用于尿素循环蛋白和核酸的替代的细胞外囊泡

摘要

本发明涉及工程化的细胞外囊泡(EV)，其作为治疗尿素循环障碍的新颖的治疗方法。更具体地说，本发明涉及各种蛋白质工程化和核酸工程化策略用于改善尿素循环蛋白或编码尿素循环蛋白的核酸向EV中的装载以及将所得EV靶向感兴趣组织和器官的用途。

说明书

技术领域

本发明涉及工程化的细胞外囊泡(EV)，其作为治疗尿素循环障碍的新颖的治疗方法。更具体地说，本发明涉及各种蛋白质和核酸工程化策略用于改善尿素循环相关性蛋白质和/或核酸的装载以及将所得EV靶向感兴趣组织和器官的用途。

背景技术

尿素循环中涉及的酶的基因缺陷导致含氮化合物尿素的新陈代谢不良。突变导致尿素循环中涉及的各种酶和转运体缺乏，并导致尿素循环障碍。如果任何尿素循环酶或转运体有缺陷的个体摄入的氨基酸超出了最低每日需求量，则所产生的氨将无法转化为尿素。这些个体可能会经历高氨血症或毒性循环中间体的累积。

尿素循环障碍(UCD)是由与尿素生产有关的酶或线粒体转运蛋白不足引起的代谢遗传错误，其导致血液中氨的毒性水平积累(高氨血症)。最常见的尿素循环障碍是：

·N-乙酰谷氨酸合酶缺乏症

·氨基甲酰磷酸合成酶缺乏症

·鸟氨酸氨甲酰基转移酶缺乏症

·瓜氨酸血症(缺乏精氨酸琥珀酸合酶)

·精氨酸琥珀酸尿症(缺乏精氨酸琥珀酸裂解酶)

·精氨酸血症(缺乏精氨酸酶)

·高鸟氨酸血症-高氨血症-同型瓜氨酸尿症(HHH)综合征(缺乏线粒体鸟氨酸转运体)

·II型瓜氨酸血症(缺乏柠檬素，一种天冬氨酸谷氨酸转运体)

·赖氨酸尿蛋白不耐受(y+L氨基酸转运体1发生突变)

·乳清酸尿症(缺乏酶尿苷单磷酸合酶UMPS)

UCD亚型包含由X连锁突变和鸟氨酸氨甲酰基转移酶(OTC)相应缺乏引起的亚型，以及由常染色体隐性突变和精氨酸琥珀酸合成酶(ASS)、氨基甲酰磷酸合成酶(CPS)、精氨酸琥珀酸裂解酶(ASL)、精氨酸酶(ARG)、N-乙酰谷氨酸合成酶(NAGS)、鸟氨酸转位酶(HHH)和天冬氨酸谷氨酸转运体(CITRIN)相应缺乏引起的亚型。这些是罕见疾病，在美国，据估计，每35,000例活产中的总体发病率大约为1例。当受试者经历氨水平>100μmol/L的高氨血症事件，并伴有与高氨血症相容的体征和症状，而没有其它明显原因时，则被怀疑为UCD，并且通常通过基因测试证实UCD。

ASA以及其它UCD被认为是罕见的遗传性疾病。ASA的特征是缺乏或缺少精氨酸琥珀酸裂解酶(ASL)。ASL对两个代谢通路很重要：i)基于肝脏的尿素循环，该循环使氨解毒；以及ii)瓜氨酸一氧化氮循环，该循环由L-精氨酸合成一氧化氮。患有ASL缺乏症的患者可能在出生后不久或在生命后期发病，并以高氨血症和具有严重神经系统表型的多器官疾病为特征。这些患者目前的医疗需求尚未得到满足，因为ASA是第二大最常见的尿素循环障碍，目前仅提供对症治疗。

UCD发病的严重性和时机根据缺乏的严重性而有所不同，取决于特定的酶或转运体的缺乏以及相关基因中的特定突变，严重性范围可以从轻到重。在发生如感染、创伤、手术、怀孕/分娩或饮食改变等突发事件之后，UCD患者可能在新生儿早期出现严重疾病，或者在儿童时期或甚至成人时期中的任何时间点发病。任何年龄的急性高氨血症发作都有患脑病的风险，并且所导致的神经系统损伤，有时甚至致命的，但甚至是慢性、亚临界的高氨血症也可能导致认知能力下降。因此，UCD与各个年龄段的神经系统异常以及智力和发育障碍的发生率显著相关。与生命后期发病的患者相比，患有新生儿发作疾病的UCD患者尤其容易经受认知障碍和死亡。

目前还没有治愈尿素循环障碍的治疗法，因此，这代表了未满足的医疗需求。与尿素循环有关的障碍的治疗是旨在管理症状的终生过程。考虑对一些患者进行肝移植，但是主要的疾病管理策略是通过饮食限制来减少饮食中蛋白质的摄入。用除氨化合物进行药理治疗已广泛用于治疗UCD，但其不能治愈，仅能控制症状。苯丁酸钠或Buphenyl、苯甲酸钠、口服乳果糖和新斯波林(neosporin)可以帮助清除氨或防止结肠细菌产生氨，然而这些治疗方法通常伴有严重的副作用，并且治疗窗口相对较小。在许多情况下，还规定了多种维生素、钙和抗氧化剂的补充。

药用级L-瓜氨酸补充剂用于氨基甲酰磷酸合成酶(CPS)和鸟氨酸氨甲酰基转移酶(OTC)缺乏症，而L-精氨酸用于精氨酸琥珀酸合酶缺乏症和瓜氨酸血症的情况下，以催化尿素循环中的酶并支持最佳的氨去除。抗酸剂通常用于减轻这些药物的胃肠道副作用，诸如反酸和胃痛。

诸如蛋白质生物制剂之类的生物药物(其中UCD的一类重要但经常不足的药物是酶替代疗法(ERT))和RNA疗法可以提供治疗尿素循环障碍的更有效替代方法。然而，尽管ERT在治疗涉及溶酶体区室的酶缺乏症方面是活跃的，但对于UCD而言并不是可行的选择，因为ERT无法进入细胞内环境。mRNA存在一些相同的问题，即，进入细胞内空间受到质膜的严格限制。

已显示，外泌体是各种类型的生物分子货物的优良载体，并被认为跨越血脑屏障，然而，外泌体在体内递送治疗性蛋白质和/或mRNA的实际用途并不简单，并且需要周密的囊泡工程化。

基于核酸的疗法正在迅速地应用于临床。基因疗法、基于mRNA的疗法、基于短寡核苷酸和基于siRNA的疗法只是RNA疗法领域内众多模式中的一些实例。由于裸核酸(通常为RNA)由于快速清除、核酸酶活性、缺乏器官特异性分布以及细胞摄取效率低而难以在体内递送，因此通常必须使用专门的递送媒剂作为实现生物活性递送的手段。肝脏靶标和非肝脏靶标以及高分子量RNA疗法(诸如mRNA和基因疗法)都是这种情况。

现有技术的EV装载技术通常在将蛋白质或核酸(NA)装载到EV中时效率非常低。首先，现有技术的装载系统导致EV与蛋白质和/或NA货物的可变装载，其次，被装载的那些EV每囊泡载有少量的蛋白质和/或NA拷贝(与这些问题相关的缺点将在下面更详细地讨论)。

现有技术的装载技术通常依赖于将蛋白质治疗性货物或NA试剂外源装载到EV中。通常，蛋白质与EV分开生产，并通常通过电穿孔或转染将蛋白质装载到单独生产和纯化的EV中。这种方法具有许多缺点：(i)分别生产EV和治疗性货物的成本可能限制了商业化；(ii)外源装载技术可能会对EV本身的完整性和功能产生负面影响，(iii)纯化和下游加工可能很困难且需要多个步骤，而且劳动强度大；以及(iv)外源装载的复杂蛋白质可能会出现构象变化以及不稳定和/或错误的翻译后修饰问题，从而可能导致活性降低。

类似地，现有技术的NA装载系统通常无法实现核酸货物的功能性、生物活性递送，这可能是由于：(i)mRNA和其它编码性RNA分子的装载效率低下且可变；(ii)通过现有技术递送的mRNA一旦到达细胞就不会被翻译，因为核酸不会从EV中释放出来；以及(iii)偶尔会使用产生次优EV的细胞来源。一种此类现有技术是在US14/502,494中描述的所谓的TAMEL系统。TAMEL系统存在所有上述缺点，并且还遭受以下事实的困扰：该系统依赖于噬菌体衍生的RNA结合蛋白，该RNA结合蛋白可能引起不期望的免疫反应性。

因此，TAMEL系统不适合用于装载到EV中以及随后递送临床上相关数量的生物活性核酸，这主要是因为缺乏有效的装载和递送方式，部分原因是免疫毒性，由于EV的部分肝脾生物分布模式，这在肝病的情况下尤其成问题。

这些可变的和低水平的装载结合了这样的事实，即装载的核酸随后几乎不可能被释放，因此不具有生物活性，或者实际装载的蛋白质很少、没有经过适当的翻译后修饰或没有正确折叠成最佳的活性构象，这意味着现有技术系统具有许多缺点，并且不适合用于装载和递送临床上相关数量的生物活性核酸或生物活性蛋白。本发明克服了这些显著的缺点，并允许以无毒的方式将生物活性治疗剂递送至受UCD影响的肝脏和其它组织和器官。

发明内容

本发明涉及工程化的细胞外囊泡(EV)，其作为治疗尿素循环障碍的新颖的治疗方法。更具体地说，本发明涉及各种蛋白质工程化和核酸工程化策略用于改善尿素循环蛋白或编码尿素循环蛋白的核酸向EV中的装载以及以无毒方式将所得EV靶向感兴趣组织和器官(具体地说，受UCD影响的肝脏和其它组织和器官系统)的用途。

因此，本发明的目的是克服与EV的工程化相关的上述问题，并将这些EV应用于全新领域，即用于UCD的治疗。本发明解决了针对UCD的基于EV的疗法的几个关键方面，即，将复杂的蛋白质药物货物和/或核酸药物货物包装并装载到EV中；优化EV本身的药代动力学；利用EV的再生作用；以及药物货物(在这种情况下为尿素循环蛋白和/或编码尿素循环蛋白的核酸)在体内向靶细胞的生物活性递送。

本发明通过利用新颖的EV工程化技术以生物活性状态和构型包装并装载治疗UCD所需的复杂且通常非常大的尿素循环蛋白或编码尿素循环蛋白的NA(诸如mRNA)来实现这一点。

此外，本发明通过利用新颖的EV工程化技术在合适的组织或器官中装载和释放NA货物而克服了与NA货物装载和释放相关的问题。这是通过对多肽和多核苷酸构建体进行高级工程化而实现的，这不仅确保将所讨论的NA高效装载到EV中，而且还确保其有效释放。这通过提供包括至少一种融合多肽的细胞外囊泡(EV)来实现，所述至少一种融合多肽包括至少一种核酸(NA)结合结构域和至少一种EV富集多肽。所述NA结合结构域可以有利地以几个拷贝的形式存在，并且每个NA货物分子也可以以多个拷贝的形式存在，其中每个拷贝都具有针对NA结合结构域的多个结合位点。重要的是，形成所述融合多肽的一部分并且负责与所述NA货物分子相互作用的所述NA结合结构域是可释放的NA结合结构域，这意味着其与所述NA货物分子的结合是可逆的、可释放的相互作用。所述NA结合结构域和所述NA货物分子之间的结合的可释放性质是特别有利的，因为本发明人已经认识到，产生EV的细胞中所述NA货物分子的过表达允许足够高的局部浓度以实现所述NA结合结构域和所述NA货物分子之间的相互作用，而目标位置(诸如在靶细胞内部)中所述NA结合分子的较低浓度允许有效释放NA分子，从而实现其生物活性递送。

