改变细胞培养物中产生的重组糖蛋白的糖基化谱的方法

摘要

本发明涉及一种改变细胞培养物中产生的重组糖蛋白的糖基化谱的方法，包括在细胞培养基中培养表达重组糖蛋白的真核细胞，其中细胞培养基补充了岩藻糖、锰和牛磺酸，其中所产生的重组糖蛋白的糖基化谱被改变，使得与没有所述补充培养时相比，更类似于参考糖蛋白的糖基化谱。

说明书

发明领域

本发明涉及一种改变细胞培养物中产生的重组糖蛋白的糖基化谱的方法，包括在细胞培养基中培养表达重组糖蛋白的真核细胞，其中细胞培养基补充了岩藻糖、锰和牛磺酸，其中所产生的重组糖蛋白的糖基化谱被改变，使得相比于没有所述补充培养时，更类似于参考糖蛋白的糖基化谱。

糖蛋白对于包括先天免疫系统和适应性免疫系统在内的免疫系统所有分支的正常功能是至关重要的。例如，糖蛋白经由补体依赖的细胞毒作用(CDC)和抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用(ADCC)参与威胁的识别、结合、信号转导和消除(Rudd等，Science，291，2001，2370-2376；和Jefferis等，Immunol Rev，163，1998，59-76)。

哺乳动物表达的抗体在其重链(HC)的Asn残基上带有单个聚糖。聚糖结构的存在和组成影响抗体的受体结合和效应子功能(Rudd等，Science，291，2001，2370-2376；和Jefferis等，Immunol Rev，163，1998，59-76)。例如，IgG的Fc区(Fcγ)的聚糖组成的变化有区别地影响Fc区和Fc结合受体(FcR)的结合亲和力。存在三类FcγR，即FcγRI、FcγRII和FcγRIII(Jefferis等，Immunol Rev，163，1998，59-76；Ravetch&Bolland，Annu RevImmunol，19，2001，275-290)。抗体和Fcγ受体的不同亲和力决定了宿主对特定抗原的免疫反应的命运，并且还可能负责了激活、抑制、抗体功效/半衰期、耐受性和自身免疫反应(Ravetch&Bolland，Annu Rev Immunol，19，2001，275-290)。抗体对不同类型受体的亲和力会根据其带有的聚糖的存在和组成而变化，因此突出了寡糖/蛋白质相互作用对抗体生物功能的重要性(Raju等，Glycobiology，10，2000，477-486；Jefferis等，Immunol Rev，163，1998，59-76)。

在真核生物(例如哺乳动物)宿主细胞中表达蛋白质后，蛋白质经历翻译后修饰，通常包括酶促添加糖残基，一般称为“糖基化”。多肽的糖基化通常是N-连接的或O-连接的。碳水化合物部分附着到天冬酰胺残基侧链称为N-连接的糖基化。三肽序列天冬酰胺(Asn)-X-丝氨酸(Ser)和天冬酰胺(Asn)-X-苏氨酸(Thr)是碳水化合物部分与天冬酰胺侧链酶促连接的识别序列(其中X是除脯氨酸以外的任何氨基酸)。N-乙酰半乳糖胺、半乳糖、岩藻糖、N-乙酰葡糖胺或木糖之一附着到羟基氨基酸(最常见的是丝氨酸或苏氨酸，尽管也可能涉及5-羟基脯氨酸或5-羟基赖氨酸)，被称为O-连接的糖基化。哺乳动物产生的蛋白质的糖基化模式可以细分为几组，包括复杂的、高甘露糖和混合结构，以及糖苷连接的寡糖(ThePlasma Proteins:Structure，Function and Genetic Control，Putnam,F.W.编辑，第2版，Vol.4，Academic Press，New York，1984，尤其是pp.271-315.)。

在过去的几十年里，大量研究集中在治疗性重组糖蛋白的生产上，如单克隆抗体。虽然文献中的一种方法是使用含有血清或水解物的培养基，但也开发了化学限定培养基以消除复杂成分的批次间差异问题(Luo和Chen，Biotechnology and Bioengineering，97(6):1654-1659(2007))。对细胞培养更好的理解允许了转向化学限定培养基而不影响生长、活力、滴度等。已经报道了效价高达7.5-10g/L的优化的化学限定过程(Huang等，Biotechnology Progress 26(5):1400-1410(2010)；Ma等，Biotechnology Progress 25(5):1353-1363(2009)；Yu等，Biotechnology and Bioengineering，108(5):1078-1088(2011))。通常，高效价化学限定过程是分批补料过程，培养时间为11-18天。

许多报告已经证明了与重组蛋白相关的N-聚糖的加工对于每个哺乳动物细胞都是特异性的(James等，Bio/Technology，13:592-596(1995)；Lifely等，Glycobiology，5:813-822(1995))。这些差异对治疗性糖蛋白的生产很重要，这不仅是由于直接影响重组糖蛋白的抗原性、体内清除率和稳定性(Jenkins等，Nature Biotechnol.14:975-981(1996))，而且由于任何给定的批准的治疗性糖蛋白都必须满足严格的监管标准。因此，重要的不仅是能够表征与治疗性重组糖蛋白结合的聚糖以预测体内安全性和有效性的后果，而且还在于能够了解支持在潜在的宿主细胞中的聚糖加工的细胞控制(Grabenhorst等，Glycoconjug.J.，16:81-97(1999)；James和Baker，Encyclopedia of bioprocesstechnology:Fermentation、biocatalysis and bioseparation.New York：John Wiley&Sons.p.1336-1349(1999))。

正如选择真核细胞用于生产治疗性重组糖蛋白(如单克隆抗体)一样，糖基化也高度依赖于细胞培养基和其他生产工艺参数(Ho等，BioProcess International；14(4):30-8(2016))。具体而言，已经表明了生长和补料培养基的组成(包括氨、谷氨酰胺、葡萄糖和金属离子的浓度)可以影响抗体糖基化(Hossler等，Glycobiol.19(9):936-946(2009))。因此，已经开发了通过补充生长培养基来控制重组糖蛋白的糖基化模式和/或谱的策略。例如，WO2017079165公开了将岩藻糖源，例如岩藻糖，补充到被工程化为缺乏GDP-酮-6-脱氧甘露糖-3,5-差向异构酶、4-还原酶或GDP-D-甘露糖-4,6-脱水酶活性的细胞的培养物中，以产生具有特定岩藻糖基化水平的糖蛋白。岩藻糖补充(单独使用(WO2017120359；WO2017120347)或结合烟酰胺使用(WO2017134667))已被用于减少无岩藻糖基化的糖型，即增加抗体的岩藻糖基化。锰补充(单独使用(WO2017021871；WO2015011660；WO2013114245)，结合铜使用(WO2016089919)，或结合铜、铁和锌使用(WO2015128314))已被用于增加无岩藻糖基化的糖型，即降低岩藻糖基化。锰也被用于控制治疗性单克隆抗体阿达木单抗(Adalimumab)的半乳糖基化谱(WO2012149197)。

