来源于红球菌属细菌的纳米囊泡及其用途

摘要

本发明涉及来源于红球菌属细菌的囊泡及其用途。发明人已经通过实验证实了在从患有肺癌、胰腺癌、胆管癌、乳腺癌、膀胱癌、淋巴瘤、糖尿病、中风、心肌梗塞、哮喘COPD和痴呆症的患者获得的临床样品中的囊泡与正常个体相比显著减少，并且当施用从菌株中分离的囊泡时，由病原囊泡(例如来源于大肠杆菌的囊泡)引起的炎性介质的分泌被显著抑制，且来源于红球菌属细菌的囊泡显著抑制应激激素引起的脑神经细胞损伤，并且因此，根据本发明的来源于红球菌属细菌的囊泡可有效地用于开发诊断肺癌、胰腺癌、胆管癌、乳腺癌、膀胱癌、淋巴瘤、糖尿病、中风、心肌梗塞、哮喘COPD和/或痴呆症的方法以及开发用于预防、缓解或治疗恶性疾病、糖尿病、中风、心血管疾病、炎性肺病和/或脑神经疾病的组合物。

说明书

技术领域

本发明涉及来源于红球菌属(genus Rhodococcus)细菌的纳米囊泡及其用途，更具体地，涉及使用来源于红球菌属细菌的纳米囊泡诊断恶性疾病(例如肺癌、胰腺癌、胆管癌、乳腺癌、膀胱癌、淋巴瘤等等)、糖尿病、中风、心血管疾病(例如心肌梗塞等)、炎性肺病(如哮喘、慢性阻塞性肺病(COPD)等)或痴呆症的方法，和一种用于预防、缓解或治疗恶性疾病、糖尿病、中风、心血管疾病、炎性肺病或脑神经疾病(a cranial nerve disease)的组合物，其包含所述囊泡。

本申请要求2019年1月9日提交的韩国专利申请No.10-2019-0002609和2020年1月7日提交的韩国专利申请No.10-2020-0002274的优先权和在这些申请中的说明书和附图中的所有公开的内容并入本申请。

背景技术

自21世纪初以来，在过去被认为是流行病的急性传染病已变得不那么重要，而由于人类与微生物群落之间的不和谐而导致的伴随免疫功能障碍的慢性炎性疾病已经改变疾病模式，成为决定生活质量和人类寿命的主要疾病。作为21世纪的顽固性慢性病，癌症、心血管疾病、慢性炎性疾病、代谢性疾病和神经精神疾病是决定人类寿命和生活质量的重大疾病，并且成为公共卫生的一大挑战。

众所周知，人体中共存的微生物数量已达到100万亿，是人体细胞数量的10倍，微生物基因数量是人体基因数量的100倍以上。微生物群或微生物组是指微生物群落，包括存在于给定栖息地中的细菌，古细菌和真核生物。

我们体内共存的细菌和周围环境中存在的细菌会分泌纳米大小的囊泡，以便与其他细胞交换有关基因、低分子化合物、蛋白质等的信息。粘膜形成物理防御膜，尺寸为200纳米(nm)或更大的颗粒无法通过该物理防御膜，因此，共存于粘膜中的细菌不能通过粘膜，但来源于细菌的囊泡的大小为100纳米或更小并通过粘膜相对自由地穿过上皮细胞后被吸收到我们体内。由细菌局部分泌的来源于细菌的囊泡经粘膜上皮细胞吸收，从而引起局部炎症反应，而穿过上皮细胞的囊泡经淋巴管系统吸收，从而分布在各个器官中，并且免疫和炎性反应在分布有囊泡的器官中受到调节。例如，来源于诸如大肠杆菌之类的致病性革兰氏阴性细菌的囊泡局部引起结肠炎，并且在被吸收到血管中时，通过血管内皮炎症反应促进全身性炎症反应和血液凝固，以及在被吸收到胰岛素作用肌细胞中时引起胰岛素耐受性和糖尿病等等。另一方面，来源于有益细菌的囊泡可通过控制由致病性囊泡引起的免疫功能障碍和代谢功能障碍来控制疾病。

作为对来源于细菌的囊泡等因子的免疫应答，以白介素(以下称IL)-17细胞因子的分泌为特征的Th17免疫应答发生，并且在暴露于来源于病原菌的囊泡时从上皮细胞、免疫细胞等分泌IL-6，从而诱导Th17免疫应答。由Th17免疫应答引起的炎症的特征在于嗜中性粒细胞浸润，并且在发生炎症的过程中，从炎症细胞(如中性白细胞和巨噬细胞)分泌的肿瘤坏死因子-α(以下称为TNF-α)起着重要的作用。

慢性炎症与致癌作用密切相关。特别是中性粒细胞等炎症细胞分泌的IL-6和TNF-α促进癌细胞的产生和癌细胞向周围组织的浸润，从而诱发癌变。

脑源性神经营养因子(BDNF)是大脑中由BDNF基因产生的一种蛋白质，并且是一组神经营养因子中的一种，其作为生长因子的一部分。该因子与碱性神经生长因子有关，已知在抑郁症、痴呆症、阿尔茨海默病、自闭症等中该因子的表达降低。

同时，红球菌属细菌是在例如土壤或水等环境中广泛生活的嗜氧革兰氏阳性菌，并且是具有将有害的环境污染物转化为无害物质的功能的细菌。在这些细菌中，马红球菌(Rhodococcus equi)由于将其吸入而在免疫缺陷动物中引起肺部疾病，并且已知红球菌(Rhodococcus faciens)是在植物如烟叶中引起疾病的细菌。但是，迄今为止，尚未报道红球菌属细菌在细胞外分泌囊泡的情况，特别是尚未报道在癌症或心脑血管疾病等疑难杂症的诊断和治疗中的应用案例。.