此外，本发明还涉及偶然地选择和分析来自细胞来源的具有特定分子特性的EV，其在合适的药代动力学和再生特性之间提供最佳的平衡，以及提供在各种UCD中具有治疗活性的包括另外的蛋白质和核酸组分的EV。本发明的发明人已经认识到，EV代表UCD酶和/或转运体的最佳递送媒剂，这部分是由于EV的生物分布模式，并且部分是由于EV的一些天然组分(诸如热休克蛋白，其有助于使货物蛋白保持最佳生物活性构象)以及其它再生性组分。事实证明，各种细胞来源对于产生载有UCD蛋白/核酸的EV而言也是优选的，因此，本发明提供了针对这些通常无法治疗的疾病的新颖方法。重要的是，本发明解决了从完全新颖的角度处理UCD的问题。UCD通常仅以小分子方法解决，以清除或减少底物的毒性积累。近年来，已经进行了初步尝试以试图使用基因疗法来解决这一类疾病。EV和外泌体可以构成有效的递送模式，这一出乎意料的认知是本发明的重要方面，这是通过用于蛋白质或NA替代治疗性货物的创新性装载和递送技术实现的。在病毒介导的基因疗法的同时或之后，EV也可以构成非常合适的辅助治疗干预措施。EV良好的安全性和耐受性使得能够进行长期重复治疗，这在基因疗法环境中非常重要，在这种环境中，目标器官的更新会导致病毒递送的转基因随着时间的流逝而流失，因此需要补充所讨论的NA或蛋白质，这可以通过EV介导的UCD疗法来实现。

因此，在第一方面，本发明涉及一种用于尿素循环蛋白的替代的细胞外囊泡(EV)。这是通过使用载有至少一种尿素循环蛋白和/或至少一种编码尿素循环蛋白的核酸的工程化EV来实现的，所述核酸通常为mRNA或pDNA或病毒基因组或类似物。

在第二方面，本发明还涉及包括与尿素循环蛋白融合的EV蛋白的多肽构建体和/或包括与核酸(NA)结合结构域融合的EV蛋白(可互换地被称为EV富集多肽或外泌体多肽或EV多肽或EV蛋白或类似物)的多肽构建体，所述核酸结合结构域用于帮助将编码UCD蛋白的多核苷酸转运到EV中。

在第三方面，本发明还涉及一种编码本发明的任何一种多肽构建体的多核苷酸构建体，所述多核苷酸构建体可以被引入细胞中以产生表达本发明的一种或多种多肽构建体的产生EV的细胞。

本发明还涉及一种产生根据前述权利要求中任一项所述的EV的方法，所述方法包括：(i)将根据本发明的至少一种多核苷酸构建体引入产生EV的细胞中，以及(ii)在所述产生EV的细胞中表达由所述至少一种多核苷酸构建体编码的至少一种多肽构建体，从而通过直接表达为UCD蛋白或通过借助于所述多肽构建体装载的多核苷酸(诸如mRNA或任何其它编码性RNA或DNA分子)的表达而产生包括至少一种尿素循环蛋白的所述EV。

本发明还涉及一种细胞，其包括(i)根据本发明的至少一种多核苷酸构建体和/或(ii)本发明的至少一种多肽构建体和/或(iii)本发明的至少一种EV。

在第四方面，本发明还涉及一种药物组合物，其包括：

(i)根据本发明的至少一种多核苷酸构建体，和/或

(ii)根据本发明的至少一种多肽构建体，和/或

(iii)根据本发明的至少一种EV，

以及药学上可接受的赋形剂或载体；任选地进一步包括一种或多种用于治疗尿素循环障碍的另外的化合物。

本发明涉及用于治疗一种或多种尿素循环障碍的本发明的EV和/或本发明的药物组合物。本发明还涉及(i)根据本发明的至少一种多核苷酸构建体、(ii)根据本发明的至少一种多肽构建体、(iii)根据本发明的至少一种EV、(iv)根据本发明的至少一种细胞和/或(v)根据本发明的药物组合物，其用于药物中，优选地用于治疗一种或多种尿素循环障碍。

本发明还涉及一种治疗疾病或障碍的方法，所述方法包括向有需要的患者施用有效量的根据本发明的EV。

附图说明

图1：使用根据本发明的融合多肽构建体，载有NA货物分子的EV的示意图，该NA货物分子通常编码UCD蛋白。

图2：使用根据本发明的多肽装载策略载有UCD蛋白分子的EV的示意图。

图3：条形图，其示出了与TAMEL装载构建体(CD63-MS2)相比，通过本发明的示例性构建体(CD63-PUF)将报告核酸(NanoLuc mRNA)装载到EV中的比较功效。当与对照融合构建体CD63-MS2相比时，通过使用融合构建体CD63-PUF显著改善了报告mRNA向外泌体的递送。

图4：示出了使用不同的EV工程化方法，通过EV介导的蛋白质递送在体外递送UCD蛋白的图。工程化的经修饰的EV能够以生物活性浓度递送具有生物活性的UCD蛋白。

图5：条形图，其示出了由EV通过ASL工程化的外泌体进行的富马酸酯生产，这表明装载到外泌体中的ALS酶具有催化活性。

图6：示出了用ALS工程化的外泌体处理的ASL基因敲除小鼠的血氨水平的图。结果表明，体内递送被工程化为含有尿素循环酶的外泌体能够将氨水平降低至健康个体的氨水平。

序列表说明

SEQ ID NO 1:Puf 531蛋白质序列

SEQ ID NO 2:PUF mRNA loc/PUFeng蛋白质序列

SEQ ID NO 3:PUFx2蛋白质序列

SEQ ID NO 4:Cas6蛋白质序列

SEQ ID NO 5:His适体蛋白质序列

SEQ ID NO 6:TAT适体蛋白质序列

SEQ ID NO 7:人ASL蛋白质序列

具体实施方式

通过使用本发明的EV工程化技术，结合蛋白质和多核苷酸货物分子的选择性设计，以及对生物活性EV群体的概况分析，本发明解决了针对UCD的基于EV的疗法的几个关键方面。重要的是，EV介导的递送技术在UCD治疗中的应用基于本发明的发明人的以下认知，即，当EV被工程化和修饰成包括治疗水平的UCD蛋白或相应的NA时，其构成用于这些复杂的疾病(经常是肝脑疾病)的合适的递送模式。来自选定的产生EV的细胞来源且具有特定分子特征的EV特别适合在此类疾病中驱动治疗活性。本发明的EV的无毒性和非免疫原性是UCD中的体内治疗活性的重要因素。显然，患有肝病的受试者将无法忍受包括免疫毒性噬菌体蛋白的递送媒剂的施用，并且类似地，其它非基于EV的递送媒剂也将面临相同的问题，即肝功能已经受损的患者中的肝毒性。

为方便和清楚起见，在下文中收集并描述了本文中采用的某些术语。除非另外定义，否则本文所使用的所有技术和科学术语均具有与本发明所属领域的普通技术人员所通常理解的含义相同的含义。

当本发明的特征、方面、实施例或替代方案以马库什(Markush)组进行描述时，本领域技术人员将认识到，本发明还由此以马库什组的任何单独成员或成员的子组进行描述。本领域技术人员将进一步认识到，本发明还由此以马库什组的单独成员或成员的子组的任何组合进行描述。另外，应注意，结合本发明的方面和/或实施例之一进行描述的实施例和特征在进行必要的修改后还适用于本发明的所有其它方面和/或实施例。

例如，本文所述的尿素循环蛋白(例如与包括这种尿素循环蛋白的EV有关)应被理解为是公开的、与本文中的所有其它方面、教导和实施例(例如，涉及用于产生包括这种尿素循环蛋白的EV的方法的方面和/或实施例或涉及本文的多肽和/或多核苷酸构建体的方面)相关和兼容。此外，可以使用用于融合多肽的常规策略将本文中标识的所有多肽和蛋白质自由地组合到多肽构建体中。作为非限制性实例，本文中描述的所有尿素循环蛋白可以按任意组合方式与一个或多个EV富集多肽自由地组合。而且，本文的任何和所有尿素循环蛋白均可以与任何其它尿素循环蛋白组合以产生包括多于一种尿素循环蛋白的多肽(和/或相应的多核苷酸)构建体。此外，任何和所有特征(例如，马库什组的任何和所有成员)可以与任何和所有其它特征(例如，任何其它马库什组的任何和所有成员)自由地组合。另外，当本文中的教导将单数形式的EV和/或将EV称为离散的天然纳米颗粒样囊泡时，应理解所有这种教导与多个EV和EV群体同等相关且适用于该多个EV和EV群体。作为一般注释，根据本发明的尿素循环蛋白、EV富集多肽、组织靶向部分、肽和/或多肽、产生EV的细胞来源以及所有其它方面、实施例和替代方案可以在不脱离本发明的范围和主旨的情况下以任何和所有可能的组合自由地组合。

此外，只要任何给定分子保持进行与其相关联的期望的技术效果的能力，本发明的任何多肽或多核苷酸或任何多肽或多核苷酸序列(分别为氨基酸序列或核苷酸序列)就可以相当大地偏离原始多肽、多核苷酸和序列。只要维持其生物特性，根据本申请的多肽和/或多核苷酸序列就可以相对于天然序列偏离至多50％(使用任何序列比对或序列同源性工具(例如BLAST)计算的)，尽管尽可能高的序列同一性是优选的(例如60％、70％、80％或例如90％或更高)。例如，至少一种尿素循环蛋白与至少一种EV富集多肽的组合(融合)自然意味着相应多肽的某些区段可以被替代和/或修饰和/或该序列可以通过插入其它氨基酸片段而中断，这意味着只要保留了关键特性(例如，尿素循环蛋白的天然效果、EV运输和富集、靶向特性等)，与天然序列的偏离就可以是相当大的。类似推理因此理所当然地适于对这种多肽进行编码的多核苷酸序列。本文中提及的与肽、多肽和蛋白质有关的所有SEQID NO应仅被视为实例并且仅供参考，并且所有肽、多肽和蛋白质应被赋予如技术人员将理解的其普通含义。因此，如上文所提及的，技术人员还将理解，本发明不仅涵盖本文中所指的特定的SEQ ID NO，而且还涵盖其变体和衍生物。本文提及的所有蛋白质、多肽、肽、核苷酸和多核苷酸均应根据技术人员所理解的常规含义来解释。

术语“细胞外囊泡”或“EV”或“外泌体”在本文中可互换使用，并且应被理解为涉及可从呈任何形式的细胞获得的任何类型的囊泡，例如微囊泡(例如从细胞的质膜脱落的任何囊泡)、外泌体(例如源自内溶酶体通路或源自任何其它产生外泌体的细胞通路的任何囊泡)、凋亡小体(例如可从凋亡细胞获得)、微颗粒(其可以源自例如血小板)、核外颗粒体(可源自例如血清中的中性粒细胞和单核细胞)、前列腺颗粒体(例如可从前列腺癌细胞获得)或心肌颗粒体(例如可源自心肌细胞)等。外泌体和/或微泡(具体地说，ARRDC1介导的微泡(ARMM))代表特别优选的EV，但是其它EV在各种情况下也可能是有利的。

