一种基于HPLC的硝苯地平有关物质分析方法

摘要

本发明提供了一种基于HPLC的硝苯地平有关物质分析方法，该分析方法为采用HPLC法对硝苯地平中的有关物质进行分离检测，其中，所述有关物质包括杂质Ⅰ和杂质Ⅱ，所述方法主要包括以下步骤：制备供试品溶液：取供试品加三氯甲烷进行研磨，用甲醇转移到容量瓶中并稀释得到供试品溶液；制备对照品储备液；制备对照溶液；系统实用性溶液；采用高效液相色谱分别对供试品溶液和对照品溶液进行检测；本发明提供的基于HPLC的硝苯地平有关物质分析方法通过具体限定供试品溶液的配置方法，能够显著降低实验员操作失误率，提高检测效率和检测结果的正确性。

说明书

技术领域

本发明属于药物分析技术领域，具体涉及一种基于HPLC的硝苯地平有关物质分析方法。

背景技术

采用HPLC方法的药品标准对实际生产的药品进行有关物质检测时，如果检验方法的本身的耐用性不好，当出现异常峰时，由于无法排除是化验本身的问题，经常会归结为该批药品的生产存在问题，会产生严重质检误判，不仅需要多次质量复检，还可能导致本来符合质量要求的批次无法出厂。硝苯地平是第一代钙拮抗剂，为高血压、防止心绞痛药物，是20世纪80年代中期世界畅销的药物之一，起效快，峰/谷比值高，现有的HPLC对硝苯地平有关物质的分析方法耐用性仍有优化空间，比如在分析的过程中，有时会发现样品杂质峰异常，峰面积远远高于正常样品杂质峰的峰面积，即使多次复检，检验人员也无法排除异常峰出现的原因，浪费大量的人力物力和时间，导致相关批次产品无法出厂。

发明内容

为了解决以上技术问题，本发明提供了一种基于HPLC的硝苯地平有关物质分析方法。

本发明一方面提供了一种基于HPLC的硝苯地平有关物质分析方法，其中，有关物质包括杂质Ⅰ和杂质Ⅱ，杂质Ⅰ为硝基吡啶，杂质Ⅱ为亚硝基吡啶，该方法主要包括以下步骤：

制备供试品溶液：取供试品加三氯甲烷进行研磨，用甲醇转移到容量瓶中并稀释得到供试品溶液，避光保存；

制备对照品储备液：取杂质Ⅰ对照品与杂质Ⅱ对照品，分别加入甲醇溶解并定量稀释制成混合溶液；

制备对照溶液：取供试品溶液与对照品储备液，分别用流动相定量稀释；

系统适用性溶液：取硝苯地平、杂质Ⅰ对照品与杂质Ⅱ对照品，加甲醇溶解并稀释得到系统适用性溶液，每1ml系统适用性溶液中分别含1mg、10μg与10μg的硝苯地平、杂质Ⅰ对照品与杂质Ⅱ对照品；

采用高效液相色谱仪分别对供试品溶液和对照溶液进行检测；

色谱条件为：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以甲醇-水(60:40)为流动相，检测波长为235nm，进样体积为20μl；

系统适用性要求：系统适用性溶液色谱图中，杂质Ⅰ峰、杂质Ⅱ峰与硝苯地平峰之间的分离度符合要求；

测定法：取供试品溶液与对照溶液，分别注入液相色谱仪，记录色谱图至主成分峰保留时间的2倍；

限度：供试品溶液色谱图中如有与杂质Ⅰ峰、杂质Ⅱ峰保留时间一致的色谱峰，按外标法以峰面积计算，均不得超过0.1％，其他单个杂质峰面积不得大于对照溶液中硝苯地平峰面积(0.2％)，杂质总量不得超过0.5％。

