心血管疾病风险因子C-反应蛋白及同型半胱氨酸准确定值方法研究——Ⅰ.C-反应蛋白标准物质定值方法(同位素稀释质谱氨基酸分析法)Ⅱ.血清中同型半胱氨酸同位素稀释质谱定值方法

摘要

心脑血管疾病危险因子的检测一直是全世界的重要课题。近几年来，随着检测技术的发展，同型半胱氨酸和C-反应蛋白成为新的指标应用于临床。为保证测量结果的可溯源性和准确可比，实现临床检验的标准化，有必要建立准确可靠的参考方法，研制相关标准物质，来满足临床检验的需求。
　　 超敏C-反应蛋白(hsCRP)作为心脑血管炎症敏感指标逐渐被人们重视。本文建立了C-反应蛋白的液相色谱-同位素稀释串联质谱检测方法，该方法选取蛋白中的亮氨酸和缬氨酸两种氨基酸同时定量。按照样品完全水解后产生缬氨酸和亮氨酸摩尔比1∶1的比例与同位素标记缬氨酸和亮氨酸溶液混合，加酸水解后吹干复溶，经过滤膜过滤后上机测定。流动相为A+B=水(0.8mM全氟庚酸+0.05％三氟乙酸)+乙腈，采用梯度洗脱。使用Agilent6410三重四级杆质谱在MRM方式下进行检测，监测离子对为m/z=118.1-＞72.1(缬氨酸)，m/z=123.1-＞75.1(13C5-缬氨酸)，m/z=132.1-＞86.1(亮氨酸)，m/z=142.1-＞96.1(D10-亮氨酸)。使用括号法计算氨基酸浓度，再由氨基酸得到蛋白的量。建立的定值方法中，利用氨基酸分析法、同位素标记稀释和LC-MS/MS定量检测相结合，优化了水解条件，实现了较简单的前处理过程，提高了测定结果的准确度，保证了测定结果的溯源性，并参加了日本计量院组织的CRP中日韩国际比对进行方法验证，为我国研制CRP标准物质奠定重要的基础。
　　 高同型半胱氨酸(homocysteine，Hcy)血症是心脑血管病的独立危险因素。本课题建立的ID-LCMS/MS测定人血清中总同型半胱氨酸含量的方法，用D8-同型胱氨酸做内标，二硫苏糖醇做还原剂，乙腈沉淀蛋白，用带有电喷雾离子源的三重四极质谱的多重反应监模式(MRM)检测目标离子对(m/z140.1-＞94.1，136.1-＞90.1)，使用括号法定量，分别考查了血清同型半胱氨酸准确测量所需的前处理条件、液相色谱分离条件、质谱测量条件。
　　 对于低、中、高三种不同浓度的血清样品，相对标准偏差为0.58％～2.86％，血清的加标回收率范围为96.54～100.05％。线性范围为0.01～500μmol/kg，检测限为0.07 ng/g，方法总不确定度4.0％。方法的确证使用美国NIST SRM1955血清标准物质的三个浓度水平，测量结果均在其证书给定的不确定度范围内。综上分析结果，本文建立的血清同型半胱氨酸测定方法简单、快速、定量准确，有望作为参考方法，并为血清同型半胱氨酸标准物质的研制提供支撑。

目录

声明

致谢

摘要

第一章 综述

1．1 概述

1．2 C-反应蛋白

1．2．1 CRP的结构及特点

1．2．2 C-反应蛋白检测对心血管疾病的临床意义

1．2．3 C-反应蛋白的测定方法

1．3 同型半胱氨酸

1．3．1 同型半胱氨酸的结构及特点

1．3．2 同型半胱氨酸检测对心血管疾病的临床意义

1．3．3 同型半胱氨酸的测定方法

1．4 课题研究的目的和意义

1．4．1 建立人C-反应蛋白氨基酸水解同位素稀释质谱方法及参加国际比对的目的和意义

1．4．2 建立血清中同型半胱氨酸参考方法的目的和意义

1．5 课题的主要工作及创新点

1．5．1 CRP氨基酸水解同位素稀释质谱方法的主要工作及创新点

1．5．2 血清中同型半胱氨酸同位素稀释质谱方法的主要工作及创新点

第二章 人C-反应蛋白含量氨基酸水解同位素稀释-液相色谱／串联质谱法定量研究

2．1 试剂、仪器与实验材料

2．1．1 试剂

2．1．2 蛋白样品

2．1．3 仪器

2．2 溶液配制及样品预处理

2．2．1 标准溶液配制

2．2．2 校准比值混合溶液配制

2．2．3 蛋白样品预处理

2．3 人C-反应蛋白的测定实验方法选择

2．3．1 水解时间的确定

2．3．2 色谱条件

2．3．3 质谱条件

2．3．4 分析过程

2．3．5 数据处理

2．4 测量结果

2．5 小结

第三章 人C-反应蛋白氨基酸水解同位素稀释质谱国际比对研究

3．1 样品接收

3．2 试剂与仪器

3．2．1 试剂

3．2．2 仪器

3．3 溶液配制及样品预处理

3．3．1 标准溶液配制

3．3．2 校准比值混合溶液配制

3．3．3 蛋白样品的水解

3．4 人C-反应蛋白的测定实验条件

3．4．1 色谱条件

3．4．2 质谱条件

3．4．3 分析过程及数据处理

3．5 测量结果

3．6 测量不确定度评定

3．6．1 方法重复性引入的不确定度

3．6．2 称量引入的不确定度

3．6．3 标准物质纯度引入的不确定度

3．6．4 水解效率引入的不确定度

3．7 不确定度计算

3．8 比对样品定值结果

3．9 小结

第四章 血清中同型半胱氨酸参考方法的建立

4．1 试剂、仪器与实验材料

4．1．1 试剂

4．1．2 血清样品

4．1．3 仪器

4．2 溶液配制及样品预处理

4．2．1 标准溶液配制

4．2．2 校准曲线配制

4．2．3 血清样品的前处理

4．3 血清同型半胱氨酸的测定实验方法选择

4．3．1 还原所需pH值、还原剂用量、还原温度及还原时间

4．3．2 色谱条件

4．3．3 质谱条件

4．3．4 分析过程

4．3．5 数据处理

4．4 结果与讨论

4．4．1 方法的精密度

4．4．2 回收率

4．4．3 线性范围和检测限

4．5 方法的确证

4．5．1 血清样品

4．5．2 校准溶液配制及样品预处理

4．5．3 血清中总同型半胱氨酸测量条件

4．5．4 分析过程

4．5．5 测量结果

4．5．6 测量不确定度计算

4．6 小结

第五章 结论

参考文献

攻读硕士学位期间发表的学术论文