首页> 中国专利> 一种基于MS2噬菌体研究蛋白相互作用的新方法

一种基于MS2噬菌体研究蛋白相互作用的新方法

页面导航

摘要
著录项
说明书
相似文献

摘要

本发明属于蛋白质生物学研究技术领域，具体涉及研究蛋白相互作用的方法。本发明提供的基于MS2噬菌体研究蛋白相互作用的新方法，将待研究的两个蛋白称作X和Y，将MS2噬菌体REP蛋白拆分成功能互补的2个片段REP‑a和REP‑b，使REP‑a与X融合，REP‑b与Y融合；构建质粒1，包含MS2噬菌体基因组，质粒1的REP编码区由REP‑a与X融合基因片段替换，无REP‑b基因片段；构建质粒2，表达REP‑b与Y融合片段；将质粒1表达的病毒样颗粒(VLPs)侵染含质粒2的MS2噬菌体宿主菌并检查是否有噬菌斑形成，如产生噬菌体斑则说明X与Y有相互作用。本发明提供的方法操作相对简单，结果易见。

著录项

公开/公告号CN113265489A

专利类型发明专利
公开/公告日2021-08-17

原文格式PDF
申请/专利权人广州医科大学;
展开▼

申请/专利号CN202110605852.3
发明设计人欧阳永长;刘捷婧;林小容;陈敏;陈伟烙;
展开▼

申请日2021-06-01
分类号C12Q1/70(20060101);C12N15/70(20060101);C12N15/62(20060101);
代理机构44364 广东深宏盾律师事务所;
代理人陈俊
地址 511436 广东省广州市东风西路195号
入库时间 2023-06-19 12:16:29

说明书

技术领域

本发明属于蛋白质生物学研究技术领域，具体涉及研究蛋白相互作用的方法。

背景技术

蛋白质是生命活动的承担者，具有形成组织结构，信号转导，免疫保护及物质运输等功能。在体内，蛋白质几乎不单独行使功能，而是通过形成蛋白质复合物发挥作用。蛋白相互作用及其形成的作用网络，在许多生命活动中发挥重要作用，蛋白相互作用的研究在推断生物体内蛋白质功能方面具有重要作用，可以通过研究未知蛋白质与已知蛋白质的相互作用，推断未知蛋白质的功能。

近年来，蛋白相互作用的数据及其网络结构正因许多高通量试验方法而被逐渐地证实和完善，这些高通量试验方法可分为三类：生物活体外试验，活体内试验和模拟生物学试验的生物学信息方法。因生物活体外试验更为简便，应用更为广泛，其包括：双向电泳技术，串联亲和纯化，GST-pulldown技术，BIAcore，蛋白碎片互补法，亲和色谱法，双分子荧光互补技术，免疫共沉淀，蛋白质微阵列法，X-光散技术，核磁共振法和噬菌体展示技术等。这些技术虽然促进蛋白相互作用的发展，但不可否认的是，他们虽都有优点却仍存在着很多不足之处，例如：双向电泳虽然灵敏度很高却常受到电泳缓冲溶液及其他一些环境因素的影响；串联亲和纯化检测则接近蛋白在生物体内的原始状态但却常受到标签的干扰而常常出错；GST-pulldown技术则展示其极高的特异性却无法对大规模的蛋白样品进行筛选甚至会因内源性蛋白而呈现假阳性并且该假阳性较难排除；BIAcore具有自动化却花费昂贵；蛋白碎片互补法可以鉴定整个蛋白家族中蛋白质间的相互作用，鉴定的蛋白质不论分子质量及表达量却被灵敏度及操作难度限制；亲和色谱法结果虽可靠准确却也常有假阳性；双分子荧光互补简单快速却常伴有假阳性和假阴性结果必须重复多次验证；免疫共沉淀一般适用于两个蛋白质之间的相互作用研究但无法达到大规模验证的要求；蛋白质微阵列技术能检测丰度较低及分子质量相对较小的蛋白质但是当需要检测大量样品时其需要探针太多且与靶蛋白结合的特异性很低；X-光散技术具有高分辨率且能观察到蛋白质相互作用时三维构象的变化但操作比较繁琐困难；核磁共振则能观察大分子及小分子的信号但是对环境却不太友好。

而噬菌体展示技术拥有不同于其他方法的操作和应用，发展更为迅猛，2018年的诺贝尔化学奖更是颁给了在噬菌体展示技术方面做出重要贡献的两位科学家Winter和Smith。噬菌体展示技术的优越性体现在不仅灵敏度高，检测度高，而且成本低，更能进行高通量的筛选。在临床方面、新药,疫苗开发，抗体工程分离技术方面得到广泛应用。但该方法需要将候选蛋白固定填料上，操作较繁琐。