因此，在本发明中，证实了与正常人相比，在肺癌、胰腺癌、胆管癌、乳腺癌、膀胱癌、淋巴瘤、糖尿病、中风、心肌梗塞、哮喘、慢性阻塞性肺病(COPD)和痴呆症患者的临床样品中，来自红球菌属细菌的囊泡显著减少，从而诊断疾病。此外，通过从属于红球菌属的马红球菌中分离囊泡并分析其特征，证实它们可以用作预防、缓解或治疗恶性疾病、糖尿病、中风、心血管疾病、炎症性肺病或脑神经疾病的组合物。

发明内容

[技术问题]

作为认真研究以解决上述常规问题的结果，发明人证实，通过宏基因组分析，与正常个体相比，在从来源于患有恶性疾病(例如肺癌、胰腺癌、胆管癌、乳腺癌、膀胱癌、淋巴瘤等等)、糖尿病、中风、心血管疾病(例如心肌梗塞等)、炎性肺病(如哮喘、COPD等)和痴呆症的患者获得的样品中，来源于红球菌属的细菌的囊泡的含量显著降低。此外，当巨噬细胞用从属于红球菌属的马红球菌中分离的囊泡处理时，证实了由病原性囊泡引起的作为炎症介质的IL-6和TNF-α的分泌受到显著抑制，抑制由应激激素引起的脑神经细胞损伤的BDNF表达显著增加，因此，在此基础上完成了本发明。

因此，本发明的一个目的是提供一种为肺癌、胰腺癌、胆管癌、乳腺癌、膀胱癌、淋巴瘤、糖尿病、中风、心肌梗塞、哮喘、COPD或痴呆症的诊断提供信息的方法。

此外，本发明的另一个目的是提供一种用于预防、缓解或治疗选自由恶性疾病、糖尿病、中风、心血管疾病、炎性肺病和脑神经疾病组成的群组中的一种或多种疾病的组合物，该组合物包含作为活性成分的来自于红球菌属细菌的囊泡。

然而，本发明要实现的技术问题不限于上述问题，并且本领域技术人员根据以下描述可以清楚地理解未提及的其他问题。

[技术方案]

为了实现上述本发明的目的，本发明提供了一种提供用于诊断肺癌、胰腺癌、胆管癌、乳腺癌、膀胱癌、淋巴瘤、糖尿病、中风、心肌梗塞、哮喘、慢性阻塞性肺病(COPD)或痴呆症的信息的方法，该方法包括以下步骤：

(a)从分离自正常个体样品和受试者样品的囊泡中提取DNA；

(b)使用基于在16S rDNA中存在的基因序列制备的成对的引物对所提取的所述DNA进行PCR(聚合酶链式反应)；以及

(c)通过对所述PCR产物的定量分析将其中来源于红球菌属细菌的囊泡的含量低于所述正常个体样品的情况分类为肺癌、胰腺癌、胆管癌、乳腺癌、膀胱癌、淋巴瘤、糖尿病、中风、心肌梗塞、哮喘、COPD或痴呆症。

此外，本发明提供了一种诊断肺癌、胰腺癌、胆管癌、乳腺癌、膀胱癌、淋巴瘤、糖尿病、中风、心肌梗塞、哮喘、慢性阻塞性肺病(COPD)或痴呆症的方法，该方法包括以下步骤：

(a)从分离自正常个体样品和受试者样品的囊泡中提取DNA；

(b)使用基于在16S rDNA中存在的基因序列制备的成对的引物对所提取的所述DNA进行PCR以获得每种PCR产物；以及

(c)通过对所述PCR产物的定量分析将其中来源于红球菌属细菌的囊泡的含量低于所述正常个体样品的情况确定为肺癌、胰腺癌、胆管癌、乳腺癌、膀胱癌、淋巴瘤、糖尿病、中风、心肌梗塞、哮喘、COPD或痴呆症。

作为本发明的一实施方案，步骤(a)中的样本可以是血液、尿液、粪便、唾液或鼻粘膜，优选血液或尿液，但不受限于此。

作为本发明的另一实施方案，步骤(b)中的引物对可以是SEQ ID No.1和SEQ IDNo.2的引物。

此外，本发明提供了一种用于预防或治疗选自由恶性疾病、糖尿病、中风、心血管疾病、炎性肺疾病和脑神经疾病组成的群组的一种或多种疾病的药物组合物，其包含作为活性成分的来源于红球菌属细菌的囊泡。

此外，本发明提供了一种用于预防或缓解选自由恶性疾病、糖尿病、中风、心血管疾病、炎性肺病和脑神经疾病组成的群组中的一种或多种疾病的食品组合物，其包含作为活性成分的来源于红球菌属细菌的囊泡。

此外，本发明提供了一种用于预防或治疗选自由恶性疾病、糖尿病、中风、心血管疾病、炎性肺病和脑神经疾病组成的群组中的一种或多种疾病的吸入剂组合物，其包含作为活性成分的来源于红球菌属细菌的囊泡。

此外，本发明提供了一种预防或治疗选自由恶性疾病、糖尿病、中风、心血管疾病、炎性肺病和脑神经疾病组成的群组中的一种或多种疾病的方法，所述方法包括将包含作为活性成分的来源于红球菌属细菌的囊泡的药物组合物施用给受试者的步骤。

此外，本发明提供了包含作为活性成分的来源于红球菌属细菌的囊泡的药物组合物的用途，其用于预防或治疗选自由恶性疾病、糖尿病、中风、心血管疾病、炎性肺病和脑神经疾病组成的群组中的一种或多种疾病。

此外，本发明提供了来源于红球菌属细菌的囊泡用于制备药物的用途，所述药物用于治疗选自由恶性疾病、糖尿病、中风、心血管疾病、炎性肺病和脑神经疾病组成的群组中的一种或多种疾病。

作为本发明的一实施方案，所述恶性疾病可以为选自由肺癌、胰腺癌、胆管癌、乳腺癌、膀胱癌和淋巴瘤组成的群组中的一种或多种。

作为本发明的另一实施方案，所述心血管疾病可以为选自由心肌梗塞、高血压、缺血性心脏病、冠状动脉疾病、心绞痛、动脉粥样硬化(动脉硬化)和心律失常组成的群组中的一种或多种。

