补体因子I和补体因子I辅因子、编码它们的载体和治疗用途

摘要

一种产物，其包含(i)补体因子I(CFI)辅因子；和(ii)补体因子I(CFI)，或编码它们的核苷酸序列，作为疗法中同时、单独或依序使用的组合制剂。

说明书

技术领域

本发明涉及用于基因疗法的剂。具体地，本发明涉及补体因子I(CFI)和CFI辅因子诸如补体因子H样蛋白1(FHL1)的组合、编码它们的多核苷酸，以及它们在补体介导和补体相关病症的治疗或预防中的用途，所述病症包括补体介导的眼病，诸如年龄相关性黄斑变性(AMD)。

背景技术

黄斑是眼睛视网膜中的一个小区域，大约3至5毫米大小，与视神经相邻。黄斑是视网膜最敏感的区域，并且包含中央凹，这是一个允许高视敏度并包含密集浓度的视锥细胞(即负责色视觉的光感受器)的凹陷区域。

年龄相关性黄斑变性(AMD)是发达国家50岁以上人群功能性失明的最常见原因(Seddon,J.M.,Epidemiology of age-related macular degeneration.In:Ogden,T.E.等人,编辑Ryan S.J.主编.Retina第II卷.第3版.St.Louis,Mo.:Mosby；2001:1039-1050)。AMD与起源于脉络膜脉管系统并延伸到视网膜下腔(subretinal space)中的新血管形成有关。此外，AMD的特征在于视网膜、视网膜色素上皮(RPE)和底层脉络膜(位于RPE下方、视网膜和巩膜之间的高度血管化组织)的进行性变性。

多种因素，包括氧化应激、可能带有自身免疫成分的炎症、遗传背景(例如突变)以及环境或行为因素(诸如吸烟和饮食)都可能导致AMD的发病。

AMD的临床进展是根据黄斑的变化而分期表征的。早期AMD的标志是玻璃膜疣的出现，即视网膜下细胞外碎片的积累，并且在临床检查和眼底照片上表现为视网膜中的黄色斑点。玻璃膜疣根据尺寸分为小(<63μm)、中(63-124μm)和大(>124μm)。根据它们在眼科检查时边缘的外观，也将其认为是硬的或软的。硬玻璃膜疣具有清晰界定的边缘，而软玻璃膜疣具有不那么清晰界定的流体边缘。年龄相关眼病研究(AREDS)眼底照相严重程度量表是用于这种病状的主要分类系统之一。

中期AMD通过大的玻璃膜疣和/或任何视网膜色素异常来诊断。中期AMD可能会导致一些视觉丧失，但与早期AMD一样，它通常是无症状的。

晚期AMD已分为“干性”和“湿性”(渗出性或新生血管性)形式。干性AMD比湿性AMD更常见，但干性形式可以发展为湿性形式，并且在大量病例中两者同时发生。干性AMD的典型特征在于RPE层中的细胞和上覆光感受器细胞、更经常是脉络膜毛细血管层中的底层细胞的进行性凋亡。伴有上覆光感受器萎缩的RPE细胞死亡的汇合区域(Confluent area)被称为地图状萎缩(GA)。患有这种形式的AMD(晚期干性形式)的患者会经历中央视觉缓慢且渐进的恶化。

湿性AMD的特征在于从RPE和黄斑下方的脉络膜血管(脉络膜毛细血管)生长的异常血管的出血和/或流体渗漏，这可能是导致突然且致残的视觉丧失的原因。据估计，患者经历的大部分视觉丧失是由于这种脉络膜新血管形成(CNV)及其继发性并发症。新生血管性AMD的一个亚型被称为视网膜血管瘤增生(RAP)。在此，血管瘤增生起源于视网膜并且向后延伸到视网膜下腔中，在一些情况下最终与脉络膜新血管相通。

基于AMD患者眼玻璃膜疣中补体系统(CS)成分的鉴定，CS与早期AMD发病有关。在AMD中，已鉴定出至少129种类型的玻璃膜疣沉积蛋白，包括不同的载脂蛋白类型(E、B或A-I)、几种淀粉样肽(P、Aβ或SA-1)、TIMP-3、血清白蛋白和某些与细胞功能相关的蛋白质(例如ATP合酶β亚基、清道夫受体B2和视黄醇脱氢酶)。AMD来源的玻璃膜疣也包含几乎所有的补体蛋白，包括调节蛋白(CFH、补体受体1(CR1)、玻连蛋白和簇集蛋白)、CS激活和降解的产物(C1q、C3、C3a、C3b和C5a)，和包含分离和复合形式的MAC组分(即5、6、8(α、β和γ)和9)的末端CS途径的成员。积累的玻璃膜疣可能会激活CS，触发炎症介质的局部产生，并吸引白细胞，从而增加AMD中存在的局部炎症状态。

目前针对AMD的治疗选择包括使用苯并卟啉的光动力疗法(Arch Ophthalmol(1999)117:1329-1345)和许多靶向血管内皮生长因子(VEGF)途径的疗法。此类VEGF靶向疗法的实例包括诸如雷珠单抗(ranibizumab)(以Lucentis

目前没有得到批准的用于早期或晚期(干性)形式AMD的治疗方法。

补体系统是治疗许多炎性疾病的有据可查的靶点。过度活跃或功能不正常的补体系统与许多慢性炎性病状(包括AMD)的病理学有关(Nature Reviews(2015)14:857-877)。因此，已经提出或目前正在开发几种补体靶向疗法，它们以旁路途径(alternativepathway)扩增回路/C3b反馈循环为目标，作为减少C3b反馈或增加C3b分解的手段(图1)。

兰帕珠单抗(Lampalizumab)(Genentech/Roche)是一种抑制补体因子D的人源化单克隆抗体，通过每月一次的玻璃体内注射施用，以阻止地图状萎缩的进展速率。在2期临床试验中，兰帕珠单抗显示地图状萎缩扩大速率有所降低。然而，在涉及906名参与者的III期随机临床试验中，经过48周，当与假治疗(sham)相比时，兰帕珠单抗未能减少GA扩大。结果显示GA明显且持续的扩大，平均每年大约2mm

然而，仍然需要用于治疗补体介导或补体相关疾病，特别是眼部疾病，诸如AMD的替代疗法，特别是在广泛的AMD人群中有效且不限于可能使个体易患AMD和其他补体相关病症的特定基因型的治疗。

发明内容

申请人已经确定了用于递送给患者以恢复或重新平衡过度活跃的补体C3b反馈循环的补体因子I(CFI)和CFI辅因子(在CFI介导的C3b裂解中具有辅因子活性的蛋白质，诸如补体因子H样蛋白1(FHL1)、补体因子H(CFH)、补体受体1型(CR1)和膜辅因子蛋白(MCP))的治疗组合。所述组合提供如下摩尔比的CFI和CFI辅因子，所述摩尔比确保辅因子以与CFI的化学计量过量来提供，以确保CFI在C3b分解中的最大活性(和过度活跃的补体系统的下调)。这对于在某些补体系统蛋白中可能存在遗传缺陷的患者和/或对于向与全身水平相比而言辅因子水平可能降低的组织或器官(例如在眼睛或肾脏中)施用的治疗而言是很重要的。

此外，申请人提供了双顺反子载体，其能够用于向患者递送和共表达CFI和CFI辅因子(例如FHL1)。具体地，申请人成功设计了功能性AAV载体，其能够以良好的滴度生产并包含编码CFI和辅因子的核苷酸序列，从而克服了AAV容量有限带来的挑战。本发明的双顺反子载体也有利地实现CFI和辅因子的良好表达；以及以本文已确定为有益的比率的CFI和辅因子的共表达。

在一方面，本发明提供了一种产物，其包含(i)补体因子I(CFI)辅因子；和(ii)补体因子I(CFI)，或编码它们的核苷酸序列，作为疗法中同时、单独或依序使用的组合制剂。

在另一方面，本发明提供了一种产物，其包含(i)补体因子H样蛋白1(FHL1)或补体因子H(CFH)；和(ii)补体因子I(CFI)，或编码它们的核苷酸序列，作为疗法中同时、单独或依序使用的组合制剂。

在特定实施方案中，所述产物用于治疗补体介导的病症，特别是慢性炎性病状，并且甚至更特别地是与补体C3b反馈循环过度活跃相关的病症。

在另一方面，本发明提供了一种产物，其包含(i)补体因子I(CFI)辅因子；和(ii)补体因子I(CFI)，或编码它们的核苷酸序列，作为在治疗或预防补体介导的病症，优选补体介导的眼部病症中同时、单独或依序使用的组合制剂。

在另一方面，本发明提供了一种产物，其包含(i)补体因子H样蛋白1(FHL1)或补体因子H(CFH)；和(ii)补体因子I(CFI)，或编码它们的核苷酸序列，作为在治疗或预防补体介导的眼部病症中同时、单独或依序使用的组合制剂。

在一些实施方案中，补体因子I(CFI)辅因子选自由以下组成的组：补体因子H样蛋白1(FHL1)；补体因子H(CFH)；补体受体1(CR1)或其片段；和膜辅因子蛋白(MCP)或其片段。

在一些实施方案中，补体因子I(CFI)辅因子是补体因子H(CFH)。在一些实施方案中，补体因子I(CFI)辅因子是补体受体1(CR1)或其片段。在一些实施方案中，补体因子I(CFI)辅因子是膜辅因子蛋白(MCP)或其片段。

在优选的实施方案中，补体因子I(CFI)辅因子是补体因子H样蛋白1(FHL1)。

在优选的实施方案中，产物包含(i)补体因子H样蛋白1(FHL1)；和(ii)补体因子I(CFI)，或编码它们的核苷酸序列。在其他实施方案中，产物包含(i)补体因子H(CFH)；和(ii)补体因子I(CFI)，或编码它们的核苷酸序列。在其他实施方案中，产物包含(i)补体受体1(CR1)或其片段；和(ii)补体因子I(CFI)，或编码它们的核苷酸序列。在其他实施方案中，产物包含(i)膜辅因子蛋白(MCP)或其片段；和(ii)补体因子I(CFI)，或编码它们的核苷酸序列。

在一些实施方案中，病症与补体C3b反馈循环的过度活跃和/或C3b分解循环的活跃不足有关(参见图1)。

在一些实施方案中，病症是慢性补体介导的眼睛炎性病状。

在一些实施方案中，病症是年龄相关性黄斑变性(AMD)或糖尿病性视网膜病变。在其他实施方案中，病症是青光眼、斯塔加特病(Stargardts disease)、中心性浆液性脉络膜视网膜病变或视网膜色素变性。

在优选的实施方案中，病症是AMD。在一些实施方案中，AMD是干性AMD。

在一些实施方案中，产物以至少2:1、至少3:1、至少4:1、至少5:1、至少6:1、至少7:1、至少8:1、至少9:1、至少10:1、至少15:1、至少20:1、至少25:1、至少30:1、至少40:1、至少50:1、至少60:1的(i):(ii)摩尔比向受试者提供(i)和(ii)。

在一些实施方案中，产物以至少2:1的(i):(ii)摩尔比向受试者提供(i)和(ii)。在一些实施方案中，产物以至少3:1的(i):(ii)摩尔比向受试者提供(i)和(ii)。在优选的实施方案中，产物以至少8:1的(i):(ii)摩尔比向受试者提供(i)和(ii)。

在一些实施方案中，产物以2:1至34:1之间、2:1至25:1之间、、2:1至15:1之间、2:1至12:1之间、2:1至10:1之间的(i):(ii)摩尔比向受试者提供(i)和(ii)。

在优选的实施方案中，产物以3:1至10:1之间的(i):(ii)摩尔比向受试者提供(i)和(ii)。

所提供的摩尔比可以通过，例如，将蛋白质、多核苷酸或载体递送至受试者来实现。技术人员可以使用本领域已知的技术，诸如ELISA容易地测量蛋白质水平，例如如本文所描述的。同样，可以使用类似的方法测量从编码它们的多核苷酸或载体表达的蛋白质的量。

在另一方面，本发明提供了一种分离的多核苷酸，其包含编码(i)补体因子I(CFI)辅因子；和(ii)补体因子I(CFI)的核苷酸序列。

在另一方面，本发明提供了一种分离的多核苷酸，其包含编码(i)补体因子H样蛋白1(FHL1)或补体因子H(CFH)；和(ii)补体因子I(CFI)的核苷酸序列。

在一些实施方案中，补体因子I(CFI)辅因子选自由以下组成的组：补体因子H样蛋白1(FHL1)；补体因子H(CFH)；补体受体1(CR1)或其片段；和膜辅因子蛋白(MCP)或其片段。

在一些实施方案中，补体因子I(CFI)辅因子是补体因子H(CFH)。在一些实施方案中，补体因子I(CFI)辅因子是补体受体1(CR1)或其片段。在一些实施方案中，补体因子I(CFI)辅因子是膜辅因子蛋白(MCP)或其片段。

在优选的实施方案中，补体因子I(CFI)辅因子是补体因子H样蛋白1(FHL1)。

在优选的实施方案中，多核苷酸包含编码(i)补体因子H样蛋白1(FHL1)；和(ii)补体因子I(CFI)的核苷酸序列。在其他实施方案中，多核苷酸包含编码(i)补体因子H(CFH)；和(ii)补体因子I(CFI)的核苷酸序列。在其他实施方案中，多核苷酸包含编码(i)补体受体1(CR1)或其片段；和(ii)补体因子I(CFI)的核苷酸序列。在其他实施方案中，多核苷酸包含编码(i)膜辅因子蛋白(MCP)或其片段；和(ii)补体因子I(CFI)的核苷酸序列。

在一些实施方案中，多核苷酸还包含编码CMV启动子的核苷酸序列。优选地，CMV启动子位于编码(i)和(ii)的核苷酸序列的上游。

在一些实施方案中，多核苷酸还包含编码WPRE调控元件的核苷酸序列。优选地，WPRE调控元件位于编码(i)和(ii)的核苷酸序列的下游。

在一些实施方案中，多核苷酸还包含编码poly-A信号的核苷酸序列。优选地，其中poly-A信号位于编码(i)和(ii)的核苷酸序列的下游。

在一些实施方案中，多核苷酸还包含编码牛生长激素poly-A信号的核苷酸序列。优选地，其中牛生长激素poly-A信号位于编码(i)和(ii)的核苷酸序列的下游。

在一些实施方案中，多核苷酸还包含编码以下的核苷酸序列：

(a)CMV启动子，其中CMV启动子位于编码(i)和(ii)的核苷酸序列的上游；和

(b)牛生长激素poly-A信号，其中牛生长激素poly-A信号位于编码(i)和(ii)的核苷酸序列的下游。

在其他实施方案中，多核苷酸还包含编码以下的核苷酸序列：

(a)CMV启动子，其中CMV启动子位于编码(i)和(ii)的核苷酸序列的上游；

(b)WPRE调控元件，其中WPRE调控元件位于编码(i)和(ii)的核苷酸序列的下游；和

(c)牛生长激素poly-A信号，其中牛生长激素poly-A信号位于编码(i)和(ii)的核苷酸序列的下游。

在优选的实施方案中，WPRE调控元件是WPRE3调控元件。

在优选的实施方案中，编码(i)的核苷酸序列位于编码(ii)的核苷酸序列的上游。

在其他实施方案中，编码(ii)的核苷酸序列位于编码(i)的核苷酸序列的上游。

在一些实施方案中，编码(i)和(ii)的核苷酸序列通过接头可操作地连接。在一些实施方案中，接头是弗林蛋白酶(Furin)、GSG、11aa1D或F2A接头。在优选的实施方案中，接头含有自裂解2A肽序列，例如P2A或包含弗林蛋白酶裂解位点、GSG、11a1D和F2A序列或由它们定义的序列。