大肠杆菌MS2噬菌体属于单链RNA噬菌体，基因组全长3659bp，由编码成熟酶蛋白(A蛋白)、衣壳蛋白(CP)、复制酶蛋白(REP)和裂解蛋白(Lys)等4种蛋白质分子的基因组成。A蛋白和CP蛋白与噬菌体颗粒形成相关，REP为RNA复制酶，与噬菌体基因组的复制相关，缺乏REP则噬菌体不能繁殖。

发明内容

本发明基于MS2噬菌体建立一个新的蛋白相互作用方法，操作相对简单，结果易见，是现有研究蛋白相互作用方法的有益补充。

本发明基于MS2噬菌体开发的研究蛋白相互作用的新方法，其原理如下：将待研究的两个蛋白称作X和Y，将MS2噬菌体REP蛋白拆分成功能互补的2个片段REP-a和REP-b，使REP-a与X融合，REP-b与Y融合。构建质粒1，包含MS2噬菌体基因组，质粒1的REP编码区由REP-a与X融合基因片段替换，无REP-b基因片段；构建质粒2，表达REP-b与Y融合片段。将质粒1表达的病毒样颗粒(virus-like particles，VLPs)侵染含质粒2的MS2噬菌体宿主菌并检查是否有噬菌斑形成。如X与Y能相互作用，则会使REP-a与REP-b相互靠近。REP-a与REP-b这2个片段由于功能互补，相互靠近后具备完整的REP酶活性，则会产生噬菌体斑。如X与Y没有相互作用，单独的REP-a或REP-b不具备完整的REP活性，噬菌体不能繁殖，则不产生噬菌斑。

本发明建立的一种基于MS2噬菌体研究蛋白相互作用的新方法，将待检测相互作用的2个蛋白分别命名为X和Y，其特征在于：包括以下步骤：

(1)将MS2噬菌体RNA复制酶REP蛋白拆分成功能互补的2个片段REP-a和REP-b；

(2)构建质粒1，包含MS2噬菌体基因组，REP编码区由REP-a与X融合基因片段替换，无REP-b基因片段，也就是质粒1包含重组MS2噬菌体基因组；

(3)表达步骤(2)中构建的质粒1，重组MS2噬菌体基因组中MS2噬菌体的A蛋白和CP蛋白的表达将转录后形成的重组MS2噬菌体基因组RNA包装后形成VLPs，纯化该VLPs；

(4)构建质粒2，将REP-b片段基因与Y基因融合，能表达形成REP-b-Y的蛋白片段；

(5)将质粒2转入MS2宿主菌中；MS2宿主菌可以选择XL1-Blue等；

(6)将第(3)步纯化得到的VLPs侵染第(5)步含质粒2的MS噬菌体宿主菌，并检测噬菌斑。观察噬菌斑检测结果，如出现噬菌斑则说明X,Y蛋白有相互作用。

具体的，在步骤(1)中，将MS2噬菌体RNA复制酶拆分成功能互补的2个片段，其使用的野生型MS2噬菌体的REP由545氨基酸组成，将前氨基端的53个氨基酸组成的片段作为REP-a，将第54氨基酸(Thr)到第545(Arg)氨基酸组成的蛋白片段作为REP-b，或者将前氨基端的384氨基酸组成的蛋白片段作为为REP-a，将第385氨基酸(Arg)到第545氨基酸(Arg)组成的蛋白片段为REP-b；

具体的，在步骤(2)中，REP-a与X融合基因片段，在REP-a和X蛋白之间加入连接序列；

具体的，上述REP-a和X蛋白之间加入连接序列为编码连接肽(SGGGG)n的序列，n的取值为1-3中的整数；

具体的，步骤(4)中，REP-b与Y融合基因片段，在REP-b和Y蛋白之间加入连接序列；

具体的，上述REP-b和Y蛋白之间加入连接序列为编码连接肽(SGGGG)n的序列，n的取值为1-3中的整数。

附图说明

图1为本发明建立的一种基于MS2噬菌体研究蛋白相互作用的新方法的原理图；

图2为本发明一具体实施例的实验结果图；

图3为本发明另一具体实施例的实验结果图。

具体实施方式

为使本研究领域普通技术人员更好地理解本发明，以下结合具体实施例及附图对本发明进行进一步的说明，具体实施例不用于限制本发明。

实施例一

在本实施例中选取野生型MS2噬菌体(ATCC13076-B1，购自ATCC)作为实验材料，其基因序列在GenBank中可获取到，GenBank(NC_001417.2)，如SEQ ID NO:1所示。

1.将MS2噬菌体中REP蛋白拆分成能成功互补的2个片段REP-a和REP-b:野生型MS2噬菌体的REP为545氨基(GenBank:NC_001417.2中第1761-3398间DNA编码的蛋白，该蛋白序列在GenBank中可查询到，GenBank:YP_009640127.1)组成，其蛋白序列如SEQ ID NO:2所示。从氨基端开始的第384氨基酸为Tyr。本实验选择将前氨基端的384个氨基酸组成的蛋白片段为REP-a(GenBank:NC_001417.2，第1761-2912间DNA编码的蛋白)，第385氨基酸(Arg)到第545氨基酸(Arg)组成的蛋白片段为REP-b(GenBank:NC_001417.2，第2913-3398间DNA编码的蛋白)。本实验待检测的相互作用的蛋白X为钙调素结合多肽(CBP，其DNA编号序列如SEQ ID NO:3所示),Y为钙调蛋白(calmodulin，GenBank：M19381.1中187-636间DNA编码的蛋白，其编码序列如SEQ ID NO:4所示)。

