一种富亮氨酸α-2糖蛋白1标准物质的定值方法

摘要

本发明公开了一种富亮氨酸α‑2糖蛋白1标准物质的定值方法。本发明的有益效果为：本发明所述的一种富亮氨酸α‑2糖蛋白1(Leucine‑richalpha‑2‑glycoprotein，LRG1)标准物质的定值方法使用同位素稀释质谱法进行LRG1标准物质的含量测定，填补了现有技术空白，保证了定值结果的准确性、可靠性和溯源性，对建立LRG1标准物质的质量控制和评价体系具有重要意义。

说明书

技术领域

本发明涉及一种蛋白质分析检测技术，具体涉及一种富亮氨酸α-2糖蛋白1(LRG1)标准物质的定值方法。

背景技术

随着生命科学领域的蓬勃发展，蛋白质分析检测技术被广泛应用于临床医学检验、生物医药分析等领域。在临床医学检验中，许多疾病标志物如甲胎蛋白、癌胚抗原、C反应蛋白等属于蛋白质，因此这些蛋白标志物定量结果的准确性对于疾病的诊断及预后监测具有重大影响。

目前对于目标蛋白标志物的定量分析，多采用基于抗原-抗体反应的免疫学分析方法。免疫学分析方法检测速度快，灵敏度高，特异性好，但是其准确性与可靠性依赖于体外诊断试剂生产厂家提供的标准物质(抗原蛋白，即目标蛋白标志物)，从而导致不同厂家的产品对于同一样本的检测结果差异较大。因此，为了得到准确和可比较的临床检验结果，最有效的方法是对蛋白标准物质进行定值，并且结果可溯源到SI单位。目前国际上公认的蛋白标准物质定值方法是同位素稀释质谱法。

LRG1蛋白的生理作用是通过调节体内转化生长因子-β通路影响生物功能。它通过促进异常血管生成，调节细胞凋亡，促进上皮细胞向间质细胞的转变等过程来参与肿瘤的发生发展，是一种重要的癌症早期诊断和预后生物标志物。

在实际检测工作中，采用免疫分析方法对LRG1进行测定，均需要使用LRG1蛋白标准物质，但是目前还没有对LRG1标准物质进行量值溯源分析研究的报道。

发明内容

本申请的主要目的在于提供一种具有良好的准确性、可靠性和溯源性的富亮氨酸α-2糖蛋白1(LRG1)标准物质的定值方法。

为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种富亮氨酸α-2糖蛋白1标准物质的定值方法，包括以下步骤：

步骤一：筛选LRG1的特征肽段和稳定同位素标记的内标肽段；

步骤二：优化特征肽段与内标肽段的纳升液相色谱-质谱分析条件；

步骤三：将不同浓度的特征肽段和固定浓度的内标肽段等体积混合，采用步骤二优化后的纳升液相色谱-质谱分析方法进行分析，并建立标准曲线；

步骤四：将LRG1标准物质进行酶解，酶解后的反应液加入内标肽段后采用步骤二优化后的纳升液相色谱-质谱分析方法进行分析，将所选的特征肽段与内标肽段的峰面积比值代入步骤三所建标准曲线，求得LRG1标准物质的浓度。

上述一种富亮氨酸α-2糖蛋白1标准物质的定值方法，作为一种优选的实施方案，步骤一中：筛选LRG1的特征肽段和稳定同位素标记的内标肽段的方法为：

(1)向LRG1重组蛋白溶液中依次加入NH

(2)过滤步骤(1)所得反应液，对过滤所得液体进行纳升液相色谱-质谱分析，在数据依赖扫描DDA(Data Dependent Acquisition，DDA)模式下采集数据；

(3)使用Proteome Discoverer软件和Uniprot数据库，将步骤(2)所得数据与Uniprot数据库中的蛋白氨基酸序列进行比对，从中鉴定和筛选出2条用于定量的特征肽段；