EV可以是可以充当递送或转运媒剂的任何类型的脂类结构(具有囊泡形态或具有任何其它类型的合适形态)。有利地，EV不是人工脂质体或人工脂质纳米颗粒。

EV的大小可以有很大的变化，而EV通常具有纳米大小的流体动力学半径，即低于1000nm的半径。外泌体的大小通常介于30和300nm之间，通常介于30和200nm之间，诸如在介于50和250nm之间的范围内，这是非常合适的大小范围。显然，EV可以源自任何细胞类型，可以是体内、离体和体外细胞。本发明的优选的EV是外泌体和/或微泡，但是其它EV在各种情况下也可能是有利的。在另一个优选的实施例中，EV优选地可从羊膜来源的细胞、沃顿氏胶冻(Wharton’s jelly)来源的细胞、羊膜上皮(AE)细胞、间充质基质细胞(MSC)和胎盘来源的细胞获得。此外，术语“EV”和/或“外泌体”和/或“微泡”还应被理解为涉及通过例如膜挤出、超声处理或其它技术等获得的细胞外囊泡模拟物，例如基于细胞膜的囊泡或基于EV的囊泡。

技术人员将清楚的是，在描述EV的医疗和科学用途和应用时，本发明一般涉及多个EV，即可以包括数千、数百万、数十亿或甚至数万亿个EV的EV群体。如可以从下文实验部分看到的，EV可以以如每体积单位(例如每ml)10

术语“EV富集多肽”、“EV蛋白”、“EV多肽”、“外泌体多肽”和“外泌体蛋白”在本文中可互换使用，并且应被理解为涉及可以用于将多肽构建体(除了EV富集蛋白之外，该多肽构建体通常还包括尿素循环蛋白或与编码UCD蛋白的NA货物分子结合的NA结合结构域)转运到合适的囊泡结构(即合适的EV)的任何多肽。更具体地，这些术语应被理解为包括能够将融合蛋白构建体转运、运输或穿梭到囊泡结构(诸如EV)的任何多肽。此类外泌体多肽的实例是例如CD9、CD53、CD63、CD81、CD54、CD50、FLOT1、FLOT2、CD49d、CD71(也被称为转铁蛋白受体)及其内体分选结构域，即转铁蛋白受体内体分选结构域，CD133、CD138(多配体蛋白聚糖-1)、CD235a、ALIX、AARDC1、棕榈酰化信号(Palm)、同线蛋白(也被称为同线蛋白-1)、同线蛋白的N端部分、Lamp2b、多配体蛋白聚糖-2、多配体蛋白聚糖-3、多配体蛋白聚糖-4、TSPAN8、TSPAN14、CD37、CD82、CD151、CD231、CD102、NOTCH1、NOTCH2、NOTCH3、NOTCH4、DLL1、DLL4、JAG1、JAG2、CD49d/ITGA4、ITGB5、ITGB6、ITGB7、CD11a、CD11b、CD11c、CD18/ITGB2、CD41、CD49b、CD49c、CD49e、CD51、CD61、CD104、Fc受体、白介素受体、免疫球蛋白、MHC-I或MHC-II组分、CD2、CD3ε、CD3ζ、CD13、CD18、CD19、CD30、TSG101、CD34、CD36、CD40、CD40L、CD44、CD45、CD45RA、CD47(CD47可以在α、β或δ位置融合)、CD86、CD110、CD111、CD115、CD117、CD125、CD135、CD184、CD200、CD279、CD273、CD274、CD362、COL6A1、AGRN、EGFR、GAPDH、GLUR2、GLUR3、ARRDC1、HLA-DM、HSPG2、L1CAM、LAMB1、LAMC1、LFA-1、LGALS3BP、Mac-1α、Mac-1β、MFGE8、SLIT2、STX3、TCRA、TCRB、TCRD、TCRG、VTI1A、VTI1B、其它外泌体多肽及其任何片段、衍生物、结构域或组合，但是能够将多肽构建体转运至EV的许多其它多肽也包括在本发明的范围内。通常，在本发明的许多实施例中，至少一种EV富集多肽包括在多肽构建体中，该多肽构建体包括尿素循环蛋白或与编码UCD蛋白的NA结合的NA结合结构域，并且该融合多肽构建体还可以有利地包括各种其它组分，包含接头、跨膜结构域、胞质结构域、多聚化结构域、释放结构域等。接头和多聚化结构域可用于有利地允许UCD蛋白或NA结合结构域采用其适当的构象，并因此递送具有改善的生物活性的UCD蛋白或实现改善的核酸结合，从而针对难以装载核酸而改善核酸装载。

术语“核酸”或“多核苷酸”或“NA”或“NA货物分子”或类似物在本文中可互换使用，并可以用于描述选自包括以下各项的群组的任何核酸：单链RNA或DNA、双链RNA或DNA以及其它多核苷酸(诸如mRNA、质粒)或任何其它RNA或DNA载体(诸如例如病毒基因组)。NA通常编码至少一种尿素循环蛋白，但也可以编码其它肽或多肽。在本发明的几个实施例中，至少一种外泌体多肽与NA结合结构域融合，以形成存在于EV中的融合蛋白以帮助NA货物分子的装载。这种融合蛋白还可以包括用于优化其一个或多个功能的各种其它组分，包含接头、跨膜结构域、胞质结构域、多聚化结构域等，其优点如上所述。

术语“NA结合结构域”或“NA结合多肽”或“NA结合蛋白”在本文中可互换使用，并且涉及能够与一段核苷酸结合的任何结构域。NA结合结构域可以结合RNA、DNA、RNA和DNA的混合体、特定类型的NA(诸如mRNA)、环状RNA或DNA、核酶、小环DNA、质粒DNA等。此外，NA结合结构域还可以结合经化学修饰的核苷酸，诸如2'-O-Me、2'-O-烯丙基、2'-O-MOE、2'-F、2'-CE、2'-EA 2'-FANA、LNA、CLNA、ENA、PNA、硫代磷酸酯、三环DNA等。

有利地，本发明所使用的NA结合蛋白在真核生物中都是高度保守的，因此当递送给患者时不大可能引起不良的免疫反应。此外，本发明的NA结合结构域还可以结合NA的特定序列、结合结构域(诸如重复序列)或结合NA基序(如茎环或发夹)。NA结合结构域的此类结合位点可以天然存在于感兴趣NA货物分子中和/或可以被工程化到NA货物分子中以进一步增强EV装载和生物活性递送。NA结合结构域对核酸的结合亲和力使得核酸以足够高的亲和力结合以穿梭到EV中，但是结合的亲和力并未高到足以阻止核酸随后释放到靶细胞中，使得核酸一旦被递送至靶细胞就具有生物活性。因此，重要且与现有技术完全相反的是，本发明涉及借助于可释放的NA结合结构域而载有NA货物分子的EV，其中所述NA结合结构域形成具有外泌体多肽的融合多肽的一部分。已经选择了本发明的NA结合结构域以允许NA结合结构域和NA货物分子之间的可编程的、可改变的亲和力，使得能够产生包括融合多肽的EV，该融合多肽包括NA结合结构域和至少一种NA货物分子，其中融合多肽构建体的NA结合结构域以可编程、可逆、可修饰的方式与NA货物分子相互作用，从而既可以将NA货物分子装载到EV中，又可以在EV中释放NA货物分子和/或与靶细胞结合。这与现有技术完全相反，现有技术仅允许使用MS2蛋白将mRNA分子装载到外泌体中，但是其中MS2蛋白保持与mRNA结合，从而抑制其释放和随后的翻译。

在利用NA结合结构域的本发明的实施例中，NA结合结构域可以选自：PUF蛋白、CRISPR相关多肽(Cas)(具体地说，Cas6和Cas13)以及各种类型的NA结合适体。本发明使用术语PUF蛋白来涵盖来自任何物种(例如人Pumilio同源物1(PUM1)、PUMx2或PUFx2(其是PUM1的复制品)等)的所有相关蛋白和此类蛋白(也可以被称为PUM蛋白)的结构域，或可从任何PUF(PUM)蛋白获得的任何NA结合结构域。PUF蛋白通常的特征是存在八个连续的PUF重复序列，每个重复序列大约40个氨基酸，通常侧接两个相关序列Csp1和Csp2。每个重复序列都有一个“核心共有”，其中含有芳香族残基和碱性残基。RNA结合需要整个PUF重复序列簇。显著地，这一相同区域也与蛋白质共调节剂相互作用，并足以在很大程度上挽救PUF蛋白突变体的缺陷，这使得PUF蛋白高度适合于本发明中使用的突变。此外，PUF蛋白是可释放的NA结合结构域的高度优选的实例，该NA结合结构域以合适的亲和力结合至NA货物分子，从而使得PUF蛋白可释放地、可逆地附着至NA货物。PUF蛋白存在于大多数真核生物中，并参与胚胎发生和发育。PUF具有一个结合RNA的结构域，该结构域由8个通常含有36个氨基酸的重复序列组成，这是本专利申请中通常用于RNA结合的结构域。每个重复序列都结合一个特定的核苷酸，并且通常是位置12和16处的氨基酸通过与氨基酸13的堆积相互作用而赋予特异性。天然存在的PUF可以结合核苷酸腺苷、尿嘧啶和鸟苷，并且工程化的PUF也可以结合核苷酸胞嘧啶。因此，该系统是模块化的，并且可以通过切换重复序列结构域的结合特异性来改变PUF结构域所结合的8个核苷酸序列。因此，根据本发明的PUF蛋白可以是天然的或被工程化以结合RNA分子中的任何位置，或者可替代地，对于不同的序列，可以选择具有不同结合亲和力的PUF蛋白并将RNA分子工程化成含有所述序列。此外，还存在工程化的PUF结构域，其以序列特异性方式结合16个核苷酸，也可用于进一步增加对NA货物分子的特异性。因此，根据本发明，PUF结构域可以被修饰以结合具有不同亲和力和序列长度的任何序列，这使得系统高度模块化并且适用于任何RNA货物分子。根据本发明可以用作NA结合结构域的PUF蛋白及其区域和衍生物包含以下PUF蛋白的非限制性列表：FBF、FBF/PUF-8/PUF-6,-7,-10(均来自秀丽隐杆线虫)；来自黑腹果蝇的Pumilio；Puf5p/Mpt5p/Uth4p、Puf4p/Ygl014wp/Ygl023p、Puf5p/Mpt5p/Uth4p、Puf5p/Mpt5p/Uth4p、Puf3p(均来自酿酒酵母)；来自盘基网柄菌的PufA；人PUM1(Pumillo 1，有时也被称为PUF-8R)及其任何结构域、包括来自至少两个PUM1的NA结合结构域的多肽、任何经截短或修饰的PUF蛋白(诸如例如PUF-6R、PUF-9R、PUF-10R、PUF-12R、PUF-16R)或其衍生物；以及来自非洲爪蟾的X-Puf1。根据本发明的特别合适的NA结合PUF包含以下：PUF 531、PUF mRNA loc(有时被称为PUFengineered或PUFeng)和/或PUFx2，及其任何衍生物、结构域和/或区域。PUF/PUM蛋白是高度有利的，因为它们可以被选择为来自人类来源，这是本发明的有利实施例。

人类来源的蛋白质(而不是诸如MS2蛋白等噬菌体来源的蛋白质)是有益的，因为它们不太可能非法不良的免疫反应。此外，MS2与噬菌体来源的茎环相互作用，与PUF蛋白不同，这意味着需要将原核NA序列和基序引入所选的NA分子中。显然，噬菌体来源和结构的茎环结构的这种插入可能会干扰mRNA的翻译，从而导致无功能的mRNA货物分子，甚至触发免疫毒性。