2.质粒1的构建：合成序列5如SEQ ID NO:5所示，由上海生物工程有限公司合成，并由该公司通过pstI酶切位点构建到puc57载体上，得到质粒1，序列5包括GenBank ID:NC_001417.2中1-2912间的序列以及3399-3569间的序列，其中2913-3398间的序列由连接肽(SGGGG)

3.质粒2的构建：合成序列7，其序列如SEQ ID NO:7所示，由上海生物工程有限公司合成，并由该公司通过NcoI和SacI酶切位点构建到pstv-28载体(Takara公司，大连)上，得到质粒2。序列7包括calmodulin，GenBank：M19381.1中187-636间DNA的编码蛋白(protein_id为AAA66182.1)，在其C末端融合REP-b序列(GenBank：NC_001417.2序列中第2913-3398间的DNA序列)。

4.VLPs的纯化。取100ng puc-MS-384REP质粒加入JM109感受态(唯地生物技术有限公司，上海)菌株中，冰上放置30min后，42℃热激30s，涂抹于含氨苄抗性的LB平板上，挑取阳性单菌落于无菌LB液体中过夜培养。取过夜培养的菌液1ml加入50ml含氨苄抗生素的LB培养基中，37℃扩培2-3h，加入终浓度为1mM IPTG诱导6h后，加入等体积的氯仿抽提，5000rmp离心5min后留上清。上清加入Nacl(每50ml上清加入2.9克氯化钠，搅拌溶解后，冰浴上1h)，12000g离心，10min，去除沉淀，回收上清，量筒测定上清体积，加入10％PEG8000(m/V),搅拌让PEG完全溶解，冰上放置至少1h，以便VLPs沉淀。4℃，11000g离心10min回收沉淀的VLPs,倒置试管将溶液去除干净。用SM溶液(50ml菌液大约加0.8ml)小心重悬VLPs,室温放置1h，以便VLPs完全溶解。加入等体积的氯仿抽提细胞碎片和PEG，温和振荡30s，4℃3000g回收上清，即得到VLP。该VLP可选择通过超滤管(100kd,Millipore公司)浓缩和进一步纯化。

5.将上述质粒2转入XL1-Blue感受态细胞(唯地生物技术有限公司，上海)，并挑取单个阳性菌落活化过夜，4℃放置备用。

6.准备含0.7％琼脂粉的LB无菌半固体培养基，加热溶解后放于45℃水浴箱备用。将第4步得到的VLPs 200ul与第5步得到的含质粒2的XL1-Blue菌200ul等体积混匀。阳性对照为野生型MS2噬菌体(ATCC13076-B1)与含质粒2的XL1-Blue菌200ul等体积混匀，阴性对照为无菌水与含质粒2的XL1-Blue菌200ul等体积混匀。以上混合物放37℃静置30min后，将上述400ul混合物分别加入半固体培养基15ml，混匀后迅速倒入培养基，待凝固后放置37℃培养箱，10h后观察结果。结果如图2所示，a图为阳性对照(野生型MS2噬菌体)，b图为VLPs侵染，c图为阴性对照。a和b图都有噬菌斑，而c图没有。此结果说明CBP与calmodulin有相互作用。

实施例二

在本实施例中选取野生型MS2噬菌体(ATCC13076-B1，购自ATCC)作为实验材料，其基因序列为GenBank(NC_001417.2)，如SEQ ID NO:1所示。在本实施例中采用与实施例一不同的方式将MS2噬菌体RNA复制酶REP蛋白拆分成功能互补的2个片段REP-a和REP-b。

1.将野生型MS2噬菌体RNA复制酶REP蛋白拆分成功能互补的2个片段REP-a和REP-b：从氨基端开始的第54氨基酸为Thr。本实验选择将前氨基端的54个氨基酸组成的蛋白片段为REP-a(GenBank:NC_001417.2，第1761-1922间DNA编码的蛋白)，第55氨基酸(Lys)到第545氨基酸(Arg)组成的蛋白片段为REP-b(GenBank:NC_001417.2，第1923-3398间DNA编码的蛋白)。本实验待检测的相互作用的蛋白X为钙调素结合多肽(CBP),Y为钙调蛋白(calmodulin，GenBank：M19381.1中187-636间DNA的编码蛋白，protein_id为AAA66182.1，其编码序列如SEQ ID NO:4所示)。

