一种检测牛结节性皮肤病的Cycleave荧光PCR方法

摘要

本发明提供一种Cycleave荧光PCR引物对、探针及应用该引物对和探针的检测方法；所提供的引物对和探针，其中引物对的正向引物的序列为SEQ ID NO:1，反向引物的序列为SEQ ID NO:2；探针的序列为SEQ IDNO:3。本发明所提供的Cycleave荧光PCR检测牛结节性皮肤病病毒的引物、探针及方法具有检测灵敏度高、特异性好、高通量和操作简便的优点。

说明书

技术领域

本发明属牛病病原微生物检测技术领域，具体涉及一种用于检测牛结节性皮肤病的Cycleave荧光PCR引物对、探针及应用该引物对和探针的检测方法。

背景技术

牛结节性皮肤病(Lumpy skin disease，LSD)是一种由痘病毒科(Poxviridae)、羊痘病毒属(Capripoxvirus，CaPV)的牛结节性皮肤病病毒(Lumpy skin disease virus，LSDV)引起的急性、亚急性传染病，主要特征是发热，皮肤、粘膜上结节样病变和淋巴结肿大等。

牛是该病毒的特异性宿主，发病可导致奶牛产奶量下降、公牛短暂或永久不育、怀孕牛流产、皮革损坏以及继发细菌感染导致死亡。该病曾于非洲、中东、东欧等地区多个国家流行并造成巨大经济损失。

检测时，通过发热、皮肤结节样变化、淋巴结肿大等临床症状可初步诊断该病，但其确诊需依赖实验室检测，特别是疾病处于潜伏期或前驱期时。而且患病牛产生皮肤损伤的症状易与皮肤癣病、昆虫叮咬等易混淆；发病期，患病牛结节处可呈现黏膜坏死、破溃等症状，需与口蹄疫、蓝舌病、牛病毒性腹泻、牛传染性鼻气管炎等进行鉴别。此外，还存在无临床症状的隐性感染的情况，均需进行实验室检测确诊。因此，开发快速、准确、简便的LSD特异性检测方法是防控该病的关键。

发明内容

本发明的目的是提供一种Cycleave荧光PCR引物对、探针及应用该引物对和探针的检测方法，从而实现对牛结节性皮肤病病毒特异、敏感、快速的检测。

本发明首先提供一种检测牛结节性皮肤病病毒的引物对和探针，引物对和探针序列信息如下：

牛结节性皮肤病病毒检测正向引物LSD forward：

5′-CGATACACTCTCCRATATC-3′(SEQ ID NO:1)

牛结节性皮肤病病毒检测反向引物LSD reverse：

5′-AACGAGAAGTATGAATTAGC-3′(SEQ ID NO:2)

牛结节性皮肤病病毒检测探针LSD probe：

5′-GGCC

其中，检测探针LSD probe的5′端进行羧基荧光素FAM标记，3′端进行淬灭基团Eclipse标记，下划线位置为标记的RNA位点。

上述引物和探针用于制备检测牛结节性皮肤病病毒的Cycleave荧光PCR检测体系。

进一步，本发明还提供检测牛结节性皮肤病病毒核酸的Cycleave荧光PCR 方法，包括如下的步骤：

1)Cycleave荧光PCR反应体系配制

反应液每管25μL，含有2×Cycleave PCR反应液12.5μL，5pmol/μL的LSD forward和LSD reverse各0.6μL，5pmol/μL的LSD probe 0.8μL，双蒸水8.5μL，待检测样品DNA模板2μL。其中，Cycleave PCR检测试剂盒(目录号：CY505A) 购自宝生物工程(大连)有限公司产品。

2)Cycleave荧光PCR反应体系扩增

检测反应条件设置为：95℃预变性10s；95℃变性5s，55℃退火10s， 72℃延伸20s(收集FAM信号)，共40个循环。

3)结果判定

阈值设定原则以阈值线刚好超过阴性对照品扩增曲线的最高点，或可根据仪器噪音情况进行调整。待检样品无Ct值并且无扩增曲线，结果判为阴性；待检样品Ct值≤40.0，且出现典型的扩增曲线，结果判为阳性。