其中，硝基吡啶为2,6-二甲基-4-(2-硝基苯基)-3,5-吡啶二甲酸二甲酯，亚硝基吡啶为2,6-二甲基-4-(2-亚硝基苯基)-3,5-吡啶二甲酸二甲酯。

进一步地，制备供试品溶液具体方法为：取供试品加三氯甲烷进行研磨，研磨环境温度为20℃-30℃，研磨时间为3min-5min，研磨速度为60r/min-150r/min，用甲醇转移到容量瓶中并稀释得到供试品溶液，避光保存。

进一步地，制备对照溶液的步骤如下：取供试品溶液与对照品储备液，分别用流动相定量稀释制成每1ml中分别含硝苯地平2μg、杂质Ⅰ1μg与杂质Ⅱ1μg的混合溶液。

进一步地，研磨时间为3min，研研磨速度为150r/min，研磨温度为30℃。

进一步地，研磨时间为4min，研磨速度为100r/min，研磨温度为25℃。

进一步地，研磨时间为5min，研磨速度为60r/min，研磨温度为20℃。

进一步地，供试品溶液每1ml甲醇中含1mg供试品。

本发明另一方面还提供一种基于HPLC的硝苯地平有关物质分析方法，有关物质包括杂质Ⅰ和杂质Ⅱ，杂质Ⅰ为硝基吡啶，杂质Ⅱ为亚硝基吡啶，方法主要包括以下步骤：

制备供试品溶液：取供试品加三氯甲烷进行研磨，用甲醇转移到容量瓶中并稀释得到供试品溶液，避光保存；

制备备选供试品溶液：取供试品加三氯甲烷进行研磨，研磨环境温度为20℃-30℃，研磨时间为3min-5min，研磨速度为60r/min-150r/min，用甲醇转移到容量瓶中并稀释得到供试品溶液；

制备对照品储备液：取杂质Ⅰ对照品与杂质Ⅱ对照品，分别加入甲醇溶解并定量稀释制成混合溶液；

制备对照溶液：取供试品溶液与对照品储备液，分别用流动相定量稀释制成每1ml中分别含硝苯地平2μg、杂质Ⅰ1μg与杂质Ⅱ1μg的混合溶液；

系统适用性溶液：取硝苯地平、杂质Ⅰ对照品与杂质Ⅱ对照品，加甲醇溶解并稀释得到系统适用性溶液，每1ml系统适用性溶液中分别含1mg、10μg与10μg的硝苯地平、杂质Ⅰ对照品与杂质Ⅱ对照品；

采用高效液相色谱仪分别对供试品溶液和对照溶液进行检测；

色谱条件为：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以甲醇-水(60:40)为流动相，检测波长为235nm，进样体积为20μl；

测定法：取供试品溶液与对照溶液，分别注入液相色谱仪，记录色谱图至主成分峰保留时间的2倍；

限度：供试品溶液色谱图中如有与杂质Ⅰ峰、杂质Ⅱ峰保留时间一致的色谱峰，按外标法以峰面积计算，均不得超过0.1％，其他单个杂质峰面积不得大于对照溶液中硝苯地平峰面积，杂质总量不得超过0.5％；当与杂质Ⅰ峰保留时间一致的色谱峰，按外标法以峰面积计算，超过0.1％时，取备选供试品溶液注入液相色谱仪，记录色谱图至主成分峰保留时间的2倍，重新进行限度计算。

进一步地，制备备选供试品溶液中，研磨时间为3min，研研磨速度为150r/min，研磨温度为30℃。

进一步地，制备备选供试品溶液中，研磨时间为4min，研磨速度为100r/min，研磨温度为25℃。

进一步地，制备备选供试品溶液中，研磨时间为5min，研磨速度为60r/min，研磨温度为20℃。

本发明提供的有关物质分析方法具有以下技术效果：本发明提供的基于HPLC的硝苯地平有关物质分析方法通过具体限定供试品溶液的配制方法，提高检测效率和检测结果的正确性，耐用性好。