因此，本领域需要鉴定可以预测地改变目标重组糖蛋白的糖基化谱以更类似于满足所有安全性、功效和监管标准的参考重组糖蛋白的方法。

发明人发现在细胞培养物中产生的重组糖蛋白的糖基化谱可以通过包括在补充有岩藻糖、锰和牛磺酸的细胞培养基中培养表达重组糖蛋白的真核细胞的方法来改变。通过发明的方法改变糖基化谱，使得所产生的重组糖蛋白的糖基化谱改变，相比于没有所述补充培养时，更类似于参考糖蛋白的糖基化谱。

本发明的目的通过独立权利要求的主题来解决。优选实施方案从从属权利要求是显而易见的。

因此，在一个实施方案中，本发明提供了一种改变细胞培养物中产生的重组糖蛋白的糖基化谱的方法，包括在细胞培养基中培养表达重组糖蛋白的真核细胞，其中细胞培养基补充了岩藻糖、锰和牛磺酸，其中改变了所产生的重组糖蛋白的糖基化谱，相比于没有所述补充培养时，更类似于参考糖蛋白的糖基化谱。

在一个实施方案中，改变的糖基化谱包括岩藻糖基化谱和/或半乳糖基化谱中的一个或多个。优选地，改变的岩藻糖基化谱是参考糖蛋白的岩藻糖基化谱的至少90％，优选至少95％，更优选至少96％，更优选至少98％和/或改变的半乳糖基化谱是参考糖蛋白的半乳糖基化谱的至少90％，优选至少95％，更优选至少96％，更优选至少98％。

在一个实施方案中，培养基中的岩藻糖浓度通过补充提高了0.4mM至1.6mM，优选0.4mM至1.2mM，更优选0.6mM至1mM和优选0.8mM。

在一个实施方案中，培养基中的锰浓度通过补充提高了0.02μM至0.1μM，优选0.04μM至0.08μM，更优选0.06μM至0.08μM，和最优选0.068μM±0.01μM。

在一个实施方案中，培养基中的牛磺酸终浓度在补充后为12.5mM至50mM，优选15mM至35mM，更优选20mM至30mM，和优选25mM。

在一个实施方案中，该方法进一步包括从细胞培养物分离所产生的重组糖蛋白的步骤。

在一个实施方案中，真核细胞是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。

在一个实施方案中，重组糖蛋白以大规模来生产。

在一个实施方案中，重组糖蛋白是IgG型免疫球蛋白。

在一个实施方案中，重组糖蛋白是单克隆抗体，任选是治疗性单克隆抗体。

在一个实施方案中，细胞培养进行14天。

在一个实施方案中，培养基的补充从培养进行的第3天开始每隔一天进行，任选直至培养的第13天。

在一个实施方案中，以氯化锰(MnCl

在一个实施方案中，在细胞培养物的生产期间进行培养基的补充。

在一个实施方案中，在37℃下进行细胞培养。

在一个实施方案中，在pH7.05±0.05下进行细胞培养。

在一个实施方案中，细胞培养是补料-分批培养。

在一个实施方案中，糖蛋白是VEGF拮抗剂，优选抗VEGF抗体。在这个实施方案中，改变的岩藻糖基化谱优选是参考VEGF拮抗剂(优选抗VEGF抗体)的岩藻糖基化谱的至少90％，优选至少95％，更优选至少96％，更优选至少98％和/或改变的半乳糖基化谱是参考VEGF拮抗剂(优选抗VEGF抗体)的半乳糖基化谱的至少90％，优选至少95％，更优选至少96％，更优选至少98％。

在一个实施方案中，糖蛋白是抗CD20抗体。在这个实施方案中，改变的岩藻糖基化谱优选是参考抗CD20抗体的岩藻糖基化谱的至少90％，优选至少95％，更优选至少96％，更优选至少98％和/或改变的半乳糖基化谱是参考抗CD20抗体的半乳糖基化谱的至少90％，优选至少95％，更优选至少96％，更优选至少98％。

图1：鸟苷、岩藻糖和甘露糖对本发明的抗VEGF抗体的总主要无岩藻糖基化(MAF)糖型的影响。结果来自培养的第12天。黑色条：不含培养基添加剂的对照批次。灰色条：补料两种不同浓度(20mM和60mM)的补充鸟苷的补料培养基的批次；斑点条：补料两种不同浓度(10mM和20mM)的补充岩藻糖的补料培养基的批次；斜条纹条：补料两种不同浓度(20mM和60mM)的补充甘露糖的补料培养基的批次。

图2：不同岩藻糖浓度对本发明的抗VEGF抗体的总主要无岩藻糖基化(MAF)糖型的影响。结果来自培养的第12天。黑色条：补料培养基未用岩藻糖补充的对照批次。灰色条：补料了补充10mM岩藻糖的补料培养基的批次；斑点条：补料了补充20mM岩藻糖的补料培养基的批次；斜条纹条：补料了补充40mM岩藻糖的补料培养基的批次。黑色线：本发明的参考抗VEGF抗体的总主要无岩藻糖基化(MAF)糖型的范围。

图3：不同牛磺酸浓度对本发明的抗VEGF抗体的总主要无岩藻糖基化(MAF)糖型的影响。结果来自培养的第14天。黑色条：未用补充牛磺酸的培养基的对照批次。灰色条：用补充了12.5mM牛磺酸的培养基培养的批次；斑点条：用补充了25mM牛磺酸的培养基培养的批次；斜条纹条：用补充了50mM牛磺酸的培养基培养的批次。黑色线：本发明的参考抗VEGF抗体的总主要无岩藻糖基化(MAF)糖型的范围。

图4：牛磺酸、岩藻糖和锰对本发明的抗VEGF抗体的总主要无岩藻糖基化(MAF)糖型的影响。结果来自培养的第14天。黑色条：用补充了1.7μM氯化锰的补料培养基补料但未用岩藻糖和牛磺酸补料的对照批次；灰色条：用补充了25mM牛磺酸的培养基培养并用补充了1.7μM氯化锰的补料培养基补料的但未用补充岩藻糖的补料培养基补料的批次；斑点条：用补充了25mM牛磺酸的培养基培养的并用补充了20mM岩藻糖和1.7μM氯化锰的补料培养基补料的批次。黑色线：本发明的参考抗VEGF抗体的总主要无岩藻糖基化(MAF)糖型的范围。