因此，在有利的实施例中，本发明涉及与外泌体蛋白融合的真核NA结合蛋白。在一个优选的实施例中，NA结合结构域来自PUF蛋白家族，例如PUF531、PUFengineered和/或PUFx2，所有这些都有利地是人类来源的。重要的是，PUF蛋白优选地用于EV介导的mRNA或shRNA递送，由于PUF蛋白的序列特异性，这可以实现高度受控和特异性的NA药物货物装载。在优选的实施例中，PUF蛋白有利地与跨膜蛋白或可溶性外泌体蛋白组合。有利的融合蛋白构建体包含以下非限制性实例：CD63-PUF531、CD63-PUFx2、CD63-PUFengineered(可替代地被称为PUFeng或PUF mRNA loc)、CD81-PUF531、CD81-PUFx2、CD81-PUFengineered、CD9-PUF531、CD9-PUx2、CD9-PUFengineered和其它跨膜融合蛋白，优选地基于融合至一个、两个或多个PUF蛋白的四跨膜外泌体蛋白。包括PUF蛋白和至少一种可溶性外泌体蛋白的有利的融合蛋白包含以下非限制性实例：CD63-PUF、同线蛋白-PUF531、同线蛋白-PUx2、同线蛋白-PUFengineered、多配体蛋白聚糖-PUF531、多配体蛋白聚糖-PUx2、多配体蛋白聚糖-PUFengineered、Alix-PUF531、Alix-PUx2、Alix-PUFengineered以及与PUF蛋白融合的任何其它可溶性外泌体蛋白。

PUF蛋白对目标NA货物分子具有可修饰的序列特异性这一事实使其成为融合至外泌体多肽伴侣的理想NA结合结构域。因此，在本发明的优选实施例中，使用可释放的NA结合结构域(作为具有外泌体蛋白的融合蛋白的一部分)将NA货物分子装载到EV中，其中NA结合结构域与NA货物分子之间的相互作用有利地基于对靶核苷酸序列的特异性而不是基于靶核苷酸的二级结构(因为二级结构不能实现序列特异性)。在优选的实施例中，NA货物分子被工程化以包括和/或自然包括被选作NA结合结构域的PUF蛋白的靶核苷酸序列。这种靶核苷酸序列可以如上所述，例如，是mRNA的3'UTR的一部分，或者可以被引入到任何NA货物分子(诸如mRNA、shRNA、miRNA、lncRNA、DNA等)中，从而允许PUF蛋白与NA货物分子结合。NA货物分子上的PUF结合位点通常比许多其它RNA结合蛋白(诸如MS2，其仅识别组合形式的4个核苷酸和一个茎环)所结合的序列长，因此在目标结合位点上优选的核苷酸片段例如可以是5个核苷酸(nt)、6个nt、7个nt、8个nt、9个nt、10个nt、11个nt、12个nt、13个nt、14个nt、15个nt、16个nt、17个nt、18个nt、19个nt或甚至20个nt或更长，这取决于对NA结合结构域的可修饰序列特异性的需求。在一个优选的实施例中，PUF蛋白对长度为6个nt、8个nt、9个nt、10个nt、12个nt或16个nt的天然存在和/或人工存在的NA货物分子结合位点具有特异性。

CRISPR相关多肽(Cas)代表另一组NA结合结构域，并且可以具体地包含Cas6和Cas13以及任何其它RNA结合性Cas分子。Cas6以高亲和力结合前体CRISPR RNA(crRNA)，并对其进行处理，以便稍后并入到例如Cas9中。RNA分子的切割速率可以被调节和高度定义，因此RNA分子与Cas6之间的缔合时间也可以以非常准确的方式定义，这对于本发明的目的是重要的。可以使用已经被突变以增加或降低RNA切割效率的Cas6或Cas13的突变体形式。可以使用已经被突变以增加或降低RNA结合亲和力的Cas6或Cas13的突变体形式。例如，当RNA货物分子将在受体细胞中释放时，这将是一个优点。然后可以调节定义的缔合时间，以在囊泡内释放RNA分子，但不在生产细胞内释放。可以对Cas6可以识别的RNA序列进行工程化，以将其插入感兴趣NA分子中。可以将Cas13工程化成仅结合其定义的RNA靶标，而不降解该RNA靶标。通过改变sgRNA分子的序列，可以调节Cas13-sgRNA复合物以结合20-30个核苷酸之间的任何RNA序列。此外，与PUF蛋白的情况一样，Cas蛋白是可释放的NA结合结构域的高度优选的实例，该NA结合结构域以合适的亲和力结合至NA货物分子，从而使得Cas蛋白可释放地、可逆地附着至NA货物。与基于PUF的NA结合结构域一样，Cas蛋白代表可释放的、不可逆的NA结合结构域，其对目标NA货物分子具有可编程的、可修饰的序列特异性，从而能够以较低的总亲和力实现更高的特异性，从而既可以将NA货物装载到EV中，又可以在目标位置中释放NA货物。

根据本发明，NA适体结合结构域是另一组NA结合结构域。这种NA适体结合结构域是可以被基于NA的适体特异性结合的结构域、区域、氨基酸片段或整个多肽或蛋白质。适体是形成二级和/或三级结构以识别分子的RNA序列，类似于抗体对其靶抗原的亲和力。因此，这些RNA分子可以以高亲和力识别特定的氨基酸序列。通过将特定的核苷酸序列插入NA分子中以识别特定的氨基酸序列，从而将RNA适体应用于本发明。可以将此类氨基酸序列工程化到外泌体载体多肽中和/或旁边，以使适体(其被工程化到NA货物分子中和/或旁边)能够与其结合，从而借助于外泌体多肽将NA货物分子穿梭于EV中。具有合适特性的两个适体是对一段组氨酸(His)氨基酸具有高亲和力的His适体和针对HIV Tat结构域的适体。优选地将适体序列插入mRNA的3'和/或5'非翻译区或非编码性RNA的非特异性区。也可以将两个或更多个适体组合成一个NA货物分子，以增加对外泌体载体蛋白的特异性和亲和力。重要的是，本发明的所有NA结合结构域提供了与NA货物分子(例如mRNA)的可编程的、序列特异性的、可逆的、可释放的结合，这与现有技术中发现的与RNA的高亲和力、不可逆结合完全相反。在本发明的优选实施例中，NA结合结构域是PUF蛋白或Cas蛋白，因为这些蛋白具有易于编程的性质和序列特异性并且与NA货物分子可逆地、可释放地结合。重要的是，Cas蛋白和PUF蛋白作为NA结合结构域的序列特异性优选地基于与目标NA分子上至少6个nt(优选地，至少8个nt)的相互作用，当与低亲和力相互作用结合时，这可以实现NA货物分子的高生产力的EV介导的递送。NA货物分子上的至少6个nt结合位点优选地以连续的核苷酸序列形式存在。因此，NA货物分子的结合位点优选地在长度上对应于两个密码子。

术语“UCD蛋白”或“尿素循环蛋白”或类似物在本文中可互换使用，并且应被理解为涉及属于尿素循环蛋白组的任何多肽，即参与形成尿素循环的一部分的酶和其它蛋白质。UCD蛋白的非限制性实例包含N-乙酰基谷氨酸合酶、氨基甲酰磷酸合成酶、鸟氨酸氨甲酰基转移酶、氨基甲酰磷酸合成酶、精氨酸琥珀酸合酶、精氨酸琥珀酸合成酶、精氨酸琥珀酸裂解酶(也被称为精氨基琥珀酸裂解酶)、精氨酸酶、线粒体鸟氨酸转运体、鸟氨酸转位酶、柠檬素等。

本发明涉及包括至少一种融合多肽的细胞外囊泡(EV)，该融合多肽包括至少一种核酸(NA)结合结构域和至少一种外泌体多肽，其中该至少一种NA结合结构域可以是一个或多个PUF、与CRISPR相关的(Cas)多肽和/或NA适体结合结构域。由于NA结合结构域的存在，EV通常进一步包括至少一种NA货物分子，其通常编码UCD蛋白。通常，每个EV中包括的NA货物分子的数量是相当大的，这是对现有技术的明显改进，现有技术通常在给定的EV群体中实现非常低的装载效率和高度可变的装载。在本发明的情况下，融合多肽构建体的发明性设计是指(借助于融合多肽)将至少一个NA货物分子非常有效地转运到EV中，随后显著改善释放过程。NA结合结构域(其包括在融合多肽中)和NA货物分子之间的结合的可释放性质是本发明的关键方面，因为其允许NA货物分子在产生EV的细胞(其中NA货物分子通常被过表达)中结合，同时能够在靶细胞内和/或靶细胞附近递送生物活性NA分子。

因此，与现有技术不同，NA结合结构域与NA货物分子之间的可编程的、较低亲和力的相互作用使得本发明能够有效地将EV装载在产生EV的细胞中，同时还能够在合适的位置(通常在靶细胞内部)释放NA货物，其中NA货物分子和NA结合结构域之间的相互作用的较低亲和力和可释放性是高度有利的。此外，与仅公开MS2作为结合4个nt和茎环的高亲和力RNA结合蛋白的现有技术不同，本发明允许与核苷酸片段的序列特异性的低亲和力或中等亲和力结合，该核苷酸片段更长且因此更具特异性的，例如长度为6个nt或长度为8个nt。

较长的结合位点长度使得能够引入一系列不同的突变，这些突变产生具有一系列经修饰的结合亲和力的结合位点，从而产生上述可编程的较低亲和力相互作用。例如，将单点突变引入6或8个核苷酸区域中将微妙地改变结合亲和力，而已知的是，即使是MS2的较短的4个核苷酸结合区域中的单个突变也会显著影响MS2对RNA的结合亲和力。较长的核酸长度提供了更大的范围来引入一种或多种影响蛋白质对核酸的结合亲和力的突变。类似地，对结合更长的核苷酸片段的需要会导致能够与更长的核苷酸序列相互作用的大量氨基酸，从而为突变那些相互作用的氨基酸提供了更多可能性，并再次产生了更大范围的具有多种结合亲和力可能的蛋白质突变体。与通过MS2蛋白或MS2 RNA序列的突变可以实现的亲和力相比，PUF、Cas6和Cas13的更长的核苷酸结合位点和更大的蛋白质结合位点在通过突变实现更大范围的亲和力方面均具有优势。因此，如果需要改善货物核酸的释放，则这种更长的序列提供了更大的可能性来工程化核酸和/或结合蛋白以专门针对感兴趣单个货物定制结合亲和力。如上所述，控制与核苷酸货物结合的亲和力从而改变和控制核苷酸货物的可释放性的能力是本发明相对于现有技术的显著优点，其导致生物活性核酸的递送和释放。重要的是，如上所述，在涉及肝脏疾病的情况下，噬菌体蛋白刺激的免疫毒性将特别成问题，因为EV生物分布模式会导致噬菌体蛋白在肝脏中大量积累，从而对已经患有肝系统受损的患者的肝功能产生更大的负面影响。