本发明所提供的Cycleave荧光PCR检测牛结节性皮肤病病毒的引物、探针及方法，具有如下的技术优点：

1)灵敏度高：扩增模板的最低检出限可达1.13×10

附图说明

图1：本发明扩增LSDV ORF024基因部分序列的引物和探针设计示意图，其中引物探针设计区域由方框圈出。

图2：阳性质粒制备电泳结果图，其中泳道1：2000bp Marker；泳道2： LSDV/China/XJ/2019-1。

图3：Cycleave PCR灵敏度试验结果图，其中1：工作标准品1；2：工作标准品2；3：工作标准品3；4：工作标准品4；5：工作标准品5；6：工作标准品 6；7：工作标准品7；8：工作标准品8；9：工作标准品9；10：阴性对照。

图4：Cycleave PCR标准曲线结果图，其中1：工作标准品1；2：工作标准品2；3：工作标准品3；4：工作标准品4；5：工作标准品5；6：工作标准品6； 7：工作标准品7；8：工作标准品8。

图5：Cycleave PCR特异性试验结果图，其中1：工作标准品4；2：绵羊痘病毒；3：山羊痘病毒；4：O型/A型口蹄疫病毒；5：牛病毒性腹泻-黏膜病病毒与传染性鼻气管炎病病毒；6：蓝舌病病毒；7：阴性对照。

具体实施方式

本发明采用的Cycleave荧光PCR是采用一对引物和一个嵌合有RNA位点的 DNA探针扩增模板，当探针与互补的目标DNA杂交时，在RNA位点连接处切割探针，产生标记荧光，通过实时监测荧光信号实现检测目的。

为了对本发明的技术特征、目的和效果有更清楚的理解，现对照附图详细说明本发明的具体实施方式。

实施例1：引物及探针的筛选与设计

牛结节性皮肤病病毒(Lumpy skin disease virus,LSDV)属于羊痘病毒属，同属还有山羊痘病毒(Goatpox virus,GTPV)和绵羊痘病毒(Sheeppox virus,SPPV)，已有研究显示三种病毒间具有较高基因组同源性。

为了避免检测LSDV时出现假阳性，首先，从NCBI数据库中查找并下载已有的全部27株LSDV基因组全序列(GenBank登录号：MN636843.1、MN636842.1、MN636841.1、MN636840.1、MN636839.1、MN636838.1、MK4418381、 MH646674.1、KX764645.1、KX764644.1、KX764643.1、MT992618.1、MT130502.1、 AF409137.1、MN995838.1、MN642592.1、MN072619.1、KX894508.1、MH893760.2、 KY829023.3、KY829023.3、KY702007.1、KX683219.1、MT130502.2、MT643825.1、 AF325528.1、AF409138.1)，已有全部12株GTPV基因组全序列(GenBank登录号：KX576657.1、AY077836.1、AY077835.1、MN072621.1、MN072620.1、 MH381810.1、KC951854.1、MW020570.1、MN072622.1、MN072625.1、MN072624.1、MN072623.1)和全部13株SPPV基因组全序列(GenBank登录号： MN072631.1、MN072630.1、MN072629.1、MN072628.1、MN072627.1、 MN072626.1、MW020571.1、MG000156.1、AY077834.1、AY077833.1、AY077832.1、 KT438551.1、KT438550.1)。

再利用生物信息学软件BLAST和Lasergene MegAlign，逐段将上述LSDV、 GTPV、SPPV基因组全序列进行比较，分析筛选了4个LSDV种特异性单核苷酸多态性位点(singlenucleotide polymorphism,SNP)，即ORF024基因Y51G与 A287G，ORF101基因A1671T与T1743C。针对上述的SNP位点，综合考虑SNP 位点两翼序列的保守性、碱基组成、GC含量、二级结构的形成、Tm值等因素，设计了4组检测LSDV的Cycleave荧光PCR引物探针方案(表1)。