图5：本发明产生的抗VEGF抗体的总主要无岩藻糖基化谱(MAF)。结果分别来自从培养的第7天到第13天，或从培养的第7天到第14天的每日样品分析。黑色线：未用牛磺酸和岩藻糖但用补充了锰的补料培养基补料的对照批次；点划线：用补充了岩藻糖和锰的补料培养基补料的批次；虚线：用补充了牛磺酸的培养基培养的并用补充了锰的补料培养基补料的批次；点线：用补充了牛磺酸的培养基培养的并用补充了锰和岩藻糖的补料培养基补料的批次。灰色线：本发明的参考抗VEGF抗体的总主要无岩藻糖基化糖型的范围。

图6：本发明产生的抗VEGF抗体的非半乳糖基化糖型(G0)谱。结果分别来自从培养的第7天到第13天，或从培养的第7天到第14天的每日样品分析。黑色线：未用牛磺酸和岩藻糖但用补充了锰的补料培养基补料的对照批次；点划线：用补充了岩藻糖和锰的补料培养基补料的批次；虚线：用补充了牛磺酸的培养基培养的并用补充了锰的补料培养基补料的批次；点线：用补充了牛磺酸的培养基培养的并用补充了锰和岩藻糖的补料培养基补料的批次。灰色线：本发明的参考抗VEGF抗体的非半乳糖基化(G0)糖型的范围。

如以下说明性地描述的本发明可以在不存在本文未具体公开的任何一个或多个要素、一个或多个限制或限制的情况下适当地实施。

将关于特定的实施方案来描述本发明，但本发明不限于此，而是仅由权利要求来限制。

在本说明书和权利要求中使用术语“包含”的情况中，不排除其他要素。出于本发明的目的，术语“由……组成”被认为是术语“包含”的优选实施方案。如果在下文中将一组限定为包含至少特定数量的实施方案，则这意味着还包括优选地仅由这些实施方案组成的一组。。

在指代单数名词时使用不定冠词或定冠词的情况中，例如“一个(a)”、“一个(an)”或“该(the)”，除非另有说明，否则包括该名词的复数形式。

如本文所用的，术语“多肽”或“蛋白质”是指经由肽键连接在一起的连续氨基酸链。该术语用于指任何长度的氨基酸链，但本领域普通技术人员将理解该术语不限于长链，且可以指包含经由肽键连接在一起的两个氨基酸的最小链。如果单个多肽是离散的功能单元并且确实需要与其他多肽永久物理结合以形成离散的功能单元，则本文所用的术语“多肽”和“蛋白质”可互换使用。如果离散的功能单元由超过一个的彼此物理结合的多肽组成，则本文所用的术语“蛋白质”是指物理偶联并作为离散单元一起起作用的多个多肽。

术语“糖蛋白”在本文中用于指与至少一个碳水化合物部分(例如多糖或寡糖)偶联的多肽或蛋白质，所述碳水化合物部分经由氨基酸残基的含氧或含氮侧链附着到蛋白质，所述氨基酸残基例如丝氨酸或苏氨酸残基(“O-连接的”)或天冬酰胺残基(“N-连接的”)。“糖蛋白”在本文中以最宽泛的含义来使用，包括全长糖蛋白、基因工程糖蛋白、重组糖蛋白、嵌合糖蛋白、人源化糖蛋白、全人糖蛋白以及此类糖蛋白的片段，如肽，只要它们保持功能并呈现出所需的生物活性。糖蛋白的“生物活性”是指糖蛋白引发生物反应的能力，其可以在体外或体内测量。

术语“重组糖蛋白”是指通过重组方式制备、表达、形成或分离的所有糖蛋白，如从转基因宿主细胞(如，例如，NS0或CHO细胞)，或从对于糖蛋白基因是转基因的动物分离的糖蛋白，或使用转染至宿主细胞(如，例如，SP 2/0小鼠骨髓瘤细胞)中的重组表达载体表达的糖蛋白。

术语“聚糖”是指多糖或寡糖，例如由单糖组成的聚合物。聚糖可以是单糖残基的均聚物或杂聚物，并且可以是直链或支链的。在真核生物(例如，哺乳动物)宿主细胞中表达蛋白质后，蛋白质经过翻译后修饰，通常包括酶促添加糖残基，如聚糖。这种糖残基(例如聚糖)的添加，在本文中称为“糖基化”。“N-连接的聚糖”是指连接到天冬酰胺残基侧链的聚糖。“O-连接的聚糖”是指与羟基氨基酸连接的聚糖，最常见的是丝氨酸或苏氨酸，但也可能涉及5-羟基脯氨酸或5-羟基赖氨酸。糖基化包括例如半乳糖基化和/或岩藻糖基化。

如本文所用的，目标重组糖蛋白的“糖基化模式”是指糖蛋白的多糖或寡糖的各种物理特性，如，例如存在的各种单糖的数量和质量、分支的程度和/或连接(例如，N-连接的或O-连接的)。糖蛋白的“糖基化模式”也可以指由糖蛋白的寡糖和多糖赋予的功能特性。例如，糖蛋白可以结合FcγRIIIa并诱导抗体依赖的细胞的细胞毒作用(ADCC)的程度。

如本文使用的，目标重组糖蛋白的“糖基化谱”或“糖基化程度”是指存在的各种单糖的数量。在目的糖蛋白的不同生产的批次之间，例如，生物仿制的治疗性糖蛋白及其参考产品糖蛋白之间，糖基化谱可能变动。尽管在监管标准内可能允许某种程度的糖基化谱改变，而无需进行新的临床试验来批准治疗性糖蛋白生物仿制药，但最理想的是尽可能地匹配参考糖蛋白的糖基化谱，从而将安全性和功效也保持在尽可能接近参考糖蛋白的水平上。重组糖蛋白的糖基化谱可以包括例如重组糖蛋白的岩藻糖基化谱和/或半乳糖基化谱。

术语“岩藻糖基化”是指岩藻糖残基在多糖和寡糖(例如，N-聚糖、O-聚糖和糖脂)上的程度和分布。术语“岩藻糖基化谱”或“岩藻糖基化度”是指多糖和寡糖(例如N-聚糖、O-聚糖和糖脂)上岩藻糖残基的数量。具有非岩藻糖基化或“无岩藻糖基化”N-聚糖的治疗性糖蛋白，例如抗体或Fc融合蛋白，由于FcγRIIIa结合能力的增强，呈现出显著增强的抗体依赖的细胞的细胞毒作用(ADCC)，而没有任何可检测到的补体依赖的细胞毒作用(CDC)或抗原结合能力的变化。在某些情况中，例如癌症治疗，非岩藻糖基化或“无岩藻糖基化”抗体，即具有低“岩藻糖基化谱”的抗体，是理想的，因为它们可以在低剂量下实现治疗功效，同时诱导针对肿瘤细胞的高细胞毒性，并且通过增强的与FcγRIIIa的相互作用，在自然杀伤(NK)细胞中触发高效应子功能。在其他情况中，例如炎症或自身免疫性疾病的治疗，增强的ADCC和FcγRIIIa的结合是不合乎需要的，并且因此，在其N-聚糖中具有较高高水平的岩藻糖残基，即较高的岩藻糖基化谱的治疗性糖蛋白可能是优选的。在目的糖蛋白的不同生产的批次之间，例如，生物仿制的治疗性糖蛋白及其参考产品糖蛋白之间，岩藻糖基化谱可能变动。尽管在监管标准内可能允许某种程度的岩藻糖基化谱改变，而无需进行新的临床试验来批准治疗性糖蛋白生物仿制药，但最理想的是尽可能地匹配参考糖蛋白的岩藻糖基化谱，从而将安全性和功效也保持在尽可能接近参考糖蛋白的水平上。