2.质粒1构建：序列8(其序列如SEQ ID NO:8所示)由上海生物工程有限公司合成，并由该公司通过pstI酶切位点构建到puc57载体上，得到质粒1。序列8包括GenBank ID:NC_001417.2中第1-1922间的序列以及第3399-3569间的序列，1923-3398间的序列由连接肽SGGGGSGGGGSGGG(其编码序列如SEQ ID NO:6所示)与CBP融合的基因片段替换。

3.质粒2的构建：序列9(其DNA序列如SEQ ID NO:9所示)由上海生物工程有限公司合成，并由该公司通过NcoI和SacI酶切位点将该序列构建到pstv-28载体上，得到质粒2。序列9包括calmodulin基因(GenBank：NC_001417.2序列中第1923-3398间的DNA序列)，在其C末端融合REP-b部分序列(GenBank：NC_001417.2序列中第1923-3398间的DNA序列)。Calmodulin与REP片段之间有编码连接肽SGGGGSGGGG的基因。

5.将上述质粒2转入XL1-Blue感受态细胞(唯地生物，上海)，并挑取单个阳性菌落活化过夜，4℃放置备用。

6.准备含0.7％琼脂粉的LB无菌半固体培养基，加热溶解后放于45℃水浴箱备用。将第4步得到的VLPs 200ul与第5步得到的含质粒2的XL1-Blue菌200ul等体积混匀。阳性对照为野生型MS2噬菌体(ATCC13076-B1)与含质粒2的XL1-Blue菌200ul等体积混匀，阴性对照为无菌水与含质粒2的XL1-Blue菌200ul等体积混匀。以上混合物放37℃静置30min后，将上述400ul混合物分别加入半固体培养基15ml，混匀后迅速倒入培养基，待凝固后放置37℃培养箱，10h后观察结果。结果如图3所示，a图为阳性对照，b图为VLPs侵染，c图为阴性对照。a和b图都有噬菌斑，而c图没有。此结果说明蛋白CBP与calmodulin有相互作用。

以上实施例用于理解本发明的构思而非用于限制本发明，本领域技术人员在理解本发明构思的基础上，可以采用更多的方式将MS2噬菌体RNA复制酶REP蛋白拆分成功能互补的2个片段REP-a和REP-b，可以将质粒2转入其他合适的宿主细胞来达到本发明的目的。

序列表

<110> 广州医科大学

<120> 一种基于MS2噬菌体研究蛋白相互作用的新方法

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 3569

<212> DNA

<213> 大肠杆菌噬菌体MS2(Escherichia phage MS2)