(4)在选定特征肽段的基础上，使用

优选地，步骤(1)中，向20ul LRG1重组蛋白溶液中依次加入25ul浓度为50mmol/L的NH

优选地，步骤(2)中，所述过滤为采用0.22um的滤膜进行过滤；

优选地，步骤(3)中，筛选得到的两条用于定量的特征肽段为LRG1a和LRG1b，氨基酸序列分别为VAAGAFQGLR和LHLEGNK。

特征肽段筛选的原则为：

①肽段氨基酸组成中不含甲硫氨酸(Met)和半胱氨酸(Cys)；

②肽段不含漏切位点；

③质谱中带2+或3+电荷；

④肽段长度为6-20个氨基酸；

⑤肽段的质谱峰强度在满足条件①-④的候选肽段中处于前3位。

优选地，步骤(4)中，使用稳定同位素

上述一种富亮氨酸α-2糖蛋白1标准物质的定值方法，作为一种优选的实施方案，步骤二中，优化特征肽段与内标肽段的纳升液相色谱-质谱分析条件为：

(1)将选取的特征肽段和内标肽段分别进行纳升液相色谱-质谱分析，并在平行反应监测(Parallel Reaction Monitor-ing,PRM)模式下采集数据；

(2)通过Skyline软件分析步骤一所得质谱数据，选取每个肽段母离子碎裂后峰强度最高的5个碎片离子作为对应的目标肽段子离子。

上述一种富亮氨酸α-2糖蛋白1标准物质的定值方法，作为一种优选的实施方案，步骤三中，将LRG1a冻干粉和LRG1b冻干粉溶解于5％乙腈的水溶液中，配成等浓度的混合标准溶液，并用0.1％甲酸水溶液分别稀释成0.5ng/mL、2.0ng/mL、5.0ng/mL、20.0ng/mL和50.0ng/mL，得到混合标准系列溶液；

将LRG1a_IS冻干粉和LRG1b_IS冻干粉溶解于5％乙腈的水溶液中，配成等浓度的混合内标溶液，并用0.1％甲酸水溶液稀释成5.0ng/mL的混合内标工作溶液；

将上述不同浓度的混合标准系列溶液与混合内标工作溶液等体积混合，配制得到标准系列溶液，按照优化后的纳升液相色谱-质谱分析方法进行分析，在PRM扫描模式下采集数据，并通过Skyline软件定量分析；以特征肽段的浓度为横坐标，特征肽段及其内标肽段的峰面积比值为纵坐标，权重为1/x，绘制标准曲线。

上述一种富亮氨酸α-2糖蛋白1标准物质的定值方法，作为一种优选的实施方案，

取LRG1标准物质20uL，精确记录体积V

待酶解后，加入4uL 10％TFA终止酶解反应；将样本冰冻干燥，用0.1％甲酸水溶液复溶，并经0.22um滤膜过滤；将滤液与5.0ng/mL的混合内标工作溶液等体积混合后，取5uL按照优化后的PRM方法进行纳升液相色谱-质谱分析；

通过Skyline软件对采集的质谱数据进行定量分析，将上机样本中特征肽段及其内标肽段的峰面积比值代入标准曲线中，求得上机样本中特征肽段的浓度C

LRG1标准物质的蛋白浓度C

C

式中：

C

C

V

R

M

V

M

将两条特征肽段LRG1a和LRG1b分别换算得到的蛋白浓度取平均值，作为LRG1标准物质的蛋白浓度。

相对于现有技术，本发明的有益效果为：

1、本发明一种富亮氨酸α-2糖蛋白1标准物质的定值方法使用同位素稀释质谱法进行LRG1标准物质的含量测定，填补了现有技术空白，保证了定值结果的准确性、可靠性和溯源性，对建立LRG1标准物质的质量控制和评价体系具有重要意义。

2、本发明首次采用纳升液相色谱进行溯源分析，相比于常规液相色谱，上样量少，减少了流动相使用量，同时提高了灵敏度，常规液相色谱流动相(色谱柱内径4.6mm)的流量为300-1000mL/min，而本发明采用的纳升液相色谱(色谱柱内径0.075mm)的流量为300nL/min；相对于常规液相色谱-质谱分析，本发明的纳升液相色谱-质谱分析的灵敏度理论上可提高约3800倍。

3、本发明对LRG1酶解后的特征肽段进行

附图说明

图1为特征肽段LRG1a的标准曲线；

图2为特征肽段LRG1b的标准曲线；

图3为特征肽段LRG1a的色谱图；

图4为内标肽段LRG1a_IS的色谱图；

图5为特征肽段LRG1b的色谱图；

图6为内标肽段LRG1b_IS的色谱图。

具体实施方式

为了使本技术领域的人员更好地理解本申请方案，下面将结合案例对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本申请保护的范围。