表1：LSDV种特异性SNP位点及引物探针组设计表

简并碱基Y＝T/C，R＝A/G；探针中加粗标记为LSDV特异性SNP位点，下划线为RNA碱基位点，U表示尿嘧啶。

经过灵敏性、特异性验证后，本发明最终采用方案2所示的引物探针组合。以LSDVNI-2490株(GenBank登录号：AF325528.1)作为参考株，设计引物用于扩增LSDV ORF024基因第238～388位序列，设计探针含LSDV特异性SNP位点。引物和探针设计区域见图1。其具体序列信息如下：

牛结节性皮肤病病毒检测正向引物LSD forward：

5′-CGATACACTCTCCRATATC-3′(SEQ ID NO:1)

牛结节性皮肤病病毒检测反向引物LSD reverse：

5′-AACGAGAAGTATGAATTAGC-3′(SEQ ID NO:2)

牛结节性皮肤病病毒检测探针LSD probe：

5′-GGCC

其中，牛结节性皮肤病病毒检测探针LSD probe针的5′端进行羧基荧光素 FAM标记，3′端进行淬灭基团Eclipse标记，下划线位置为标记的RNA位点。引物和探针均由宝生物工程(大连)有限公司合成。

实施例2：筛选的引物对、探针的灵敏度实验

1、阳性质粒标准品的制备

1)阳性质粒的制备

中国流行株LSDV/China/XJ/2019-1病毒由中国动物卫生与流行病学中心分离、鉴定、保存及提供。采用商品化病毒基因组提取试剂盒按说明方法提取病毒DNA模板，进行常规PCR扩增，具体步骤如下：

反应液每管25μL，含有2×Platinum Super Green PCR Mix反应液12.5 μL，10pmol/μL的LSD forward和LSD reverse各1μL，双蒸水8.5μL，提取的 DNA模板2μL。其中，Platinum Super Green PCR Mix检测试剂盒(目录号： 00766789)购自Invitrogen公司。二是反应条件设置：95℃预变性5min，95℃变性30s、55℃退火30s、72℃延伸30s，35个循环，72℃最后延伸5min； 4℃保存。

PCR产物经3％琼脂糖凝胶电泳(见图2)，回收目的片段并连接pMD19-T 载体，转化DH5α大肠杆菌，经PCR鉴定阳性菌株送青岛睿博兴科公司测序。测序结果符合预期作为阳性菌种，提取其质粒作为阳性质粒。阳性质粒含ORF024 基因第238～388位序列，及LSDV特异性SNP位点A287G。序列如下：

5′-

(注：下划线区域表示引物匹配位置；下划线斜体区域为探针匹配位置；阴影为SNP位点位置；加粗为RNA碱基位置)

2)阳性质粒标准品的制备

采用超微量紫外分光光度计测定阳性质粒OD260/OD280比值及浓度 (单位ng/μL)，根据公式：质粒拷贝数(copies/μL)＝(质粒浓度×10

经测定阳性质粒OD260/OD280比值为1.98，初始浓度为250.9ng/μL，拷贝数为1.13×10

2、灵敏度检测的实施

采用实施例1中设计的引物、探针制备反应体系，对系列工作标准品和阴性对照(成分为无核酸酶水)进行检测并绘制标准曲线，具体步骤如下：

(1)反应体系配制：反应液每管25μL，含有2×Cycleave PCR反应液12.5 μL，5pmol/μL的LSD forward和LSD reverse各0.6μL，5pmol/μL的LSD probe 0.8μL，双蒸水8.5μL，待检测样品DNA模板2μL。其中，Cycleave PCR检测试剂盒(目录号：CY505A)购自宝生物工程(大连)有限公司产品。(2)反应条件设置：95℃预变性10s；95℃变性5s，55℃退火10s，72℃延伸20s(收集FAM信号)，共40个循环。(3)结果的判定：阈值设定原则以阈值线刚好超过阴性对照品扩增曲线的最高点，或可根据仪器噪音情况进行调整。待检样品无Ct值并且无扩增曲线，结果判为阴性；待检样品Ct值≤40.0，且出现典型的扩增曲线，结果判为阳性。