<220>

<221> misc_feature

<223> GenBank(NC_001417.2)查询到的序列信息

<400> 1

gggtgggacc cctttcgggg tcctgctcaa cttcctgtcg agctaatgcc atttttaatg 60

tctttagcga gacgctacca tggctatcgc tgtaggtagc cggaattcca ttcctaggag 120

gtttgacctg tgcgagcttt tagtaccctt gatagggaga acgagacctt cgtcccctcc 180

gttcgcgttt acgcggacgg tgagactgaa gataactcat tctctttaaa atatcgttcg 240

aactggactc ccggtcgttt taactcgact ggggccaaaa cgaaacagtg gcactacccc 300

tctccgtatt cacggggggc gttaagtgtc acatcgatag atcaaggtgc ctacaagcga 360

agtgggtcat cgtggggtcg cccgtacgag gagaaagccg gtttcggctt ctccctcgac 420

gcacgctcct gctacagcct cttccctgta agccaaaact tgacttacat cgaagtgccg 480

cagaacgttg cgaaccgggc gtcgaccgaa gtcctgcaaa aggtcaccca gggtaatttt 540

aaccttggtg ttgctttagc agaggccagg tcgacagcct cacaactcgc gacgcaaacc 600

attgcgctcg tgaaggcgta cactgccgct cgtcgcggta attggcgcca ggcgctccgc 660

taccttgccc taaacgaaga tcgaaagttt cgatcaaaac acgtggccgg caggtggttg 720

gagttgcagt tcggttggtt accactaatg agtgatatcc agggtgcata tgagatgctt 780

acgaaggttc accttcaaga gtttcttcct atgagagccg tacgtcaggt cggtactaac 840

atcaagttag atggccgtct gtcgtatcca gctgcaaact tccagacaac gtgcaacata 900

tcgcgacgta tcgtgatatg gttttacata aacgatgcac gtttggcatg gttgtcgtct 960

ctaggtatct tgaacccact aggtatagtg tgggaaaagg tgcctttctc attcgttgtc 1020

gactggctcc tacctgtagg taacatgctc gagggcctta cggcccccgt gggatgctcc 1080

tacatgtcag gaacagttac tgacgtaata acgggtgagt ccatcataag cgttgacgct 1140

ccctacgggt ggactgtgga gagacagggc actgctaagg cccaaatctc agccatgcat 1200

cgaggggtac aatccgtatg gccaacaact ggcgcgtacg taaagtctcc tttctcgatg 1260

gtccatacct tagatgcgtt agcattaatc aggcaacggc tctctagata gagccctcaa 1320

ccggagtttg aagcatggct tctaacttta ctcagttcgt tctcgtcgac aatggcggaa 1380

ctggcgacgt gactgtcgcc ccaagcaact tcgctaacgg ggtcgctgaa tggatcagct 1440

ctaactcgcg ttcacaggct tacaaagtaa cctgtagcgt tcgtcagagc tctgcgcaga 1500

atcgcaaata caccatcaaa gtcgaggtgc ctaaagtggc aacccagact gttggtggtg 1560

tagagcttcc tgtagccgca tggcgttcgt acttaaatat ggaactaacc attccaattt 1620

tcgctacgaa ttccgactgc gagcttattg ttaaggcaat gcaaggtctc ctaaaagatg 1680

gaaacccgat tccctcagca atcgcagcaa actccggcat ctactaatag acgccggcca 1740

ttcaaacatg aggattaccc atgtcgaaga caacaaagaa gttcaactct ttatgtattg 1800

atcttcctcg cgatctttct ctcgaaattt accaatcaat tgcttctgtc gctactggaa 1860

gcggtgatcc gcacagtgac gactttacag caattgctta cttaagggac gaattgctca 1920

caaagcatcc gaccttaggt tctggtaatg acgaggcgac ccgtcgtacc ttagctatcg 1980

ctaagctacg ggaggcgaat ggtgatcgcg gtcagataaa tagagaaggt ttcttacatg 2040

acaaatcctt gtcatgggat ccggatgttt tacaaaccag catccgtagc cttattggca 2100

acctcctctc tggctaccga tcgtcgttgt ttgggcaatg cacgttctcc aacggtgctc 2160

ctatggggca caagttgcag gatgcagcgc cttacaagaa gttcgctgaa caagcaaccg 2220

ttaccccccg cgctctgaga gcggctctat tggtccgaga ccaatgtgcg ccgtggatca 2280

gacacgcggt ccgctataac gagtcatatg aatttaggct cgttgtaggg aacggagtgt 2340

ttacagttcc gaagaataat aaaatagatc gggctgcctg taaggagcct gatatgaata 2400

tgtacctcca gaaaggggtc ggtgctttca tcagacgccg gctcaaatcc gttggtatag 2460

acctgaatga tcaatcgatc aaccagcgtc tggctcagca gggcagcgta gatggttcgc 2520

ttgcgacgat agacttatcg tctgcatccg attccatctc cgatcgcctg gtgtggagtt 2580

ttctcccacc agagctatat tcatatctcg atcgtatccg ctcacactac ggaatcgtag 2640

atggcgagac gatacgatgg gaactatttt ccacaatggg aaatgggttc acatttgagc 2700

tagagtccat gatattctgg gcaatagtca aagcgaccca aatccatttt ggtaacgccg 2760

gaaccatagg catctacggg gacgatatta tatgtcccag tgagattgca ccccgtgtgc 2820

tagaggcact tgcctactac ggttttaaac cgaatcttcg taaaacgttc gtgtccgggc 2880

tctttcgcga gagctgcggc gcgcactttt accgtggtgt cgatgtcaaa ccgttttaca 2940

tcaagaaacc tgttgacaat ctcttcgccc tgatgctgat attaaatcgg ctacggggtt 3000

ggggagttgt cggaggtatg tcagatccac gcctctataa ggtgtgggta cggctctcct 3060

cccaggtgcc ttcgatgttc ttcggtggga cggacctcgc tgccgactac tacgtagtca 3120

gcccgcctac ggcagtctcg gtatacacca agactccgta cgggcggctg ctcgcggata 3180

cccgtacctc gggtttccgt cttgctcgta tcgctcgaga acgcaagttc ttcagcgaaa 3240

agcacgacag tggtcgctac atagcgtggt tccatactgg aggtgaaatc accgacagca 3300

tgaagtccgc cggcgtgcgc gttatacgca cttcggagtg gctaacgccg gttcccacat 3360

tccctcagga gtgtgggcca gcgagctctc ctcggtagct gaccgaggga cccccgtaaa 3420

cggggtgggt gtgctcgaaa gagcacgggt gcgaaagcgg tccggctcca ccgaaaggtg 3480

ggcgggcttc ggcccaggga cctcccccta aagagaggac ccgggattct cccgatttgg 3540

taactagctg cttggctagt taccaccca 3569

<210> 2

<211> 545

<212> PRT

<213> 大肠杆菌噬菌体MS2(Escherichia phage MS2)