“半乳糖基化”是指是指半乳糖残基在多糖和寡糖(例如，N-聚糖、O-聚糖和糖脂)上的类型和分布。术语“半乳糖基化谱”或“半乳糖基化度”是指多糖和寡糖(例如N-聚糖、O-聚糖和糖脂)上半乳糖残基的数量。“半乳糖”是指一组单糖，包括开链和环状形式。一种重要的半乳糖双糖形式是半乳糖-α-1,3-半乳糖(a-gal)。在目的糖蛋白的不同生产的批次之间，例如，生物仿制的治疗性糖蛋白及其参考产品糖蛋白之间，半乳糖基化谱可能变动。尽管在监管标准内可能允许某种程度的半乳糖基化谱改变，而无需进行新的临床试验来批准治疗性糖蛋白生物仿制药，但最理想的是尽可能地匹配参考糖蛋白的半乳糖基化谱，从而将安全性和功效也保持在尽可能接近参考糖蛋白的水平上。

术语“改变糖基化谱”、“改变岩藻糖基化谱”和“改变半乳糖基化谱”是指，重组糖蛋白在第一组培养条件(例如，细胞培养基中存在岩藻糖、锰和/或牛磺酸)下生产时，分别与第二组培养条件(例如，细胞培养基中不存在岩藻糖、锰和/或牛磺酸)下生产时的同一重组糖蛋白的糖基化谱、岩藻糖基化谱和半乳糖基化谱相比糖基化谱、岩藻糖基化谱和半乳糖基化谱各自的变化。相对于在第二组培养条件下获得的曲线，在第一组培养条件下获得的糖基化谱、岩藻糖基化谱和/或半乳糖基化谱可以增加或减少。优选，改变通过第一组培养条件获得的糖基化谱、岩藻糖基化谱和/或半乳糖基化谱，以分别比在第二组培养条件下获得的糖基化谱、岩藻糖基化谱和/或半乳糖基化谱糖更类似于参考糖蛋白各自的糖基化谱、岩藻糖基化谱和/或半乳糖基化谱。更优选，改变糖基化谱、岩藻糖基化谱和/或半乳糖基化谱，以分别为参考糖蛋白的糖基化谱、岩藻糖基化谱和/或半乳糖基化谱的至少90％，还更优选至少95％，更优选至少96％，最优选至少98％。

如本文所用的，术语“参考糖蛋白”、“参考VEGF拮抗剂”、“参考抗VEGF抗体”或“参考抗CD20抗体”是指与在相关细胞培养物中产生的相同糖蛋白、拮抗剂或目标抗体，其可期望与目标糖蛋白的糖基化谱、岩藻糖基化谱和/或半乳糖基化谱匹配或更相似。例如，参考糖蛋白、拮抗剂或抗体可具有有用的特性，如稳定性、功效、安全性和/或与给定的糖蛋白、拮抗剂或抗体相关的其他特性。参考糖蛋白、拮抗剂或抗体可以是，例如，已获得监管批准用于受试者(例如，人受试者)治疗用途的糖蛋白、拮抗剂或抗体。在这种情况中，在改变糖基化谱、岩藻糖基化谱和/或半乳糖基化谱的方法中产生的糖蛋白可以是生物仿制药。

如本文所用的，术语“培养物”、“细胞培养物”和“真核细胞培养物”是指在适于细胞群体存活和/或生长的条件下在细胞培养基中维持或生长的真核细胞群体，是贴壁的或悬浮的。如本文所用的，这些术语可指包含哺乳动物细胞群体和该群体悬浮于其中的细胞培养基的组合。细胞培养可以是例如连续培养、分批培养、补料分批培养或其他培养类型。

如本文使用的术语“介质”、“培养基”、“细胞培养基”、“培养基”、“组织培养基”、“组织培养介质”和“生长培养基”是指含有营养物的溶液，其支持培养的真核细胞的生长。通常，这些溶液提供细胞最小生长和/或存活需要的必需和非必需氨基酸、维生素、能量源、脂质和微量元素。该溶液还可以含有增强生长和/或存活超过最小速率的组分，包括激素和生长因子。该溶液可以配制为对于细胞存活和增殖最佳的pH和盐浓度。该培养基也可以是“限定培养基”或“化学限定培养基”，不含蛋白质、水解物或未知组成的成分的无血清培养基。限定培养基不含动物源性成分，并且所有成分具有已知的化学结构。限定培养基可以包含重组糖蛋白或蛋白质，例如，但不限于，激素、细胞因子、白介素和其他信号传输分子。

培养基基本不含来自任何哺乳动物源的血清或其级分(例如，基本上不含胎牛血清(FBS))时，细胞培养基通常是“无血清的”。“基本上不含”表示细胞培养基包含约0-5％血清，优选约0-1％血清，且最优选约0-0.1％血清。有利地，可以使用无血清限定培养基，其中培养基中每种成分的性质和浓度是已知的(即，培养基中不存在未限定的成分，如真核细胞提取物)。