结果如图3所示，工作标准品1～8均出现典型扩增曲线，检测结果为阳性；工作标准品9和阴性对照无扩增曲线，检测结果为阴性。结果显示，本方法最低检出限为工作标准品8，灵敏度为2.26copies/反应。选取梯度稀释的工作标准品 1～8绘制标准曲线，如图4所示，标准曲线的线性方程为：y＝-2.723x+38.388， R2＝0.999，扩增效率E＝132.9％。结果说明本发明所使用的引物对和探针具有极高的扩增效率，且在检测范围内模板浓度与检测Ct值间具有良好线性关系。

实施例3重复性实验

采用实施例1中设计的引物、探针制备反应体系，对实施例2中制备的工作标准品2～6进行三次Cycleave荧光PCR重复检测，计算批间变异系数；在同次 Cycleave荧光PCR中重复检测三次，计算批内变异系数，具体步骤如下：

(1)反应体系配制：反应液每管25μL，含有2×Cycleave PCR反应液12.5 μL，5pmol/μL的LSD forward和LSD reverse各0.6μL，5pmol/μL的LSD probe 0.8μL，双蒸水8.5μL，待检测样品DNA模板2μL。其中，Cycleave PCR检测试剂盒(目录号：CY505A)购自宝生物工程(大连)有限公司产品。(2)反应条件设置：95℃预变性10s；95℃变性5s，55℃退火10s，72℃延伸20s(收集FAM信号)，共40个循环。(3)结果判定：阈值设定原则以阈值线刚好超过阴性对照品扩增曲线的最高点，或可根据仪器噪音情况进行调整。重复检测工作标准品2～6，分别统计3次批间和3次批内重复检测的Ct值，按变异系数 CV％＝(标准偏差SD/平均值Mean)×100％，计算批间和批内重复Ct值变异系数。

结果如表2所示，工作标准品2～6批内重复性检测和批间重复性检测 Ct值变异系数均小于2％，表明本方法具有良好的可重复性。

表2：批内和批间重复性检测结果表

实施例4特异性实验

采用实施例1中设计的引物、探针制备反应体系，对牛病毒性腹泻/黏膜病病毒等相关病毒样品，健康牛来源全血、唾液、皮肤样品，以及阳性对照(成分为实施例2中制备的工作标准品4)和阴性对照(成分为无核酸酶水)进行检测，具体步骤如下：

(1)特异性样品制备：健康牛来源全血、唾液、皮肤样品，由国家外来动物疫病研究中心采集与提供；山羊痘病毒AV41株、口蹄疫病毒O型和A型 (FMDV/Re-O/MYA98/JSCZ2013+FMDV/Re -A/WH/09株)、牛病毒性腹泻/黏膜病病毒和牛传染性鼻气管炎病毒(NMG株 +LY株)来源市售商品化疫苗；绵羊痘病毒GL株DNA模板由中国农业科学院兰州兽医研究所惠赠；蓝舌病病毒DNA模板由军事医学科学院军事兽医研究所惠赠。全血、唾液、病毒样品直接采用商品化DNA提取试剂盒于全自动核酸提取仪上取核酸；皮肤样品先进行匀浆，再采用商品化DNA提取试剂盒于全自动核酸提取仪上取核酸，获得的核酸样本于-20℃保存备用。(2)反应体系配制：反应液每管25μL，含有2×Cycleave PCR反应液12.5μL，5pmol/μL的LSDforward和LSD reverse各0.6μL，5pmol/μL的LSD probe 0.8μL，双蒸水8.5μL，待检测样品DNA模板2μL。其中，Cycleave PCR检测试剂盒(目录号：CY505A) 购自宝生物工程(大连)有限公司产品。(3)反应条件设置：95℃预变性10s； 95℃变性5s，55℃退火10s，72℃延伸20s(收集FAM信号)，共40个循环。(4)结果的判定：阈值设定原则以阈值线刚好超过阴性对照品扩增曲线的最高点，或可根据仪器噪音情况进行调整。待检样品无Ct值并且无扩增曲线，结果判为阴性；待检样品Ct值≤40.0，且出现典型的扩增曲线，结果判为阳性。