附图说明

图1.为用实施例1的方法进行硝苯地平有关物质分析得到的色谱图；

图2.为用高效液相法进行9批硝苯地平有关物质分析得到的色谱比较示意图；

图3.为用高效液相色谱法进行硝苯地平有关物质分析得到的三个色谱图叠加组成的色谱比较示意图，其中，三个色谱图分别为对照溶液注入色谱仪后得到的色谱图、正常供试品溶液注入色谱仪后得到的色谱图和操作失误制备的供试品溶液注入色谱仪后得到的色谱图；

图4.为用高效液相法对甲苯磺酸索拉非尼片、盐酸亚格拉汀胶囊、奥美拉唑肠溶片、加兰他敏片、塞来昔布胶囊进行检测得到的色谱图。

具体实施方式

实施例1

本实施例提供了一种基于HPLC的硝苯地平有关物质分析方法，有关物质包括杂质Ⅰ和杂质Ⅱ，杂质Ⅰ为硝基吡啶，杂质Ⅱ为亚硝基吡啶，该方法主要包括以下步骤：

制备供试品溶液：在温度为30℃的条件下在100mg供试品中加2ml三氯甲烷进行研磨，研磨时间为3min，研磨速度为150r/min，再用2ml甲醇将供试品转移到100ml容量瓶中，并通过甲醇定容得到供试品溶液；

制备对照品储备液：取硝基吡啶对照品与亚硝基吡啶对照品，分别加入甲醇溶解并定量稀释制成每1ml甲醇各含有10μg硝基吡啶对照品与亚硝基吡啶对照品的混合溶液；

制备对照溶液：取供试品溶液与对照品储备液，分别用流动相定量稀释制成每1ml中分别含硝苯地平2μg、杂质Ⅰ1μg与杂质Ⅱ1μg的混合溶液；

系统适用性溶液：取硝苯地平、杂质Ⅰ对照品与杂质Ⅱ对照品，加甲醇溶解并稀释得到系统适用性溶液，每1ml系统适用性溶液中分别含1mg、10μg与10μg的硝苯地平、杂质Ⅰ对照品与杂质Ⅱ对照品；

采用高效液相色谱仪分别对供试品溶液和对照溶液进行检测；

色谱条件为：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以甲醇-水(60:40)为流动相，检测波长为235nm，进样体积为20μl；

系统适用性要求：系统适用性溶液色谱图中，杂质Ⅰ峰、杂质Ⅱ峰与硝苯地平峰之间的分离度符合要求；

测定法：取供试品溶液与对照溶液，分别注入液相色谱仪，记录色谱图至主成分峰保留时间的2倍；

限度：供试品溶液色谱图中如有与杂质Ⅰ峰、杂质Ⅱ峰保留时间一致的色谱峰，按外标法以峰面积计算，均不得超过0.1％，其他单个杂质峰面积不得大于对照溶液中硝苯地平峰面积，杂质总量不得超过0.5％；

由实施例1的分析方法得到的色谱图见图1。

实施例2

本实施例提供了一种基于HPLC的硝苯地平有关物质分析方法，该分析方法与实施例1的区别在于，供试品溶液的制备方法不同，本实施例中制备供试品溶液的方法为：在温度为25℃的条件下在100mg供试品中加2ml三氯甲烷进行研磨，研磨时间为4min，研磨速度为100r/min，再用甲醇将供试品转移到100ml容量瓶中并稀释得到供试品溶液，避光保存。

实施例3

本实施例提供了一种基于HPLC的硝苯地平有关物质分析方法，该分析方法与实施例1的区别在于，供试品溶液的制备方法不同，本实施例中制备供试品溶液的方法为：在温度为20℃的条件下在100mg供试品中加2ml三氯甲烷进行研磨，研磨时间为5min，研磨速度为60r/min，再用甲醇将供试品转移到100ml容量瓶中并稀释得到供试品溶液，避光保存。

实施例4

本实施例提供了一种基于HPLC的硝苯地平有关物质分析方法，该分析方法还包括以下步骤：

其中，有关物质包括杂质Ⅰ和杂质Ⅱ，杂质Ⅰ为硝基吡啶，杂质Ⅱ为亚硝基吡啶，该方法主要包括以下步骤：

制备供试品溶液：取供试品加三氯甲烷进行研磨，用甲醇转移到容量瓶中并稀释得到供试品溶液，避光保存；

制备备选供试品溶液：取100mg供试品加三氯甲烷进行研磨，研磨时间为3min，研研磨速度为150r/min，研磨温度为30℃，用甲醇转移到100ml容量瓶中并稀释得到供试品溶液。