可以在适于待培养的特定细胞的任何培养基中进行本发明的细胞培养。在一些实施方案中，培养基含有例如无机盐、碳水化合物(例如，糖类，如葡萄糖、半乳糖、麦芽糖或果糖)、氨基酸、维生素(例如，B族维生素(例如，B12)、维生素A、维生素E、核黄素、硫胺素和生物素)、脂肪酸和脂质(例如，胆固醇和类固醇)、蛋白质和肽(例如，白蛋白、转铁蛋白、纤连蛋白和胎球蛋白)、血清(例如，包含白蛋白、生长因子和生长抑制剂的组合物，如胎牛血清、新生小牛血清和马血清)、微量元素(例如，锌、铜、硒和三羧酸中间体)、水解物(源自植物或动物来源的水解蛋白)，及其组合。可商购的培养基，如5x-浓缩DMEM/F12(Invitrogen)、CDOptiCHO feed(Invitrogen)、CD EfficientFeed(Invitrogen)、Cell Boost(HyClone)、BalanCD CHO Feed(Irvine Scientific)、BD Recharge(Becton Dickinson)、CellventoFeed(EMD Millipore)、Ex-cell CHOZN Feed(Sigma-Aldrich)、CHO Feed BioreactorSupplement(Sigma-Aldrich)、SheffCHO(Kerry)、Zap-CHO(Invitria)、ActiCHO(PAA/GEHealthcare)、Ham's F10(Sigma)、最小必需培养基([MEM]，Sigma)、RPMI-1640(Sigma)和Dulbecco's改良Eagle's培养基([DMEM]，Sigma)是适于本发明方法的示例性细胞培养基。此外，Ham和Wallace(1979)Meth.Enz.、58:44；Barnes和Sato(1980)Anal.Biochem.102:255；U.S.Pat.No.4,767,704；4,657,866；4,927,762；5,122,469或4,560,655；国际公开号WO 90/03430和WO 87/00195中描述的任何培养基可以用作培养基。这些培养基中的任何一种按照需要补充激素和/或其他生长因子(如胰岛素、转铁蛋白或表皮生长因子)、盐类(如氯化钠、钙、镁和磷酸盐)、缓冲剂(HEPES)、核苷类(如腺苷和胸苷)、抗生素(如庆大霉素)、微量元素(定义为通常以微摩尔范围的终浓度存在的无机化合物)、脂质(如亚油酸或其他脂肪酸)及其合适的载体，以及葡萄糖或等效能源。在一些实施方案中，培养基是无血清培养基、无蛋白质培养基或化学限定培养基。也可以以本领域技术人员已知的适当浓度包括任何其他必要的补充剂。

如本文使用的术语“基础介质制剂”、“基础培养基”或“基础介质”是指用于培养细胞的任何细胞培养基，其未通过补充或选择性去除特定的一种或多种成分而改变。

如本文使用的术语“补料培养基”、“补料介质”或“补料”是指在细胞培养开始后添加的任何细胞培养基。它通常比细胞培养开始时使用的细胞培养基浓度更高，并且用于补充用完的营养物或为细胞培养提供补充剂或添加剂。

术语“补充(supplementation)”、“补充(supplementing)”或“补充(supplemented)”是指向细胞培养基(例如基础培养基或补料培养基)中添加添加剂或补充剂。如本文所用的，术语“添加剂”或“补充剂”是指为实现本公开中描述的目的而对基础培养基或补料培养基进行的任何补充。添加剂或补充剂可以包括单一物质，例如牛磺酸、锰或岩藻糖，或可以包括多种物质，例如岩藻糖和牛磺酸、岩藻糖和锰、牛磺酸和锰、或岩藻糖、锰和牛磺酸。术语“添加剂”或“补充剂”是指所有添加的成分，即使它们不需要同时添加，也不需要以相同的方式添加。例如，添加剂或补充剂的一种或多种成分可以作为来自储液的单一丸剂或两种或更多种丸剂加入，而相同添加剂或补充剂的其他成分可以作为补料培养基的一部分加入。补充剂的添加也可以连续或半连续发生。此外，添加剂或补充剂中的任何一种或多种成分可以从细胞培养开始就存在于基础培养基中。因此，补充可以发生在培养开始时，和/或培养开始后，例如在生长期和/或生产期的过程中进行。

如本文使用的术语“提高”或“提高了”表示通过补充后将该补充剂或添加剂补充至较高浓度，用所述补充剂补充前的添加剂或补充剂的浓度提高了。即，与用补充剂或添加剂补充前相比，补充限定量后的细胞培养基具有更高的补充剂或添加剂浓度。

术语细胞培养物的“生长期”是指指数细胞生长阶段(对数期)，在该阶段细胞通常快速分裂。细胞培养物的细胞生长周期的确定可以针对预想的特定细胞进行确定，而无需过多的实验。在生长期过程中，细胞在含有必需添加剂的细胞培养基中，通常在约25℃-40℃，优选在37℃，在受控气氛中培养，从而实现特定细胞(例如细胞系的细胞)的最佳生长。细胞维持在指数生长期约一到五天的时间段，例如两到四天之间，例如四天。例如，如果将培养物保持在本发明/如上所述的生长条件下，生长期的长度将是足以使特定细胞繁殖至活细胞密度在最大可能活细胞密度的约20％-80％范围内的时间段。

细胞培养物的“生产期”或“蛋白质生产期”是指细胞生长达到稳定期时的时间段。在生产期过程中，对数细胞生长已经结束，并且蛋白质生产是细胞培养的主要活动。在这个时间段期间，通常补充培养基以支持持续的蛋白质生产并获得所需的糖蛋白产品。生产期通常从培养的第5天开始并持续到培养结束，优选地直到培养的第14天。

如本文使用的术语“细胞活力”是指培养中的细胞在给定的一组培养条件或实验性变化下存活的能力。本文使用的术语还指在特定时间相对于当时培养物中的活细胞和死细胞总数的存活的细胞部分。如本文所用的，术语“细胞密度”或“活细胞密度”是指存在于给定体积的培养基中的活细胞的数量。

如本文所用的，术语“分批培养”是指一种培养细胞的方法，其中在培养过程开始时提供最终用于培养细胞的所有成分，包括培养基以及细胞本身。分批培养通常在某个时间点停止并且收集培养基中的细胞和/或成分并任选进行纯化。

如本文使用的，术语“补料-分批培养”是指一种培养细胞的方法，其中在培养过程开始后的某个时间向培养物提供额外的成分。可以使用例如基础培养基开始补料分批培养。在培养过程开始后的某个时间向培养物提供附加成分的培养基是“补料培养基”或“补料溶液”。补料分批培养通常在某个时间点停止并且收集培养基中的细胞和/或成分并任选进行纯化。

如本文所用，术语“连续培养”或“灌注培养”是指一种培养细胞的方法，其中在培养过程开始后连续或半连续地向培养物提供附加成分。所提供的成分通常包括用于细胞的在培养过程中已经耗尽的营养补充剂。通常在连续或半连续的基础上收集培养基中的部分细胞和/或成分并任选进行纯化。

细胞培养通常在生物反应器中进行。如本文使用的术语“生物反应器”是指用于哺乳动物细胞培养物生长的任何容器。根据培养规模，生物反应器可以是任何尺寸的，只要可用于哺乳动物细胞的培养。通常，生物反应器将至少为500毫升，并且可以是1、10、50、100、250、500、1,000、2,000、2,500、3,000、5,000、8,000、10,000、12,0000、15,000、20,000升或更大，或其中之间的任何体积。例如，生物反应器将为10至5,000升，10至10,000升，10至15,000升，10至20,000升，50至5,000升，50至10,000升，50至15,000升，50至20,000升，1,000至5,000升或1,000至3,000升。生物反应器可以是搅拌罐生物反应器或摇瓶。生物反应器的内部条件，包括例如pH和温度通常在培养期间受到严格控制。生物反应器可以由适于在本发明的培养条件下将哺乳动物细胞培养物保持悬浮在培养基中的任何材料组成，包括玻璃、塑料或金属。如本文所用的，术语“生产生物反应器”是指用于生产目的糖蛋白或蛋白质的最终生物反应器。