<220>

<221> CHAIN

<223> GenBank:YP_009640127.1查询到的序列信息

<400> 2

Met Ser Lys Thr Thr Lys Lys Phe Asn Ser Leu Cys Ile Asp Leu Pro

1 5 10 15

Arg Asp Leu Ser Leu Glu Ile Tyr Gln Ser Ile Ala Ser Val Ala Thr

20 25 30

Gly Ser Gly Asp Pro His Ser Asp Asp Phe Thr Ala Ile Ala Tyr Leu

35 40 45

Arg Asp Glu Leu Leu Thr Lys His Pro Thr Leu Gly Ser Gly Asn Asp

50 55 60

Glu Ala Thr Arg Arg Thr Leu Ala Ile Ala Lys Leu Arg Glu Ala Asn

65 70 75 80

Gly Asp Arg Gly Gln Ile Asn Arg Glu Gly Phe Leu His Asp Lys Ser

85 90 95

Leu Ser Trp Asp Pro Asp Val Leu Gln Thr Ser Ile Arg Ser Leu Ile

100 105 110

Gly Asn Leu Leu Ser Gly Tyr Arg Ser Ser Leu Phe Gly Gln Cys Thr

115 120 125

Phe Ser Asn Gly Ala Pro Met Gly His Lys Leu Gln Asp Ala Ala Pro

130 135 140

Tyr Lys Lys Phe Ala Glu Gln Ala Thr Val Thr Pro Arg Ala Leu Arg

145 150 155 160

Ala Ala Leu Leu Val Arg Asp Gln Cys Ala Pro Trp Ile Arg His Ala

165 170 175

Val Arg Tyr Asn Glu Ser Tyr Glu Phe Arg Leu Val Val Gly Asn Gly

180 185 190

Val Phe Thr Val Pro Lys Asn Asn Lys Ile Asp Arg Ala Ala Cys Lys

195 200 205

Glu Pro Asp Met Asn Met Tyr Leu Gln Lys Gly Val Gly Ala Phe Ile

210 215 220

Arg Arg Arg Leu Lys Ser Val Gly Ile Asp Leu Asn Asp Gln Ser Ile

225 230 235 240

Asn Gln Arg Leu Ala Gln Gln Gly Ser Val Asp Gly Ser Leu Ala Thr

245 250 255

Ile Asp Leu Ser Ser Ala Ser Asp Ser Ile Ser Asp Arg Leu Val Trp

260 265 270

Ser Phe Leu Pro Pro Glu Leu Tyr Ser Tyr Leu Asp Arg Ile Arg Ser

275 280 285

His Tyr Gly Ile Val Asp Gly Glu Thr Ile Arg Trp Glu Leu Phe Ser

290 295 300

Thr Met Gly Asn Gly Phe Thr Phe Glu Leu Glu Ser Met Ile Phe Trp

305 310 315 320

Ala Ile Val Lys Ala Thr Gln Ile His Phe Gly Asn Ala Gly Thr Ile

325 330 335

Gly Ile Tyr Gly Asp Asp Ile Ile Cys Pro Ser Glu Ile Ala Pro Arg

340 345 350

Val Leu Glu Ala Leu Ala Tyr Tyr Gly Phe Lys Pro Asn Leu Arg Lys

355 360 365

Thr Phe Val Ser Gly Leu Phe Arg Glu Ser Cys Gly Ala His Phe Tyr

370 375 380

Arg Gly Val Asp Val Lys Pro Phe Tyr Ile Lys Lys Pro Val Asp Asn

385 390 395 400

Leu Phe Ala Leu Met Leu Ile Leu Asn Arg Leu Arg Gly Trp Gly Val

405 410 415

Val Gly Gly Met Ser Asp Pro Arg Leu Tyr Lys Val Trp Val Arg Leu

420 425 430

Ser Ser Gln Val Pro Ser Met Phe Phe Gly Gly Thr Asp Leu Ala Ala

435 440 445

Asp Tyr Tyr Val Val Ser Pro Pro Thr Ala Val Ser Val Tyr Thr Lys

450 455 460

Thr Pro Tyr Gly Arg Leu Leu Ala Asp Thr Arg Thr Ser Gly Phe Arg

465 470 475 480

Leu Ala Arg Ile Ala Arg Glu Arg Lys Phe Phe Ser Glu Lys His Asp

485 490 495

Ser Gly Arg Tyr Ile Ala Trp Phe His Thr Gly Gly Glu Ile Thr Asp

500 505 510

Ser Met Lys Ser Ala Gly Val Arg Val Ile Arg Thr Ser Glu Trp Leu

515 520 525

Thr Pro Val Pro Thr Phe Pro Gln Glu Cys Gly Pro Ala Ser Ser Pro

530 535 540

Arg

545

<210> 3

<211> 78

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> 钙调素结合多肽CBP的编码序列

<400> 3

aagcgacgat ggaaaaagaa tttcatagcc gtctcagcag ccaaccgctt taagaaaatc 60

tcatcctccg gggcactt 78

<210> 4

<211> 450

<212> DNA

<213> 家鼠(Mus musculus (house mouse))