在一些实施方案中，多核苷酸还包含一个或多个腺相关病毒(AAV)反向末端重复(ITR)。在优选的实施方案中，多核苷酸还包含两个AAV ITR。

在一些实施方案中，多核苷酸在其5'端包含AAV ITR，并且在其3'端包含AAV ITR。

在一些实施方案中，多核苷酸包含：

(a)5’端AAV ITR；

(b)CMV启动子；

(c)编码补体因子I(CFI)辅因子，优选FHL1的核苷酸序列；

(d)接头，任选地其中接头包含弗林蛋白酶裂解位点、GSG、11a1D和F2A序列；

(e)编码CFI的核苷酸序列；

(f)poly-A信号，优选牛生长激素poly-A信号；和

(g)3’端AAV ITR。

在一些实施方案中，多核苷酸包含：

(a)5’端AAV ITR；

(b)CMV启动子；

(c)编码补体因子I(CFI)辅因子，优选FHL1的核苷酸序列；

(d)接头，任选地其中接头包含弗林蛋白酶裂解位点、GSG、11a1D和F2A序列；

(e)编码CFI的核苷酸序列；

(f)WPRE调控元件，优选地其中WPRE调控元件是WPRE3调控元件；

(g)poly-A信号，优选牛生长激素poly-A信号；和

(h)3’端AAV ITR。

在优选的实施方案中，多核苷酸包含：

(a)5’端AAV ITR；

(b)CMV启动子；

(c)编码FHL1的核苷酸序列；

(d)接头，其包含弗林蛋白酶裂解位点、GSG、11a1D和F2A序列；

(e)编码CFI的核苷酸序列；

(f)WPRE3调控元件；

(g)poly-A信号，优选牛生长激素poly-A信号；和

(h)3’端AAV ITR。

在一些实施方案中，补体因子I(CFI)辅因子选自由以下组成的组：补体因子H样蛋白1(FHL1)；补体因子H(CFH)；补体受体1(CR1)或其片段；和膜辅因子蛋白(MCP)或其片段。

在一些实施方案中，补体因子I(CFI)辅因子是补体因子H(CFH)。在一些实施方案中，补体因子I(CFI)辅因子是补体受体1(CR1)或其片段。在一些实施方案中，补体因子I(CFI)辅因子是膜辅因子蛋白(MCP)或其片段。

在优选的实施方案中，补体因子I(CFI)辅因子是补体因子H样蛋白1(FHL1)。

在一些实施方案中，AAV ITR是AAV2或AAV8 ITR。在优选的实施方案中，AAV ITR是AAV2 ITR。

在一些实施方案中，编码补体因子I(CFI)辅因子，诸如FHL1或CFH的核苷酸序列是密码子优化的。在一些实施方案中，编码CFI的核苷酸序列是密码子优化的。在优选的实施方案中，编码补体因子I(CFI)辅因子，诸如FHL1或CFH，和CFI的核苷酸序列是密码子优化的。

在一些实施方案中，编码FHL1的核苷酸序列与SEQ ID NO：12具有至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。

在优选的实施方案中，编码FHL1的核苷酸序列是SEQ ID NO：12。

在一些实施方案中，编码CFI的核苷酸序列与SEQ ID NO：10具有至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。

在优选的实施方案中，编码CFI的核苷酸序列是SEQ ID NO：10。

在优选的实施方案中，编码FHL1的核苷酸序列是SEQ ID NO：12并且编码CFI的核苷酸序列是SEQ ID NO：10。

在一些实施方案中，多核苷酸包含SEQ ID NO：22的核苷酸序列，或与其具有至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的核苷酸序列。

在一些实施方案中，多核苷酸包含SEQ ID NO：23的核苷酸序列，或与其具有至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的核苷酸序列。

在一些实施方案中，多核苷酸小于或等于5.2、5.1、5.0、4.9、4.8或4.7kb。在优选的实施方案中，多核苷酸小于或等于4.7kb。

在另一方面，本发明提供了一种包含本发明的多核苷酸的载体。

在一些实施方案中，载体是腺相关病毒(AAV)、逆转录病毒、慢病毒或腺病毒载体。

在优选的实施方案中，载体是AAV载体。

在一些实施方案中，载体是病毒载体颗粒的形式。

在一些实施方案中，AAV载体颗粒包含AAV2或AAV8基因组。

在一些实施方案中，AAV载体颗粒包含AAV2或AAV8衣壳蛋白。

在一些实施方案中，AAV载体颗粒包含AAV2基因组和AAV2衣壳蛋白(AAV2/2)。在一些实施方案中，AAV载体颗粒包含AAV2基因组和AAV2衣壳蛋白(AAV2/8)。在其他实施方案中，AAV载体颗粒包含AAV8基因组和AAV8衣壳蛋白(AAV8/8)。

在另一方面，本发明提供了一种包含本发明的多核苷酸的细胞。

在另一方面，本发明提供了一种用本发明的载体转导的细胞。

在另一方面，本发明提供了一种药物组合物，其包含本发明的多核苷酸、载体或细胞，与药学上可接受的载剂、稀释剂或赋形剂组合。

在优选的实施方案中，药物组合物用于眼内施用。

在另一方面，本发明提供了用于疗法的本发明的多核苷酸、载体或细胞。

在另一方面，本发明提供了用于治疗或预防眼部病症的本发明的多核苷酸、载体或细胞。

在另一方面，本发明提供了用于治疗或预防补体介导或补体相关病症的本发明的多核苷酸、载体或细胞。

在另一方面，本发明提供了用于治疗或预防补体介导的眼部病症的本发明的多核苷酸、载体或细胞。

在另一方面，本发明提供了用于治疗或预防补体介导或补体相关的肾脏病症或补体介导或补体相关的中枢神经系统(CNS)病症的本发明的多核苷酸、载体或细胞。

在另一方面，本发明提供了一种治疗或预防补体介导或补体相关的眼部病症的方法，其包括向有需要的受试者施用本发明的多核苷酸、载体或细胞。

在另一方面，本发明提供了一种向受试者提供(i)补体因子I(CFI)辅因子；和(ii)补体因子I(CFI)的方法，其包括将本发明的多核苷酸、载体或细胞递送至受试者，优选地递送至受试者的眼睛。

在另一方面，本发明提供了一种向受试者提供(i)补体因子H样蛋白1(FHL1)或补体因子H(CFH)；和(ii)补体因子I(CFI)的方法，其包括将本发明的多核苷酸、载体或细胞递送至受试者的眼睛。

在一些实施方案中，病症与补体C3b反馈循环的过度活跃和/或C3b分解循环的活跃不足有关(参见图1)。

在一些实施方案中，病症是慢性补体介导或慢性补体相关炎性病状。

在一些实施方案中，病症是慢性补体介导的眼睛炎性病状。

在一些实施方案中，病症是年龄相关性黄斑变性(AMD)或糖尿病性视网膜病变。在其他实施方案中，病症是青光眼、斯塔加特病、中心性浆液性脉络膜视网膜病变或葡萄膜炎。优选地，葡萄膜炎是后葡萄膜炎。

在优选的实施方案中，病症是AMD。在一些实施方案中，AMD是干性AMD。

在一些实施方案中，受试者已被诊断患有AMD或有患AMD的风险。

在一些实施方案中，所述使用是用于治疗或预防受试者的病症，所述受试者：

(a)在眼睛和/或血清中具有低于正常的补体因子I活性或浓度，优选地在血清中具有0-30、0-20或0-10μg/mL的浓度或等效活性；和/或

(b)对于与年龄相关性黄斑变性(AMD)相关的SNP、优选罕见补体因子I变体是杂合的或纯合的。

在一些实施方案中，所述使用是用于治疗或预防受试者的病症，所述受试者：

(a)在眼睛和/或血清中具有正常水平的补体因子I活性或浓度，优选地在血清中至少30μg/mL，诸如30-40μg/mL；和/或

(b)不携带罕见的补体因子I变异等位基因。

在另一方面，本发明提供了用于治疗或预防年龄相关性黄斑变性(AMD)的本发明的多核苷酸、载体或细胞。在优选的实施方案中，AMD是干性AMD。

在另一方面，本发明提供了用于治疗或预防糖尿病性视网膜病变的本发明的多核苷酸、载体或细胞。

在一些实施方案中，预防或减少了地图状萎缩的形成，和/或减少了地图状萎缩的量。

在一些实施方案中，减慢了地图状萎缩的进展。

在一些实施方案中，相对于经过同一时间段的未治疗的眼睛，在向受试者的所治疗眼睛施用后经过12个月，地图状萎缩面积的增加至少减少了10％。在其他实施方案中，相对于经过同一时间段的未治疗的眼睛，在向受试者的所治疗眼睛施用后经过12个月，地图状萎缩面积的增加至少减少了20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。

在一些实施方案中，多核苷酸、载体或细胞的施用增加了在受试者或受试者的眼睛，诸如视网膜色素上皮(RPE)中的C3b灭活和iC3b降解活性的水平，任选地增加到超过受试者或其眼睛或RPE中的正常水平的水平。

在另一方面，本发明提供了用于改善或恢复例如患有眼部病症，诸如本文公开的眼部病症的受试者的视觉或视敏度的本发明的多核苷酸、载体或细胞。在另一方面，本发明提供了用于减轻视觉或视敏度的丧失，例如与眼部病症，诸如本文公开的眼部病症相关的视觉或视敏度丧失的本发明的多核苷酸、载体或细胞。

在另一方面，本发明提供了用于提高或恢复受试者，例如患有眼部病症，诸如本文公开的眼部病症的受试者的阅读速度的本发明的多核苷酸、载体或细胞。在另一方面，本发明提供了用于减轻受试者的阅读速度的降低，例如与眼部病症，诸如本文公开的眼部病症相关的阅读速度的降低的本发明的多核苷酸、载体或细胞。

在另一方面，本发明提供了用于减少或预防光感受器和/或视网膜色素上皮(RPE)的损失，例如与眼部病症，诸如本文公开的眼部病症相关的光感受器和/或RPE的损失的本发明的多核苷酸、载体或细胞。

在一些实施方案中，多核苷酸、载体或细胞是眼内施用的。

在一些实施方案中，多核苷酸、载体或细胞通过视网膜下、直接视网膜、脉络膜上或玻璃体内注射施用于受试者的眼睛。

在一些实施方案中，多核苷酸、载体或细胞通过视网膜下注射施用于受试者的眼睛。

在一些实施方案中，本发明的多核苷酸或载体不包含hAAT启动子。在一些实施方案中，本发明的多核苷酸或载体不包含ApoR增强子。在其他实施方案中，本发明的多核苷酸或载体不包含两个ApoR增强子。

在一些实施方案中，本发明的载体不包含AAV2基因组和AAV8衣壳蛋白，即本发明的载体不是AAV2/8载体。

在一些实施方案中，本发明的多核苷酸、载体或细胞不是全身施用的。在其他实施方案中，本发明的多核苷酸、载体或细胞不是静脉内施用的。

本领域技术人员应当理解，以上关于AMD治疗的描述是基于调节过度激活的补体系统(由于过度活跃的C3b反馈循环和/或不活跃的C3b分解循环)的理论，并且因此(具体涉及眼内施用的文字除外)所述描述同样适用于涉及补体系统的其他慢性炎性病状。可以通过全身施用(例如通过外周静脉输注)、局部施用(例如鞘内)或直接递送至靶组织或器官(例如，肝脏、肾脏)来施用本文所述的产物、蛋白质、载体、细胞和组合物来治疗此类病症。

附图说明

图1

脊椎动物补体旁路途径的C3b反馈(扩增)和分解(下调)循环(“I”＝补体因子I、“H”＝补体因子H、“B”＝补体因子B以及“D”＝补体因子D)。

图2

(A)基于C3b至iC3b裂解的ELISA法测量的辅因子测定。CFI和C3b的浓度是固定的，并以指定的比率进行CFH或FHL1滴定。

(B)基于向正常血清补充补体因子I(FI)、补体因子H(FH)或补体因子H样蛋白1(FHL1)的LPS沉积测定。

图3

来自HEK293细胞载体转导的上清液的蛋白质印迹分析(RC001，包含野生型FHL1的对照载体；GT005，包含野生型CFI的对照载体)。

图4

来自HEK293细胞载体转导的上清液的ELISA分析(RC001，包含野生型FHL1的对照载体；GT005，包含野生型CFI的对照载体)。

图5

载体基因组包装的碱性凝胶分析(上图)。由qPCR和衣壳ELISA确定的全病毒颗粒:空病毒颗粒比率的比较(下图)。(RC001，包含野生型FHL1的对照载体；GT005，包含野生型CFI的对照载体)。

图6

使用蛋白质印迹分析(上图)和ELISA(下图)的C3b裂解测定。(RC001，包含野生型FHL1的对照载体；GT005，包含野生型CFI的对照载体)。

图7

在血浆(n＝80)和玻璃体液(n＝29)中的补体因子I(FI):补体因子H(FH)比率的比较。

图8

用于测量C3沉积的LPS沉积测定。Fl＝补体因子I，sCR1＝可溶性补体受体1，FH＝补体因子H，FHL1＝因子H样蛋白1。每个条形上方的数字显示与仅血清相比，C3沉积减少的百分比。

图9

体外转导的HEK-293细胞上清液的蛋白质印迹分析。UTC＝未转导的细胞、GT005＝表达CFI的AAV、GT007＝表达CFI和FHL1的AAV、RC001＝表达FHL1的AAV。

图10

用于测试构建体功能活性的辅因子测定的C3b蛋白质印迹和iC3b ELISA。(A)C3b辅因子测定的蛋白质印迹。(B)C3b辅因子测定的iC3b ELISA。C3b＝补体C3b、CFI＝补体因子I、FHL1＝补体因子H样蛋白1、UTD＝未转导的细胞。

图11

脉络膜铺片(flatmount)中的同工凝集素染色面积。通过Kolmogorov-Smirnov检验评估，同工凝集素染色面积数据是非正态分布的，并且使用广义线性模型分析确定所观察到的差异的统计显著性。*＝P<0.05；***＝P<0.0001，****＝P<0.00001。点代表单个激光烧伤的结果，线代表平均值。

具体实施方式

如本文所用的术语“包含(comprising)”、“包含(comprises)”和“包含(comprisedof)”与“包括(including)”、“包括(includes)”或“含有(containing)”、“含有(contains)”同义，并且是包容性的或开放式的，不排除额外的、未列举的成员、元素或步骤。术语“包含(comprising)”、“包含(comprises)”和“包含(comprised of)”还包括术语“由……组成”。

补体系统

补体系统是体液免疫系统的一个组成部分，并且参与组织炎症、细胞调理和细胞溶解。它提供针对微生物的保护并介导外源性和内源性细胞碎片从宿主组织中的清除。

补体系统级联包含三个激活途径。所有途径最终都以C3因子的中心裂解和其活性片段C3a和C3b的产生结束。C3a是一种过敏毒素，其触发一系列趋化和促炎反应，诸如募集炎症细胞和增加微血管通透性，而C3b负责与C3b共价连接的外来表面的调理作用。激活的C3片段(C3b和iC3b)的调理作用实现三个主要功能：(i)由吞噬细胞(例如巨噬细胞或小胶质细胞)消除细胞碎片并且刺激适应性免疫系统(B和T细胞)；(ii)通过表面结合的C3转化酶的形成来扩增补体激活；和(iii)C5转化酶的装配。

C5转化酶的装配负责C5裂解，导致形成能够在细胞膜上产生穿孔的溶细胞膜攻击复合物(MAC)，从而促进细胞溶解和不必要细胞的消除。通过所有这些活动，先天补体级联支持并促进免疫系统的保护宿主组织完整性的下游机制的功能。总的来说，补体系统途径激活导致促炎反应，包括MAC产生，其介导细胞溶解、释放趋化因子以将炎症细胞吸引到损伤部位，以及增强毛细血管通透性以促进浸润性白细胞的外渗。在生理条件下，补体激活通过可溶性的和膜相关的补体调节分子(CRM)的协调作用而得到有效控制。可溶性补体调节剂，诸如C1抑制剂、过敏毒素抑制剂、C4b结合蛋白(C4BP)、补体因子H(CFH)、补体因子I(CFI)、簇集蛋白和玻连蛋白，在级联反应的多个位点限制补体在人体组织中的作用。此外，每个单个细胞都受到表面蛋白，诸如补体受体1(CR1，CD35)、膜辅因子蛋白(CD46)和糖基磷脂酰肌醇锚定蛋白，诸如衰变加速因子(CD55)或CD59分子的保护，免受同源补体的攻击。值得注意的是，未充分保护免受补体攻击的宿主细胞和组织可能会受到旁邻细胞溶解的影响。

本发明涉及例如眼睛的补体介导病症的治疗或预防。例如，补体介导的病症可以是与旁路途径调节缺陷相关的病症，并且具体地是与补体C3b反馈循环的过度活性和/或C3b分解循环的活性不足相关的病症。