本文所用的术语“大规模细胞培养”或“大规模生产”是指在通常具有至少500或1,000升，优选至少为5,000或8,000升，且最优选10,000或20,000体积的生产生物反应器中的细胞培养。

术语“抗体”或“免疫球蛋白”在本文中可互换使用并具有最宽泛的含义，且包括全长抗体、基因工程抗体、重组抗体、多价抗体、单克隆抗体、多克隆抗体、双特异性抗体、多特异性抗体、嵌合抗体、人源化抗体、完全人抗体以及此类抗体的片段，只要它们保持生物功能并呈现出所需的生物活性。抗体的“生物活性”是指抗体与抗原结合并产生生物反应的能力，其可以在体外或体内测量。

天然产生的抗体是具有不同结构的分子。例如，天然IgG抗体是约150,000道尔顿的杂四聚糖蛋白，由二硫键连接的两条相同的轻链和两条相同的重链组成。从N-至C-末端，每条重链具有可变结构域(VH)，也称为可变重链结构域或重链可变结构域，接着是三个或四个恒定结构域(CH1、CH2、CH3和任选的CH4)。相似地，从N-至C-末端，每条轻链具有可变结构域(VL)，也称为可变轻链结构域或轻链可变结构域，接着是恒定轻链(CL)结构域。抗体的轻链，基于其恒定结构域的氨基酸序列，可以被确定为称为kappa(κ)和lambda(λ)的两种类型之一。

“全长抗体”包含轻链(V

术语“抗体片段”或“抗原结合片段”在本文中以最宽的含义来使用并且包含全长抗体的一部分，优选包含其抗原结合区或可变区。抗体片段保留了亲本免疫球蛋白的原始特异性。抗体片段的实例包括例如Fab、Fab'、F(ab')

“单克隆抗体”是对抗原的单个表位具有特异性的抗体，即针对抗原上的单个决定簇。产生单克隆抗体的方法是本领域技术人员已知的。

术语“重组抗体”是指通过重组方式制备、表达、形成或分离的所有抗体，如从转基因宿主细胞(如，例如，NS0或CHO细胞)，或从对于免疫球蛋白基因是转基因的动物分离的抗体，或使用转染至宿主细胞(如，例如，SP 2/0小鼠骨髓瘤细胞)中的重组表达载体表达的抗体。

本发明的抗体或免疫球蛋白优选是IgG分子，如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4分子。更优选，免疫球蛋白是IgG1。甚至更优选，免疫球蛋白是其中至少Fc部分是人的IgG1。

“嵌合抗体”，例如，鼠-人嵌合抗体是其中Fc部分是人的而可变区是小鼠来源的抗体。

在本发明的一个实施方案中，嵌合抗体是利妥昔单抗(rituximab)或英夫利昔单抗(infliximab)。

利妥昔单抗是嵌合抗CD20抗体，其详细描述于例如WO 94/11026中。

英夫利昔单抗是嵌合抗TNFα抗体，其详细描述于例如WO 92/16553中。

“人源化抗体”是其中抗原结合部分(互补决定区(CDR))源自非人物种(如小鼠)的人抗体，并且因此与亲本免疫球蛋白相比，具有不同的特异性。CDR蛋白序列可以改进，以提高它们与人类中自然产生的抗体变体的相似性。

在本发明的一个实施方案中，人源化抗体是曲妥珠单抗(trastuzumab)或贝伐单抗(bevacizumab)。

曲妥珠单抗是人源化抗-HER2抗体，其详细描述于例如WO 92/22653中。

贝伐单抗是人源化抗-VEGF抗体，其详细描述于例如WO 98/45331中。

“完全人抗体”是其中所有部分都源自人来源的抗体。

在本发明的一个实施方案中，人抗体是阿达木单抗(adalimumab)或地诺单抗(denosumab)。

阿达木单抗是人抗TNFα抗体，其详细描述于例如WO 97/29131中。

地诺单抗是人抗RANKL抗体，其详细描述于例如WO 03/002713中。

在优选实施方案中，抗体是利妥昔单抗或贝伐单抗。

术语“治疗性抗体”是指用于治疗疾病的抗体。治疗性抗体可以具有多种作用机制。治疗性抗体可以结合并中和与抗原相关的靶标的正常功能。例如，阻断癌细胞存活所需蛋白质活性的单克隆抗体会导致细胞死亡。另一种治疗性单克隆抗体可以结合并激活与抗原相关的靶标的正常功能。例如，单克隆抗体可以结合细胞上的蛋白质并触发细胞凋亡信号。还有一种单克隆抗体可以与仅在患病组织上表达的靶抗原结合；将毒性有效载荷(有效药剂)，如化疗剂或放疗剂与单克隆抗体结合，可以产生一种药剂，用于将毒性有效载荷特异性递送至患病组织，从而减少对健康组织的伤害。治疗性抗体的“生物功能片段”将呈现出归因于完整抗体的生物学功能中的至少一种，如果不是部分或全部的话，该功能至少包括与靶抗原的特异性结合。

术语“摩尔渗透压浓度”是水溶液中溶解的溶质颗粒的渗透压的量度。溶质颗粒包括离子和非电离分子。摩尔渗透压浓度表示为溶解在1kg水中的渗透活性颗粒(即渗透压摩尔)的浓度(37℃下1mOsm/kgH

“容量摩尔渗透压浓度”是指溶解在1升溶液中的溶质颗粒的数量。因此，将溶质，如补充剂，例如岩藻糖、锰和/或牛磺酸添加到培养基中将增加其容量摩尔渗透压浓度。通常，给定的细胞培养物需要细胞培养基的最佳容量摩尔渗透压浓度范围，因此摩尔渗透压浓度必须稳定地保持在该最佳摩尔渗透压浓度范围内。在本文中使用时，缩写“mOsm”表示“毫渗透压摩尔/kg H

如本文所用的，术语“效价”是指由细胞培养物产生的重组表达的糖蛋白的总量除以给定量的培养基体积。效价通常以每毫升培养基的糖蛋白毫克数为单位或以每升培养基的糖蛋白克数为单位来表示。