制备对照品储备液：取杂质Ⅰ对照品与杂质Ⅱ对照品，分别加入甲醇溶解并定量稀释制成混合溶液；

制备对照溶液：取供试品溶液与对照品储备液，分别用流动相定量稀释制成每1ml中分别含硝苯地平2μg、杂质Ⅰ1μg与杂质Ⅱ1μg的混合溶液；

系统适用性溶液：取硝苯地平、杂质Ⅰ对照品与杂质Ⅱ对照品，加甲醇溶解并稀释得到系统适用性溶液，每1ml系统适用性溶液中分别含1mg、10μg与10μg的硝苯地平、杂质Ⅰ对照品与杂质Ⅱ对照品；

采用高效液相色谱仪分别对供试品溶液和对照溶液进行检测；

色谱条件为：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以甲醇-水(60:40)为流动相，检测波长为235nm，进样体积为20μl；

测定法：取供试品溶液与对照溶液，分别注入液相色谱仪，记录色谱图至主成分峰保留时间的2倍；

限度：供试品溶液色谱图中如有与杂质Ⅰ峰、杂质Ⅱ峰保留时间一致的色谱峰，按外标法以峰面积计算，均不得超过0.1％，其他单个杂质峰面积不得大于对照溶液中硝苯地平峰面积，杂质总量不得超过0.5％；当与杂质Ⅰ峰保留时间一致的色谱峰，按外标法以峰面积计算，超过0.1％时，取备选供试品溶液注入液相色谱仪，记录色谱图至主成分峰保留时间的2倍，重新进行限度计算。

试验例1

试验样品

本次共检测9批产品，使用同一批硝苯地平原料，批号为2008014，该批原料药有关物质正常(<0.05％)，硝苯地平缓释片的样品批号分别为：20120041、20120061、20120071、20120081、20120091、20120101、20120111、20120121、20120131。

检测方法：

有关物质包括杂质Ⅰ和杂质Ⅱ；杂质Ⅰ为硝基吡啶，杂质Ⅱ为亚硝基吡啶；

该方法主要包括以下步骤：

制备供试品溶液：取供试品加三氯甲烷进行研磨，用甲醇转移到容量瓶中并稀释得到供试品溶液，避光保存；

制备对照品储备液：取硝基吡啶对照品与亚硝基吡啶对照品，分别加入甲醇溶解并定量稀释制成每1ml甲醇各含有10μg硝基吡啶对照品与亚硝基吡啶对照品的混合溶液；

制备对照溶液：取供试品溶液与对照品储备液，分别用流动相定量稀释制成每1ml中分别含硝苯地平2μg、杂质Ⅰ1μg与杂质Ⅱ1μg的混合溶液；

系统适用性溶液：取硝苯地平、杂质Ⅰ对照品与杂质Ⅱ对照品，加甲醇溶解并稀释得到系统适用性溶液，每1ml系统适用性溶液中分别含1mg、10μg与10μg的硝苯地平、杂质Ⅰ对照品与杂质Ⅱ对照品；

试验前查看实验所用设备仪器，均运行正常且在有效期内，查看所有对照品，样品均正确无误且在有效期内，查看仪器方法及实验方法，与文件要求一致，查看实验现场，容量瓶、移液管使用正确，观察供试品溶液未发现异常情况；

采用高效液相色谱仪分别对供试品溶液和对照溶液进行检测；

色谱条件为：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以甲醇-水(60:40)为流动相，检测波长为235nm，进样体积为20μl；