在一些实施方案中，在施用本发明的产物、多核苷酸、载体、细胞或药物组合物之前，受试者具有低水平(例如低于正常水平)的补体因子I活性，例如眼睛中低水平的补体因子I活性和/或低血清水平的补体因子I活性。补体因子I活性低于正常水平可能是由于功能正常的补体因子I低于正常表达，或补体因子I的非或亚功能变体的至少部分(例如杂合)表达(在正常或低于正常水平)。(这样的受试者可携带AMD相关SNP的一个或多个拷贝，例如对于下文进一步讨论的罕见补体因子I变体之一，受试者可以是纯合的或杂合的)。因此，受试者在眼睛和/或血清中可具有低浓度(例如低于正常浓度)的补体因子I。对于人受试者，补体因子I活性(C3b灭活和iC3b降解活性)的正常水平可相当于受试者血清中30-40μg/mL补体因子I所提供的水平。因此，在具有低补体因子I活性的受试者中，血清中的补体因子I活性可对应于小于30μg/mL且大于0μg/mL的补体因子I，诸如0-20或0-10μg/mL(这些是补体因子I血清浓度的范围，其可涵盖具有低补体因子I浓度的受试者)。

因此，本发明待治疗的受试者可患有补体介导的眼部病症，诸如AMD，更具体地是干性AMD(例如以地图状萎缩为特征)，或者可以有发展这种病症的风险。例如，受试者可以对于与补体介导病症相关的一种或多种SNP是纯合或杂合敏感的。

在一些实施方案中，受试者有发展AMD的风险。例如，受试者可以对于与AMD相关的一个或多个SNP是纯合或杂合敏感的，例如与晚期AMD相关的补体因子I中的罕见突变，其通常导致血清补体因子I水平降低(Kavanagh等人(2015)Hum Mol Genet 24：3861-3870)。具体地，受试者可携带一种或多种以下罕见补体因子I变体的一个或两个拷贝：rs144082872(编码P50A)、4:110687847(编码P64L)、rs141853578(编码G119R)、4:110685721(编码V152M)、4:110682846(编码G162D)、4:110682801(编码N177I)、rs146444258(编码A240G)、rs182078921(编码G287R)、rs41278047(编码K441R)和rs121964913(编码R474)。

本发明还可以包括确定受试者是否具有发展补体介导病症(例如，AMD)的风险，例如通过确定受试者对于一种或多种与补体介导的病症相关的SNP是纯合还是杂合敏感的(例如，通过确定受试者对于一种或多种与上面列出的AMD相关的罕见补体因子I变体是纯合还是杂合敏感的)。

另选地，受试者可以例如在眼睛和/或血清中具有正常水平的内源性补体因子I活性或浓度，和/或可以不携带罕见的变异补体因子I等位基因。

在一些实施方案中，本发明的产物、多核苷酸、载体、细胞或药物组合物的施用从而增加受试者眼睛中C3b灭活和iC3b降解活性的水平。在其他实施方案中，本发明的产物、多核苷酸、载体、细胞或药物组合物的施用从而将受试者眼睛中的C3b灭活和iC3b降解活性水平增加至超过眼睛中正常水平的水平。更具体地，眼睛的RPE中C3b灭活和iC3b降解活性的水平增加。

应当理解，在提供本发明的产物和/或从本发明的多核苷酸或载体表达补体因子I和CFI辅因子诸如补体因子H样蛋白1之后，受试者中的C3b灭活和iC3b降解活性可以包括来自受试者内源性补体因子I(即，不是由所述产物提供的或从所述多核苷酸或载体的表达产生的受试者补体因子I)的C3b灭活和iC3b降解活性，以及由本发明的产物提供的或通过从本发明的多核苷酸或载体表达产生的C3b灭活和iC3b降解活性，使得受试者的C3b灭活和iC3b降解活性的总水平超过正常水平。

在一些实施方案中，在受试者中，例如眼睛中的C3b灭活和iC3b降解活性水平增加到比正常水平高至少5％、10％、15％、20％或25％的水平。

在其他实施方案中，在受试者中，例如眼睛中的C3b灭活和iC3b降解活性水平增加到至多正常水平的两倍或比正常水平高至多80％、60％、40％或20％。

例如，在受试者中，例如眼睛中的C3b灭活和iC3b降解活性水平可以增加到比正常水平高5-100％、5-80％、5-60％、5-40％、5-20％、10-100％、10-80％、10-60％、10-40％、10-20％、15-100％、15-80％、15-60％、15-40％、15-20％、20-100％、20-80％、20-60％、20-40％、25-100％、25-80％、25-60％或25-40％的水平。

在一些实施方案中，本发明的产物、多核苷酸、载体、细胞或药物组合物的施用不会明显增加受试者血浆/血清中C3b灭活和iC3b降解活性的水平。在其他实施方案中，本发明的产物、多核苷酸、载体、细胞或药物组合物的施用不会将受试者血浆/血清中C3b灭活和iC3b降解活性的水平明显地增加至高于正常水平的水平。

在上述部分中，除非明显不适用，否则提及补体因子I和C3b灭活和iC3b降解活性可替换为CFI辅因子，优选补体因子H或补体因子H样蛋白1，以及充当辅因子用于补体因子I介导的C3b裂解并分别增加C3转化酶和C5转化酶的解离速率的能力。在一些实施方案中，在施用本发明的产物、多核苷酸、载体、细胞或药物组合物之前，受试者具有低水平(例如低于正常水平)的补体因子H，例如眼睛中低水平的补体因子H和/或低血清水平的补体因子H。对于人受试者，受试者血清中补体因子H的正常水平可为约200-500μg/mL。因此，在具有低水平补体因子H的受试者中，血清中的水平可低于200μg/mL且高于0μg/mL，诸如0-100μg/mL。另选地，例如在眼睛和/或血清中，受试者可具有正常水平的内源性补体因子H。

补体因子I(CFI)

补体因子I(因子I，CFI)，也称为C3b/C4b灭活剂，是一种在人体中由CFI基因编码的蛋白质。

补体因子I是一种丝氨酸蛋白酶，以～35μg/mL的浓度(Nilsson等人(2011)MolImmunol 48:1611-1620)以酶原样状态循环(Roversi等人(2011)PNAS 108:12839-12844)。补体因子I蛋白是一种高度N-糖基化的异源二聚体，由通过一个二硫键连接的两个多肽链组成。重链(50kDa)包含N端区域、Fl膜攻击复合物(FIMAC)结构域、CD5样结构域或清道夫受体富含半胱氨酸(SRCR)结构域、两个低密度脂蛋白受体(LDLr)结构域和功能未知的、为物种间序列变异位点的C端区域(Roversi等人(2011)PNAS 108:12839-12844)。轻链(38kDa)包含具有保守催化残基的丝氨酸蛋白酶(SP)结构域(Goldberger等人(1987)J Biol Chem262：10065-10071)。

补体因子I通过将C3b裂解为iC3b、C3d和C3d,g来使C3b灭活并且以类似方式将C4b裂解为C4c和C4d。为了正确发挥其功能，补体因子I需要存在辅因子蛋白，诸如C4b结合蛋白(C4BP)、补体因子H(CFH)、补体受体1(CR1/CD35)和膜辅因子蛋白(MCP/CD46)(Degn等人(2011)Am J Hum Genet 88:689-705)。

iC3b不能与因子B相关联，并且因此不能使通过旁路途径的补体级联扩增或激活持续下去。因此，一旦C3b被裂解为iC3b，旁路途径起始和末端补体级联激活都不会发生。

iC3b能够通过结合并激活多形核白细胞(主要是中性粒细胞)、NK细胞和单核吞噬细胞(诸如巨噬细胞)上的补体受体3(CR3)(CD11b/CD18)来提供促炎作用。

补体因子I能够通过需要辅因子CR1的蛋白酶活性将iC3b加工成C3dg。C3dg无法结合CR3。由于iC3b与补体受体CR3反应是补体激活引起炎症的主要机制，iC3b分解为C3dg对减少补体诱导的炎症至关重要(Lachmann(2009)Adv.Immunol.104：115-149)。

补体因子I具有促进C3b裂解为iC3b以及加速iC3b分解的独特能力-再结合其在人血清中相对较低的浓度，对达到治疗效果所需的递送量有影响-使其成为一个特别有利的靶点。

在一些实施方案中，补体因子I多肽能够将C3b裂解成无活性的降解产物。例如，补体因子I多肽可能够将C3b裂解成iC3b。

在一些实施方案中，补体因子I多肽能够将iC3b加工成无活性的降解产物。例如，补体因子I多肽可能够将iC3b加工成C3dg。

在优选的实施方案中，补体因子I多肽能够将C3b裂解成iC3b并将iC3b加工成C3dg。

适当地，补体因子I的片段或衍生物可以保留天然补体因子I的C3b灭活和iC3b降解活性的至少50％、60％、70％、80％、90％、95％或100％。

补体因子I或其片段或衍生物的C3b灭活和iC3b降解活性可以使用技术人员已知的任何合适的方法来确定。例如，补体因子I蛋白水解活性的测量在Hsiung等人(Biochem.J.(1982)203:293-298)中有所描述，CFI活性的溶血和共凝集(conglutinating)测定均在Handbook of Experimental Immunology,第3版,DM Weir Blackwells编,Scientific Publications,第5A章第17页中的Lachmann PJ&Hobart MJ(1978)"Complement Technology"中有所描述。由在"Weir's Handbook of Experimentalimmunology”第5版；Herzenberg Leonore A'Weir DM,Herzenberg Leonard A&BlackwellC Blackwells编,Scientific Publications第75章第36-37页中的Harrison RA(1996)进行了更详细的描述，也包括蛋白水解测定。共凝集测定灵敏度高，能够用于检测将固定的C3b转化为iC3b和获得与共凝集素(conglutinin)的反应性的第一(双)夹(clip)；以及用于通过从固定的iC3b开始并寻找与共凝集素的反应性丧失来检测C3dg的最后夹。溶血测定用于将C3b转化为iC3b，并且蛋白水解测定检测所有夹。

在一些实施方案中，补体因子I是人补体因子I。

一种示例人补体因子I蛋白是具有UniProtKB登录号P05156的人补体因子I蛋白。此示例性序列的长度为583个氨基酸(如SEQ ID NO：1所公开的)，其中的氨基酸1至18形成信号序列。

在一些实施方案中，补体因子I的氨基酸序列是SEQ ID NO：1。在其他实施方案中，补体因子I的氨基酸序列是如SEQ ID NO：1的位置19至583所公开的序列。

在一些实施方案中，补体因子I的氨基酸序列是SEQ ID NO：9，其对应于NCBI登录号NP_000195。在其他实施方案中，补体因子I的氨基酸序列是如SEQ ID NO：9的位置19至583所公开的序列。

编码补体因子I的示例野生型核苷酸序列是具有NCBI登录号NM_000204的核苷酸序列，本文公开为SEQ ID NO：2。

在一些实施方案中，用于本发明的补体因子I的核苷酸序列是密码子优化的。不同的细胞在特定密码子的使用方面有所不同。这种密码子偏好性对应于细胞类型中特定tRNA的相对丰度的偏好性。通过改变序列中的密码子，使它们被定制为与对应tRNA的相对丰度相匹配，可以增加表达。出于同样的原因，可以通过有意选择在特定细胞类型中对应tRNA已知是罕见的密码子来降低表达。因此，可获得额外程度的翻译控制。

编码补体因子I的优选核苷酸序列是如SEQ ID NO：10所公开的核苷酸序列。

编码补体因子I的另一示例密码子优化核苷酸序列是SEQ ID NO：8。

在一些实施方案中，编码补体因子I的核苷酸序列与SEQ ID NO：10、8或2，优选SEQID NO：10具有至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。优选地，由所述核苷酸序列编码的蛋白质基本上保留了由SEQ ID NO：1或9表示的蛋白质的功能活性。

在其他实施方案中，编码补体因子I的核苷酸序列是SEQ ID NO：10、8或2，优选SEQID NO：10。

在其他实施方案中，编码补体因子I的核苷酸序列与SEQ ID NO：10、8或2，优选SEQID NO：10的位置55到1752具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、95％、99％、97％、98％或99％的同一性。优选地，由所述核苷酸序列编码的蛋白质基本上保留了由SEQ ID NO：1或9表示的蛋白质的功能活性。

在其他实施方案中，编码补体因子I的核苷酸序列是SEQ ID NO：10、8或2，优选SEQID NO：10的位置55至1752。

在其他实施方案中，编码补体因子I的核苷酸序列编码与SEQ ID NO：1或9具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。优选地，其中氨基酸序列基本上保留了由SEQ ID NO：1或9表示的蛋白质的功能活性。

在其他实施方案中，编码补体因子I的核苷酸序列编码氨基酸序列SEQ ID NO：1或9。

在其他实施方案中，编码补体因子I的核苷酸序列编码与SEQ ID NO：1或9的位置19至583具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。优选地，其中氨基酸序列基本上保留了由SEQ ID NO：1或9表示的蛋白质的功能活性。

在其他实施方案中，编码补体因子I的核苷酸序列编码SEQ ID NO：1或9的位置19至583的氨基酸序列。

本发明的一个优点是补体因子I特别难以以纯化蛋白质的形式制备。因此，本发明人设计了一种通过以包含编码补体因子I的核苷酸序列的AAV载体形式施用补体因子I来调节补体系统的方式，例如以实现年龄相关性黄斑变性(AMD)的治疗。可以将AAV载体施用于所关注部位，例如眼睛，以实现补体因子I多肽的原位翻译。

补体因子I(CFI)辅因子

如本文所用，术语“补体因子I(CFI)辅因子”可以指能够充当CFI介导的C3b裂解的辅因子的蛋白质。

在一些实施方案中，补体因子I(CFI)辅因子选自由以下组成的组：补体因子H样蛋白1(FHL1)；补体因子H(CFH)；补体受体1(CR1)或其片段；和膜辅因子蛋白(MCP)或其片段。

在一些实施方案中，补体因子I(CFI)辅因子是补体因子H(CFH)。在一些实施方案中，补体因子I(CFI)辅因子是补体受体1(CR1)或其片段。在一些实施方案中，补体因子I(CFI)辅因子是膜辅因子蛋白(MCP)或其片段。

在优选的实施方案中，补体因子I(CFI)辅因子是补体因子H样蛋白1(FHL1)。

补体因子H(CFH)

补体因子H(因子H，CFH)是一种补体控制蛋白。

补体因子H是一种大(155kDa)的可溶性糖蛋白，以200-300μg/mL的典型浓度存在于人血浆中(Hakobyan等人(2008)49(5):1983-90)。补体因子H的主要功能是调节补体系统的旁路途径。

补体因子H为补体因子I介导的C3b裂解提供辅因子活性。补体因子H还增加了C3bBb复合物(C3转化酶)和(C3b)NBb复合物(C5转化酶)的解离速率，从而降低了补体旁路途径的活性。

补体因子H由20个补体控制蛋白(CCP)模块(也称为短共有重复或寿司结构域)组成，这些模块通过短接头(3到8个氨基酸残基)相互连接，并以头尾延伸的方式排列。每个CCP模块由大约60个氨基酸组成，其中具有以1-3 2-4排列通过二硫键键合的四个半胱氨酸残基，以及围绕几乎不变的色氨酸残基构建的疏水核心。CCP模块编号为1-20(从蛋白质的N端)。CCP1-4和CCP19-20与C3b接合，而CCP6-8和CCP19-20与GAG和唾液酸结合(Schmidt等人(2008)Journal of Immunology 181:2610-2619)。

已表明，使用补体因子H的基因疗法能够改善小鼠中诱导的AMD样病理(Cashman等人(2015)J.Gene Med.17:229-243)，小鼠视网膜下共注射：(i)表达补体成分C3的腺病毒载体，其先前已被证明可重现人AMD的许多病理特征；和(ii)表达补体因子H的腺病毒载体。相对于接受GFP而非补体因子H的对照动物，补体因子H转导的小鼠显示内皮细胞增殖减少91％，RPE萎缩减弱69％。视网膜电图显示，接受补体因子H的小鼠视网膜功能得到改善，并且视紫红质和RPE65的免疫细胞化学与此类动物中光感受器和RPE的补救一致。

在一些实施方案中，补体因子H多肽或其片段或衍生物能够充当补体因子I介导的C3b裂解的辅因子。在一些实施方案中，补体因子H多肽或其片段或衍生物能够增加C3转化酶和C5转化酶的解离速率。