在另一个实施例中，EV可以进一步包括器官、组织或细胞靶向肽和/或多肽。已被证明可以有效地将EV转运到大脑和CNS中(这在具有CNS表现的某些UCD中可能很重要)的靶向肽的实例是狂犬病毒糖蛋白(RVG)肽，但其它肽和多肽也在本发明的范围内。重要的是，组织靶向肽和/或多肽可以包括在多肽构建体中，该多肽构建体还包括尿素循环多肽(和任选的用于增强UCD蛋白和/或相应的编码性NA货物分子的装载的EV富集多肽)和/或可以作为分离的多肽构建体存在于EV中。当靶向肽和/或多肽是单独的多肽构建体的一部分时，优选地将其融合到外泌体蛋白上，以确保有效地装载到EV中。

当根据本发明的EV包括至少一个靶向部分时，所述靶向部分能够靶向EV以及相关的多肽或多核苷酸货物，以靶向递送至感兴趣细胞、组织、器官和/或隔室。靶向部分可以包括在融合多肽本身中，当使用具有跨膜结构域的外泌体多肽使靶向部分能够在EV的表面上显示时，这是特别有利的。靶向部分可以是蛋白质、肽、抗体、纳米抗体、α抗体、单链片段或抗体或结合剂的任何其它衍生物等。靶向部分还可以形成EV中包括的单独的多肽构建体的一部分。此外，本发明的EV中包括的融合多肽还可以包括各种另外的部分以增强生物活性递送。这种部分和/或结构域可以包含功能结构域的以下非限制性实例：(i)使融合多肽二聚、三聚或多聚以增强EV形成和/或改善装载的多聚化结构域；(ii)如上所述的接头，其用于避免空间位阻并提供灵活性，例如在UCD蛋白和外泌体蛋白之间或外泌体蛋白和NA结合结构域之间；(iii)释放结构域，诸如具有自切割活性的顺式切割元件(如内含肽)，其可用于释放融合多肽的特定部分(例如，释放UCD蛋白和/或编码UCD蛋白的NA货物)；(iv)RNA切割结构域，其用于改善受体细胞中RNA的释放，例如编码核酸酶(诸如Cas6、Cas13)的结构域；(v)内体逃逸结构域，诸如HA2、VSVG、GALA、B18等；和/或(vi)核定位信号(NLS)。组织靶向部分可以是组织靶向肽和/或多肽，其可以包括在与治疗性肽相同的多肽构建体中和/或作为单独的多肽构建体存在。

在一个实施例中，NA货物分子可以选自包括以下各项的群组：mRNA、环状RNA、小环DNA、质粒DNA或病毒基因组，但是根据本发明，基本上任何类型的NA分子都可以包括在EV中，只要其可以编码需要在UCD中替代的UCD蛋白。单链和双链的NA分子均在本发明的范围内，并且NA分子可以是天然存在的(诸如RNA或DNA)，或者可以是化学合成的RNA和/或DNA分子，其可以包括经化学修饰的核苷酸，诸如2'-O-Me、2'-O-烯丙基、2'-O-MOE、2'-F、2'-CE、2'-EA 2'-FANA、LNA、CLNA、ENA、PNA、硫代磷酸酯、三环-DNA等。重要的是，尽管本发明高度适用于NA货物分子(例如mRNA、环状RNA、病毒基因组等)的内源装载，但其也适用于NA分子的外源装载，可以通过将产生EV的细胞暴露于所讨论的NA分子和/或通过将NA货物分子与EV本身共同孵育或配制来装载该NA分子。

NA货物分子可以是线性的、环化的和/或具有任何二级和/或三级和/或其它结构。NA货物分子可以包括以下一种或多种：(i)用于miRNA结合的位点，其中此位点任选地是组织和/或细胞类型特异性的；(ii)至少一个稳定结构域，诸如polyA尾或茎环；或(iii)在5'和/或3'端中的至少一个杂合UTR。

在本发明的实施例中，根据本发明的NA货物分子包括(i)用于融合多肽的NA结合结构域的至少一个结合位点和(ii)编码治疗性UCD蛋白的多核苷酸结构域。在优选的实施例中，NA货物分子包括至少两个结合位点，甚至更优选地，更高数量的结合位点，如3、4、5、6、7、8、9、10、15或更大的数字。本发明人已经认识到，包含1-8个结合位点可将NA货物分子最佳装载到EV中，而不会对货物的释放和生物活性递送产生负面影响。NA结合结构域的结合位点可以被基因工程化到3'和/或5'UTR中和/或侧接3'和/或5'UTR，和/或通过序列优化而被置于NA货物分子的编码区域中。

NA货物分子(即，编码所讨论的UCD蛋白的多核苷酸)和包含NA结合结构域的融合多肽构建体二者的设计是装载、释放和生物活性递送(例如进入靶细胞和/或进入特定的器官、组织和身体隔室)的关键。如上所述，在本发明中使用的NA结合结构域是高度有利的，因为其避免触发免疫刺激和毒性，这尤其重要，因为EV旨在将UCD蛋白和/或相应的NA货物递送至肝脏，尿素循环障碍本身的影响已经包括了这一点。本发明人已经发现特别有利的实施例是包括融合多肽的EV，该融合多肽包括在两侧均侧接至少一个NA结合结构域(即，在每一侧上具有至少一个NA结合结构域)的至少一种外泌体多肽。可替代地，在各种情况下，NA结合结构域可通过在至少一个位置(例如在例如CD63的囊泡环上)插入外泌体多肽中，例如当需要在EV的外部显示NA结合结构域以增强外源装载时。外泌体多肽可以紧紧侧接C端和/或N端，但是最有利的设计之一是在外泌体多肽和NA结合结构域之间包含连接肽和/或切割多肽结构域(诸如内含肽)(或在此类UCD蛋白的蛋白质递送释放的情况下)，以为外泌体多肽和NA结合结构域的维持活性提供间隔和灵活性。这种接头可以有利地是含有特定数量的重复序列的甘氨酸-丝氨酸(GS)接头。本发明人已经认识到1-4个重复序列中的任一个是最有利的，其提供足够的灵活性而不会使融合多肽过于结构化。如上所述，对于涉及NA货物分子的外源装载的应用，EV优选地包括融合多肽，该融合多肽包括至少一种外泌体多肽，该至少一种外泌体多肽在其N端和/或其C端和/或在外泌体多肽的任何囊外(即存在于EV外部)区域中与至少一个NA结合结构域融合，以便使NA结合结构域暴露在外泌体表面上。

本发明还涉及NA货物分子的各种发明性修饰，这些修饰是确保装载、释放和生物活性递送的高效率的关键。例如，通过将NA货物分子设计为线性或圆形，可以增加或降低诸如装载效率和稳定性等方面。此外，通过优化序列的设计，还可能影响NA货物的二级和三级结构，通过促进NA结合结构域对目标NA的容易接近性，这可以进一步促进装载。

在又一个有利的实施例中，NA货物分子可以包括另外的部分以通过增强装载、改善释放、增加组织特异性活性和/或增加NA货物分子的稳定性来增加效力。例如，NA货物分子可以包括以下一种或多种：(i)用于miRNA结合的位点，其中此位点任选地是组织和/或细胞类型特异性的，用于驱动优先的细胞和/或组织特异性活性；(ii)至少一个稳定结构域，诸如长的PolyA尾或多于一个PolyA尾(例如2个或3个或甚至4个PolyA尾)；(iii)5'和/或3'UTR中的至少一个茎环结构，其用于抑制核酸酶降解；(iv)RNA聚合酶，其用于驱动NA货物分子的转录；(v)经密码子优化的序列，其用于增加mRNA的稳定性；(vi)5'和/或3'端中的至少一个杂合UTR，其用于增加mRNA翻译效率；和/或(vii)核酶。

如上所述，NA货物分子(即编码UCD蛋白的多核苷酸)可以有利地包括：(i)NA结合结构域的至少一个结合位点，其用于共定位到EV中；和(ii)编码治疗性UCD蛋白的多核苷酸结构域。NA货物分子可以有利地进一步包括在至少一个结合位点和编码性NA组分之间的切割位点。包括NA结合结构域的融合多肽可以包括至少一个在N端和/或C端侧接NA结合结构域的外泌体多肽，和/或其中至少一个NA结合结构域插入EV多肽序列中。

根据本发明的EV借助于融合多肽而装载有NA货物分子，该融合多肽通常包括外泌体多肽，该外泌体多肽融合至与NA货物分子结合并将其转运到EV中的至少一个NA结合结构域。不希望受到任何理论的束缚，据推测，装载与产生EV的细胞内部EV的形成有关，或通过将NA货物分子与工程化的EV一起孵育来外源性地进行。融合多肽通常可以结合NA货物分子(诸如在产生EV的细胞中共表达的mRNA分子)，并将其运输到囊泡中，该囊泡然后作为EV从生产细胞中分泌出来。如所提到的，NA货物分子可以在与融合多肽相同的产生EV的细胞中表达(内源装载)和/或一旦形成EV并任选地纯化后，其可以被外源装载到EV中。NA货物在产生EV的细胞中的共表达是一个非常有利的实施例，因为EV生产是在单个细胞中的单个步骤中进行的，这可以扩展流程并简化上游和下游流程。NA货物分子(例如，mRNA或任何其它编码UCD蛋白的NA分子等)可以从与融合多肽相同的多核苷酸构建体中表达，或者可以从另一个多核苷酸构建体中表达。两种方法都具有优点：使用一种构建体可确保融合多肽和NA货物分子一起被翻译/转录，而使用不止一种构建体可以使两种组分的差异表达成为可能，例如融合多肽或NA货物分子的较高表达水平。在优选的实施例中，有利地将表达融合多肽和/或NA货物分子的多核苷酸构建体稳定地引入到产生EV的细胞中，以能够一致地、可再现地和高产率地生产装载NA的EV。稳定细胞的产生(优选地随后是单细胞克隆以获得用于EV生产的单细胞克隆)对于将编码性NA分子装载到EV中和将包括UCD蛋白的融合多肽装载到EV中同样重要。在一个优选的实施例中，用包括融合多肽和NA货物分子的双顺反子或多顺反子载体(也被称为构建体或多核苷酸等)稳定地转染和/或转导产生EV的细胞。这种双顺反子或多顺反子构建体可以包括例如诱导型启动子、IRES元件或2A肽键，其允许表达(i)包括NA结合结构域和外泌体蛋白的融合多肽以及(ii)感兴趣NA货物分子，例如mRNA或任何其它类型的编码性NA货物分子。除了使用双顺反子或多顺反子载体之外，多个或双向启动子代表了另一种易于处理的方法，该方法用于稳定地插入编码将被装载到根据本发明的EV中的两个感兴趣组分的单个构建体。显然，在替代性实施例中，也可以将两个或更多个构建体(例如质粒)转染和/或转导到产生EV的细胞中，尽管使用单个构建体可能是有利的，因为其可以实现等摩尔浓度的融合多肽(以及因此，NA结合结构域)和NA货物分子本身。重要的是，通常将本发明的产生EV的细胞设计成过表达至少一种多核苷酸构建体，该多核苷酸构建体允许在产生EV的细胞中以合适的浓度适当产生NA货物分子，从而允许NA结合结构域可逆地、可释放地附接至NA分子。多核苷酸的过表达是重要的工具，其允许在产生EV的细胞中产生相对较高的UCD蛋白融合多肽或编码UCD蛋白的NA货物分子浓度，同时允许在NA货物分子浓度较低的靶细胞中释放NA货物分子。这与PUF和Cas蛋白特别相关。

如上所述，EV通常不以单个囊泡形式存在，而是以实质的多个囊泡形式存在，因此，本发明也涉及EV群体。在有利的实施例中，在整个这种群体中，每个EV中的NA货物分子的平均数量高于平均一个(1)NA货物分子/EV，优选地高于10个NA货物分子/EV，甚至更优选地高于100个NA货物分子/EV。然而，在整个群体中，也可能存在不包括任何NA货物分子的EV，因此本发明也可能涉及每个EV包括平均少于一个(1)NA货物分子的EV群体。