作为本发明的另一实施方案，所述炎性肺病可以为选自由哮喘、COPD、急性肺损伤、脓胸、肺脓肿、肺炎、肺结核和支气管炎组成的群组中的一种或多种。

作为本发明的另一实施方案，所述脑神经疾病可以为选自由抑郁症、强迫症、精神分裂症、痴呆、阿尔茨海默病、癫痫、自闭症和帕金森病组成的群组中的一种或多种。

此外，本发明提供一种用于预防或缓解炎性皮肤病的化妆品组合物，其包含作为活性成分的来源于红球菌属细菌的囊泡。

作为本发明的另一实施方案，所述炎性皮肤病可以是选自由特应性皮炎、痤疮、脱发和牛皮癣组成的群组中的一种或多种。

作为本发明的一实施方案，囊泡的平均直径可以为10至200nm。

作为本发明的另一实施方案，囊泡可以由红球菌属细菌天然或人工分泌。

作为本发明的另一个实施方案，来源于红球菌属细菌的囊泡可以从马红球菌分泌。

[有益效果]

发明人证实肠道细菌不会通过上皮细胞吸收到体内，但是来源于细菌的囊泡会被吸收，全身分布，然后通过肾脏、肝脏和肺部排泄出体内，以及通过对来源于在患者的血液中存在的细菌的囊泡进行宏基因组分析，也证实了与正常个体相比，来源于在患有肺癌、胰腺癌、胆管癌、乳腺癌、膀胱癌、淋巴瘤、糖尿病、中风、心肌梗塞、哮喘、COPD和痴呆症的患者的血液中存在的红球菌属的细菌的囊泡明显减少。此外，当炎性细胞与从作为红球菌属的一种细菌物种的马红球菌体外培养和分离的囊泡一起在体外施用时，观察到由炎性因子引起的炎症介质的分泌受到显著抑制。此外，由于证实了被应激激素抑制的神经细胞的BDNF表达被囊泡显著恢复，因此根据本发明的来源于红球菌属细菌的囊泡有望被有效地使用在诊断肺癌、胰腺癌、胆管癌、乳腺癌、膀胱癌、淋巴瘤、糖尿病、中风、心肌梗塞、哮喘、COPD或痴呆症的方法中，以及使用在用于预防或治疗恶性疾病、糖尿病、中风、心血管疾病、炎性肺病和脑神经疾病的食品、吸入剂或药物组合物中。

附图说明

图1A是在对小鼠口服施用细菌和来源于细菌的囊泡(EV)之后按时间捕获细菌和来源于细菌的囊泡(EV)的分布模式的一系列照片，并且图1B是通过在口服施用细菌和囊泡后12小时收集血液、肾脏、肝脏和各种器官来评估细菌和囊泡的体内分布模式的结果。

图2A和2B是通过在对肺癌患者和正常个体的血液中存在的来源于细菌的囊泡进行了宏基因组分析之后，比较来源于红球菌属的细菌的囊泡的分布所获得的结果，其中图2A是使用血液样品的结果，而图2B是使用尿液样品的结果。

图3是在对胰腺癌患者和正常个体的血液中存在的来源于细菌的囊泡进行了宏基因组分析之后，比较来源于红球菌属的细菌的囊泡的分布的结果。

图4是在对胆管癌患者和正常个体的血液中存在的来源于细菌的囊泡进行了宏基因组分析之后，比较来源于红球菌属的细菌的囊泡的分布的结果。

图5是在对乳腺癌患者和正常个体的血液中存在的来源于细菌的囊泡进行了宏基因组分析之后，比较来源于红球菌属的细菌的囊泡的分布的结果。

图6是在对膀胱癌患者和正常个体的血液中存在的来源于细菌的囊泡进行了宏基因组分析之后，比较来源于红球菌属细菌的囊泡的分布的结果。

图7是在对淋巴瘤患者和正常个体的血液中存在的来源于细菌的囊泡进行了宏基因组分析之后，比较来源于红球菌属的细菌的囊泡的分布的结果。

图8是在对糖尿病患者和正常个体的血液中存在的来源于细菌的囊泡进行了宏基因组分析之后，比较来源于红球菌属的细菌的囊泡的分布的结果。

图9是在对中风患者和正常个体的血液中存在的来源于细菌的囊泡进行了宏基因组分析之后，比较来源于红球菌属的细菌的囊泡的分布的结果。

图10是在对心肌梗塞患者和正常个体的血液中存在的来源于细菌的囊泡进行了宏基因组分析之后，比较来源于红球菌属的细菌的囊泡的分布的结果。

图11是在对哮喘患者和正常个体的血液中存在的来源于细菌的囊泡进行了宏基因组分析之后，比较来源于红球菌属的细菌的囊泡的分布的结果。

图12是在对COPD患者和正常个体的血液中存在的来源于细菌的囊泡进行了宏基因组分析之后，比较来源于红球菌属的细菌的囊泡的分布的结果。

图13是在对痴呆患者和正常个体的血液中存在的来源于细菌的囊泡进行了宏基因组分析之后，比较来源于红球菌属的细菌的囊泡的分布的结果。

图14A和14B是通过在处理作为致病性囊泡的大肠杆菌囊泡(E.coli EV)之前通过来源于红球菌属细菌的囊泡进行预处理来评估对大肠杆菌囊泡的炎症介质分泌的影响而获得的结果，以评估来源于马红球菌的囊泡的抗炎性和免疫调节作用，图14A为比较IL-6分泌程度的结果，图14B为比较TNF-α分泌程度的结果。

图15显示了通过同时用来源于马红球菌的囊泡处理已经用作为应激激素的肾上腺皮质激素(GC)处理过的神经细胞来评估对由神经细胞进行的脑源性神经营养因子(BDNF)表达的影响的结果，以评估来源于马红球菌的囊泡的神经细胞保护作用(EV：马红球菌细胞外囊泡)。