结果如图5，阳性对照出现典型扩增曲线，阴性对照未出现扩增信号，实验成立。本实验中检测的相关山羊痘病毒、绵羊痘病毒、口蹄疫病毒、牛病毒性腹泻/黏膜病病毒、牛传染性鼻气管炎病毒、蓝舌病病毒样本核酸均未出现扩增信号，表明本方法检测上述病毒均无交叉反应，具有良好的特异性。

实施例5实际临床样本的检测

采用实施例1中设计的引物、探针制备反应体系，对采集自临床疑似感染动物的血液等类型临床样品，以及阳性对照(成分为实施例2中制备的工作标准品 4)和阴性对照(成分为无核酸酶水)进行检测；同时参照国家标准《牛结节性皮肤病诊断技术》(GB/T 39602-2020)方法对临床样品进行平行检测。具体步骤如下：

(1)临床样品的制备：临床疑似感染牛结节性皮肤病牛的全血、唾液、皮肤结节样品共计89份，由内蒙古自治区动物疫病预防与控制中心采集与提供。全血、唾液样品直接采用商品化DNA提取试剂盒于全自动核酸提取仪上取核酸；结节样品先进行匀浆，再采用商品化DNA提取试剂盒于全自动核酸提取仪上取核酸，获得的核酸样本于-20℃保存备用。

(2)Cycleave荧光PCR方法：一是反应体系配制：反应液每管25μL，含有2×Cycleave PCR反应液12.5μL，5pmol/μL的LSD forward和LSD reverse各 0.6μL，5pmol/μL的LSD probe 0.8μL，双蒸水8.5μL，待检测样品DNA模板2μL。其中，Cycleave PCR检测试剂盒(目录号：CY505A)购自宝生物工程(大连) 有限公司产品。二是反应条件设置为：95℃预变性10s；95℃变性5s，55℃退火 10s，72℃延伸20s(收集FAM信号)，共40个循环。三是结果的判定：阈值设定原则以阈值线刚好超过阴性对照品扩增曲线的最高点，或可根据仪器噪音情况进行调整。待检样品无Ct值并且无扩增曲线，结果判为阴性；待检样品Ct值≤40.0，且出现典型的扩增曲线，结果判为阳性。

(3)国标方法：参照国家标准《牛结节性皮肤病诊断技术》(GB/T 39602-2020)中通用牛结节性皮肤病病毒核酸检测方法进行。

检测结果见表3，Cycleave荧光PCR方法检出牛结节性皮肤病病毒核酸阳性53份、阴性36份；国标方法检出牛结节性皮肤病病毒核酸阳性49份、阴性 40份。与国标方法相比，Cycleave荧光PCR方法敏感性为100％，特异性为90％，总符合率为95.5％。将与国际方法检测结果不一致的4份样品，回收扩增片段并测序鉴定，证实均为牛结节性皮肤病病毒核酸阳性。结果显示，Cycleave荧光PCR 方法与国标荧光定量PCR方法检测结果间符合率良好，同时具有更高的阳性检出率。

表3：Cycleave荧光PCR与国标方法平行检测临床样品结果表

综上，本发明的引物对、探针及使用该引物对、探针的Cycleave荧光PCR 方法特异敏感且简便快速，适用于我国牛结节性皮肤病的检测。

序列表

<110> 中国动物卫生与流行病学中心

<120> 一种检测牛结节性皮肤病的Cycleave 荧光PCR方法

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

cgatacactc tccratatc 19

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

aacgagaagt atgaattagc 20

<210> 3

<211> 7

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ggccgcc 7