在优选的实施方案中，补体因子H多肽或其片段或衍生物能够充当补体因子I介导的C3b裂解的辅因子并且增加C3转化酶和C5转化酶的解离速率。

在一些实施方案中，补体因子H是人补体因子H。

一种示例人补体因子H蛋白是具有UniProtKB登录号P08603的人补体因子H蛋白。此示例性序列的长度为1231个氨基酸(如SEQ ID NO：3所公开的)，其中的氨基酸1至18形成信号序列。

在一些实施方案中，补体因子H的氨基酸序列是SEQ ID NO：3。在其他实施方案中，补体因子H的氨基酸序列是SEQ ID NO：3的位置19至1231。

编码补体因子H的示例核苷酸序列是具有NCBI登录号NM_000186的核苷酸序列。

在一些实施方案中，编码补体因子H的核苷酸序列是SEQ ID NO：4。

在一些实施方案中，编码补体因子H的核苷酸序列与SEQ ID NO：4具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。优选地，其中由所述核苷酸序列编码的蛋白质基本上保留了由SEQ ID NO：3表示的蛋白质的功能活性。

在一些实施方案中，编码补体因子H的核苷酸序列是SEQ ID NO：4。

在其他实施方案中，编码补体因子H的核苷酸序列与SEQ ID NO：4的位置55至3696具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。优选地，其中由所述核苷酸序列编码的蛋白质基本上保留了由SEQ ID NO：3表示的蛋白质的功能活性。

在其他实施方案中，编码补体因子H的核苷酸序列是SEQ ID NO：4的位置55至3696。

在其他实施方案中，编码补体因子H的核苷酸序列编码与SEQ ID NO：3具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。优选地，其中氨基酸序列基本上保留了由SEQ ID NO：3表示的蛋白质的功能活性。

在其他实施方案中，编码补体因子H的核苷酸序列编码氨基酸序列SEQ ID NO：3。

在其他实施方案中，编码补体因子H的核苷酸序列编码与SEQ ID NO：3的位置19至1231具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。优选地，其中氨基酸序列基本上保留了由SEQ ID NO：3表示的蛋白质的功能活性。

在其他实施方案中，编码补体因子H的核苷酸序列编码SEQ ID NO：3的位置19至1231的氨基酸序列。

补体因子H样蛋白1(FHL1)

补体因子H样蛋白1(FHL1)是补体因子H的一个剪接变体，它包含补体因子H的前7个CCP，后跟一个四个氨基酸的羧基末端尾(Clark,SJ,等人(2015)J Clin Med 4:18-31)。

在一些实施方案中，FHL1是人FHL1。

在一些实施方案中，FHL1的氨基酸序列是SEQ ID NO：11。

编码FHL1的一个示例核苷酸序列是：

本发明中使用的FHL1的核苷酸序列优选是密码子优化的。

编码FHL1的优选核苷酸序列是SEQ ID NO：12。

在一些实施方案中，编码FHL1的核苷酸序列与SEQ ID NO：12或16，优选SEQ IDNO：12具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。优选地，由所述核苷酸序列编码的蛋白质基本上保留了由SEQ ID NO：11表示的蛋白质的功能活性。

在其他实施方案中，编码FHL1的核苷酸序列是SEQ ID NO：12或16，优选SEQ IDNO：12。

补体受体1(CR1)

补体受体1(CR1)，也称为CD35，是一种I型膜结合糖蛋白，属于补体活性(RCA)家族的调节剂。CR1可在红细胞、嗜酸性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、B淋巴细胞、CD4+T细胞亚群、树突细胞、皮肤中的朗格罕细胞和肾小球足细胞的质膜上被发现。

CR1是一种～200kDa的单链糖蛋白，其细胞外部分包含30个补体控制蛋白重复(CCP)或短共有重复。在血浆中发现了一种非膜结合可溶性形式的CR1(sCR1)。它可能是通过裂解表面形式的CR1从白细胞中释放产生的。CR1和sCR1的结构在，例如，Liu，D.等人(2009)Immunopharmacology and Immunotoxicology 31:524-535中有所描述。

在一些实施方案中，CR1或其片段是人CR1或其片段。

示例CR1序列是：

编码CR1的示例核苷酸序列是：

在一些实施方案中，CR1或其片段是可溶性CR1(sCR1)。

CR1片段优选能够充当CFI介导的C3b裂解的辅因子。技术人员将能够使用本领域已知的任何合适的方法(例如本文所公开的)容易地确定这种CFI活性。

CR1包含两个已知的C3b结合位点(参见Liu,D.等人(2009)Immunopharmacologyand Immunotoxicology 31:524-535)。在优选的实施方案中，CR1片段包含一个或两个C3b结合位点。

优选地，CR1的片段是CR1的可溶性片段，例如通过从全长CR1中去除跨膜和细胞质结构域和/或通过选择包含某些CCP或由某些CCP组成的CR1截短物产生。

示例CR1片段是本领域已知的(参见，例如，WO2019138137)。例如，CR1片段可以包含CCP8-10或由CCP8-10组成(例如对应于SEQ ID NO：24的氨基酸491至684)和/或CCP15-17(例如对应于SEQ ID NO：24的氨基酸941至1134)。

在一些实施方案中，CR1片段包含CCP8-10。在一些实施方案中，CR1片段包含CCP15-17。在一些实施方案中，CR1片段包含CCP8-10和CCP15-17。

在其他实施方案中，编码CR1的核苷酸序列编码与SEQ ID NO：24具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。优选地，其中氨基酸序列基本上保留了由SEQ ID NO：24表示的蛋白质的功能活性。

在其他实施方案中，编码CR1的核苷酸序列编码氨基酸序列SEQ ID NO：24。

在其他实施方案中，编码CR1的核苷酸序列编码与SEQ ID NO：24的位置491至684具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。优选地，其中氨基酸序列基本上保留了由SEQ ID NO：24表示的蛋白质的功能活性。

在其他实施方案中，编码CR1的核苷酸序列编码SEQ ID NO：24的位置491至684的氨基酸序列。

在其他实施方案中，编码CR1的核苷酸序列编码与SEQ ID NO：24的位置941至1134具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。优选地，其中氨基酸序列基本上保留了由SEQ ID NO：24表示的蛋白质的功能活性。

在其他实施方案中，编码CR1的核苷酸序列编码SEQ ID NO：24的位置941至1134的氨基酸序列。

膜辅因子蛋白(MCP)

膜辅因子蛋白(MCP)，也称为CD46，是一种I型膜蛋白，作为补体系统的调节部分并且充当CFI的辅因子。

MCP的细胞外区域包含四个短共有重复(SCR)。

在一些实施方案中，MCP或其片段是人MCP或其片段。

示例MCP序列是：

编码MCP的示例核苷酸序列是：

在一些实施方案中，MCP或其片段是可溶性MCP。

MCP片段优选能够充当CFI介导的C3b裂解的辅因子。技术人员将能够使用本领域已知的任何合适的方法(例如本文所公开的)容易地确定这种CFI活性。

优选地，MCP的片段是MCP的可溶性片段，例如通过从全长MCP中去除跨膜和/或通过选择包含某些SCR或由某些SCR组成的MCP截短物产生。

在一些实施方案中，MCP片段包含SCR2和3。在一些实施方案中，MCP片段包含SCR2、3和4。

在其他实施方案中，编码MCP的核苷酸序列编码与SEQ ID NO：26具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。优选地，其中氨基酸序列基本上保留了由SEQ ID NO：26表示的蛋白质的功能活性。

在其他实施方案中，编码MCP的核苷酸序列编码氨基酸序列SEQ ID NO：26。

接头

在优选的实施方案中，编码(i)的核苷酸序列位于编码(ii)的核苷酸序列的上游。在其他实施方案中，编码(ii)的核苷酸序列位于编码(i)的核苷酸序列的上游。

在一些实施方案中，编码(i)和(ii)的核苷酸序列通过接头可操作地连接。在一些实施方案中，接头包含自裂解2A肽序列，诸如包含弗林蛋白酶裂解位点、GSG、11a1D和F2A序列或由它们定义的序列。

在一些实施方案中，接头是SEQ ID NO：17。

在其他实施方案中，接头与SEQ ID NO：17具有至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。优选地，接头基本上保留了SEQ ID NO：17的功能活性。

“可操作地连接”应理解为，各个部件以使得它们能够基本上不受阻碍地执行其功能的方式连接在一起。

产物

本发明的产物可以是，例如，组合物(例如药物组合物)，其包含混合物形式的(i)补体因子I(CFI)辅因子；和(ii)补体因子I(CFI)，或编码它们的核苷酸序列。另选地，产物可以是，例如，药盒，其包含以下项的制剂：(i)补体因子I(CFI)辅因子；和(ii)补体因子I(CFI)，或编码它们的核苷酸序列，以及任选地，将制剂同时、依序或单独施用给有需要的受试者的说明书。

本发明的产物可以是，例如，组合物(例如药物组合物)，其包含混合物形式的(i)补体因子H样蛋白1(FHL1)或补体因子H(CFH)；和(ii)补体因子I(CFI)，或编码它们的核苷酸序列。另选地，产物可以是，例如，药盒，其包含以下项的制剂：(i)补体因子H样蛋白1(FHL1)或补体因子H(CFH)；和(ii)补体因子I(CFI)，或编码它们的核苷酸序列，以及任选地，将制剂同时、依序或单独施用给有需要的受试者的说明书。

蛋白质转导

作为将多核苷酸递送至细胞的替代方案，本发明的产物和剂可通过蛋白质转导递送至细胞。

蛋白质转导可以是通过载体递送(Cai,Y.等人(2014)Elife 3:e01911；Maetzig,T.等人(2012)Curr.Gene Ther.12:389-409)，载体递送涉及病毒颗粒(例如慢病毒颗粒)的工程化以包含待递送至细胞的蛋白质。因此，当工程化病毒颗粒作为其自然生命周期的一部分进入细胞时，颗粒中包含的蛋白质被携带到细胞中。

蛋白质转导可以是通过蛋白质递送(Gaj,T.等人(2012)Nat.Methods 9:805-7)。例如，可以通过使用媒介物(例如脂质体)或甚至通过将蛋白质本身直接施用于细胞来实现蛋白质递送。

多核苷酸

本发明的多核苷酸可包含DNA或RNA，优选DNA。它们可以是单链或双链的。技术人员将理解，由于遗传密码的简并性，多个不同的多核苷酸能够编码相同的多肽。此外，应当理解，技术人员可以使用常规技术进行不影响由本发明的多核苷酸编码的多肽序列的核苷酸置换，以反映将在其中表达本发明多肽的任何特定宿主生物的密码子使用。

本文公开的本发明的核苷酸序列可在其3'端包含或缺少终止密码子，例如取决于它们在双顺反子载体中的位置。因此，本公开涵盖其中存在或不存在终止密码子的本文公开的SEQ ID NO。

可以通过本领域可用的任何方法来修饰多核苷酸。可以进行此类修饰以增强本发明的多核苷酸的体内活性或寿命。

多核苷酸诸如DNA多核苷酸可以重组方式、合成方式或通过本领域技术人员可用的任何方式产生。它们也可通过标准技术克隆。

更长的多核苷酸通常使用重组方式产生，例如使用聚合酶链反应(PCR)克隆技术。这将涉及制作一对引物(例如约15至30个核苷酸)，位于想要克隆的靶序列的侧翼，使引物与从动物或人细胞获得的mRNA或cDNA接触，在引起所需区域扩增的条件下进行聚合酶链反应，分离扩增的片段(例如通过用琼脂糖凝胶纯化反应混合物)并回收扩增的DNA。引物可以设计成含有合适的限制酶识别位点，以便扩增的DNA能够被克隆到合适的载体中。

在一些实施方案中，多核苷酸包含以下项或由以下项组成：SEQ ID NO：22的核苷酸序列，或与其具有至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的核苷酸序列。

在一些实施方案中，多核苷酸包含以下项或由以下项组成：SEQ ID NO：23的核苷酸序列，或与其具有至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的核苷酸序列。

眼睛的结构

可以将本文公开的药物递送至哺乳动物，优选与治疗或预防眼病，诸如年龄相关性黄斑变性(AMD)有关的人眼。

治疗眼病的技术人员将对眼睛的结构有详细而透彻的理解。但是，描述了以下与本发明特别相关的结构。

视网膜

视网膜是多层膜，衬于眼睛的内后房，并且感知通过视神经与大脑连通的视觉世界的图像。从眼睛的内侧到外侧按顺序，视网膜包括视网膜神经感觉层和视网膜色素上皮层，与位于视网膜色素上皮外侧的脉络膜。

视网膜神经感觉层和光感受器细胞

视网膜神经感觉层拥有直接感知光的光感受器细胞。它包括以下几层：内界膜(ILM)、神经纤维层、神经节细胞层、内丛状层、内核层、外丛状层、外核层(光感受器的核)、外界膜(ELM)和光感受器(视杆细胞和视椎细胞的内段和外段)。

技术人员将对光感受器细胞有详细了解。简而言之，光感受器细胞是位于视网膜中将光转化为生物信号的特殊神经元。光感受器细胞包括视杆细胞和视锥细胞，它们在视网膜上的分布不同。

视杆细胞主要分布在视网膜的外部。它们高度敏感并且可在低光照水平下提供视觉。在正常的人视网膜中平均有约1.25亿个视杆细胞。

视锥细胞遍布视网膜，但特别高度集中在中央凹中，中央凹是视网膜神经感觉层中负责中央高分辨率视觉的一个凹坑。视锥细胞不如视杆细胞敏感。在正常的人视网膜中平均有约6-7百万个视椎细胞。

视网膜色素上皮

视网膜色素上皮(RPE)是紧邻视网膜神经感觉层外侧的色素细胞层。RPE执行多种功能，包括将营养物质和其他物质输送到光感受器细胞，以及吸收散射光以改善视觉。

脉络膜

脉络膜是位于眼睛的RPE和外巩膜之间的血管层。脉络膜的脉管系统能够为视网膜提供氧气和营养物质。

年龄相关性黄斑变性(AMD)

年龄相关性黄斑变性(AMD)的临床进展是根据黄斑的变化而分期表征的。早期AMD的标志是玻璃膜疣的出现，即视网膜下细胞外碎片的积累，并且在临床检查和眼底照片上表现为视网膜中的黄色斑点。玻璃膜疣根据尺寸分为小(<63pm)、中(63-124pm)和大(>124pm)。根据它们在眼科检查边缘的外观，它们也被认为是硬的或软的。硬玻璃膜疣具有清晰界定的边缘，而软玻璃膜疣具有不那么清晰界定的流体边缘。年龄相关眼病研究(A REDS)眼底照相严重程度量表是用于这种病状的主要分类系统之一。

AMD分为“干性”和“湿性”(渗出性或新生血管性)形式。干性AMD比湿性AMD更常见，但干性形式可以发展为湿性形式，并且在大量病例中两者同时发生。干性AMD的典型特征在于RPE层中的细胞、上覆光感受器细胞、更经常是脉络膜毛细血管层中的底层细胞的进行性凋亡。伴有上覆光感受器萎缩的RPE细胞死亡的汇合区域被称为地图状萎缩(GA)。患有这种形式的AMD的患者会经历中央视觉缓慢且渐进的恶化。

湿性AMD的特征在于从RPE和黄斑下方的脉络膜血管(脉络膜毛细血管)生长的异常血管的出血和/或流体渗漏，这可能是导致突然且致残的视觉丧失的原因。据估计，患者经历的大部分视觉丧失是由于这种脉络膜新血管形成(CNV)及其继发性并发症。

本文描述的AMD的治疗或预防可以减少或预防上述AMD表型的出现。优选地，AMD的治疗能够维持或改善视觉功能。

在一些实施方案中，AMD的治疗或预防结果是地图状萎缩的形成的预防或减少。在其他实施方案中，AMD的治疗或预防结果是减慢地图状萎缩的进展。例如，相对于经过同一时间段的未治疗的眼睛，在向受试者的所治疗眼睛施用后经过12个月，结果是GA面积的增加至少减少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。在其他实施方案中，AMD的治疗或预防结果是地图状萎缩的治疗，例如地图状萎缩量的减少。

在一些实施方案中，AMD的治疗或预防结果是玻璃膜疣的形成的预防或减少。在其他实施方案中，AMD的治疗或预防结果是现有玻璃膜疣的减少，例如现有玻璃膜疣的尺寸和/或数量的减小。