重要的是，现有技术通常仅以非常低效的方式将RNA货物装载到小部分的EV中。例如，TAMEL系统实际上导致单个EV的零到次单个百分点的装载。TAMEL系统的发明人报告说，当以至多7倍使用TAMEL系统时，增加了RNA分子向外泌体中的装载，而与以下各项相比，本发明将例如mRNA和其它NA货物分子的装载提高了通常至少10倍(优选地至少25倍、但经常至少50倍以及优选地至少70倍)：(i)融合蛋白中不存在NA结合结构域和/或NA货物分子中不存在NA结合结构域的结合位点的EV；(ii)本身不具有融合蛋白的EV(例如图2所示)；(iii)仅被动载有NA货物分子的非工程化EV；和/或(iv)任何给定的内部NA控制分子。因此，本发明提供了一种用于将大量更多的NA货物分子装载到给定的EV群体中的方法，并且重要的是，与现有技术相比，本发明还能够装载显著更高比例的EV。在一个实施例中，本发明涉及这样的EV群体：其中所有EV中至少5％、至少10％、至少20％、至少50％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％和/或至少95％包括所讨论的NA货物分子。如上所述，本发明与例如US14/502,494和其它现有技术文献之间的关键差异涉及融合多肽在整个EV群体中的无效性以及严重不均匀分布。例如，US14/502,494中使用的MS2蛋白仅存在于一小部分EV中，这导致整个EV群体中mRNA货物的装载分布不均匀。相反，本发明的融合蛋白均匀地分布在整个EV群体中，这意味着基本上每个EV都包括至少一种根据本发明的融合多肽和通常至少一个NA货物分子。因此，在一个实施例中，本发明涉及基本上包括两个EV亚群的EV组合物，其中(i)第一EV亚群中每个EV包括平均多于一个融合多肽(包括NA结合结构域和外泌体多肽)；并且(ii)其中第二个EV亚群包括所讨论的NA货物分子，每个EV包括平均多于一个融合多肽/EV。相反，现有技术，例如US14/502,494，教导了这样的EV：其中每个EV包括非常少的融合多肽，通常每10个EV包括少于1个融合多肽，这清楚地暗示了依赖于所述融合蛋白的NA货物分子的生产性装载和递送将显著低于本申请中的情况。不希望受到任何理论的束缚，据推测，现有技术未能实现将融合蛋白更高装载到EV中的原因是由于MS2和类似的非真核蛋白不能有效地穿梭到外泌体中和/或MS2和类似的非真核蛋白会触发毒性，这是本发明解决的两个问题。

当本发明的EV载有UCD蛋白时，每个EV可以包括多肽构建体的至少一个拷贝(即，UCD蛋白，其任选地与外泌体蛋白融合)。更优选地，本发明的单个EV可以包括：(i)多肽构建体的至少10个拷贝；(ii)多肽构建体的至少50个拷贝；和/或(iii)多肽构建体的至少100个拷贝。

本发明的多肽构建体包括至少一种治疗性尿素循环蛋白，其与至少一种EV富集多肽(例如CD63、CD81、CD9、同线蛋白、Lamp2B、Lamp2A、多配体蛋白聚糖、Alix、CD47、棕榈酰化结构域、肉豆蔻酰化结构域或任何其它EV富集多肽，其可在多核苷酸和多肽水平上可操作地连接至治疗性尿素循环蛋白)组合在一个多肽构建体中。

如上所述，在有利的实施例中，可以将根据本发明的EV中所包括的多肽构建体工程化成包括至少一种EV富集多肽，以便驱动尿素循环蛋白内化到EV中。此类EV富集多肽可以选自基本上任何EV多肽，例如选自以下EV富集多肽的群组：CD9、CD53、CD63、CD81、CD54、CD50、FLOT1、FLOT2、CD49d、CD71、CD133、CD138、CD235a、ALIX、同线蛋白-1、同线蛋白-2、Lamp2b、TSPAN8、TSPAN14、CD37、CD82、CD151、CD231、CD102、NOTCH1、NOTCH2、NOTCH3、NOTCH4、DLL1、DLL4、JAG1、JAG2、CD49d/ITGA4、ITGB5、ITGB6、ITGB7、CD11a、CD11b、CD11c、CD18/ITGB2、CD41、CD49b、CD49c、CD49e、CD51、CD61、CD104、Fc受体、白介素受体、免疫球蛋白、CD2、CD3ε、CD3ζ、CD13、CD18、CD19、CD30、CD34、CD36、CD40、CD40L、CD44、CD45、CD45RA、CD47、CD86、CD110、CD111、CD115、CD117、CD125、CD135、CD184、CD200、CD279、CD273、CD274、CD362、COL6A1、ARRDC1、AGRN、EGFR、GAPDH、GLUR2、GLUR3、棕榈酰化结构域、肉豆蔻酰化结构域HLA-DM、HSPG2、Hsp70、L1CAM、LAMB1、LAMC1、LFA-1、LGALS3BP、Mac-1α、Mac-1β、MFGE8、SLIT2、STX3、TCRA、TCRB、TCRD、TCRG、VTI1A、VTI1B、其任何衍生物和/或结构域及其任何片段、衍生物、结构域或组合。任何UCD蛋白可以与本发明的任何EV富集多肽组合在融合蛋白中。进一步有利地，本发明的多肽构建体可以进一步包括内含肽，该内含肽能够使UCD蛋白货物通过内含肽的自切割活性被切割并因此从EV富集多肽中释放出来。

在本发明的另外的实施例中，编码此类UCD蛋白的尿素循环蛋白或NA分子选自包括以下各项的群组：N-乙酰谷氨酸合酶、氨基甲酰磷酸合成酶、鸟氨酸氨甲酰基转移酶、精氨酸琥珀酸合酶、精氨酸琥珀酸合成酶、精氨酸琥珀酸裂解酶、精氨酸酶、线粒体鸟氨酸转运体、鸟氨酸转位酶、柠檬素、y+L氨基酸转运体1、尿苷单磷酸合酶或其任何片段、衍生物、结构域或组合。

如上所述，另一方面，本发明涉及包括至少一个NA结合结构域和至少一种外泌体多肽的本发明融合多肽，其中该至少一个NA结合结构域是PUF、Cas和/或NA适体结合结构域中的一个或多个。在有利的实施例中，融合多肽可以任选地进一步包括赋予多肽特定功能的另外的区域、结构域、序列和/或部分。融合多肽中包括的另外的结构域的非限制性实例包含(i)多聚化结构域、(ii)接头、(iii)释放结构域、(iv)RNA切割结构域、(v)内体逃逸部分、(vi)蛋白酶特异性切割位点、(vii)内含肽(viii)靶向部分和/或(ix)自切割结构域，诸如内含肽。

多聚化结构域能够使融合多肽发生二聚化、三聚化或任何更高阶的多聚化，这增加了融合多肽向EV的分选和运输，并且还可能有助于增加由产生EV的细胞所产生的囊泡的产率。接头可用于为融合多肽构建体以及相应的多核苷酸构建体提供增加的灵活性，并且还可用于确保避免空间位阻和保持融合多肽的功能性。释放结构域可以包含在融合多肽构建体中，以便能够从原始融合多肽中释放特定部分或结构域。当融合多肽的部分的释放将增加NA货物的生物活性递送时和/或当融合多肽的特定功能在较小构建体的一部分中更好地起作用时，这是特别有利的。合适的释放结构域可以是顺式切割序列(诸如内含肽)、光诱导的单体或二聚体释放结构域(诸如Kaede、KikGR、EosFP、tdEosFP、mEos2、PSmOrange、GFP样Dendra蛋白Dendra和Dendra2、CRY2-CIBN等)。NA切割结构域也可以有利地包含在融合多肽中，以触发NA货物的切割。NA切割结构域的非限制性实例包含核酸内切酶，诸如Cas6、Cas13、工程化的PUF核酸酶、位点特异性RNA核酸酶等。此外，本发明的融合多肽还可以包含内体逃逸结构域以驱动内体逃逸并由此增强EV本身和EV NA货物分子的生物活性递送。用于增强递送的另一策略是将EV靶向细胞、组织和/或器官或其它身体隔室。可以通过多种手段来实现靶向，例如使用靶向肽。这种靶向肽可以是长度为几个氨基酸到长度为100个氨基酸的任何位置，例如，3-100个氨基酸、3-30个氨基酸、5-25个氨基酸之间的任何位置，例如7个氨基酸、12个氨基酸、20个氨基酸等。本发明的靶向肽还可以包含全长蛋白，诸如受体、受体配体等。此外，根据本发明的靶向肽还可以包含抗体和抗体衍生物，例如单克隆抗体、单链可变片段(scFv)、其它抗体结构域等。

在本发明特别优选的实施例中，多肽构建体包括使用融合蛋白在腔外显示的ASL蛋白，该融合蛋白包括LAMP2b-ASL；CD47α–ASL；CD47β–ASL；CD47δ–ASL和/或CD47γ-ASL(CD47α/β/γ/δ依次代表CD47蛋白的更多截短形式)。可替代地，在本发明的其它同样优选的实施例中，多肽构建体包括使用融合蛋白在腔内显示的ASL蛋白，该融合蛋白包括CD63-内含肽-ASL和/或Palm-内含肽-ASL(Palm是棕榈酰化序列)。本发明的EV还可以包括这些额外的和腔内显示的蛋白质构建体的任何或全部组合。此外，优选实施例中的ASL蛋白可以被任何其它尿素循环蛋白替代。腔内装载尿素循环蛋白/编码尿素循环蛋白的多核苷酸的好处是，通过封装在EV内，可以保护蛋白质/多核苷酸免于降解，从而延长货物分子的半衰期。

使用棕榈酰化序列是特别有利的，因为棕榈酰化是可逆的过程，其允许蛋白质动态地重新定位在胞质溶胶和细胞内膜/质膜之间。其效果是双重的：首先，在EV生产细胞中，其允许本发明的多肽构建体在生产细胞内再循环，使得如果多肽最初位于不产生EV的膜上，则其随后可以重新定位至能够产生EV的不同亚细胞膜上，并因此增加最终并入到EV中的多肽构建体的水平；其次，一旦将EV递送至靶细胞，就可以通过去棕榈酰化酶去除脂肪酸，并因此可以以游离的未附着形式递送货物(不必在其中内置内含肽或其它切割机制)，从而使被递送的货物蛋白获得其最佳的生物活性确认，从而显示出增强的治疗效果。因此，利用棕榈酰化具有令人惊讶且出乎意料的双重作用，即在对产生EV的细胞进行上游处理期间将货物定位至EV，以及使得能够在相关的目标位置中释放货物。

在另一方面，本发明涉及编码根据本发明的多肽构建体的多核苷酸构建体。可以使用各种载体在体内、离体和/或体外天然表达这种多核苷酸构建体。在另一个方面，包括根据本发明的多核苷酸构建体的合适的载体包含：质粒；迷你圆；任何类型的基本上环化的多核苷酸；病毒，诸如腺病毒、腺相关病毒、慢病毒和/或无衣壳病毒和/或病毒基因组；线性DNA和/或RNA多核苷酸；天然信使RNA(mRNA)；和/或经修饰的mRNA，其通常包括经修饰的核苷(诸如5-甲基胞苷和假尿苷)，以降低免疫原性并增强mRNA的稳定性。