测定法：取供试品溶液与对照溶液，分别注入液相色谱仪，记录色谱图至主成分峰保留时间的2倍；

限度：供试品溶液色谱图中如有与杂质Ⅰ峰、杂质Ⅱ峰保留时间一致的色谱峰，按外标法以峰面积计算，均不得超过0.1％，其他单个杂质峰面积不得大于对照溶液中硝苯地平峰面积，杂质总量不得超过0.5％。

对照品溶液，是供试品溶液Ⅰ稀释50倍后再加入对照品储备液配制而成，现20120101批供试品溶液Ⅰ中杂质Ⅰ的峰面积异常，约为正常样品中杂质Ⅰ峰面积的250倍，但20120101对照Ⅱ峰面积正常。

如图2所示，用高效液相做硝苯地平有关物质分析时发现，9批中只有1批结果异常不合格，排除原料药不合格导致杂质超标的可能性，如图3所示，在两个杂质峰中间出现一个未知峰，初步怀疑是20120101批供试品溶液配制过程中被污染或HPLC故障导致的异常峰，因此进行假设试验进一步证明；

假设实验

假设实验1：

怀疑20120101供试品溶液Ⅰ液相小瓶污染或在液相进样过程中污染导致杂质结果超标，重新检测原液相小瓶溶液、原容量瓶中供试品溶液Ⅰ。实验结果见表1.

表1.原液相小瓶溶液、原容量瓶中供试品Ⅰ溶液的检测结果.

结论：通过以上实验数据对比，发现三个数据基本相同，故排除液相小瓶和进样过程中污染原因。

怀疑原容量瓶中的供试品溶液Ⅰ被污染，查看TM264-07《硝苯地平缓释片(Ⅰ)10mg测定方法》，发现在供试品溶液Ⅰ的配制过程中，使用玛瑙研钵将片子研磨成细粉，再使用玻璃研钵加氯仿进行研磨溶解并用甲醇转移到容量瓶，此次试验9批样品均使用同一玛瑙研磨研细，再分别用9个玻璃研钵和9个容量瓶配制供试品溶液Ⅰ，不同批次之间使用无尘纸擦拭玛瑙研钵，因20120101批次前后两个批次杂质Ⅰ含量均正常，故排除玛瑙研钵的污染，证明20120101批样品细粉没有问题，因此怀疑是玻璃研钵或容量瓶污染导致结果异常。

假设实验2：通过假设实验1，怀疑细粉配制供试品溶液过程中玻璃研钵或容量瓶污染导致结果异常，20120101批次的细粉因未避光保存，实验员在供试品溶液配制完成后将粉末废弃，故需重新取20120101样品进行检测。

结果：杂质Ⅰ峰面积为11062；

结论：实验结果符合可接受标准，因此怀疑供试品Ⅰ溶液配制过程中玻璃研钵或容量瓶污染导致结果异常；

为进一步证明异常峰不是污染产生的峰，进行假设实验证明，若是污染仅可能是玻璃研钵或容量瓶污染，经调查玻璃研钵仅用于硝苯地平检测，故不存在污染的可能性，100ml容量瓶实验室仅进行甲苯磺酸索拉非尼片、盐酸亚格拉汀胶囊、奥美拉唑肠溶片、加兰他敏片、塞来昔布胶囊产品检测，若有污染仅可能是这几个产品。

假设实验：称取以上每个产品对照品1mg配制到100ml容量瓶中，再进行一针硝苯地平杂质Ⅰ和杂质Ⅱ的混合溶液进行定位，以硝苯地平有关物质的检测方法进行液相实验。

结果：仅奥美拉唑及索拉非尼片出峰，故排除加兰他敏片、盐酸亚格拉汀胶囊、塞来昔布胶囊污染的可能性，又因索拉非尼出峰位置与异常峰不同，故排除索拉非尼污染的可能性，奥美拉唑出峰位置与异常峰相似，但峰型不同(如图4所示)，且查看实验室最近检测产品，近两个月未进行奥美拉唑检测，故排除奥美拉唑污染的可能性。