<220>

<221> misc_feature

<223> GenBank：M19381.1中187-636间DNA序列，编码钙调蛋白calmodulin

<400> 4

atggctgatc agctgactga agagcagatt gctgaattca aggaagcttt ctccctattc 60

gataaagatg gtgacaacac catcacaacc aaggaactgg gtaccgtcat gcgttcactt 120

ggtcagaacc caacagaagc cgagctgcag gatatgatca acgaagtgga tgctgatggc 180

aatggcacca ttgacttccc agagttcttg actatgatgg ctagaaaaat gaaagacaca 240

gatagcgaag aagagatccg cgaggccttc cgagtgtttg acaaggatgg gaatggttac 300

atcagtgcgg cagaactgcg ccacgtcatg acaaacttag gagaaaagct aacagatgaa 360

gaagtagatg aaatgatcag agaagcagat attgatggcg acggacaagt caactatgaa 420

gaattcgtac agatgatgac tgcaaaatga 450

<210> 5

<211> 3499

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> 该序列用于构建实施例一种的质粒1

<400> 5

ctgcagggaa ttgtgagcgg ataacaattc ccctctagaa gcgggaatag ctcagttggt 60

agagcacgac cttgccaagg tcggggtcgc gagttcgagt ctcgtttccc gctccagggg 120

tgggacccct ttcggggtcc tgctcaactt cctgtcgagc taatgccatt tttaatgtct 180

ttagcgagac gctaccatgg ctatcgctgt aggtagccgg aattccattc ctaggaggtt 240

tgacctgtgc gagcttttag tacccttgat agggagaacg agaccttcgt cccctccgtt 300

cgcgtttacg cggacggtga gactgaagat aactcattct ctttaaaata tcgttcgaac 360

tggactcccg gtcgttttaa ctcgactggg gccaaaacga aacagtggca ctacccctct 420

ccgtattcac ggggggcgtt aagtgtcaca tcgatagatc aaggtgccta caagcgaagt 480

gggtcatcgt ggggtcgccc gtacgaggag aaagccggtt tcggcttctc cctcgacgca 540

cgctcctgct acagcctctt ccctgtaagc caaaacttga cttacatcga agtgccgcag 600

aacgttgcga accgggcgtc gaccgaagtc ctgcaaaagg tcacccaggg taattttaac 660

cttggtgttg ctttagcaga ggccaggtcg acagcctcac aactcgcgac gcaaaccatt 720

gcgctcgtga aggcgtacac tgccgctcgt cgcggtaatt ggcgccaggc gctccgctac 780

cttgccctaa acgaagatcg aaagtttcga tcaaaacacg tggccggcag gtggttggag 840

ttgcagttcg gttggttacc actaatgagt gatatccagg gtgcatatga gatgcttacg 900

aaggttcacc ttcaagagtt tcttcctatg agagccgtac gtcaggtcgg tactaacatc 960

aagttagatg gccgtctgtc gtatccagct gcaaacttcc agacaacgtg caacatatcg 1020

cgacgtatcg tgatatggtt ttacataaac gatgcacgtt tggcatggtt gtcgtctcta 1080

ggtatcttga acccactagg tatagtgtgg gaaaaggtgc ctttctcatt cgttgtcgac 1140

tggctcctac ctgtaggtaa catgctcgag ggccttacgg cccccgtggg atgctcctac 1200

atgtcaggaa cagttactga cgtaataacg ggtgagtcca tcataagcgt tgacgctccc 1260

tacgggtgga ctgtggagag acagggcact gctaaggccc aaatctcagc catgcatcga 1320

ggggtacaat ccgtatggcc aacaactggc gcgtacgtaa agtctccttt ctcgatggtc 1380

cataccttag atgcgttagc attaatcagg caacggctct ctagatagag ccctcaaccg 1440

gagtttgaag catggcttct aactttactc agttcgttct cgtcgacaat ggcggaactg 1500

gcgacgtgac tgtcgcccca agcaacttcg ctaacggggt cgctgaatgg atcagctcta 1560

actcgcgttc acaggcttac aaagtaacct gtagcgttcg tcagagctct gcgcagaatc 1620

gcaaatacac catcaaagtc gaggtgccta aagtggcaac ccagactgtt ggtggtgtag 1680

agcttcctgt agccgcatgg cgttcgtact taaatatgga actaaccatt ccaattttcg 1740

ctacgaattc cgactgcgag cttattgtta aggcaatgca aggtctccta aaagatggaa 1800

acccgattcc ctcagcaatc gcagcaaact ccggcatcta ctaatagacg ccggccattc 1860

aaacatgagg attacccatg tcgaagacaa caaagaagtt caactcttta tgtattgatc 1920

ttcctcgcga tctttctctc gaaatttacc aatcaattgc ttctgtcgct actggaagcg 1980

gtgatccgca cagtgacgac tttacagcaa ttgcttactt aagggacgaa ttgctcacaa 2040

agcatccgac cttaggttct ggtaatgacg aggcgacccg tcgtacctta gctatcgcta 2100