在一些实施方案中，AMD的治疗或预防结果是补体沉积的预防或减少。在其他实施方案中，AMD的治疗或预防结果是现有补体沉积的减少。

在一些实施方案中，AMD的治疗或预防结果是视觉或视敏度的改善或恢复。在其他实施方案中，AMD的治疗或预防减轻视觉或视敏度的丧失。

在一些实施方案中，AMD的治疗或预防结果是受试者阅读速度的提高或恢复。在其他实施方案中，AMD的治疗或预防减轻了受试者阅读速度的降低。

在一些实施方案中，AMD的治疗或预防结果是光感受器和/或视网膜色素上皮(RPE)损失的减少或预防。

糖尿病性视网膜病变

糖尿病性视网膜病变是一种以视网膜血管损伤为特征的病状，这是由与糖尿病相关的高血糖水平引起的。如果不及时治疗，糖尿病性视网膜病变会导致失明。

尽管患有轻度糖尿病性视网膜病变的受试者可能具有良好的视觉，但某些类型的糖尿病性视网膜病变，即糖尿病性黄斑水肿(DMO)和增殖性糖尿病视网膜病变(PDR)可能会威胁受试者的视力。

糖尿病性黄斑水肿的特征是从眼后部的受损血管中渗漏流体。渗漏的流体积聚在黄斑内，这导致肿胀和视觉模糊。这最终会造成中央视觉不佳以及无法阅读或驾驶。侧面视觉通常保持正常。

增殖性糖尿病视网膜病变的特征是视网膜血管闭合，导致视网膜表面上异常的脆弱血管生长。这可能会因眼睛出血、瘢痕化和视网膜脱离而导致永久性视觉丧失。非增殖性视网膜病变是糖尿病性视网膜病变的早期阶段，如果不及时治疗可能导致增殖性视网膜病变。因此，所有阶段和类型的糖尿病性视网膜病变都在治疗的考虑之内。

载体

载体是一种允许或促进实体从一个环境转移到另一个环境的工具。

腺相关病毒(AAV)载体

在一方面，本发明提供了包含本发明的多核苷酸的AAV载体。

优选地，AAV载体是AAV载体颗粒的形式。

制备和修饰病毒载体和病毒载体颗粒(诸如源自AAV的那些)的方法是本领域已知的。

AAV载体可包含AAV基因组或其片段或衍生物。

已知AAV能够包装至多5.2kb大小的基因组(Dong,J.-Y.等人(1996)Human GeneTherapy 7:2101-2112)。

AAV基因组是一个多核苷酸序列，它可以编码AAV颗粒的产生所需的功能。这些功能包括在宿主细胞中AAV的复制和包装周期中起作用的功能，包括将AAV基因组包封到AAV颗粒内。自然存在的AAV是复制缺陷型的，并且依赖于提供反式辅助功能来完成复制和包装周期。因此，本发明的AAV载体的AAV基因组通常是复制缺陷型的。

AAV基因组可以是正义或反义的单链形式，或者是双链形式。双链形式的使用使得避开靶细胞中的DNA复制步骤，因此能够加速转基因表达。

AAV基因组可来自任何天然来源的AAV血清型、分离株或进化枝。因此，AAV基因组可以是天然存在的AAV的全基因组。如技术人员所知，自然界中存在的AAV可根据各种生物系统进行分类。

通常，根据AAV的血清型来提及它们。血清型对应于AAV的变异亚种，所述变异亚种由于其衣壳表面抗原的表达谱而具有独特的反应性，可用于将其与其他变异亚种区分开来。通常，具有特定AAV血清型的病毒不会与对任何其他AAV血清型特异的中和抗体高效地交叉反应。

AAV血清型包括AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10和AAV11，以及最近从灵长类脑中鉴定出的重组血清型，诸如Rec2和Rec3。任何这些AAV血清型均可用于本发明。

在一些实施方案中，AAV载体颗粒是AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、Rec2或Rec3 AAV载体颗粒。

在一些实施方案中，AAV可以是AAV1、AAV2、AAV5、AAV7或AAV8血清型。

在一些实施方案中，AAV可以是AAV2或AAV8血清型。

在一些实施方案中，AAV可以是AAV2血清型。在其他实施方案中，AAV可以是AAV8血清型。

衣壳蛋白可以是突变衣壳蛋白，诸如在WO 2008/124724中所公开的，所述参考特此以引用的方式并入。

在一些实施方案中，AAV载体包含具有Y733F突变的AAV8衣壳。

对AAV血清型的综述可见于Choi等人(2005)Curr.Gene Ther.5:299-310和Wu等人(2006)Molecular Therapy 14:316-27。用于本发明的AAV基因组或AAV基因组元件的序列，包括ITR序列、rep或cap基因，可源自以下AAV全基因组序列的登录号：腺相关病毒1NC_002077，AF063497；腺相关病毒2NC_001401；腺相关病毒3NC_001729；腺相关病毒3BNC_001863；腺相关病毒4NC_001829；腺相关病毒5Y18065、AF085716；腺相关病毒6NC_001862；禽AAV ATCC VR-865AY186198、AY629583、NC_004828；禽AAV毒株DA-1NC_006263、AY629583；牛AAV NC_005889、AY388617。

AAV也可以根据进化枝或克隆来提及。这是指天然来源的AAV的系统发育关系，并且通常是指可以追溯到共同祖先的AAV系统发育群，并且包括其所有后代。另外，AAV可以根据特定分离株，即自然界中发现的特定AAV的遗传分离株来提及。术语“遗传分离株”描述了这样的AAV种群，其与其他天然存在的AAV进行有限遗传混合，从而在遗传水平上定义了可识别的独特种群。

技术人员能够基于他们的公知常识选择用于本发明的适当的AAV血清型、进化枝、克隆或分离株。例如，AAV5衣壳已表明能够高效地转导灵长类视锥光感受器，遗传性色视觉缺陷的成功矫正就证明了这一点(Mancuso等人(2009)Nature 461:784-7)。

AAV血清型决定了AAV感染的组织特异性(或向性)。因此，根据本发明用于向患者施用的AAV的优选AAV血清型是那些对眼内靶细胞具有天然向性或高感染效率的AAV血清型。在一些实施方案中，用于本发明的AAV血清型是那些转导视网膜神经感觉层、视网膜色素上皮和/或脉络膜的细胞的AAV血清型。

通常，AAV的天然来源血清型、分离株或进化枝的AAV基因组包含至少一个反向末端重复序列(ITR)。ITR序列顺式发挥作用以提供功能性复制起点并允许载体与细胞基因组的整合和从细胞基因组的切除。在优选的实施方案中，一个或多个ITR序列位于编码补体因子I和/或补体因子H或FHL1的核苷酸序列的侧翼。AAV基因组通常还包含包装基因，诸如编码AAV颗粒的包装功能的rep和/或cap基因。rep基因编码蛋白质Rep78、Rep68、Rep52和Rep40或其变体中的一种或多种。cap基因编码一种或多种衣壳蛋白，诸如VP1、VP2和VP3或其变体。这些蛋白质构成了AAV颗粒的衣壳。下面讨论衣壳变体。

启动子将可操作地连接至每个包装基因。此类启动子的具体实例包括p5、p19和p40启动子(Laughlin等人(1979)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 76：5567-5571)。例如，p5和p19启动子一般用来表达rep基因，而p40启动子一般用来表达cap基因。

如上面所讨论的，在本发明的AAV载体中使用的AAV基因组因此可以是天然存在的AAV的全基因组。例如，包含AAV全基因组的载体可用于体外制备AAV载体或载体颗粒。然而，虽然原则上可以将这种载体施用于患者，但在实践中很少这样做。优选地，AAV基因组将会为了施用于患者而被衍生化。这种衍生化是本领域标准的，并且本发明涵盖任何已知的AAV基因组衍生物的使用，以及可以通过应用本领域已知技术产生的衍生物的使用。AAV基因组和AAV衣壳的衍生化在Coura和Nardi(2007)Virology Journal 4:99中以及在上文引用的Choi等人和Wu等人中进行了综述。

AAV基因组的衍生物包括允许在体内从本发明的AAV载体表达转基因的任何截短或修饰形式的AAV基因组。通常，可以显著地截短AAV基因组以包括最小的病毒序列，但仍保留上述功能。出于安全原因这是优选的，以降低载体与野生型病毒重组的风险，并且还避免因靶细胞中病毒基因蛋白的存在而触发细胞免疫反应。

通常，衍生物将包括至少一个反向末端重复序列(ITR)，优选多于一个ITR，诸如两个ITR或更多。一个或多个ITR可源自具有不同血清型的AAV基因组，或者可以是嵌合或突变ITR。优选的突变ITR是具有trs(末端解链位点(terminal resolution site))缺失的突变ITR。这种缺失允许基因组的持续复制以产生包含编码序列和互补序列两者的单链基因组，即自身互补的AAV基因组。这使得避开靶细胞中的DNA复制，并因此能够加速转基因表达。

一个或多个ITR将优选位于编码补体因子I和/或CFI辅因子(例如补体因子H或FHL1)的核苷酸序列任一端的侧翼。包含一个或多个ITR是优选的以帮助本发明的载体在宿主细胞核中形成多联体(concatamer)，例如在宿主细胞DNA聚合酶的作用下将单链载体DNA转化为双链DNA之后。此类游离性(episomal)多联体的形成在宿主细胞的生命期间保护载体构建体，从而允许转基因延长的体内表达。

在优选的实施方案中，ITR元件将是衍生物中从天然AAV基因组中保留的唯一序列。因此，衍生物将优选不包括天然基因组的rep和/或cap基因以及天然基因组的任何其他序列。出于上述原因这是优选的，并且也是为了降低载体整合到宿主细胞基因组中的可能性。另外，减小AAV基因组的尺寸允许增加在载体中掺入除转基因之外的其他序列元件(诸如调控元件)的灵活性。

因此以下部分可以在本发明的衍生物中去除：一个反向末端重复(ITR)序列、复制(rep)基因和衣壳(cap)基因。然而，在一些实施方案中，衍生物可另外包括一个或多个rep和/或cap基因或AAV基因组的其他病毒序列。天然存在的AAV在人19号染色体上的特定位点以高频率整合，并且显示出可忽略不计的随机整合频率，使得载体中整合能力的保留可在治疗环境中被接受。

在衍生物包含衣壳蛋白即VP1、VP2和/或VP3的情况下，所述衍生物可以是一种或多种天然存在的AAV的嵌合、改组或衣壳修饰的衍生物。具体地，本发明涵盖在同一载体内提供来自AAV的不同血清型、进化枝、克隆或分离株的衣壳蛋白序列(即假型化载体)。

通常将选择嵌合的、改组的或衣壳修饰的衍生物来为AAV载体提供一种或多种所需的功能。因此，与包含天然存在的AAV基因组(诸如AAV2的基因组)的AAV载体相比，这些衍生物可展示出增加的基因递送效率、降低的免疫原性(体液的或细胞的)、改变的向性范围和/或改善的特定细胞类型的靶向作用。增加的基因递送效率可受到以下的影响：在细胞表面受体或共受体结合的改善、内化的改善、细胞内和进入细胞核内的运输改善、病毒颗粒脱壳改善和单链基因组向双链形式转化的改善。增加的效率还可与改变的向性范围或特定细胞群的靶向作用有关，使得载体剂量不因施用于不需要它的组织而被稀释。

嵌合衣壳蛋白包括那些通过天然存在的AAV血清型的两个或更多个衣壳编码序列之间的重组产生的蛋白质。这可以例如通过标记补救方法来执行，在所述方法中一种血清型的非感染性衣壳序列与不同血清型的衣壳序列共转染，并且使用指向性选择来选择具有所需特性的衣壳序列。这些不同血清型的衣壳序列可以通过细胞内的同源重组来改变，以产生新的嵌合衣壳蛋白。

嵌合衣壳蛋白还包括通过衣壳蛋白序列的工程化以在两个或更多个衣壳蛋白之间，例如在两个或更多个不同血清型的衣壳蛋白之间转移特定衣壳蛋白结构域、表面环或特定氨基酸残基所产生的那些蛋白。

改组的或嵌合衣壳蛋白也可以通过DNA改组或通过易错PCR产生。杂合的AAV衣壳基因可以通过以下产生：随机使相关AAV基因的序列，例如那些编码多种不同血清型衣壳蛋白的序列片段化，然后在自引发聚合酶反应中重新组装这些片段，这也可导致序列同源区域中的交换。可以对以这种方式、通过改组几种血清型的衣壳基因而产生的杂合AAV基因文库进行筛选，以鉴定具有所需功能性的病毒克隆。类似地，易错PCR可用于使AAV衣壳基因随机突变以产生多种不同的变体文库，然后可以针对所需特性进行选择。

也可以对衣壳基因的序列进行基因修饰以引入相对于天然野生型序列的特定缺失、置换或插入。具体地，可以通过在衣壳编码序列的开放阅读框内或在衣壳编码序列的N端和/或C端插入非相关蛋白质或肽的序列来修饰衣壳基因。

非相关蛋白质或肽可以有利地是充当特定细胞类型的配体的蛋白质或肽，从而赋予与靶细胞改善的结合或改善载体靶向于特定细胞群的特异性。一个实例可包括使用RGD肽来阻断视网膜色素上皮的摄取，并由此增强周围视网膜组织的转导(Cronin等人(2008)ARVO Abstract:D1048)。非相关蛋白质也可以是协助病毒颗粒纯化(作为生产过程的一部分)的蛋白质，即表位或亲和标签。通常将选择插入位点以便不干扰病毒颗粒的其他功能，例如内化、病毒颗粒的运输。技术人员能够基于他们的公知常识鉴定合适的插入位点。特定位点在上文引用的Choi等人中公开。

本发明另外涵盖了以与天然AAV基因组不同的顺序和构型提供AAV基因组序列。本发明还涵盖了用来自另一种病毒的序列或用由来自多于一种病毒的序列构成的嵌合基因替换一个或多个AAV序列或基因。此类嵌合基因可以由来自两种或更多种不同病毒种的相关病毒蛋白的序列构成。

本发明的AAV载体可以采用包含AAV基因组或其衍生物和编码补体因子I和/或补体因子H或FHL1转基因或其衍生物的序列的核苷酸序列的形式。

本发明的AAV颗粒包括转衣壳形式，其中具有一种血清型ITR的AAV基因组或衍生物被包装在不同血清型的衣壳中。本发明的AAV颗粒还包括镶嵌(mosaic)形式，其中来自两种或更多种不同血清型的未修饰衣壳蛋白的混合物构成病毒衣壳。AAV颗粒还包括带有被吸附到衣壳表面的配体的化学修饰形式。例如，此类配体可包括用于靶向特定细胞表面受体的抗体。

因此，例如，本发明的AAV颗粒包括那些具有AAV2基因组和AAV2衣壳蛋白(AAV2/2)的颗粒、那些具有AAV2基因组和AAV5衣壳蛋白(AAV2/5)的颗粒和那些具有AAV2基因组和AAV8衣壳蛋白(AAV2/8)的颗粒，以及那些具有AAV2基因组和多于一种血清型的衣壳蛋白的颗粒。

AAV载体可包含本文提及的核苷酸序列的多个拷贝(例如，2、3等)。

在一些实施方案中，多核苷酸还包含一个或多个AAV ITR。在优选的实施方案中，多核苷酸还包含两个AAV ITR。在一些实施方案中，多核苷酸在其5'端包含AAV ITR，并且在其3'端包含AAV ITR。在一些实施方案中，AAV ITR是AAV2或AAV8 ITR。在优选的实施方案中，AAV ITR是AAV2 ITR。

在一些实施方案中，多核苷酸包含具有SEQ ID NO：18的核苷酸序列，或与其具有至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的核苷酸序列的5'AAV ITR。

在一些实施方案中，多核苷酸还包含SEQ ID NO：20的核苷酸序列，或与其具有至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的核苷酸序列，紧邻5'ITR的3'端。

在一些实施方案中，多核苷酸包含具有SEQ ID NO：19的核苷酸序列，或与其具有至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的核苷酸序列的3'AAV ITR。

在一些实施方案中，多核苷酸还包含SEQ ID NO：21的核苷酸序列，或与其具有至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的核苷酸序列，紧邻3'ITR的5'端。