具体实施方式

本发明涉及来源于红球菌属细菌的囊泡及其用途。

发明人证实，通过宏基因组分析，与正常个体相比，在患有肺癌、胰腺癌、胆管癌、乳腺癌、膀胱癌、淋巴瘤、糖尿病、中风、心肌梗塞、哮喘、COPD和痴呆症的患者的样品中，来源于红球菌属的细菌的囊泡的含量显著降低。此外，当巨噬细胞用从属于红球菌属的马红球菌中分离的囊泡处理时，证实了由病原性囊泡引起的作为炎症介质的IL-6和TNF-α的分泌受到显著抑制，由应激激素抑制的神经细胞的BDNF表达被囊泡显著恢复，在此基础上完成了本发明。

因此，本发明提供了一种提供用于诊断肺癌、胰腺癌、胆管癌、乳腺癌、膀胱癌、淋巴瘤、糖尿病、中风、心肌梗塞、哮喘、COPD或痴呆症的信息的方法，该方法包括以下步骤：

(a)从分离自正常个体样品和受试者样品的囊泡中提取DNA；

(b)使用基于在16S rDNA中存在的基因序列制备的成对的引物对所提取的所述DNA进行PCR以获得每种PCR产物；以及

(c)通过对所述PCR产物的定量分析将其中来源于红球菌属细菌的囊泡的含量低于所述正常个体样品的情况分类为肺癌、胰腺癌、胆管癌、乳腺癌、膀胱癌、淋巴瘤、糖尿病、中风、心肌梗塞、哮喘、COPD或痴呆症。

如本文所使用的，术语“诊断”是指广义上在所有方面确定患者的疾病状况。确定的内容是疾病的实体、病因、发病机理、严重程度、疾病的详细方面、是否存在并发症、预后等。本发明中的诊断是指确定肺癌、胰腺癌、胆管癌、乳腺癌、膀胱癌、淋巴瘤、糖尿病、中风、心肌梗塞、哮喘、COPD和/或痴呆症是否发生，疾病的程度等。

如本文所使用的，术语“纳米囊泡”或“囊泡”是指由从各种细菌分泌的纳米尺寸的膜组成的结构。来源于革兰氏阴性细菌的囊泡或外膜囊泡(OMV)具有内毒素(脂多糖)、毒性蛋白、以及细菌DNA和RNA，以及来源于革兰氏阳性细菌的囊泡除了蛋白质和核酸之外还具有肽聚糖和脂磷壁酸，它们是细菌的细胞壁成分。在本发明中，纳米囊泡或囊泡是由红球菌属细菌天然分泌的或人工产生的，呈球形，平均直径为10至200nm。

如本文所使用的，术语“宏基因组”还指微生物组，并且是指在诸如土壤和动物肠等独立区域中的包括所有病毒、细菌、真菌等的全部基因组，并且通常用作基因组的概念，解释通过使用序列分析仪一次鉴定大量微生物以分析未培养的微生物(uncultivatedmicroorganisms)。特别地，宏基因组不是指一种物种的基因组，而是指一种混合基因组，作为一种环境单位的所有物种的基因组。当在组学生物学的发展过程中定义一个物种时，该宏基因组就是从形成完整物种的观点衍生的术语，它是由各种彼此相互作用的物种以及一种功能上存在的物种形成的。从技术上讲，宏基因组是技术的目标，该技术通过使用快速序列分析方法，分析所有DNA和RNA(不考虑物种)来识别一个环境中的所有物种，并研究相互作用和代谢。

在本发明中，来源于患者的样品可以是血液、尿液、粪便、唾液或鼻粘膜，优选血液或尿液，但不受限于此。

在本发明中，步骤(b)中的引物对可以是SEQ ID No.1和SEQ ID No.2的引物，但不受限于此。

本发明的另一方面提供了用于预防或治疗选自由恶性疾病、糖尿病、中风、心血管疾病、炎性肺病和脑神经疾病组成的群组中的一种或多种疾病的组合物，其包含作为活性成分的来源于红球菌属细菌的囊泡。

在本发明中，该组合物包括药物组合物和吸入剂组合物。

此外，本发明提供了一种预防或治疗选自由恶性疾病、糖尿病、中风、心血管疾病、炎性肺病和脑神经疾病组成的群组中的一种或多种疾病的方法，所述方法包括将包含作为活性成分的来源于红球菌属细菌的囊泡的药物组合物施用给受试者的步骤。

此外，本发明提供了包含作为活性成分的来源于红球菌属细菌的囊泡的药物组合物的用途，其用于预防或治疗选自由恶性疾病、糖尿病、中风、心血管疾病、炎性肺病和脑神经疾病组成的群组中的一种或多种疾病。

此外，本发明提供了来源于红球菌属细菌的囊泡用于制备药物的用途，所述药物用于治疗选自由恶性疾病、糖尿病、中风、心血管疾病、炎性肺病和脑神经疾病组成的群组中的一种或多种疾病。

如本文所使用的术语“预防”是指抑制恶性疾病、糖尿病、中风、心血管疾病、炎性肺病、脑神经疾病或类似疾病或者通过施用根据本发明的组合物来延迟其发作的所有行为。

如本文所使用的，术语“治疗”是指通过施用根据本发明的组合物来减轻或有益地改变恶性疾病、糖尿病、中风、心血管疾病、炎性肺病、脑神经疾病或类似疾病的症状的所有行为。

如本文所使用的，术语“缓解”是指至少减少与待治疗的病症相关的参数(例如症状的程度)的所有行为。

本文使用的术语“受试者”是指需要治疗选自由恶性疾病、糖尿病、中风、心血管疾病、炎性肺疾病和脑神经疾病组成的群组中的一种或多种疾病的受试者，并且更具体地，哺乳动物，例如人或非人灵长类动物、小鼠、狗、猫、马、牛等。

本文使用的术语“施用”是指通过任何合适的方法向受试者提供本发明的组合物。

本文所用的“恶性疾病”是指所有预后极差的疾病，如癌症、肉瘤等，以及治疗难度大、进展快的疾病，在本发明中，所述的恶性疾病可以是选自由肺癌、胰腺癌、胆管癌、乳腺癌、膀胱癌和淋巴瘤组成的群组中的一种或多种，但本发明不限于此。