agctacggga ggcgaatggt gatcgcggtc agataaatag agaaggtttc ttacatgaca 2160

aatccttgtc atgggatccg gatgttttac aaaccagcat ccgtagcctt attggcaacc 2220

tcctctctgg ctaccgatcg tcgttgtttg ggcaatgcac gttctccaac ggtgctccta 2280

tggggcacaa gttgcaggat gcagcgcctt acaagaagtt cgctgaacaa gcaaccgtta 2340

ccccccgcgc tctgagagcg gctctattgg tccgagacca atgtgcgccg tggatcagac 2400

acgcggtccg ctataacgag tcatatgaat ttaggctcgt tgtagggaac ggagtgttta 2460

cagttccgaa gaataataaa atagatcggg ctgcctgtaa ggagcctgat atgaatatgt 2520

acctccagaa aggggtcggt gctttcatca gacgccggct caaatccgtt ggtatagacc 2580

tgaatgatca atcgatcaac cagcgtccgg ctcagcaggg cagcgtagat ggttcgcttg 2640

cgacgataga cttatcgtct gcatccgatt ccatctccga tcgcctggtg tggagttttc 2700

tcccaccaga gctatattca tatctcgatc gtatccgctc acactacgga atcgtagatg 2760

gcgagacgat acgatgggaa ctattttcca caatgggaaa tgggttcaca tttgagctag 2820

agtccatgat attctgggca atagtcaaag cgacccaaat ccattttggt aacgccggaa 2880

ccataggcat ctacggggac gatattatat gtcccagtga gattgcaccc cgtgtgctag 2940

aggcacttgc ctactacggt tttaaaccga atcttcgtaa aacgttcgtg tccgggctct 3000

ttcgcgagag ctgcggcgcg cacttttaca gcggtggagg aggttctgga ggcggtggaa 3060

gtggtggcgg aggtaagcga cgatggaaaa agaatttcat agccgtctca gcagccaacc 3120

gctttaagaa aatctcatcc tccggggcac tttagaagct tccctcagga gtgtgggcca 3180

gcgagctctc ctcggtagct gaccgaggga cccccgtaaa cggggtgggt gtgctcgaaa 3240

gagcacgggt gcgaaagcgg tccggctcca ccgaaaggtg ggcgggcttc ggcccaggga 3300

cctcccccta aagagaggac ccgggattct cccgatttgg taactagctg cttggctagt 3360

taccacccgc cggccatggt cccagcctcc tcgctggcgg ccggtgggca acattccgag 3420

gggaccgtcc cctcggtaat ggcgaatggg acctcgagca ccaccaccac caccactgag 3480

atccggctgc taactgcag 3499

<210> 6

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> DOMAIN

<223> 用作“REP-a和X蛋白”或“REP-b和Y蛋白”之间的连接肽

<400> 6

Ser Gly Gly Gly Gly

1 5

<210> 7

<211> 994

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> 该序列用于构建实施例一中的质粒2

<400> 7

ccatggctga tcagctgact gaagagcaga ttgctgaatt caaggaagct ttctccctat 60

tcgataaaga tggtgacggc accatcacaa ccaaggaact ggggaccgtc atgcggtcac 120

tgggtcagaa cccaacagaa gccgagctgc aggatatgat caacgaagtg gatgctgatg 180

gcaatggcac cattgacttc ccagagttct tgactatgat ggccagaaaa atgaaagaca 240

cagatagcga agaagagatc cgcgaggcct tccgagtgtt tgacaaggat gggaatggtt 300

acatcagtgc ggcagaactg cgccacgtca tgacaaactt aggagaaaag ctaacagatg 360

aagaagtaga tgaaatgatc agagaagcag atattgatgg cgacggacaa gtcaactatg 420

aagaattcgt acagatgatg actgcaaaac atatgctaga atcgggatcc ccggaattcg 480

gtggaggtgg cagccgtggt gtcgatgtca aaccgtttta catcaagaaa cctgttgaca 540

atctcttcgc cctgatgctg atattaaatc ggctacgggg ttggggagtt gtcggaggta 600

tgtcagatcc acgcctctat aaggtgtggg tacggctctc ctcccaggtg ccttcgatgt 660

tcttcggtgg gacggacctc gctgccgact actacgtagt cagcccgcct acggcagtct 720

cggtatacac caagactccg tacgggcggc tgctcgcgga tacccgtacc tcgggtttcc 780

gtcttgctcg tatcgctcga gaacgcaagt tcttcagcga aaagcacgac agtggtcgct 840

acatagcgtg gttccatact ggaggtgaaa tcaccgacag catgaagtcc gccggcgtgc 900

gcgttatacg cacttcggag tggctaacgc cggttcccac attccctcag gagtgtgggc 960

cagcgagctc tcctcggtag gaattcccgg gtcg 994

<210> 8

<211> 2509

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> 该序列用于构建实施例二中的质粒1

<400> 8