如本文使用的术语“分离(isolating)”、“分离(isolate)”、“分离(isolated)”、“纯化(purify)”、“纯化(purifying)”和“纯化(purified)”是指从构成其中产生重组糖蛋白的细胞培养物中的重组糖蛋白除去或分离部分或全部细胞、细胞碎片、细胞培养基、细胞培养基成分和其他材料。一般而言，通常需要分离细胞培养物中产生的糖蛋白。糖蛋白可以，例如，分泌到培养基中，因此可以除去细胞和其他固体，例如，通过离心或过滤，作为分离过程的第一步。或者，表达的糖蛋白可以结合细胞培养物的细胞的表面。在这个实施方案中，除去培养基并将表达糖蛋白的细胞裂解作为纯化过程的第一步。哺乳动物细胞的裂解可以通过本领域普通技术人员公知的任何一种方式来实现，包括通过玻璃珠的物理破坏和暴露于高pH条件。可以通过标准方法来分离和/或纯化糖蛋白，例如，色谱(例如，离子交换、亲和、尺寸排阻和羟磷灰石色谱)、凝胶过滤、离心、差异溶解度、乙醇沉淀，或通过任何其他可用于蛋白质纯化的技术(参见，例如，Scopes，Protein Purification Principles andPractice，第2版，Springer-Verlag,New York,1987；Higgins,S.J.和Hames,B.D.(编辑)，Protein Expression:APractical Approach,Oxford Univ Press,1999；和Deutscher,M.P.,Simon,M.I.,Abelson,J.N.(编辑)，Guide to Protein Purification:Methods inEnzymology(Methods in Enzymology Series,Vol 182)，Academic Press，1997)。特别是对于免疫亲和色谱，可以通过结合亲和柱来分离糖蛋白，该亲和柱包含针对该蛋白质产生并固定于固定支持物上的抗体。或者，可以通过标准重组技术将亲和标签(如流感外壳序列、聚组氨酸或谷胱甘肽-S-转移酶)连接到糖蛋白上，以便通过经过适当的亲和柱进行纯化。蛋白酶抑制剂(如苯甲基磺酰氟(PMSF)、亮抑酶肽、胃酶抑素或抑肽酶)可以在任何或所有阶段加入，以减少或消除分离和/或纯化过程中糖蛋白的降解。必须裂解细胞以分离和纯化表达的糖蛋白时，特别需要蛋白酶抑制剂。本领域普通技术人员将理解确切的分离和/或纯化技术将根据待分离和/或纯化的糖蛋白的特征、表达糖蛋白的细胞的特征和细胞生长的培养基的组成而变化。

在需要调节糖基化谱的情况下，例如为了减少细胞培养物中产生的重组糖蛋白的无岩藻糖基化糖型的量，例如为了减少糖蛋白的ADCC和/或产生具有与参考糖蛋白相似的岩藻糖基化谱的糖蛋白，可以向细胞培养物中补充岩藻糖(参见实施例2)。然而，岩藻糖的添加也可导致所产生的糖蛋白的半乳糖基化谱降低，这又可能导致不合需要的糖基化和/或半乳糖基化谱，因为它与参考糖蛋白相比，糖基化和/或半乳糖基化谱，和/或从所产生糖蛋白的生物活性、安全性和/或功效的角度，不相似(另见Raju和Jordan.MAbs.5月1日；4(3):385-391(2012))。

作为半乳糖基化降低的对策，可以在细胞培养过程中进一步补充锰。虽然这种额外补充的锰改变了所产生的糖蛋白的半乳糖基化谱，从而不会引起仅补充岩藻糖所观察到的降低，即半乳糖基化谱相似于/更类似于参考糖蛋白的半乳糖基化谱，但它也导致/增加培养物的摩尔渗透压浓度提高。这种摩尔渗透压浓度的提高，除了由长时间的细胞培养(例如11-18天的持续时间，例如13-15天，例如14天)引起的相对高的摩尔渗透压浓度外，还增加了所产生的糖蛋白的量，这转而增加了无岩藻糖基化糖型的形成，即它导致糖蛋白的岩藻糖基化谱的降低(参见实施例3)。这当然与通过初始补充岩藻糖所达到的效果完全相反，并且相反于与本领域先前进行的观察，即较高的摩尔渗透压浓度(无关于引起的溶质)导致无岩藻糖基化糖型降低，即岩藻糖基化糖型增加(Konno等，Cytotechnology 64(3)：249-65(2012))。

为了抵消在用岩藻糖和锰补充细胞培养物时观察到的这种不希望的无岩藻糖基化糖型的增加，尝试进一步补充牛磺酸作为渗透保护剂(参见实施例4)。令人惊讶地发现了牛磺酸不仅可以用于稳定细胞培养物的摩尔渗透压浓度，而且还可以进一步降低所产生的糖蛋白的无岩藻糖基化糖型的形成，即增加岩藻糖基化谱(参见实施例5)。因此，细胞培养基补充岩藻糖、锰和牛磺酸可以改变细胞培养物中产生的糖蛋白的糖基化谱，包括岩藻糖基化和/或半乳糖基化谱，以比没有补充时相比，更类似于参考糖蛋白。与本领域常用的渗透保护剂(如甜菜碱)相反，使用牛磺酸还具有增加生产效价的额外益处(WO2017024062)。

因此，在一个实施方案中，本发明提供了一种改变细胞培养物中产生的重组糖蛋白的糖基化谱的方法，包括岩藻糖基化谱和/或半乳糖基化谱中的一种或多种，该方法包括在细胞培养基中培养表达重组糖蛋白的真核细胞，和其中细胞培养基补充岩藻糖、锰和牛磺酸，其中所产生的重组糖蛋白的糖基化谱，包括岩藻糖基化谱和/或半乳糖基化谱中的一种或多种被改变，使得与没有所述补充培养时相比，更类似于参考糖蛋白的糖基化谱，包括岩藻糖基化谱和/或半乳糖基化谱中的一种或多种。

在一个实施方案中，本发明提供了一种改变细胞培养物中产生的重组糖蛋白的岩藻糖基化谱的方法，该方法包括在细胞培养基中培养表达重组糖蛋白的真核细胞，其中细胞培养基补充岩藻糖、锰和牛磺酸，和其中所产生的重组糖蛋白的岩藻糖基化谱被改变，使得与没有所述补充培养时相比，更类似于参考糖蛋白的岩藻糖基化谱。优选，改变的岩藻糖基化谱是参考糖蛋白的岩藻糖基化谱的至少90％，优选至少95％，更优选至少96％，更优选至少98％。优选，改变的岩藻糖基化谱是参考糖蛋白的岩藻糖基化谱的至少98％。

在另一个实施方案中，本发明提供了一种改变细胞培养物中产生的重组糖蛋白的半乳糖基化谱的方法，该方法包括在细胞培养基中培养表达重组糖蛋白的真核细胞，其中细胞培养基补充岩藻糖、锰和牛磺酸，和其中所产生的重组糖蛋白的半乳糖基化谱被改变，使得与没有所述补充培养时相比，更类似于参考糖蛋白的半乳糖基化谱。优选，改变的半乳糖基化谱是参考糖蛋白的半乳糖基化谱的至少90％，优选至少95％，更优选至少96％，更优选至少98％。