本文所用术语“心血管疾病”是发生在心脏和大动脉中的疾病的总称，在本发明中，心血管疾病可以为选自由心肌梗塞、高血压、缺血性心脏病、冠状动脉疾病、心绞痛、动脉粥样硬化(动脉硬化)和心律失常组成的群组中的一种或多种，但本发明不限于此。

本文所用的术语“炎性肺病”是指由与肺相关的炎症反应引起的疾病，在本发明中，所述炎性肺病可以为选自由哮喘、COPD、急性肺损伤、脓胸、肺脓肿、肺炎、肺结核和支气管炎组成的群组中的一种或多种，但本发明不限于此。

本文所用的术语“脑神经疾病”是由脑神经细胞问题引起的疾病的总称，在本发明中，所述脑神经疾病可以为选自由抑郁症、强迫症、精神分裂症、痴呆、阿尔茨海默病、癫痫、自闭症和帕金森病组成的群组中的一种或多种，但本发明不限于此。

可通过使用选自离心、超高速离心、高压处理、挤出、超声处理、细胞裂解、均质化、冷冻-解冻、电穿孔、机械分解、化学处理、过滤器过滤、凝胶过滤色谱、自由流动电泳和毛细管电泳的一种或多种方法，从包含红球菌属细菌的培养液中分离囊泡。此外，可以进一步包括诸如用于去除杂质的洗涤和对所获得的囊泡的浓缩之类的过程。

本发明的药物组合物可以包含药学上可接受的载体。药学上可接受的载体通常用于制剂中，并且包括生理盐水(saline)、无菌水、林格氏溶液、缓冲盐水、环糊精、葡萄糖溶液、麦芽糖糊精溶液、甘油、乙醇、脂质体等，但不受限于此，并且如果需要，还可包括其他典型的添加剂，例如抗氧化剂和缓冲剂。此外，可通过另外添加稀释剂、分散剂、表面活性剂、粘合剂、润滑剂等将组合物配制成可注射的制剂(例如水溶液、悬浮液和乳剂)、丸剂、胶囊剂、颗粒剂或片剂。关于合适的药学上可接受的载体和制剂，可以优选地通过使用Remington’s literature(雷明顿文献)中公开的方法根据每种成分来配制组合物。本发明的药物组合物的制剂没有特别限制，但可以配制成注射剂、吸入剂、皮肤外用剂、口服剂等。

本发明的药物组合物可以根据所期望的方法口服施用或可肠胃外施用(例如静脉内、皮下、皮内施用)，并且剂量可以根据患者的病症和体重、疾病的严重程度、药物制剂以及施用途径和持续时间而变化，但是可以由本领域普通技术人员适当地选择。

根据本发明的药物组合物以药学有效量施用。在本发明中，药学有效量是指足以以适用于医疗的合理利益/风险比治疗疾病的量，并且有效剂量水平可根据包括患者的疾病类型、疾病的严重程度、药物活性、对药物的敏感性、施用时间、施用途径、排泄率、治疗期和同时使用的药物的因素，以及其他医学领域众所周知的因素确定。根据本发明的组合物可以作为单独的治疗剂施用或与其他治疗剂组合施用，可以与相关技术中的治疗剂顺序或同时施用，并且可以单剂量或多剂量施用。考虑到所有上述因素，重要的是以可以在没有任何副作用的情况下获得最大效果的最小量施用组合物，这可以由本领域普通技术人员容易地确定。

具体而言，根据本发明的药物组合物的有效量可以根据患者的年龄、性别或体重而变化。然而，由于剂量可以根据施用途径、肥胖的严重程度、性别、体重、年龄等而增加或减少。

本发明的另一方面提供了用于预防或缓解选自由恶性疾病、糖尿病、中风、心血管疾病、炎性肺病和脑神经疾病组成的群组中的一种或多种疾病的食品组合物，其包含作为活性成分的来源于红球菌属细菌的囊泡。

本发明的食品组合物包括保健功能食品组合物。根据本发明的食品组合物可以通过将活性成分原样添加到食品中来使用，或者可以与其他食品或食品成分一起使用，但是可以根据典型方法适当地使用。活性成分的混合量可以根据其使用目的(用于预防或减轻)适当地确定。通常，当制备食品或饮料时，基于原料计，本发明的组合物的添加量为15重量％以下，优选为10重量％以下。但是，对于出于健康和卫生目的或出于健康控制目的而长期摄入时，所述量可能少于上述范围。

除了本发明的食品组合物包含指定比例的活性成分作为必要成分之外，其他成分没有特别限制，并且本发明的食品组合物可包含各种调味剂、天然碳水化合物等，如同典型的饮料一样，作为附加成分。上述天然碳水化合物的实例包括常规的糖，例如单糖，例如葡萄糖、果糖等；二糖，例如麦芽糖、蔗糖等；和多糖，例如糊精、环糊精等；以及糖醇，如木糖醇、山梨糖醇和赤藓糖醇。作为除了上述调味剂以外的调味剂，可以有利地使用天然调味剂(甜蛋白(thaumatin)，甜叶菊提取物(例如莱鲍迪甙A、甘草甜素等)和合成调味剂(糖精、阿斯巴甜等)。天然碳水化合物的比例可以通过本领域普通技术人员的选择适当地确定。

除了所述添加剂之外，本发明的食品组合物还可包含各种营养素、维生素、矿物质(电解质)、调味剂(例如合成调味剂和天然调味剂)、着色剂和填充剂(奶酪、巧克力等)、果胶酸及其盐、藻酸及其盐、有机酸、保护性胶体增稠剂、pH调节剂、稳定剂、防腐剂、甘油、醇类、碳酸饮料中使用的碳酸化剂等。这些成分可以单独使用或以其组合使用。这些添加剂的比例也可以由本领域普通技术人员适当地选择。