启动子和调控序列

本发明的多核苷酸或载体还可包括允许在体外或体内表达补体因子I和CFI辅因子，诸如补体因子H和/或FHL1转基因的元件。这些可以称为表达控制序列。因此，多核苷酸或载体通常包含与编码转基因的核苷酸序列可操作地连接的表达控制序列(例如包含启动子序列)。

在一些实施方案中，多核苷酸或载体包含编码以下的核苷酸序列：(a)CMV启动子，任选地其中CMV启动子位于编码补体因子I和/或补体因子I(CFI)辅因子，诸如补体因子H和/或FHL1的核苷酸序列的上游；(b)WPRE调控元件，任选地其中WPRE调控元件位于编码补体因子I和/或补体因子I(CFI)辅因子，诸如补体因子H和/或FHL1的核苷酸序列的下游；和/或(c)poly-A信号，诸如牛生长激素poly-A信号，任选地其中poly-A信号位于编码补体因子I和/或补体因子I(CFI)辅因子，诸如补体因子H和/或FHL1的核苷酸序列的下游。

在优选的实施方案中，多核苷酸或载体包含：

(a)5’端AAV ITR；

(b)CMV启动子；

(c)编码补体因子I(CFI)辅因子，优选FHL1的核苷酸序列；

(d)接头，任选地其中接头包含弗林蛋白酶裂解位点、GSG、11a1D和F2A序列或由它们定义；

(e)编码CFI的核苷酸序列；

(f)WPRE调控元件，优选地其中WPRE调控元件是WPRE3调控元件；

(g)牛生长激素poly-A信号；和

(h)3’端AAV ITR。

可以使用任何合适的启动子，技术人员可以容易地进行其选择。启动子序列可以是组成型活性的(即在任何宿主细胞背景中均可操作)，或者可以仅在特定宿主细胞环境中具有活性，从而允许转基因在特定细胞类型中的靶向表达(例如组织特异性启动子)。启动子可以响应于另一个因子，例如存在于宿主细胞中的因子的存在而显示诱导型表达。在任何情况下，当施用载体用于疗法时，优选的是启动子应该在靶细胞背景中起作用。

在一些实施方案中，优选的是启动子显示视网膜细胞特异性表达以使转基因仅在视网膜细胞群中表达。因此，来自启动子的表达可以是视网膜细胞特异性的，例如仅限定于视网膜神经感觉层和视网膜色素上皮的细胞。

优选的不是视网膜细胞特异性的启动子，包括鸡β-肌动蛋白(CBA)启动子，任选地与巨细胞病毒(CMV)增强子元件组合。用于本发明的示例启动子是CAG启动子，例如在rAVE表达盒(GeneDetect.com)中使用的启动子。

在优选的实施方案中，多核苷酸或载体包含CMV启动子。

一个示例CMV启动子序列是：

在一些实施方案中，多核苷酸或载体包含具有与SEQ ID NO：13具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核苷酸序列的启动子。优选地，其中核苷酸序列基本上保留了由SEQ ID NO：13表示的启动子的功能活性。

在其他实施方案中，多核苷酸或载体包含具有SEQ ID NO：13的核苷酸序列的启动子。

另一个示例启动子序列是：

在一些实施方案中，多核苷酸或载体包含具有与SEQ ID NO：5具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核苷酸序列的启动子。优选地，其中核苷酸序列基本上保留了由SEQ ID NO：5表示的启动子的功能活性。

在其他实施方案中，多核苷酸或载体包含具有SEQ ID NO：5的核苷酸序列的启动子。

基于人序列的可诱导视网膜特异性基因表达的启动子的实例包括用于视杆细胞和视锥细胞的视紫红质激酶(Allocca等人(2007)J.Virol.81:11372-80)、仅用于视锥细胞的PR2.1(Mancuso等人(2009)Nature 461:784-7)和/或用于视网膜色素上皮的RPE65(Bainbridg等人(2008)N.Engl.J.Med.358:2231-9)或VMD2(Esumi等人(2004)J.Virol.Chem.279:19064-73)。

本发明的多核苷酸或载体还可包含一个或多个额外的调控序列，其可在转录前或转录后起作用。调控序列可以是天然转基因基因座的一部分或者可以是异源调控序列。本发明的多核苷酸或载体可包含来自天然转基因转录物的5'-UTR或3'-UTR的部分。

调控序列是促进转基因表达的任何序列，即起到增加转录物表达、提高mRNA的核输出或增强其稳定性的作用。此类调控序列包括例如增强子元件、转录后调控元件和聚腺苷酸化位点。

优选的聚腺苷酸化位点是牛生长激素poly-A(bGH poly-A)信号。

一个示例牛生长激素poly-A(bGH poly-A)信号是：

另一个示例牛生长激素poly-A(bGH poly-A)信号是：

在一些实施方案中，多核苷酸或载体包含具有与SEQ ID NO：14或6，优选SEQ IDNO：14具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核苷酸序列的聚腺苷酸化信号。优选地，其中核苷酸序列基本上保留了由SEQ ID NO：14或6表示的聚腺苷酸化信号的功能活性。

在其他实施方案中，多核苷酸或载体包含具有SEQ ID NO：14或6，优选SEQ ID NO：14的核苷酸序列的聚腺苷酸化信号。

在本发明的多核苷酸或载体的上下文中，此类调控序列将是顺式作用的。然而，本发明还涵盖位于额外基因构建体上的反式作用调控序列的使用。

用于本发明的AAV载体的优选转录后调控元件是土拨鼠肝炎转录后调控元件(WPRE)或其变体。

一个示例WPRE是：

WPRE是一种三元元件，按给定顺序包含gamma、alpha和beta元件。WPRE的仅包含最少gamma和alpha元件的缩短版本(称为WPRE3；Choi,J.-H.等人(2014)Molecular Brain 7:17)也可用于本发明。

一个示例WPRE3序列是：

在一些实施方案中，多核苷酸或载体包含具有与SEQ ID NO：15或7，优选SEQ IDNO：15具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核苷酸序列的转录后调控元件。优选地，其中核苷酸序列基本上保留了由SEQ ID NO：15或7表示的转录后调控元件的功能活性。

在其他实施方案中，多核苷酸或载体包含具有SEQ ID NO：15或7，优选SEQ ID NO：15的核苷酸序列的转录后调控元件。

可在本发明的多核苷酸或载体中使用的另一调控序列是支架附着区(SAR)。技术人员可以容易地选择额外的调控序列。

施用方法

本发明的产物、多核苷酸或载体可以全身施用(例如通过外周静脉输注)并且可以局部或区域施用(例如通过鞘内注射施用至CNS系统)。在优选的实施方案中，产物、多核苷酸或载体是眼内施用的。

术语“眼内”是指眼睛内部，因此眼内施用涉及向受试者眼睛内部的施用。

在一些实施方案中，产物、多核苷酸或载体通过视网膜下、直接视网膜、脉络膜上或玻璃体内注射施用于受试者的眼睛。在一些实施方案中，施用由机器人执行。

注射的药物组合物的体积可以是，例如约10-500μL，例如约50-500、100-500、200-500、300-500、400-500、50-250、100-250、200-250或50-150μL。体积可以是，例如约10、50、100、150、200、250、300、350、400、450或500μL。优选地，注射的药物组合物的体积为100μL。

技术人员将熟悉并能够很好地进行独立的视网膜下、直接视网膜、脉络膜上或玻璃体内注射。

优选地，产物、多核苷酸或载体通过视网膜下注射施用。

在一些实施方案中，产物、多核苷酸、载体或包含它们的药物组合物在受试者的一生中施用不超过一次或不超过两次。

视网膜下注射

视网膜下注射是注射到视网膜下腔，即在视网膜神经感觉层下方。在视网膜下注射期间，注射的材料被引导到光感受器细胞和视网膜色素上皮(RPE)层中，并在两者之间形成空间。

当通过小的视网膜切开术进行注射时，可能产生视网膜脱离。由注射的材料产生的脱离的、凸起的视网膜层被称为“水泡(bleb)”。

视网膜下注射产生的裂孔(hole)必须足够小，以便注射的溶液在施用后不会明显回流到玻璃体腔中。当注射药物时，这种回流会尤其成问题，因为药物的作用将被引导远离目标区域。优选地，注射在视网膜神经感觉层中产生自密封进入点，即一旦移除注射针，由针产生的裂孔就重新密封，使得很少或基本上没有注射的材料通过裂孔释放。

为了促进此过程，专业的视网膜下注射针是可商购获得的(例如，DORC 41GTeflon视网膜下注射针，Dutch Ophthalmic Research Center International BV，Zuidland，The Netherlands)。这些是设计用于进行视网膜下注射的针。

除非在注射过程中发生视网膜损伤，并且只要是使用足够小的针头，则基本上所有注射的材料都在局部视网膜脱离部位处保持处于脱离的视网膜神经感觉层和RPE之间(即不会回流到玻璃体腔)。实际上，水泡在短时间内的典型持续存在表明注射的材料通常很少逃逸到玻璃体中。随着注射的材料被吸收，水泡经过更长的时间可消散。

例如使用光学相干断层扫描对眼睛，具体是视网膜的可视化可以在手术前进行。

注射的药物组合物的体积可以是，例如约10-500μL，例如约50-500、100-500、200-500、300-500、400-500、50-250、100-250、200-250或50-150μL。体积可以是，例如约10、50、100、150、200、250、300、350、400、450或500μL。优选地，注射的药物组合物的体积为100μL。较大的体积可能会增加拉伸视网膜的风险，而较小的体积可能难以看到。

两步视网膜下注射

本发明的产物、多核苷酸或载体可以通过使用两步法以增加的准确度和安全性递送，在所述两步法中通过视网膜下注射第一溶液产生局部视网膜脱离。第一溶液不包含产物、多核苷酸或载体。然后使用第二次视网膜下注射将包含产物、多核苷酸或载体的药物递送到由第一次视网膜下注射产生的水泡的视网膜下液(subretinal fluid)中。因为递送所述药物的注射不是用来使视网膜脱离，所以在此第二步骤中可以注射特定体积的溶液。

在一些实施方案中，载体的视网膜下注射包括以下步骤：

(a)通过以有效使视网膜至少部分脱离以形成视网膜下水泡的量的视网膜下注射向受试者施用溶液，其中所述溶液不包含产物、多核苷酸或载体；和

(b)通过向步骤(a)形成的水泡中的视网膜下注射施用药物组合物，其中所述药物包含产物、多核苷酸或载体。

在步骤(a)中注射以使视网膜至少部分脱离的溶液体积可以是，例如约10-1000μL，例如约50-1000、100-1000、250-1000、500-1000、10-500、50-500、100-500、250-500μL。体积可以是，例如约10、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900或1000μL。

步骤(b)中注射的药物组合物的体积可以是，例如约10-500μL，例如约50-500、100-500、200-500、300-500、400-500、50-250、100-250、200-250或50-150μL。体积可以是，例如约10、50、100、200、150、200、250、300、350、400、450或500μL。优选地，步骤(b)中注射的药物组合物的体积为100μL。较大的体积可能会增加拉伸视网膜的风险，而较小的体积可能难以看到。

不包含药物的溶液(即步骤(a)的“溶液”)可以与包含药物的溶液类似地配制，如下所述。

不包含药物的优选溶液是平衡盐水溶液(BSS)或与视网膜下腔的pH和渗透压相匹配的类似缓冲溶液。

在手术期间使视网膜可视化

在某些情况下，例如在晚期视网膜变性期间，识别视网膜是很困难的，因为它很薄、透明且对着它所处的被破坏和严重色素沉着的上皮很难看到。使用蓝色活体染料(例如Brilliant

蓝色活体染料的使用还可以识别视网膜内存在增厚的内界膜或视网膜前膜的任何区域，因为通过这些结构中的任何一个进行注射都会阻碍进入视网膜下空间的清洁通道。此外，在术后即刻时间内这些结构中的任何一个的收缩都可能导致视网膜进入裂孔的拉伸，这可能导致药物回流到玻璃体腔中。

脉络膜上注射

本发明的产物、多核苷酸或载体可以使用利用微导管的外路(ab externo)方法递送至脉络膜上腔(suprachoroidal space)(参见，例如，Peden等人(2011)PLoS One 6(2):e17140)。在此方法中，执行角膜缘结膜周围切开术(limbal conjunctival peritomy)以暴露裸露的巩膜，随后进行巩膜切开术以暴露裸露的脉络膜。将微导管(诸如来自iScienceInterventional的iTrack250A，任选地连接到照明系统，诸如基于iLumin激光二极管的微照明系统(iScience Interventional))引入到脉络膜上腔中并向后朝视盘推进。在将微导管尖端操纵到所需位置后，注射产物、多核苷酸或载体会在视网膜和脉络膜内形成水泡。

因此，在一些实施方案中，产物、多核苷酸或载体通过一种方法进行脉络膜上递送，所述方法包括(i)将微导管引入脉络膜上腔；(ii)在所述腔内推进微导管直到尖端接近视网膜的患病区域；和(iii)从微导管尖端注射产物、多核苷酸或载体以形成水泡。

在一些实施方案中，上述施用程序由机器人直接进行。

药物组合物和注射溶液

本发明的药物，例如产物、多核苷酸或载体，可以配制成药物组合物。除了药物之外，这些组合物还可包含药学上可接受的载剂、稀释剂、赋形剂、缓冲剂、稳定剂或本领域公知的其他材料。此类材料应该是无毒的并且不应干扰活性成分的功效。载剂或其他材料的确切性质可由技术人员根据施用途径确定，所述施用途径例如视网膜下、直接视网膜、脉络膜上或玻璃体内注射。

药物组合物通常为液体形式。液体药物组合物通常包含液体载剂诸如水、石油、动物油或植物油、矿物油或合成油。可以包括生理盐水溶液、氯化镁、右旋糖或其他糖溶液，或二醇类，诸如乙二醇、丙二醇或聚乙二醇。在一些情况下，可以使用表面活性剂，诸如0.001％的普朗尼克酸(PF68)。

对于在患处的注射液，活性成分可以是无热原并具有合适的pH、等渗性和稳定性的水溶液形式。技术人员能够很好地使用，例如等渗媒介物诸如氯化钠注射液、林格氏注射液或乳酸林格氏注射液制备合适的溶液。可以根据需要包括防腐剂、稳定剂、缓冲剂、抗氧化剂和/或其他添加剂。

对于延迟释放，可根据本领域已知的方法将药物包含在配制用于缓慢释放的药物组合物中，诸如在由生物相容性聚合物形成的微胶囊中或在脂质体载剂系统中。

治疗方法

应当理解，本文所有对治疗的提及包括治愈性治疗、姑息性治疗和预防性治疗；尽管在本发明的上下文中，对预防的提及更通常与预防性治疗相关。治疗还可以包括阻止疾病严重程度的进展。

哺乳动物，特别是人的治疗是优选的。然而，人和兽医治疗都在本发明的范围内。

如本文所用的术语“组合”，或术语“组合形式”、“与……组合使用”或“组合制剂”可以指同时、依序或单独地组合施用两种或更多种剂。

如本文所用，术语“同时”是指并行地，即在同一时间施用所述剂。

如本文所用，术语“依序”是指先后地施用所述剂。

如本文所用，术语“单独”是指所述剂彼此独立地但在使所述剂显示出组合的、优选协同的效果的时间间隔内施用。因此，“单独”施用可允许一种剂，例如在另一种剂施用后的1分钟、5分钟或10分钟内施用。

变体、衍生物、类似物、同系物和片段

除了本文提及的特定蛋白质和核苷酸之外，本发明还涵盖其变体、衍生物、类似物、同系物和片段的使用。

在本发明的上下文中，任何给定序列的变体是这样的序列，其中特定的残基序列(无论是氨基酸残基还是核酸残基)已经以使得所讨论的多肽或多核苷酸基本上保留其功能的方式进行修饰。可以通过存在于天然存在蛋白质中的至少一个残基的添加、缺失、置换、修饰、替换和/或变异，获得变体序列。

如本文所用，与本发明的蛋白质或多肽有关的术语“衍生物”包括从或对所述序列的一个(或多个)氨基酸残基的任何置换、变异、修饰、替换、缺失和/或添加，条件是所得蛋白质或多肽基本上保留其内源功能中的至少一种。