根据本发明的多核苷酸构建体可以进一步包括一个或多个位点或结构域，用于将特定的功能赋予多核苷酸。例如，可以通过使用稳定结构域(诸如polyA尾或茎环)来增强多核苷酸构建体的稳定性，并且多核苷酸构建体还可以由特定的启动子控制，该启动子可以任选地是细胞类型特异性的诱导型启动子、接头等。还可以在mRNA货物分子的Cas6或Cas13切割位点的上游插入PolyA尾，以导致保留稳定的PolyA尾的mRNA切割。这样做的好处是，货物mRNA在体内具有更高的稳定性，从而可以从单一货物mRNA中翻译出更多的蛋白质，并因此提高每个EV递送的治疗生物活性。

本发明还涉及包括以下各项的细胞：(i)根据本发明的至少一种多核苷酸构建体和/或(ii)本发明的至少一种多肽构建体和/或(iii)本发明的至少一种EV。

术语“源细胞”或“EV源细胞”或“亲本细胞”或“细胞来源”或“产生EV的细胞”或任何其它类似术语应被理解为涉及能够在适合条件下(通常在细胞培养基中)产生EV的任何类型的细胞。细胞培养基可以包含体内、离体和/或体外的悬浮培养基、贴壁培养基或任何其它类型的培养系统。根据本发明的源细胞还可以包含在体内产生外泌体的细胞，例如通过将多核苷酸构建体递送至受试者中以随后进行EV的翻译和体内产生(例如在肝脏中)。

通常，EV可以衍生自基本上任何细胞来源，其可以是原代细胞来源或永生化细胞系。EV源细胞可以是任何胚胎细胞、胎儿细胞和成年体干细胞类型，包含诱导性多能干细胞(iPSC)和通过任何方法衍生的其它干细胞以及任何成年细胞来源。根据本发明的源细胞可以选自广泛的细胞和细胞系，例如间充质干细胞或基质细胞(可从例如骨髓、脂肪组织、沃顿氏胶冻、围产期组织、绒毛膜、胎盘、牙芽、脐带血、皮肤组织等获得)、成纤维细胞、羊膜细胞(更具体地说，任选地表达各种早期标志物的羊膜上皮细胞)、髓样抑制细胞、M2极化巨噬细胞、脂肪细胞、内皮细胞、成纤维细胞等。特别感兴趣细胞系包含人脐带内皮细胞(HUVEC)、人胚肾(HEK)细胞、内皮细胞系(诸如微血管或淋巴内皮细胞)、红细胞、红系祖细胞、软骨细胞、不同来源的MSC、羊膜细胞、羊膜上皮(AE)细胞、通过羊膜穿刺术或从胎盘获得的任何细胞、气道或肺泡上皮细胞、成纤维细胞、内皮细胞等。而且，诸如B细胞、T细胞、NK细胞、巨噬细胞、单核细胞、树突状细胞(DC)等免疫细胞也在本发明的范围内，并且本文还涵盖能够产生EV的基本上任何类型的细胞。

在治疗神经系统疾病时，可以考虑利用例如原代神经细胞、星形胶质细胞、少突胶质细胞、小神经胶质细胞和神经祖细胞作为源细胞。对待治疗的患者而言，源细胞本质上可以是同种异体的、自体的或甚至异种的，即细胞可以来自患者本身或来自不相关的、匹配的或不匹配的供体。在某些情况下，从医学角度看，同种异体细胞可能是优选的，因为它们可以提供无法从患有某些适应症的患者的自体细胞获得的免疫调节作用。例如，在治疗全身性、外周和/或神经性炎症的背景下，同种异体MSC或AE可能是优选的，因为可从此类细胞获得的EV可以通过例如巨噬细胞和/或中性粒细胞表型转换(分别从促炎性M1或N1表型转换为抗炎性M2或N2表型)实现免疫调节。根据本发明，最有利的源细胞是MSC、羊膜来源的细胞、羊膜上皮(AE)细胞、任何围产期细胞和/或胎盘来源的细胞，所有这些都是哺乳动物来源的，最优选地，是人类来源的。衍生EV的细胞系可以是贴壁细胞或悬浮细胞，可以作为稳定细胞系或单个克隆产生。

在一个实施例中，本发明涉及一种可从MSC、AE细胞或胎盘来源的细胞获得的EV，被称作MSC-EV、AE-EV和P-EV。这种细胞是特别优选的，因为其似乎允许产生包括多肽构建体的大量拷贝(即相当多的多肽构建体)的根据本发明的EV，该多肽构建体包括至少一种尿素循环蛋白，以增强其在各种不同UCD中的治疗活性。术语“内源性工程化”意指将产生EV的细胞基因工程化成含有编码治疗性尿素循环蛋白的多核苷酸构建体，该多核苷酸构建体借助于细胞机制并入EV中。尽管上述细胞来源是优选的实施例，但是本发明涉及任何产生EV的细胞来源，即可以产生EV的任何细胞。上述细胞来源在产生包括编码生物活性UCD蛋白的NA货物分子的EV方面也是高效的。

MSC-EV、AE-EV和P-EV以及其它各种产生EV的细胞来源出乎意料地能够携带正确折叠的UCD蛋白和/或编码此类UCD蛋白的NA分子的大量拷贝，并具有治疗活性，即酶活性或所述治疗性尿素循环蛋白实现的任何其它活性。不希望受任何理论的束缚，据推测，这些特性是由于在EV中(具体地说，在外泌体中)发现的高含量的热休克蛋白引起的，具体地说，热休克70kda蛋白8(也被称为Hsp70-8，由基因HSPA8编码)。可能有利地存在于和/或工程化到EV中的其它热休克蛋白包含Hsp90、Hsp70和/或Hsp60。

在另外的实施例中，根据本发明的EV被选择为对各种蛋白质标志物呈阳性，这令人惊讶地似乎与再生和免疫调节作用以及用于治疗UCD的合适的药代动力学特征有关。最具生物活性的EV对以下一种(但通常至少三种)多肽呈阳性：CD63、CD81、CD44、SSEA4、CD133、CD24和热休克蛋白家族的各种蛋白质，诸如Hsp70家族的蛋白质。

重要的是，有助于将NA货物分子装载到本发明的EV中的治疗性尿素循环蛋白和/或融合蛋白被正确折叠，这是由于所述蛋白质被内源装载到EV中。不希望受到任何理论的束缚，据推测，正确的折叠是EV中所包括的热休克蛋白引起的，该热休克蛋白可能有助于维持所讨论的蛋白质的正确折叠。

在其它方面，本发明涉及包括本文所述的多肽构建体、多核苷酸构建体或载体中的一种或多种的细胞。任何类型的产生EV的细胞都可用于本发明的目的，并且此类产生EV的细胞可存在于体外，例如在细胞培养基中，或存在于任何离体或体内系统中。根据本发明的细胞可以任选地被永生化和/或任选地用至少一种多核苷酸构建体(或包括这种至少一种多核苷酸构建体的任何载体)稳定地转染或转导，以能够持续、稳健且一致地产生EV。

如上所述，在优选的实施例中，用至少一种编码(i)包括NA结合结构域的融合蛋白和(ii)NA货物分子的多核苷酸构建体或编码至少一种包括治疗性UCD蛋白的多肽构建体的多核苷酸稳定地转染和/或转导本发明的产生EV的细胞。在高度优选的实施例中，将产生EV的细胞暴露于克隆选择方案，从而允许单细胞克隆的克隆选择。因此，在高度优选的实施例中，本发明涉及被稳定转染和/或转导以产生同时包括融合多肽和NA货物分子的产生EV的细胞的单细胞克隆群体。可以使用有限稀释方法、单细胞分选、单细胞印刷和/或使用克隆圆筒分离单个细胞来获得单个克隆。

在本发明的优选实施例中，产生EV的细胞包括至少一种包括至少一种治疗性尿素循环蛋白的多肽构建体，至少一种编码所述多肽构建体的多核苷酸构建体和/或至少一种载体。通常将本发明的细胞工程化成包括多核苷酸构建体(其可以以载体的形式存在，诸如质粒、mRNA、线性DNA分子、病毒或病毒基因组等)，该多核苷酸构建体通过细胞机制表达到相应的多肽构建体中，从而并入由细胞产生的EV(通常是外泌体和/或微泡)中。因此，细胞通常最初包括多核苷酸构建体(或包括所述构建体的载体)，并且一旦多肽构建体的表达和翻译完成，细胞将同时包括多核苷酸和相应的多肽构建体，其通常通过EV介导的胞吐作用从细胞中分泌出来，其中每个EV都包括多肽构建体的多个拷贝。

本发明的产生EV的细胞可以优选地包括多核苷酸构建体，该多核苷酸构建体编码包括至少一种尿素循环蛋白和至少一种EV富集多肽的多肽构建体，该多肽构建体被稳定地插入产生EV的细胞中。从化学、生产和控制(CMC)的角度来看，稳定(基因)工程化的产生EV的细胞来源的创建对于持续且高产率地生产具有可重复治疗效果和可复制身份的EV至关重要。通常使用例如hTERT永生化、病毒永生化和/或条件永生化策略使稳定细胞永生化。为了能够大规模生产EV，优选的是，产生EV的细胞在一定数量的群体倍增(PDL)(优选地至少20个PDL、更优选地至少50个PDL、甚至更优选地至少70个PDL、甚至更优选地至少100个PDL或甚至至少200个PDL)的情况下稳定地包括多核苷酸构建体(优选地在合适的载体中)。

在本发明的优选方面，由产生EV的细胞产生的EV中的至少50％或60％(优选地至少70％或80％，甚至更优选地90％或95％或更多)包括多肽构建体，该多肽构建体包括至少一种尿素循环蛋白和/或编码至少一种UCD蛋白的多核苷酸构建体(诸如mRNA)。

在本发明的另一个优选方面，由产生EV的细胞产生的EV包括尿素循环蛋白和/或编码至少UCD蛋白多核苷酸构建体(诸如mRNA)的至少10个、20个、30个或40个拷贝，优选地至少50个拷贝，更优选地至少70个、80个或100个拷贝。

因此，在一个有利的实施例中，本发明涉及包括EV群体的组合物，其中至少50％、60％或70％的EV对治疗性尿素循环蛋白和/或编码至少一种UCD蛋白的多核苷酸构建体(诸如mRNA)呈阳性，更优选地其中至少75％的EV对治疗性尿素循环蛋白或编码该蛋白的多核苷酸呈阳性，甚至更优选地其中至少90％的EV对治疗性尿素循环蛋白或编码该蛋白的多核苷酸呈阳性，和/或甚至更优选地其中至少95％的EV对治疗性尿素循环蛋白或编码该蛋白的多核苷酸呈阳性。

重要的是，用于优化产生EV的细胞的本发明的工程化策略导致尿素循环蛋白高效地装载到EV中。通常，根据本发明的每个EV均包括多肽构建体(以及因此尿素循环蛋白)的至少五到十个拷贝，但是更经常地远高于十个拷贝(例如约20-30个拷贝，或30-50个拷贝)或者还超过50个拷贝(例如所讨论的尿素循环蛋白的约75或约100个拷贝)。显然，这对于治疗效果非常重要，如果没有有目的地选择最佳工程化策略和EV特征以及用于生产和收获此类EV的发明性方法，则这是无法实现。类似地，EV可以包括编码至少一种UCD蛋白的多核苷酸构建体(诸如mRNA)，优选地每个EV包括多于一个拷贝，但是自然地甚至更优选地每个EV包括多于十个拷贝，或优选地每个EV包括甚至更多个拷贝(诸如多于20个、50个或100个拷贝)。在一些实施例中，并非所有EV均包括药物分子(诸如mRNA或相应的蛋白质)，例如，每2个EV中的1个EV可以包括药物分子，或者每10个EV中的1个EV可以包括药物分子。由于EV的安全性和耐受性，因而具有广泛的治疗指数，尽管某些EV可能不包括药物货物，但仅通过增加颗粒(EV)数量即可轻松实现介导药理学作用所需的EV剂量。