历史回顾对比

调查硝苯地平有关物质检测相关的OOS、OOT，发现共出现过四次检查结果异常情况，分别是OOS1301001、OOT1501001、OOS1508006、OOT1605002，查看具体调查过程发现：OOS1301001硝苯地平(超微粉)进行有关物质检测时，硝苯地平杂质Ⅱ检测结果超出可接受标准，根本原因为避光设施不足，导致硝苯地平杂质Ⅱ检测结果超标。

OOT1501001硝苯地平缓释片(Ⅰ)10mg有关物质检测时，其中4批硝苯地平杂质Ⅱ的结果符合可接受标准，但与同天检测的其他批次相比结果偏高，根本原因是实验过程中此4批样品液相小瓶在自然光下放置了20min，导致溶液遇光分解，产生硝苯地平杂质Ⅱ。

OOS1508006审核数据时，发现有关物质计算错误，正确计算后发现，硝苯地平(超细粉)的检测结果中硝苯地平杂质Ⅱ检测结果超出可接受标准，根本原因为样品避光不彻底导致遇光分解产生硝苯地平杂质Ⅱ，从而导致检测结果超标。

根据以上异常情况调查过程可知OOS1301001、OOT1501001、OOS1508006均是由于避光不合理导致样品分解出硝苯地平杂质Ⅱ，与此次OOS无相似之处，OOT1605002与本次异常情况相似。

OOT1605002硝苯地平缓释片(Ⅰ)10mg放行时发现16030231、16040281、16040291、16040301、16040311批有关物质数据均符合规定，但未知杂质的含量与之前数据对比偏大，根本原因为三氯甲烷是产生未知杂质峰的面积异常的一个原因，但不足以达到异常的峰面积，未知因素的存在也是导致硝苯地平有关物质未知杂质峰异常的一个原因。

查看OOT1605002具体调查过程，发现未知杂质出峰时间在杂质Ⅰ和杂质Ⅱ中间，面积为100000-550000，通过OOT1605002假设实验可知，溶剂中若不加入三氯甲烷，未知杂质峰未出现，而加入2ml三氯甲烷时出现峰面积大小不定的未知峰，用三氯甲烷研磨样品处理，样品中出现峰面积大小不定的未知峰，说明溶液中出现异常峰与三氯甲烷有关，但峰面积大小不定。

OOS2101001中，对比杂质Ⅰ超标的图与正常样品检测的图(如图3所示)，硝苯地平杂质Ⅰ异常峰包含了杂质Ⅰ与杂质Ⅱ中间的未知杂质峰，调查未找到明确的污染源。

结合OOT1605002与OOS2101001，发现虽然两次杂质异常情况分别是未知杂质和杂质Ⅰ，但两次的出峰时间与峰型相似，故怀疑两次异常为同一原因，根据OOT1605002调查可知，根本原因除三氯甲烷外还有未知因素，从理论上来讲，三氯甲烷没有紫外吸收，不遵循朗伯比尔定律，故峰面积大小与三氯甲烷加入多少无直接关系，而样品中之所以会产生三氯甲烷的吸收峰是因为三氯甲烷属于脂溶性溶剂，与甲醇不能完全混溶，与甲醇混合后会产生气泡或折射效应而产生吸收峰，在加入样品后，受研磨时间、三氯甲烷挥发量、辅料滤过量等不确定影响，导致折射效应增强而吸收峰变大，因不遵循朗伯比尔定律，所以大小无规律可循，查看有关物质检测方法，加入三氯甲烷后进行研磨，用甲醇转移到100ml容量瓶中，实验员实际操作时，因三氯甲烷极易挥发，采取先加入甲醇一起研磨，由于不同人员、不同环境、操作习惯等不同，导致挥发程度不一样，故对杂质峰产生的影响不一样，不同时间检测的9批供试品溶液色谱图见图2。

综上可知，此次异常峰出现的原因为供试品溶液配制过程中加入的三氯甲烷、甲醇与样品混合后会产生气泡或折射效应而产生吸收峰。

综上，仅为本发明之较佳实施例，不以此限定本发明的保护范围，凡依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆为本发明专利涵盖的范围之内。