如本文所用，与多肽或多核苷酸有关的术语“类似物”包括任何模拟物，也就是说，具有其模拟的多肽或多核苷酸的至少一种内源功能的化合物。

通常，可以进行氨基酸置换，例如从1、2或3到10或20次置换，条件是修饰的序列基本上保留了所需的活性或能力。氨基酸置换可包括使用非天然存在的类似物。

本发明中使用的蛋白质还可具有氨基酸残基的缺失、插入或置换，其产生沉默改变并产生功能等效的蛋白质。可以基于残基的极性、电荷、溶解性、疏水性、亲水性和/或两亲性质的相似性进行有意的氨基酸置换，只要保留内源功能即可。例如，带负电荷的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸；带正电荷的氨基酸包括赖氨酸和精氨酸；并且具有相似亲水性值的、带有不带电荷的极性头部基团的氨基酸包括天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸。

例如根据下表，可以进行保守置换。在第二列的同一区块中，且优选在第三列的同一行中的氨基酸可以相互置换：

如本文所用，术语“同系物”是指与野生型氨基酸序列和野生型核苷酸序列具有一定同源性的实体。术语“同源性”可以等同于“同一性”。

同源序列可包括与目标序列(subject sequence)至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％或90％相同，优选至少95％或97％或99％相同的氨基酸序列。通常，同系物将包含与目标氨基酸序列相同的活性位点等。虽然同源性也可以从相似性(即具有相似化学特性/功能的氨基酸残基)的角度考虑，但在本发明的上下文中，优选的是从序列同一性的角度表达同源性。

同源序列可包括与目标序列至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％或90％相同，优选至少95％或97％或99％相同的核苷酸序列。虽然同源性也可以从相似性的角度考虑，但在本发明的上下文中，优选的是从序列同一性的角度表达同源性。

优选地，提及与本文详述的任何一个SEQ ID NO具有百分比同一性的序列是指在提及的SEQ ID NO的整个长度上具有所述百分比同一性的序列。

同源性比较可以通过肉眼进行，或者更常见的是借助轻易可得的序列比较程序进行。这些可商购获得的计算机程序能够计算两个或更多个序列之间的同源性或同一性百分比。

可以计算连续序列的同源性百分比，即一个序列与另一序列对齐并且一个序列中的每个氨基酸直接与另一序列中的对应氨基酸进行比较，一次一个残基。这称为“无空位”比对。通常，此类无空位比对仅在相对较短数量的残基上执行。

虽然这是一种非常简单且一致的方法，但它没有考虑到，例如，在其他方面相同的序列对中，核苷酸序列中的一个插入或缺失可能引起后面的密码子失去比对，因此当执行全局比对时，可能导致同源性百分比大幅降低。因此，大多数序列比较方法都是被设计来产生最佳比对，其将可能的插入和缺失考虑在内，而不会对整体同源性评分造成过度罚分。这是通过在序列比对中插入“空位”以尽量使局部同源性最大化来实现的。

然而，这些更复杂的方法为比对中出现的每个空位分配“空位罚分”，所以对于相同数量的相同氨基酸，序列比对的空位尽可能少，反映两个比较序列之间的相关性更高，将获得比有很多空位的比对更高的分数。通常使用“仿射空位成本”，其对空位的存在收取相对较高的成本，并对空位中的每个后续残基收取较小的罚分。这是最常用的空位评分系统。高空位罚分当然会产生具有较少空位的优化比对。大多数比对程序允许修改空位罚分。然而，在使用此类软件进行序列比较时，优选的是使用默认值。例如，当使用GCG WisconsinBestfit软件包时，氨基酸序列的默认空位罚分对于一个空位是-12以及对于每个延伸是-4。

因此，考虑到空位罚分，最大同源性百分比的计算首先需要产生最佳比对。进行这种比对的合适计算机程序是GCG Wisconsin Bestfit软件包(University of Wisconsin,US,A.；Devereux等人(1984)Nucleic Acids Res.12:387)。可以执行序列比较的其他软件的实例包括但不限于，BLAST软件包(参见Ausubel等人(1999)同上-第18章)、FASTA(Atschul等人(1990)J.Mol.Biol.403-410)和GENEWORKS比较工具套件。BLAST和FASTA都可用于离线和在线搜索(参见Ausubel等人(1999)同上，第7-58页至第7-60页)。然而，对于某些应用，优选的是使用GCG Bestfit程序。另一种称为BLAST 2Sequences的工具也可用于比较蛋白质和核苷酸序列(参见FEMS Microbiol.Lett.(1999)174:247-50；FEMSMicrobiol.Lett.(1999)177:187-8)。

虽然最终同源性百分比可以根据同一性来测量，但比对过程本身通常不是基于全有或全无的配对比较(all-or-nothing pair comparison)。相反，一般使用尺度相似性评分矩阵(scaled similarity score matrix)，其基于化学相似性或进化距离来为每个成对比较分配分数。常用的这种矩阵的一个实例是BLOSUM62矩阵-BLAST程序套件的默认矩阵。GCG Wisconsin程序一般使用公共默认值或自定义符号比较表，如果提供的话(有关详情，请参阅用户手册)。对于一些应用，优选的是使用GCG软件包的公共默认值，或者在其他软件的情况下，使用默认矩阵，诸如BLOSUM62。

一旦软件产生了最佳比对，就可以计算同源性百分比，优选序列同一性百分比。软件通常将此作为序列比较的一部分并生成数值结果。

全长补体因子I或补体因子I(CFI)辅因子，诸如补体因子H或FHL1的“片段”也是变体，并且所述术语通常是指多肽或多核苷酸中在功能上或例如在测定中所关注的选定区域。因此，“片段”是指为全长多肽或多核苷酸的一部分的氨基酸或核酸序列。

此类变体可以使用标准重组DNA技术诸如定点诱变来制备。在要进行插入的情况下，可以制备编码插入的合成DNA连同对应于插入位点任一侧的天然存在序列的5'和3'侧翼区域。侧翼区域将含有与天然存在序列中的位点相对应的方便的限制性酶切位点，以便可以用合适的酶切割所述序列并将合成DNA连接到切口中。然后根据本发明表达DNA以制备编码的蛋白质。这些方法仅是本领域已知的用于操纵DNA序列的许多标准技术的示例，也可以使用其他已知技术。

本领域技术人员将理解，在不脱离所公开的本发明范围的情况下，他们可以结合本文公开的本发明的所有特征。

现在将通过非限制性实例的方式来描述本发明的优选特征和实施方案。

除非另有说明，否则本发明的实践将采用化学、生物化学、分子生物学、微生物学和免疫学的常规技术，这些技术在本领域普通技术人员的能力范围内。此类技术在文献中进行了解释。参见，例如，Sambrook,J.,Fritsch,EF和Maniatis,T.(1989)MolecularCloning:A Laboratory Manual,第二版,Cold Spring Harbor Laboratory Press；Ausubel,F.M.等人(1995和定期增刊)Current Protocols in Molecular Biology,第9、13和16章,John Wiley&Sons；Roe,B.,Crabtree,J.和Kahn,A.(1996)DNA Isolation andSequencing:Essential Techniques,John Wiley&Sons；Polak,J.M.和McGee,J.O’D.(1990)In Situ Hybridization:Principles and Practice,Oxford University Press；Gait,M.J,(1984)Oligonucleotide Synthesis:A Practical Approach,IRL Press；和Lilley,D.M.和Dahlberg,J.E,(1992)Methods in Enzymology:DNA Structures Part A:Synthesis and Physical Analysis of DNA,Academic Press.这些一般性文本各自以引用方式并入本文。

实施例

实施例1

辅因子测定

将重组补体因子I(CFI)、辅因子(补体因子H(CFH)或补体因子H样蛋白1(FHL1))以及C3b在37℃一起孵育20分钟。

CFI和C3b的浓度是固定的，并以指定的比率进行CFH或FHL1滴定。

C3b到iC3b的裂解通过ELISA来定量。

这些研究的结果如图2A所示。

从这些结果可以得出结论，最小功能CFI:CFH/FHL1摩尔比为1:2。

正常血清CFI:辅因子比率的测量

使用ELISA在正常人血清中测量补体因子I(CFI)、补体因子H(CFH)和补体因子H样蛋白1(FHL1)浓度。

发现在正常血清中CFI:辅因子的摩尔比为1:8.3。

血浆和眼内液CFI:辅因子比率的比较

我们随后比较了血浆和眼内液中CFI和CFH的水平。数据显示，与血浆(其中辅因子相对于CFI酶存在几倍摩尔过量)相反，在玻璃体液和房水中，此比率是反向的(图7)。

脂多糖(LPS)上的补体沉积测定

向微量滴定板涂覆1μg/孔的LPS，并在4℃孵育过夜。

然后清洗板并将其在37℃与正常人血清一起孵育1小时，所述正常人血清补充有不同量的重组补体因子I(CFI)、补体因子H(CFH)或补体因子H样蛋白1(FHL1)。随后彻底清洗板，并且用小鼠抗C3d抗体(Abcam)和驴抗小鼠(Jackson ImmunoResearch)作为二抗测量补体沉积。

图2B显示了CFI、CFH和FHL1补充对LPS上补体沉积的影响。

x轴示出补体因子I(CFI)与补体因子H+补体因子H样1(CFH和FHL1，“辅因子”)的比率。仅仅通过添加重组CFI、CFH或FHL1实现比率的变化。

尽管1:8.3的起始摩尔比(正常血清中的自然比率)已经具有与酶相比过量的辅因子，但当进一步提高比率时，实现了对补体沉积减少及因此对激活的进一步益处。此额外益处可能与CFH和FHL1的额外功能(衰变加速因子，DAA)有关。CFH和FHL1都具有DAA，因为它们与补体因子B(FB)竞争C3b结合，使FB从C3b转位，并因此使旁路途径转化酶“衰变”。

从这些实验中可以得出结论，低于1:2的最小CFI:CFH/FHL1摩尔比时，辅因子变成限制性的。

实施例2

双顺反子质粒的产生

构建了重组AAV转基因质粒(称为RC204、RC206-210和RC212-218)，其包含AAV2 5'和3'反向末端重复(ITR)，位于表1中所述基因盒的侧翼。

表1

使用的5'ITR相邻序列是SEQ ID NO：20。

使用的CMV启动子序列是SEQ ID NO：13。

使用的FHL1序列是SEQ ID NO：16。使用的密码子优化的FHL1(FHL1-CO)序列是SEQID NO：12。

使用的弗林蛋白酶-F2A接头序列是SEQ ID NO：17。

使用的CFI序列是SEQ ID NO：2。使用的密码子优化的CFI(CFI-CO)序列是SEQ IDNO：10。

使用的WPRE3序列是SEQ ID NO：15。

使用的牛生长激素poly-A(BGHpA)序列是SEQ ID NO：14。

使用的3'ITR相邻序列是SEQ ID NO：21。

RC212和RC218的整体序列分别是SEQ ID NO：22和23。

通过转导比较载体

贴壁HEK293中的载体产生

采用12个质粒(RC204、RC206-210和RC212-217)对HEK293细胞的单独转染使用以下方案进行：

第1天：使用ViCell分离和计数HEK293细胞。在10mL DMEM/Glutamax+10％FBS/板中将细胞以6x10

第2天：检查汇合度，发现其在70-80％之间。

将培养基替换为DMEM/Glutamax+5％FBS

4小时后，以两次重复，使用PEI以1:3的DNA:PEI比率，用5pg总质粒DNA(1.25pg构建体DNA、1.25pg RepCap质粒、2.5pg Helper质粒)/板转染细胞：

1.将2x5μg DNA在2x1 mL PBS中稀释。

2.添加2x15μL PEI并孵育20分钟。

3.将1mL DNA/PEI滴加到细胞中。

第3天：加入15mM丁酸钠。

第5天：通过合并两次重复来收获培养基，并以1000rpm离心10分钟以去除细胞碎片。

将上清液转移到新试管中，并且加入1/5体积的AAVanced(AAV110A-1，CambridgeBioscience)。

将混合物在40℃孵育72小时。

第5天：将混合物在4℃以1000rpm离心30分钟。随后弃去上清液，并且将沉淀物重悬于500μL的PBS中。将沉淀物以1500g离心3分钟，然后再次弃去上清液。将沉淀物重新悬浮在1/100体积的原始上清液中，并在-80℃储存直至滴定。

使用载体转导HEK293细胞

采用12个病毒载体(RC204、RC206-210和RC212-217)对HEK293细胞的单独转导使用以下方案进行：

第1天：使用ViCell分离和计数HEK293细胞。在400μLDMEM/Glutamax+10％FBS/孔中将细胞以1x10

第2天：添加所需量的病毒载体以达到2x10

第3天：去除培养基并替换为300μL无血清DMEM/Glutamax。

第5天：收获上清液并在4℃以14000rpm离心。将澄清的上清液转移到准备用于分析的新试管中。

蛋白质印迹

通过蛋白质印迹分析来自转导的上清液(使用CFI和FHL-1的一抗；以及ECL Prime蛋白质印迹检测试剂)。

蛋白质印迹分析如图3所示。

CFI ELISA

使用以下程序通过ELISA分析来自转导的上清液的CFI：

第1天：向ELISA板涂覆在1x涂覆缓冲液中以1:4000比率稀释的每孔50μL绵羊抗CFI多克隆抗体。将板在40℃储存过夜。

第2天：用每孔200μL的PBS-Tween(0.05％)将板清洗3次，然后用纸巾吸干。

将200μL在PBS-Tween(0.05％)中的1％BSA第五组分施加到每个孔中，并在室温下封闭2小时。

在封闭孵育期间制备样品和标准曲线。使用在DMEM 2％FBS中稀释的纯化CFI蛋白(Sigma C5938-1MG)制备标准曲线。样品在DMEM 2％FBS中按1:5和1:10稀释。

封闭2小时后，如上所述将板清洗3次，然后将50μL样品或标准品加载到每个孔中，并在室温下孵育1小时。

1小时后，如上所述清洗板，然后将抗CFI(Ox21)抗体在DMEM 5％FBS中以1:2000的比率稀释，并且将其中的50μL施加到每个孔中，在室温下孵育1小时。

1小时后，如上所述清洗板，然后将驴抗小鼠-HRP抗体在DMEM 5％FBS中以1:5000的比率稀释，并且将其中的50μL施加到每个孔中，在室温下孵育1小时。

1小时后，如上所述清洗板，然后将100μL TMB试剂施加到每个孔中并在室温下黑暗中孵育大约15分钟。一旦获得足够的蓝色，就将100μL 1M硫酸加入到每个孔中以终止反应。

然后记录A450，，对数据进行处理并传输到Microsoft Excel进行分析。

FHL1 ELISA

使用以下程序通过ELISA分析来自转染的上清液的FHL1：

第1天：向ELISA板涂覆在100mM碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液，pH9.6中的每孔50μL，3μg/mL的抗FHL-1抗体(Biorad，AbD33594.1)。将板在4℃储存过夜

第2天：用每孔200μL的TBS-Tween(0.05％)将板清洗3次，然后用纸巾吸干。

将200μL在PBS-Tween(0.05％)中的1％BSA第五组分施加到每个孔中，并在室温下封闭2小时。

在封闭孵育期间制备样品和标准曲线。使用在DMEM 2％FBS中稀释的FHL1纯化蛋白制备标准曲线。样品在封闭缓冲液中按1:5和1:10稀释。

封闭2小时后，如上所述将板清洗3次，然后将50μL样品或标准品加载到每个孔中，并在室温下孵育1小时。

1小时后，如上所述清洗板，然后将抗CFH抗体(0x24,Santa CruzBiotechnologies,sc-53067)在封闭缓冲液中以0.33μg/mL加入，并且将其中的50μL施加到每个孔中，在室温下孵育1小时。

1小时后，如上所述清洗板，然后在封闭缓冲液中以0.2μg/mL加入驴抗小鼠-HRP抗体，并且将其中的50μL施加到每个孔中，在室温下孵育1小时。

1小时后，如上所述清洗板，然后将100μL TMB试剂施加到每个孔中并在室温下黑暗中孵育大约15分钟。一旦获得足够的蓝色，就将50μL 1M硫酸加入到每个孔中以终止反应。