在另一方面，本发明进一步涉及一种药物组合物，该药物组合物包括本文所述的多种EV、至少一种多肽构建体、至少一种多核苷酸和/或至少一种载体以及药学上可接受的载体。重要的是，本文的所有生物组分(EV、多肽、多核苷酸、载体、细胞等)可以有利地单独包含在药物组合物中或以任何组合形式一起包含在药物组合物中。通常，本发明的药物组合物包括EV群体和合适的药物载体、添加剂和/或赋形剂。

在另一个实施例中，药物组合物可以有利地进一步包括药物试剂，如苯丁酸钠或buphenyl、苯甲酸钠、乳果糖、L-瓜氨酸和L-精氨酸和/或其任何衍生物。这些类型的组合可能会产生高度协同的治疗效果，因为EV会递送功能性尿素循环蛋白，然后这种药物试剂会增强这种效果。自然地，本发明的药物组合物特别适合用于治疗尿素循环存储障碍，但是也可以使用本文的发明来治疗涉及尿素循环的其它疾病。

本发明还涉及根据本发明的产生EV的方法，该方法包括：(i)将根据本发明的至少一种多核苷酸构建体引入产生EV的细胞中，以及(ii)在该产生EV的细胞中表达由该至少一种多核苷酸构建体编码的至少一种多肽构建体，从而通过直接表达为UCD蛋白或通过借助于该多肽构建体装载的多核苷酸的表达而产生包括至少一种尿素循环蛋白的所述EV。与外源装载相比，这种方法被称为内源装载。与EV的外源装载相比，内源装载的好处在于，其避免了多个制造步骤，多个制造步骤会导致产率降低和药物生产过程中不必要的复杂性。这种提高的装载效率适用于蛋白质和多核苷酸货物的装载。例如，通过外源装载方法，天然mRNA的内源装载比通常包括经修饰的核苷的人工mRNA的装载简单得多。此外，内源装载使蛋白质货物在装载到外泌体中之前能够进行适当的翻译后修饰。为了使蛋白质采用其最佳的三级或四级结构，需要进行翻译后修饰，因此，内源装载的蛋白质在递送时将处于其最佳确认状态，并因此在递送时具有更大的治疗效果。

在某些实施例中，使用单个多核苷酸构建体，而在其它实施例中，采用多于一个多核苷酸构建体。不希望受到任何理论的束缚，据推测，已经引入多核苷酸构建体(瞬时地引入或稳定地引入，这取决于EV的目的和用途)的产生EV的细胞将产生包括由多核苷酸编码的多肽构建体的EV(诸如外泌体)。然后可以任选地收集EV(通常从细胞培养基中收集)，并任选地在用于特定用途之前进一步纯化。在有利的实施例中，通过所述方法产生的EV进一步包括NA货物分子，其借助于融合多肽构建体被装载到EV中。通常，单个EV包括NA货物分子的几个拷贝，但是单个EV也可以包括多于一种类型的NA药物货物分子。

本发明的EV和/或本发明的药物组合物可以用于治疗一种或多种尿素循环障碍。另外，本发明的药物组合物也可以用于药物用途，该药物优选地用于治疗一种或多种尿素循环障碍。

在另一方面，本发明可以用于通过包括向哺乳动物施用组合物的方法来增加哺乳动物的肝、脑和/或外周细胞和/或任何其它细胞隔室中尿素循环蛋白的量，该组合物包含以下一种或多种：(i)EV、(ii)至少一种多肽构建体、(iii)至少一种多核苷酸构建体、(iv)至少一种载体和/或(iv)至少一种产生EV的细胞。此外，本发明还涉及在有需要的受试者中治疗UCD的方法，该方法包括以下步骤：(i)提供包括根据本发明的EV群体的药物组合物，以及(ii)将EV施用于患者。重要的是，如上所述，治疗干预可以可替代地包括向患者施用EV、多肽构建体、多核苷酸构建体、细胞和/或包括此类多核苷酸构建体的载体。这可以使用各种递送载体来完成，例如脂质纳米颗粒或聚合物或基于肽的递送载体。可以通过各种施用途径将组合物、EV、多核苷酸和/或多肽构建体施用于受试者，例如可以通过各种不同的施用途径将根据本发明的EV施用于人或动物受试者，例如耳廓(耳)、颊、结膜、皮肤、牙齿、电渗、宫颈内膜、鼻窦、气管内、肠内、硬膜外、羊膜外、体外、血液透析、浸润、间质、腹腔内、羊膜内、动脉内、关节内、胆道内、支气管内、法氏囊内、心内、软骨内、尾部内、海绵窦内、腔内、脑内、脑室内、脑池内、角膜内、冠状内(牙齿)、冠状动脉内、海绵体内、真皮内、椎间盘内、导管内，十二指肠内、硬膜内、表皮内、食道内、胃内、牙龈内、回肠内、病变内、管腔内、淋巴管内、髓内、脑膜内、肌内、眼内、卵巢内、心包内、腹膜内、胸膜内、前列腺内、肺内、窦内、脊柱内、滑膜内、腱内、睾丸内、鞘内、胸内、小管内、肿瘤内、鼓室内、子宫内、血管内、静脉内、静脉推注、静脉滴注、心室内、膀胱内、玻璃体内、离子电渗、冲洗、喉、鼻、鼻胃、封闭敷裹法、眼、口、口咽、其它、肠胃外、经皮、关节周、硬膜外、神经周、牙周、直肠、呼吸(吸入)、眼球后、软组织、蛛网膜下腔、结膜下、皮下、舌下、粘膜下、局部、透皮、透粘膜、经胎盘、经气管、经鼓室、输尿管、尿道和/或阴道施用，和/或上述施用途径的任何组合，这通常取决于待治疗的疾病和/或EV、多肽UCD蛋白和/或所讨论的NA货物分子或EV群体本身的特性。

本发明还可以用于至少一种货物蛋白或NA分子的细胞内递送的体外方法，该方法包括使靶细胞与至少一种根据本发明的EV和/或根据本发明的至少一种多核苷酸构建体接触。此类方法可以有利地在体外和/或离体进行。该方法可以包括以下步骤：使靶细胞与根据本发明的至少一种EV(或更常见地，根据本发明的EV群体)接触。此外，根据本发明的用于递送NA货物分子的方法还可以包括将编码本文的融合多肽的多核苷酸引入存在于任何生物系统(如人类)中的细胞中。

实例1——将mRNA装载到EV中

图3示出了与TAMEL装载构建体(CD63-MS2)相比，通过本发明的示例性构建体(CD63-PUF)将报告核酸(NanoLuc mRNA)装载到EV中的比较功效。

分别用CD63-PUF或CD63-MS2构建体进一步转染稳定产生报告mRNA(具有并入mRNA中的PUF结合位点或MS2结合位点的NanoLuc报告mRNA)的细胞。从这些细胞中生产并纯化EV，并使用NanoLuc报告测量装载到EV中的报告mRNA的水平。将外泌体蛋白CD63运输到外泌体/EV中，并且由于外泌体蛋白与RNA结合蛋白(在这种情况下为PUF或MS2)融合，这导致mRNA的相应结合位点被RNA结合蛋白结合，并因此与融合蛋白同时装载到EV中。

CD63-MS2构建体导致生物活性mRNA向EV中的装载增加了6倍。相比之下，CD63-PUF构建体导致生物活性mRNA向EV中的装载增加了169倍。与管家mRNA GAPDH的装载相比，计算倍数增加。这表明，与TAMEL CD63-MS2装载系统相比，CD63-PUF构建体可显著提高生物活性mRNA向EV中的装载。如上所述，据信，C63-MS2装载构建体无法装载生物活性mRNA，因为mRNA没有从MS2的紧密结合中释放出来，这意味着其根本不能被正确翻译。图3中的数据表明，与现有技术相比，本发明的CD63-PUF构建体克服了这个问题，并且向EV中递送了更高水平的生物活性mRNA。

实例2——将尿素循环蛋白装载到EV中

使用尿素生成测定法测量了从载有尿素循环蛋白ALS(精氨酸琥珀酸裂解酶)的HEK细胞获得的EV对尿素循环障碍模型的影响，其结果如图4所示。

尿素生成测定方法：

将WT-Huh7细胞在无血清系统中以每孔10k细胞进行培养。将来自用CD63-内含肽-ASL以1000、10000和100000个EV/细胞的浓度转染的HEK293细胞的EV与WT-Huh7细胞一起孵育48小时。洗涤样品，并将其与0.5、1或5mM氯化铵一起孵育24小时。从上清液和裂解物中测量尿素(数据来自上清液)。

在氯化铵中孵育细胞可模拟在缺乏尿素循环酶的细胞(如来自患有尿素循环障碍的患者的细胞)中积聚的过量氨，因此，这是测试本发明中公开的蛋白质替代疗法的简单模型。

图4显示，用载有ASL的EV处理的细胞比未经处理的细胞产生更多的尿素。由此可以证明，EV处理以生物学上有意义的水平向细胞提供了生物活性ASL，该细胞随后能够利用由EV提供的额外的ASL将大量的氨转化为尿素。由此可见，载有尿素循环蛋白的EV具有非常好的潜力，可以通过将功能性尿素循环蛋白递送给有需要的细胞来治疗患有尿素循环障碍的患者。

实例3——体外无细胞ASL酶活性测定

ASL催化精氨酸琥珀酸(ASA)与精氨酸的反应，从而生成富马酸作为副产物。图5示出了体外无细胞ASL酶活性测定的结果。比较了经ASL工程化的外泌体与WT外泌体和ASA对照处理产生的富马酸。

将底物ASA盐(Sigma)添加至用透化剂(Tween 20)处理的制剂中，并孵育18或21分钟。使用可从Abcam获得的比色试剂盒检测富马酸水平。从图5可以看出，在分别孵育18和21分钟后，与单独的ASA或WT外泌体相比，被工程化成含有ASL-Palm-内含肽的外泌体产生的富马酸酯的量显著增加。这表明ASL蛋白具有活性的并且通过内含肽的切割而释放。

实例4——体内ASL活性测定

在第15+/-1天，向ASL敲除小鼠给药载有ASL(作为Palm-内含肽-ASL或CD63-内含肽-ASL构建体的一部分)的外泌体、WT外泌体或媒剂处理。然后使用氨水测定试剂盒(Sigma)测试血氨水平。ASL基因敲除小鼠模型显示出升高的血氨水平，这是许多尿素循环障碍所共有的症状。

图6清楚地表明，被工程化成含有Palm-内含肽-ASL构建体或CD63-内含肽-ASL构建体的外泌体能够降低血氨水平。具体地说，palm-内含肽构建体能够将血氨水平降低至与WT小鼠相似的水平。这表明，ASL蛋白在体内由外泌体递送时具有生物学活性，而载有ASL的外泌体的体内递送能够仅在单次治疗后就将KO小鼠的血氨水平恢复到健康水平。