本发明的吸入剂组合物不仅可以包括来源于红球菌属细菌的囊泡，而且还可以包括吸入剂组合物中常规使用的成分，例如常规佐剂，例如抗氧化剂、稳定剂、增溶剂、维生素和调味剂和载体。

本发明的另一方面提供了一种用于预防或减轻炎性皮肤病的化妆品组合物，其包含作为活性成分的来源于红球菌属细菌的囊泡。

在本发明中，炎性皮肤病可以是选自由特应性皮炎、痤疮、脱发和牛皮癣组成的群组中的一种或多种疾病，但不受限于此。

本发明的化妆品组合物可以包含化妆品组合物中常规使用的成分以及来源于红球菌属细菌的囊泡，并且可以包括例如常规添加剂(例如抗氧化剂、稳定剂、增溶剂、维生素、色素和香料)以及载体。

另外，除了来源于红球菌属细菌的囊泡之外，本发明的组合物还可以通过混合常规使用的有机防晒剂来使用，只要其不通过与来源于红球菌属细菌的囊泡反应而损害皮肤保护效果即可。所述有机防晒剂可以选自由以下组成的群组中的一种或多种：甘油基PABA、甲酚曲唑三硅氧烷(drometrizole trisiloxane)、甲酚曲唑(drometrizole)、三油基二没食子酸酯(digalloyl trioleate)、苯基二苯并咪唑四磺酸二钠(disodium phenyldibenzimidazole tetrasulfonate)、二乙基己基丁酰胺三嗪酮(diethylhexylbutamidotriazone)、二乙氨基羟基苯甲酰基己基苯甲酸酯(diethylaminohydroxybenzoyl hexylbenzoate)、DEA-甲氧基肉桂酸酯(DEA-methoxycinnamate)、劳森/二羟基丙酮混合物(a Lawson/dihydroxyacetone mixture)、亚甲基双-苯并三唑基四甲基丁基苯酚(methylenebis-benzotriazolyltetramethylbutylphenol)、4-甲基亚苄基樟脑、邻氨基苯甲酸甲酯(methyl anthranilate)、二苯甲酮-3(氧苯甲酮)、二苯甲酮-4、二苯甲酮-8(二氧苯甲酮)(benzophenone-8(dioxyphebenzone))、丁基甲氧基二苯甲酰甲烷、双乙基己氧基苯酚甲氧基苯基三嗪、肉桂酸酯、乙基二羟丙基PABA、辛二烯、乙基己基二甲基PABA、甲氧基肉桂酸乙基己酯、水杨酸乙基己酯(ethylhexyl salicylate)、乙基己基三嗪酮(ethylhexyl triazone)、对甲氧基肉桂酸异戊酯(isoamyl-p-methoxycinnamate)、聚硅氧烷-15(亚苄基丙二酸盐聚硅氧烷)(polysilicon-15(dimethicodiethylbenzalmalonate))、对苯二亚甲基二樟脑磺酸(terephthalylidene dicamphor sulfonic acid)及其盐、TEA-水杨酸酯和氨基苯甲酸(PABA)。

可以包含本发明化妆品组合物的产品包括，例如化妆品，例如收敛剂，皮肤爽肤水，滋养爽肤水，各种类型的面霜，精华，面膜(packs)和粉底，清洁剂，洗面奶，肥皂，护理剂和补品。本发明的化妆品组合物的具体制剂包括皮肤乳液、皮肤柔软剂、皮肤爽肤水、收敛剂、乳液、乳霜、保湿乳液、营养乳液、按摩霜、营养霜、保湿霜、护手霜、香精、滋养香精、面膜、肥皂、洗发水、清洁泡沫、清洁乳液、清洁霜、润肤露、沐浴露、乳液、口红、隔离霜(amakeup base)、粉底、粉饼、散粉和眼影膏。

在本发明的一个实施方案中，通过对小鼠口服施用细菌和来源于细菌的囊泡并观察该细菌和囊泡的体内吸收、分布和排泄模式，证实了，尽管细菌不是通过肠粘膜吸收的，但是来源于细菌的囊泡在施用后5分钟内被吸收并全身分布，且通过肾脏、肝脏等排泄(参见实施例1)。

在本发明的另一实施方案中，通过使用从正常个体的血液或尿液中分离的囊泡进行细菌宏基因组分析，所述正常个体的年龄和性别与患有肺癌、胰腺癌、胆管癌、乳腺癌、膀胱癌、淋巴瘤、糖尿病、中风、心肌梗塞、哮喘、COPD和痴呆症的患者匹配。结果证实，与正常个体的样品相比，在患有肺癌、胰腺癌、胆管癌、乳腺癌、膀胱癌、淋巴瘤、糖尿病、中风、心肌梗塞、哮喘、COPD和痴呆症的患者的临床样品中，来源于红球菌属细菌的囊泡显著减少(参见实施例3至14)。

在本发明的又一实施方案中，评估了培养的马红球菌菌株分泌的囊泡是否表现出免疫调节和抗炎作用，并作为通过用不同浓度的来源于马红球菌的囊泡处理巨噬细胞，然后用作为炎性疾病的致病因子的来源于大肠杆菌的囊泡处理巨噬细胞来评估炎症介质分泌的结果，证实了由来源于大肠杆菌的囊泡引起的IL-6和TNF-α的分泌被来源于马红球菌的囊泡有效抑制(见实施例16)。

在本发明的又一实施方式中，评估了来源于马红球菌的囊泡的神经细胞保护作用，并且作为通过同时来源于马红球菌的囊泡处理已经用用刺激神经细胞的肾上腺皮质激素处理过的神经细胞来评估脑源性神经营养因子(BDNF)表达的结果，证实了来源于马红球菌的囊泡有效增加BDNF的表达，BDNF是防止神经细胞损伤的介质(参见实施例17)