然后记录A450，，对数据进行处理并传输到Microsoft Excel进行分析。

结论

蛋白质印迹和ELISA研究的结果分别如图3和图4所示。

根据蛋白质印迹和ELISA分析，可以得出以下结论：

所有候选者在转导后都产生了CFI和FHL1。

CFI和FHL1密码子优化增加了蛋白质水平。

RC206和RC212对于CFI表达是最佳的，但是RC212实现了最佳的CFI:FHL1摩尔比(>1:2)。

RC212是基于CFI/FHL1表达的最佳候选者。

载体包装

碱性凝胶分析

将24μL的每种未稀释样品和SRM对照(2.45x10

然后将凝胶在3个凝胶体积的0.1M Tris pH8.0中室温孵育1小时，然后在含有4xSYBRGold核酸染色剂的1个凝胶体积的0.1M NaCl中室温孵育2小时(避光)，然后用超纯水冲洗两次。

然后使用Chemidoc上的SYBRGold UV透照仪设置以10秒的曝光时间使凝胶可视化。

结果如图5(上图)所示。

全:空颗粒比率

通过比较从qPCR(DNA滴度)和衣壳ELISA计算的滴度来分析全病毒颗粒与空病毒颗粒的比率。

结果如图5(下图)所示。

结论

从这些分析中可以得出以下结论：

仅RC212时为高效包装。

>4.7kb的基因组看似是不完整包装。

RC212的全-空颗粒比率与对照单顺反子载体相当。

RC212是基于包装分析的最佳候选者。

C3b裂解测定

在C3b裂解测定中，将1mg血浆纯化的C3b与转导的HEK293上清液样品在37℃孵育1小时。

使用ELISA或蛋白质印迹分析(如下所述)进行分析。加入含对巯基乙醇的4xLaemmli缓冲液以终止反应。将样品稀释并加载到10％预灌注聚丙烯酰胺SDS PAGE凝胶(Bio-Rad)上。在转移到PVDF膜(Bio-Rad)并在封闭缓冲液(1xTBS pH8[Sigma]/0.05％Tween-20和5％干脱脂奶粉[Marvel])中封闭后，使用山羊抗人C3抗体(Biorad)检测C3b裂解。

结果如图6所示，从图可以得出结论：RC212是最有效的。

实施例3-添加多种补体调节剂时的额外补体下调

方法

为了测量补体调节剂的功能活性，进行了LPS沉积测定。在稀释的ELISA涂覆缓冲液(BioRad，BUF030B)中，将Nunc Maxisorb板在40℃用1μg/mL LPS(Sigma，大肠杆菌O26:B6)涂覆过夜。用PBS-0.05％Tween 20清洗板。制备在旁路途径缓冲液(PBS，2mM MgCl

结果

补体调节蛋白、补体因子I、可溶性补体受体1、补体因子H或因子H样1的IC50浓度使用相同测定平台在单独实验中确定。此处，结果显示(图8)，当添加IC50浓度的调节蛋白时，旁路途径(通过C3沉积的减少来测量)被淬灭(阴影柱)。如果补体因子I与其辅因子之一(可溶性补体受体1、补体因子H或因子H样1)共同补充，则观察到额外的淬灭(白色柱)，证明了增加两种补体调节剂的浓度优于单独添加任何一种。这些结果表明，由过度反应的补体系统引起的病状可能受益于多种补体调节剂的双重施用。

各个调节剂的IC50浓度在所测试的调节剂之间差异很大(sCR1比FHL1有效约10倍，比CFH和CFI有效约50倍)，而且它们的分子量也差异很大(sCR1＝213kDa、CFI＝88kDa、CFH＝155kDa和FHL1＝49kDa)，将摩尔浓度用于此直接比较。蛋白质的内源水平也将有助于观察到的效力差异；因子H的血浆浓度比FHL1或sCR1高得多。通过比较调节剂在其IC50浓度下淬灭旁路途径的能力，证明了sCR1是最有效的调节剂，因为它需要最低的摩尔浓度来达到IC50。因为CR1是红细胞上的膜结合受体，在血液中含量丰富，但在血清/血浆中并不丰富，并且血清或血浆中仅存在微量的流体CR1(即sCR1)，这可推断，sCR1将是在红细胞与血浆分离的部位，诸如脉络膜腔(choroidal space)、布鲁赫膜(Bruch's Membrane)、视网膜下腔和血管球(glomerulus)处的一种非常有效的补体调节剂和CFI辅因子。

实施例4-体外表达中补体因子I和因子H样1的表达

方法

将HEK-293细胞用以下rAAV载体之一转导：表达CFI的AAV(GT005)、表达FHL1的AAV(RC001)或表达CFI和FHL1的AAV(GT007)。通过非还原蛋白质印迹分析上清液以确定相对蛋白质表达。将山羊抗人CFI(Comptech)和山羊抗人FH(Quidel,A312)用作检测CFI和FHL1蛋白的一抗。

结果

蛋白质印迹分析显示CFI和FHL1蛋白从所有三种构建体中得以表达并分泌到培养基中(图9A和9B)。为了证实这种表达模式，通过免疫印迹分析上清液来使CFI蛋白可视化，以确定上清液中的正确加工和分泌。如图9B所示，重链和轻链CFI以及pro-CFI在用GT007转导后从HEK-293细胞分泌，证实了CFI蛋白被翻译并且发生了蛋白水解加工。在用编码CFIcDNA的质粒转染的哺乳动物细胞中，并非所有的重组pro-CFI蛋白都发生裂解，从而导致分泌出pro-CFI(88kDa)以及成熟加工的CFI，其由50kDa重链和38kDa轻链组成。

实施例5-体外表达中补体因子I和因子H样1的功能性

方法

为了分析从转导细胞分泌的CFI和FHL1的功能活性，将用以下转导的来自HEK-293细胞的条件上清液在C3b裂解测定中进行测试(图10)：单独的表达CFI的AAV(GT005)、单独的表达FHL1的AAV2(RC001)、用GT005和RC001共转导或用表达CFI和FHL1的AAV(GT007)转导。在此测定中，C3b与CFI和FHL1源混合在一起，并在37℃孵育4小时。此孵育时间针对从转导细胞中表达的转基因浓度进行了优化。此测定的原理基于，在FHL1存在下，CFI将C3b裂解成iC3b和C3f的能力。所述测定通过以下进行分析：C3b蛋白质印迹，C3b裂解产物的染色，以及通过iC3b ELISA，其定量C3b分解产物iC3b的量。

结果

C3蛋白质印迹和iC3b ELISA的结果关联并证明了体外表达的CFI和FHL1的功能活性。在C3b蛋白质印迹中(图10A)，泳道1仅显示C3b，泳道2显示C3b与CFI和FHL1混合(阳性对照)以及泳道3显示C3b与来自未转导细胞的条件上清液混合(UTD，阴性对照)。泳道4显示了当细胞的条件上清液用GT005(CFI)和RC001(FHL1)共转导时C3b的降解。泳道5显示了用GT007(表达CFI和FHL1)转导的细胞的条件上清液。所述测定证实GT007转导的细胞的条件上清液含有将C3b降解成iC3b的活性CFI和FHL1。

使用用于C3b蛋白质印迹的相同上清液执行iC3b ELISA(图10B)，并且iC3b的量被定量为蛋白质功能的直接函数。如前所述，用CFI和FHL1孵育的C3b作为阳性对照，GT005和RC001共转导的细胞的条件上清液也是如此。GT007转导的细胞的上清液显示出C3b裂解活性，证实了活性CFI和FHL1的存在。

实施例6-脉络膜新血管形成(CNV)小鼠模型的体内功效

方法

在小鼠中执行激光诱导的脉络膜新血管形成模型。小鼠(n＝12-14每组)在CNV诱导前4周接受单侧视网膜下注射AAV载体，或在CNV诱导后立即接受阿柏西普(阳性对照)。对侧的眼睛作为对照。在第4天和第7天，使用体内成像、荧光素血管造影(FA)和光谱域光学相干断层扫描(SD-OCT)跟踪小鼠。在CNV诱导后跟踪第7天研究期结束时，通过麻醉过量处死小鼠，收集血清并摘除眼睛。切除神经视网膜并在液氮中新鲜冷冻。后固定脉络膜，并制备脉络膜铺片。使用脉络膜铺片的组织学分析来定量CNV病灶中同工凝集素B4染色的面积。

结果

在CNV诱导后4天，与空(Null)载体对照组相比，阿柏西普组显著影响CNV渗漏程度(与所有其他组相比，P<0.0001)，但这在第7天消失了，大概是由于药物随时间被洗脱(washout)。在第4天(全组比较P<0.0001)和第7天(P＝0.019，与空载体组比较)，阿柏西普治疗的眼睛的CNV渗漏面积显著减少。

脉络膜铺片用荧光素标记的同工凝集素共染色。同工凝集素B4染色内皮细胞并用于使CNV病灶可视化。通过Kolmogorov-Smirnov检验评估，数据是非正态分布的(P<0.05)，并且因此，使用广义线性模型(GLM)分析确定所观察到的差异的统计显著性。与空治疗组相比，所有治疗组均显示出同工凝集素B4染色面积的统计显著降低(GLM，全组P<0.05)。表达CFI和FHL1的载体(GT005:RC001)的共同施用提供了最显著的降低。

上述说明书中提到的所有出版物均以引用方式并入本文。在不背离本发明的范围和精神的情况下，本发明所公开的剂、组合物、用途和方法的各种修改和变化对于本领域技术人员来说将是明显的。尽管本发明已经结合特定的优选实施方案进行了公开，但是应当理解，所要求保护的本发明不应被过度地限制于这些特定的实施方案。实际上，对本领域技术人员明显的、所公开的用于进行本发明的模式的各种修改旨在落入以下权利要求书的范围内。

本发明通过以下编号的段落进一步描述：

1.一种产物，其包含(i)补体因子H样蛋白1(FHL1)或补体因子H(CFH)；和(ii)补体因子I(CFI)，或编码它们的核苷酸序列，作为疗法中同时、单独或依序使用的组合制剂。

2.一种产物，其包含(i)补体因子H样蛋白1(FHL1)或补体因子H(CFH)；和(ii)补体因子I(CFI)，或编码它们的核苷酸序列，作为在治疗或预防补体介导的眼部病症中同时、单独或依序使用的组合制剂。

3.根据段落2所述的使用的产物，其中所述补体介导的病症是年龄相关性黄斑变性(AMD)或糖尿病性视网膜病变，优选AMD。

4.根据段落3所述的使用的产物，其中所述AMD是干性AMD。

5.根据任一前述段落所述的使用的产物，其中所述产物

以至少2:1，优选至少3:1，更优选至少8:1，更优选至少15:1的(i):(ii)摩尔比向受试者提供(i)和(ii)。

6.根据任一前述段落所述的使用的产物，其中所述产物以2:1至12:1之间，优选3:1至10:1之间的(i):(ii)摩尔比向受试者提供(i)和(ii)。

7.一种分离的多核苷酸，其包含编码(i)补体因子H样蛋白1(FHL1)或补体因子H(CFH)；和(ii)补体因子I(CFI)的核苷酸序列。

8.如段落7所述的分离的多核苷酸，其中所述多核苷酸还包含编码以下的核苷酸序列：

(a)CMV启动子，任选地其中CMV启动子位于编码(i)和(ii)的核苷酸序列的上游；

(b)WPRE调控元件，任选地其中WPRE调控元件位于编码(i)和(ii)的核苷酸序列的下游；和/或

(c)poly-A信号，任选地牛生长激素poly-A信号，其中所述poly-A信号任选地位于编码(i)和(ii)的核苷酸序列的下游。

9.如段落7或8所述的分离的多核苷酸，其中编码(i)的核苷酸序列位于编码(ii)的核苷酸序列的上游。

10.如段落7-9中任一段所述的分离的多核苷酸，其中所述多核苷酸还包含一个或多个腺相关病毒(AAV)反向末端重复(ITR)。

11.如段落7-10中任一段所述的分离的多核苷酸，其中所述多核苷酸在其5'端包含AAV ITR，并且在其3'端包含AAV ITR。

12.如段落7-11中任一段所述的分离的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含：

(a)5’端AAV ITR；

(b)CMV启动子；

(c)编码FHL1或CFH，优选FHL1的核苷酸序列；

(d)接头，任选地其中接头包含弗林蛋白酶裂解位点、GSG、11aa1D序列和F2A序列或由它们定义；

(e)编码CFI的核苷酸序列；

(f)WPRE调控元件，任选地其中WPRE调控元件是WPRE3调控元件；

(g)牛生长激素poly-A信号；和

(h)3’端AAV ITR。

13.如段落7-12中任一段所述的分离的多核苷酸，其中所述AAV ITR是AAV2或AAV8ITR。

14.如段落7-13中任一段所述的分离的多核苷酸，其中编码FHL1或CFH、和CFI的核苷酸序列是密码子优化的。

15.如段落7-14中任一段所述的分离的多核苷酸，其中：(a)所述编码FHL1的核苷酸序列与SEQ ID NO：12具有至少75％的序列同一性；和/或(b)所述编码CFI的核苷酸序列与SEQ ID NO：10具有至少75％的序列同一性。

16.如段落7-15中任一段所述的分离的多核苷酸，其中：(a)所述编码FHL1的核苷酸序列是SEQ ID NO：12；和/或(b)所述编码CFI的核苷酸序列是SEQ ID NO：10。

17.如段落7-16中任一段所述的分离的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含SEQ IDNO：22或23的核苷酸序列，或与其具有至少75％序列同一性的核苷酸序列。

18.如段落7-17中任一段所述的分离的多核苷酸，其中所述多核苷酸小于或等于4.7kb。

19.一种载体，其包含如段落7-18中任一段所述的多核苷酸。

20.如段落19所述的载体，其中所述载体是腺相关病毒(AAV)载体。

21.如段落19或20所述的载体，其中所述载体是病毒载体颗粒的形式。

22.如段落21所述的载体，其中所述AAV载体颗粒包含AAV2或AAV8基因组，和AAV2或AAV8衣壳蛋白。

23.一种细胞，其包含如段落7-18中任一段所述的多核苷酸。

24.一种细胞，其用如段落19-22中任一段所述的载体转导。

25.一种药物组合物，其包含如段落7-24中任一段所述的多核苷酸、载体或细胞，与药学上可接受的载剂、稀释剂或赋形剂组合。

26.如段落7-24中任一段所述的多核苷酸、载体或细胞，其用于疗法。

27.如段落7-24中任一段所述的多核苷酸、载体或细胞，其用于治疗或预防补体介导的眼部病症。

28.根据段落27所述的使用的多核苷酸、载体或细胞，其中所述补体介导的病症是年龄相关性黄斑变性(AMD)或糖尿病性视网膜病变，优选AMD。

29.根据段落28所述的使用的多核苷酸、载体或细胞，其中所述AMD是干性AMD。

30.根据段落26-29中任一段所述的使用的多核苷酸、载体或细胞，其中预防或减少了地图状萎缩的形成，和/或减少了地图状萎缩的量。

31.根据段落26-30中任一段所述的使用的多核苷酸、载体或细胞，其中减慢了地图状萎缩的进展。

32.根据段落26-31中任一段所述的使用的多核苷酸、载体或细胞，其中相对于经过同一时间段的未治疗的眼睛，在向受试者的所治疗眼睛施用后经过12个月，地图状萎缩面积的增加至少减少了10％。

33.根据段落26-32中任一段所述的使用的多核苷酸、载体或细胞，其中所述多核苷酸、载体或细胞的施用增加了在受试者或受试者的眼睛，诸如视网膜色素上皮(RPE)中的C3b灭活和iC3b降解活性的水平，任选地增加到超过受试者或其眼睛或RPE中的正常水平的水平。

34.根据段落26-33中任一段所述的使用的多核苷酸、载体或细胞，其中所述多核苷酸、载体或细胞是眼内施用的。

35.根据段落26-34中任一段所述的使用的多核苷酸、载体或细胞，其中所述多核苷酸、载体或细胞通过视网膜下、直接视网膜、脉络膜上或玻璃体内注射施用于受试者的眼睛。

36.根据段落26-35中任一段所述的使用的多核苷酸、载体或细胞，其中所述多核苷酸、载体或细胞通过视网膜下注射施用于受试者的眼睛。

37.一种治疗或预防补体介导的眼部病症的方法，其包括向有需要的受试者施用如段落7-24中任一段所述的多核苷酸、载体或细胞。

38.一种向受试者提供(i)补体因子H样蛋白1(FHL1)或补体因子H(CFH)；和(ii)补体因子I(CFI)的方法，其包括将如段落7-24中任一段所述的的多核苷酸、载体或细胞递送至受试者的眼睛。