骨骼肌、肺、脾脏和睾丸)中，发现ApoAV除了在肝脏中高表达以外，在胆囊中也有特异表达。在肝脏中的表达量约是β－actin的1.38倍，在胆囊中约是β－actin表达的1/20。本研究利用表达人ApoAV的复制缺陷的重组腺病毒作为转基因工具，发现ApoAV高表达对HepG2细胞内的脂质水平无明显影响，但可在mRNA水平显著抑制DGAT1和HL的表达。腺病毒介导的人ApoAV转基因在小鼠体内LPL功能缺失的情况下仍可显著降低TG和总胆固醇水平，说明apoAV对脂质代谢的影响独立于或至少部分独立于LPL的作用。同时人ApoAV的基因治疗还可以改善小鼠因apoE功能缺陷引起的致动脉粥样硬化血脂谱，提示apoAV降低胆固醇的作用机制可能与增加肝脏对脂蛋白和残粒的清除有关。 第二部分：中国汉族人群冠心病患者载脂蛋白A5和载脂蛋白C3基因多态性的研究 血浆甘油三酯(TG)水平的升高异常是冠心病(CAD)的独立危险因素，与遗传密切相关。研究表明，血浆载脂蛋白AV(ApoAV)和载脂蛋白CⅢ(ApoCⅢ)，在TG代谢途径中发挥重要的作用，二者基因的遗传变异可显著影响血浆TG水平，从而使不同等位基因的携带者对冠心病的易感性可能不同。为获得APOA5和APOC3基因多态性在我国北方汉族冠心病患者人群中的分布特征及探讨其及其与冠心病的相关性，本研究采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)结合聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)技术，检测了312例经冠状动脉造影确诊的冠心病患者和317例健康对照组APOA5-1131T＞C和APOC3-482C＞T多态性基因型和等位基因的分布，多元Logistic回归模型校正传统的冠心病危险因素后分析基因多态性对冠心病患病风险的相关性。同时采用生化方法检测了研究对象的血脂和载脂蛋白水平。结果发现：冠心病组APOA5-1131C等位基因频率明显高于对照组(39.9％：33.3％，P=0.02)。CC纯合子患冠心病的风险与TT纯合子相比明显升高(OR=1.93，95％CI：1.12～3.32)；通过Logistic回归分析校正性别、年龄、BMI、吸烟史、高血压糖尿病患病史及血清TC、HDL-C、LDL-C水平等冠心病易感因素后，该相关性依然存在(OR=1.80，95％CI：1.04～3.13)。冠心病组TC杂合子的TG水平明显高于CC纯合子(2.33±1.97mmol/L比1.84±1.34mmol/L，P＜0.001)，而TT纯合子TG水平最高(2.67±2.36mmol/L)。APOC3－482T等位基因频率在冠心病和对照组间无统计学差异(45.2％：43.1％，P=0.45)，不同基因型对血浆TG水平无明显影响。APOA5-1131T＞C和APOC3-482C＞T多态性存在连锁不平衡，但前者与冠心病的相关性独立于后者的作用。 综上所述，APOA5-1131T＞C基因多态性对冠心病人群血浆TG水平有影响，APOA5-1131C等位基因可能与我国北方汉族人冠心病的发生相关联。APOC3－482C＞T基因多态性与冠心病的发病风险不相关。 PartⅠEffectsofApolipoproteinAVontheTGMetabolismintheHepG2CellsandHTGAnimalModels

目录

第一部分载脂蛋白AV对细胞和模型动物甘油三酯代谢的影响

前言

材料与方法

一、实验材料

二、实验方法1

二、实验方法2

一、ApoAV基因cDNA编码区的获得

二、APOA5基因的组织表达谱

三、重组腺病毒Ad-hApoAV的制备

四、Ad-hApoAV介导的转基因对HepG2细胞脂质代谢的影响

五、hApoAV转基因对APOE基因敲除小鼠脂质代谢的影响

六、重组腺病素Ad-hApoAV介导的转基因对LPL基因敲除小鼠脂代谢的影响

讨论

小结

参考文献

第二部分中国汉族人群冠心病患者载脂蛋白A5和载脂蛋白C3基因多态性的研究

前言

材料与方法

实验结果

讨论

小结

参考文献

综述载脂蛋白AV与甘油三酯代谢

英文缩略语

致谢

个人简历