在下文中，将提出有助于理解本发明的优选实施例。然而，提供以下实施例仅是为了更容易理解本发明，并且本发明的内容不受以下实施例的限制。

为了评估细菌和来源于细菌的囊泡是否通过粘液被全身吸收，用以下方法进行实验。首先，将50μg剂量的带有荧光标记的肠道细菌和来源于肠道细菌的囊泡中的每种施用至小鼠的胃，并在0分钟、5分钟、3小时、6小时和12小时后测量荧光。作为观察小鼠的整个图像的结果，如图1A所示，细菌不被全身吸收，但是在施用后5分钟，来源于细菌的囊泡被全身吸收，并且在施用后3小时在膀胱中观察到强烈荧光，从而可以看出囊泡是排泄到泌尿道。此外，可以看出，囊泡在体内存在直至施用后12小时(参见图1A)。

此外，为了评估其中的肠道细菌和来源于肠道细菌的囊泡被全身吸收后渗透到各个器官中的模式，以与上述相同的方式施用50μg带有荧光标记的细菌和来源于细菌的囊泡，然后在施用12小时后收集尿液、心脏、肺、肝脏、肾、脾、脂肪和肌肉。作为观察到的在收集的组织中的荧光的结果，如图1B所示，可以看出来源于细菌的囊泡分布在尿液、心脏、肺、肝、脾、脂肪、肌肉和肾中，但是细菌没有被吸收(参见图1B)。

在首先将血液或尿液放入10ml试管中，并且通过离心(3,500×g，10分钟，4℃)使悬浮物沉降后，仅将上清液转移至新的10ml试管。使用0.22-μm的过滤器除去细菌和杂质后，将它们转移到Centriprep管(离心过滤器50kD)中，并在1,500×g和4℃下离心15分钟，弃去小于50kD的物质，将残余物浓缩至10ml。使用0.22-μm的过滤器再次除去细菌和杂质后，通过使用90Ti型转子在150,000×g和4℃下进行超高速离心3小时，弃去上清液，并将聚集的团块(pellet)溶解在生理盐水(PBS)中。

将通过上述方法分离的100μl囊泡在100℃下煮沸，从脂质中提取内部DNA，然后在冰上冷却5分钟。然后，为了除去残留的悬浮物，将DNA在10,000×g和4℃下离心30分钟，仅收集上清液。并且，通过使用Nanodrop定量DNA的量。此后，为了确认提取的DNA中是否存在来源于细菌的DNA，用下表1所示的16s rDNA引物进行PCR，并确认提取的基因中存在来源于细菌的基因。

[表1]

使用16S rDNA引物对通过上述方法提取的DNA进行扩增，然后进行测序(

从126例肺癌患者和198例正常个体(两组的年龄和性别均匹配)的血液中存在的囊泡中提取基因，使用实施例2的方法对所述血液进行宏基因组分析后，对来源于红球菌属细菌的囊泡的分布进行评估。结果，证实与来源于正常个体的血液相比，在来自肺癌患者的血液中的来源于红球菌属细菌的囊泡显著减少(参见表2和图2A)。

[表2]

从66例肺癌患者和78例正常个体(两组的年龄和性别均匹配)的尿液中存在的囊泡中提取基因，使用实施例2的方法对所述尿液进行宏基因组分析后，对来源于红球菌属细菌的囊泡的分布进行评估。结果，证实与来源于正常个体的尿液相比，在来自肺癌患者的尿液中的来源于红球菌属细菌的囊泡显著减少(参见表3和图2B)

[表3]

从176例胰腺癌患者和271例正常个体(两组的年龄和性别均匹配)的血液中存在的囊泡中提取基因，使用实施例2的方法对所述血液进行宏基因组分析后，对来源于红球菌属细菌的囊泡的分布进行评估。结果，证实与来源于正常个体的血液相比，在来自胰腺癌患者的血液中的来源于红球菌属细菌的囊泡显著减少(参见表4和图3)。

[表4]

从79例胆管癌患者和159例正常个体(两组的年龄和性别均匹配)的血液中存在的囊泡中提取基因，使用实施例2的方法对所述血液进行宏基因组分析后，对来源于红球菌属细菌的囊泡的分布进行评估。结果，证实与来源于正常个体的血液相比，在来自胆管癌患者的血液中的来源于红球菌属细菌的囊泡显著减少(参见表5和图4)。

[表5]

从107例乳腺癌患者和129例正常个体(两组的年龄和性别均匹配)的血液中存在的囊泡中提取基因，使用实施例2的方法对所述血液进行宏基因组分析后，对来源于红球菌属细菌的囊泡的分布进行评估。结果，证实与来源于正常个体的血液相比，在来自乳腺癌患者的血液中的来源于红球菌属细菌的囊泡显著减少(参见表6和图5)。

[表6]

从91例膀胱癌患者和176例正常个体(两组的年龄和性别均匹配)的血液中存在的囊泡中提取基因，使用实施例2的方法对所述血液进行宏基因组分析后，对来源于红球菌属细菌的囊泡的分布进行评估。结果，证实与来源于正常个体的血液相比，在来自膀胱癌患者的血液中的来源于红球菌属细菌的囊泡显著减少(参见表7和图6)。

[表7]

从81例淋巴瘤患者和86例正常个体(两组的年龄和性别均匹配)的血液中存在的囊泡中提取基因，使用实施例2的方法对所述血液进行宏基因组分析后，对来源于红球菌属细菌的囊泡的分布进行评估。结果，证实与来源于正常个体的血液相比，在来自淋巴瘤患者的血液中的来源于红球菌属细菌的囊泡显著减少(参见表8和图7)。

[表8]

从114例糖尿病患者和132例正常个体(两组的年龄和性别均匹配)的血液中存在的囊泡中提取基因，使用实施例2的方法对所述血液进行宏基因组分析后，对来源于红球菌属细菌的囊泡的分布进行评估。结果，证实与来源于正常个体的血液相比，在来自糖尿病患者的血液中的来源于红球菌属细菌的囊泡显著减少(参见表9和图8)。

[表9]