实施例1

一种富亮氨酸α-2糖蛋白1标准物质的定值方法，包括以下步骤：

步骤一：筛选LRG1的特征肽段和稳定同位素标记的内标肽段；

步骤二：优化特征肽段与内标肽段的纳升液相色谱-质谱分析条件；

步骤三：将不同浓度的特征肽段和固定浓度的内标肽段等体积混合，采用步骤二优化后的纳升液相色谱-质谱分析方法进行分析，并建立标准曲线；

步骤四：将LRG1标准物质进行酶解，酶解后的反应液加入内标肽段后采用步骤二优化后的纳升液相色谱-质谱分析方法进行分析，将所选的特征肽段与内标肽段的峰面积比值代入步骤三所建标准曲线，求得LRG1标准物质的浓度。

筛选LRG1的特征肽段和稳定同位素标记的内标肽段的具体方法为：

(1)向20uL LRG1重组蛋白溶液(购买于：南京金斯瑞生物科技有限公司)中依次加入25uL浓度为50mmol/L的NH

(2)采用0.22um的滤膜过滤步骤(1)所得反应液，对过滤所得液体进行纳升液相色谱-质谱分析，在数据依赖扫描DDA模式下采集数据；

(3)使用Proteome Discoverer软件和Uniprot数据库，将步骤(2)所得数据与Uniprot数据库中的蛋白氨基酸序列进行比对，从中鉴定和筛选出2条用于定量的特征肽段；两条用于定量的特征肽段为LRG1a和LRG1b，氨基酸序列分别为VAAGAFQGLR和LHLEGNK；

(4)在选定特征肽段的基础上，使用

优化特征肽段与内标肽段的纳升液相色谱-质谱分析条件为：

(1)将筛选的特征肽段和内标肽段分别进行纳升液相色谱-质谱分析，并在平行反应监测模式下采集数据；

(2)通过Skyline软件分析所得质谱数据，选取每个肽段母离子碎裂后峰强度最高的5个碎片离子作为对应的目标肽段子离子，扫描结果如表1所示：

表1 LRG1的PRM扫描信息

纳升液相色谱分析条件为：分析柱采用C18毛细管色谱柱(3um，75um*15cm)，柱温为55℃，流动相A为0.1％甲酸水溶液，流动相B为80％乙腈水溶液(含0.1％甲酸)；上样溶液为0.1％甲酸水溶液，体积为15uL；采用梯度洗脱22min，进样量为5uL，自动进样器温度保持为7℃，检测系统为四极杆-轨道离子阱串联质谱。每次分析样本之前，分析柱用流动相A平衡5uL。

梯度洗脱程序包括：0min，300nL/min，5％B；16min，300nL/min，80％B；17min，1000nL/min，100％B；22min，1000nL/min，100％B；

质谱分析条件为：毛细管电压为2.1kV，PRM扫描模式，分辨率为30000，隔离窗口为1.6m/z，碰撞能量NCE为27。

建立标准曲线的具体方法：

将LRG1a冻干粉和LRG1b冻干粉溶解于5％乙腈的水溶液中，配成等浓度的混合标准溶液，并用0.1％甲酸水溶液分别稀释成0.5ng/mL、2.0ng/mL、5.0ng/mL、20.0ng/mL和50.0ng/mL，得到混合标准系列溶液；

将LRG1a_IS冻干粉和LRG1b_IS冻干粉溶解于5％乙腈的水溶液中，配成等浓度的混合内标溶液，并用0.1％甲酸水溶液稀释成5.0ng/mL的混合内标工作溶液；

将上述不同浓度的混合标准系列溶液与5.0ng/mL混合内标工作溶液等体积混合，配制得到标准系列溶液，按照优化后的纳升液相色谱-质谱分析方法进行分析，在PRM扫描模式下采集数据，并通过Skyline软件定量分析；以特征肽段的浓度为横坐标，特征肽段及其内标肽段的峰面积比值为纵坐标，权重为1/x，绘制标准曲线，如图1和图2所示。

LRG1标准物质的样本制备与定量分析：

取LRG1标准物质20uL，精确记录体积V

通过Skyline软件对采集的质谱数据进行定量分析，将上机样本中特征肽段及其内标肽段的峰面积比值代入标准曲线中，求得上机样本中特征肽段的浓度C

备注：在计算蛋白浓度时，选择若干条酶切肽段定量结果进行换算。本发明实施例同时选用两条酶切肽段定量结果的平均值，也可以选择任意一条肽段的定量结果。

LRG1标准物质的蛋白浓度Cprotein的计算公式为：

C

式中：

C

C

V

R

M

V

M

将两条特征肽段LRG1a和LRG1b分别换算得到的蛋白浓度取平均值，作为LRG1标准物质的蛋白浓度。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。