从124例中风患者和142例正常个体(两组的年龄和性别均匹配)的血液中存在的囊泡中提取基因，使用实施例2的方法对所述血液进行宏基因组分析后，对来源于红球菌属细菌的囊泡的分布进行评估。结果，证实与来源于正常个体的血液相比，在来自中风患者的血液中的来源于红球菌属细菌的囊泡显著减少(参见表10和图9)。

[表10]

从57例心肌梗塞患者和113例正常个体(两组的年龄和性别均匹配)的血液中存在的囊泡中提取基因，使用实施例2的方法对所述血液进行宏基因组分析后，对来源于红球菌属细菌的囊泡的分布进行评估。结果，证实与来源于正常个体的血液相比，在来自心肌梗塞患者的血液中的来源于红球菌属细菌的囊泡显著减少(参见表11和图10)。

[表11]

从135例哮喘患者和164例正常个体(两组的年龄和性别均匹配)的血液中存在的囊泡中提取基因，使用实施例2的方法对所述血液进行宏基因组分析后，对来源于红球菌属细菌的囊泡的分布进行评估。结果，证实与来源于正常个体的血液相比，在来自哮喘患者的血液中的来源于红球菌属细菌的囊泡显著减少(参见表12和图11)。

[表12]

从205例COPD患者和231例正常个体(两组的年龄和性别均匹配)的血液中存在的囊泡中提取基因，使用实施例2的方法对所述血液进行宏基因组分析后，对来源于红球菌属细菌的囊泡的分布进行评估。结果，证实与来源于正常个体的血液相比，在来自COPD患者的血液中的来源于红球菌属细菌的囊泡显著减少(参见表13和图12)。

[表13]

从72例痴呆症患者和93例正常个体(两组的年龄和性别均匹配)的血液中存在的囊泡中提取基因，使用实施例2的方法对所述血液进行宏基因组分析后，对来源于红球菌属细菌的囊泡的分布进行评估。结果，证实与来源于正常个体的血液相比，在来自痴呆症患者的血液中的来源于红球菌属细菌的囊泡显著减少(参见表14和图13)。

[表14]

实

基于上述实施例的结果，培养属于红球菌属的马红球菌菌株，然后从中分离其囊泡。马红球菌菌株在脑心浸液(BHI)培养基中，在37℃厌氧室中培养至吸光度(OD600)为1.0～1.5，然后传代培养。之后，收集不含菌株的培养基上清液，并且在10,000g，4℃下离心15分钟，通过0.45-μm过滤器过滤，过滤后的上清液使用带有100kDa中空滤膜的QuixStand台式系统(GE Healthcare,UK)通过超滤浓缩至200mL体积。然后，将浓缩的上清液再次通过0.22-μm过滤器过滤，过滤后的上清液在150,000g和4℃下超速离心3小时，用Dulbecco磷酸盐缓冲盐水(DPBS)悬浮沉淀。随后，使用10％、40％和50％OptiPrep溶液(Axis-Shield PoCAS，挪威)进行密度梯度离心，并且用HEPES缓冲盐水(20mM HEPES，150mM NaCl，pH 7.4)稀释OptiPrep溶液，以制备低密度溶液。在200,000g和4℃下进行离心2小时，从上层分馏成相同体积1mL的每种溶液另外在150,000g和4℃下超速离心3小时。然后，使用双辛可宁酸(BCA)测定法对蛋白质进行定量，并对获得的囊泡进行实验。

为了检查来源于马红球菌的囊泡对炎症细胞分泌炎症介质的作用，用来源于马红球菌的囊泡以不同浓度(0.1μg/ml、1μg/ml和10μg/mL)处理Raw 264.7细胞(其为小鼠巨噬细胞系)，然后用大肠杆菌EV(其是炎性疾病的致病囊泡)进行处理，然后测量炎症介质(IL-6和TNF-α)的分泌量。更具体地说，将Raw264.7细胞以每孔1×10

脑源性神经营养因子(BDNF)是保护神经细胞免受神经细胞损伤的主要介质，其在痴呆、抑郁、阿尔茨海默病、自闭症等中的表达降低。在本实施例中，为了评估来源于马红球菌的囊泡对脑神经疾病的治疗效果，通过用应激激素处理神经细胞来评价神经细胞保护效果。即，神经细胞(海马神经元细胞系，HT22细胞)与肾上腺皮质激素(GC：皮质酮400ng/ml)或来源于马红球菌的囊泡(EV，20μg/mL)在体外培养24小时，并且通过PCR评估BDNF表达。

结果证实，通过来源于马红球菌的囊泡的处理，显著恢复了被肾上腺皮质激素处理抑制的BDNF表达(参见图15)。这意味着来源于马红球菌的囊泡可以有效抑制由例如压力之类的引起脑神经细胞损伤的因子所引起的脑神经疾病

提供本发明的上述描述是出于说明的目的，并且本发明所属领域的普通技术人员应理解，在不改变本发明的技术精神或基本特征的情况下，可以容易地将本发明修改为其他特定形式。因此，应当理解，上述实施例在所有方面仅进行了说明，而不是限制性的。

【工业适用性】

根据本发明，来源于红球菌属细菌的囊泡有望有效地用于诊断肺癌、胰腺癌、胆管癌、乳腺癌、膀胱癌、淋巴瘤、糖尿病、中风、心肌梗塞、哮喘、COPD或痴呆症的方法中；以及用于预防、缓解或治疗恶性疾病、糖尿病、中风、心血管疾病、炎性肺病或脑神经疾病的食品、吸入剂、化妆品或药物组合物中。

<110> MD保健株式会社

<120> 来源于红球菌属细菌的纳米囊泡及其用途

<130> MPO21-034CN

<150> KR 10-2019-0002609

<151> 2019-01-09

<150> KR 10-2020-0002274

<151> 2020-01-07

<160> 2

<170> KoPatentIn 3.0

<210> 1

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 16S_V3_F

<220>

<221> misc_feature

<222> (42)

<223> n = a 或 g 或 c 或 t/u

<400> 1

tcgtcggcag cgtcagatgt gtataagaga cagcctacgg gnggcwgcag 50

<210> 2

<211> 55

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 16S_V4_R

<400> 2

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