在再另一个优选的实施方案中，本发明提供了一种改变细胞培养物中产生的重组糖蛋白的岩藻糖基化谱和半乳糖基化谱的方法，该方法包括在细胞培养基中培养表达重组糖蛋白的真核细胞，其中细胞培养基补充岩藻糖、锰和牛磺酸，和其中所产生的重组糖蛋白的岩藻糖基化谱和半乳糖基化谱被改变，使得与没有所述补充培养时相比，更类似于参考糖蛋白的岩藻糖基化谱和半乳糖基化谱。优选，改变的岩藻糖基化谱是参考糖蛋白的岩藻糖基化谱的至少90％，优选至少95％，更优选至少96％，更优选至少98％和改变的半乳糖基化谱是参考糖蛋白的半乳糖基化谱的至少90％，优选至少95％，更优选至少96％，更优选至少98％。

在一个实施方案中，培养基中的岩藻糖浓度通过补充提高0.4mM至1.6mM，例如0.4、0.44、0.48、0.52、0.56、0.6、0.64、0.68、0.72、0.76、0.8、0.84、0.88、0.92、0.96、1、1.04、1.08、1.12、1.16、1.2、1.24、1.28、1.32、1.36、1.4、1.44、1.48、1.52、1.56或1.6mM。在优选实施方案中，培养基中的岩藻糖浓度通过补充提高0.4mM至1.2mM，例如0.4、0.44、0.48、0.52、0.56、0.6、0.64、0.68、0.72、0.76、0.8、0.84、0.88、0.92、0.96、1、1.04、1.08、1.12、1.16或1.2mM。在优选实施方案中，培养基中的岩藻糖浓度通过补充提高0.6mM至1mM，例如0.6、0.64、0.68、0.72、0.76、0.8、0.84、0.88、0.92、0.96或1mM。在最优选的实施方案中，培养基中的岩藻糖浓度通过补充提高0.8mM。

优选，通过作为补料培养基一部分的补充来实现上述岩藻糖的补充，其中补料培养基中的岩藻糖浓度为10mM至40mM，例如10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40mM。在优选实施方案中，补料培养基中的岩藻糖浓度为10mM至30mM，例如10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30mM。在优选实施方案中，补料培养基中的岩藻糖浓度为15mM至25mM，例如15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25mM。在最优选的实施方案中，补料培养基中的岩藻糖浓度为20mM。

在一个实施方案中，本发明提供了一种改变细胞培养物中产生的重组糖蛋白的糖基化谱的方法，该方法包括在细胞培养基中培养表达重组糖蛋白的真核细胞，其中细胞培养基补充了岩藻糖、锰和牛磺酸，使得细胞培养基中的岩藻糖浓度提高0.4mM至1.6mM，更优选提高0.4mM至1.2mM，再更优选提高0.6mM至1mM，最优选提高0.8mM，和其中所产生的重组糖蛋白的糖基化谱被改变，使得与没有所述补充培养时相比，更类似于参考糖蛋白的糖基化谱。

在一个实施方案中，本发明提供了一种改变细胞培养物中产生的重组糖蛋白的岩藻糖基化谱的方法，该方法包括在细胞培养基中培养表达重组糖蛋白的真核细胞，其中细胞培养基补充了岩藻糖、锰和牛磺酸，使得细胞培养基中的岩藻糖浓度提高0.4mM至1.6mM，更优选提高0.4mM至1.2mM，再更优选提高0.6mM至1mM，最优选提高0.8mM，和其中所产生的重组糖蛋白的岩藻糖基化谱被改变，使得与没有所述补充培养时相比，更类似于参考糖蛋白的岩藻糖基化谱。优选，改变的岩藻糖基化谱是参考糖蛋白的岩藻糖基化谱的至少90％，优选至少95％，更优选至少96％，更优选至少98％。

在另一个实施方案中，本发明提供了一种改变细胞培养物中产生的重组糖蛋白的半乳糖基化谱的方法，该方法包括在细胞培养基中培养表达重组糖蛋白的真核细胞，其中细胞培养基补充了岩藻糖、锰和牛磺酸，使得细胞培养基中的岩藻糖浓度提高0.4mM至1.6mM，更优选提高0.4mM至1.2mM，再更优选提高0.6mM至1mM，最优选提高0.8mM，和其中所产生的重组糖蛋白的半乳糖基化谱被改变，使得与没有所述补充培养时相比，更类似于参考糖蛋白的半乳糖基化谱。优选，改变的半乳糖基化谱是参考糖蛋白的半乳糖基化谱的至少90％，优选至少95％，更优选至少96％，更优选至少98％。

在再另一个优选的实施方案中，本发明提供了一种改变细胞培养物中产生的重组糖蛋白的岩藻糖基化谱和半乳糖基化谱的方法，该方法包括在细胞培养基中培养表达重组糖蛋白的真核细胞，其中细胞培养基补充了岩藻糖、锰和牛磺酸，使得细胞培养基中的岩藻糖浓度提高0.4mM至1.6mM，更优选提高0.4mM至1.2mM，再更优选提高0.6mM至1mM，最优选提高0.8mM，和其中所产生的重组糖蛋白的岩藻糖基化谱和半乳糖基化谱被改变，使得与没有所述补充培养时相比，更类似于参考糖蛋白的岩藻糖基化谱和半乳糖基化谱。优选，改变的岩藻糖基化谱是参考糖蛋白的岩藻糖基化谱的至少90％，优选至少95％，更优选至少96％，更优选至少98％和改变的半乳糖基化谱是参考糖蛋白的半乳糖基化谱的至少90％，优选至少95％，更优选至少96％，更优选至少98％。

在一个实施方案中，培养基中的锰浓度提高了0.02μM至0.1μM，优选提高0.04μM至0.08μM，更优选提高0.06μM至0.08μM，且最优选提高0.068μM±0.01μM。

优选，通过作为补料培养基一部分的补充来实现上述锰的补充，其中补料培养基中的锰浓度为0.5μM至2.5μM，优选1.0μM至2.0μM，更优选1.5μM至2.0μM和最优选1.7μM±0.2μM。

在一个实施方案中，本发明提供了一种改变细胞培养物中产生的重组糖蛋白的糖基化谱的方法，该方法包括在细胞培养基中培养表达重组糖蛋白的真核细胞，其中细胞培养基补充了岩藻糖、锰和牛磺酸，使得细胞培养基中的锰浓度提高0.02μM至0.1μM，优选提高0.04μM至0.08μM，更优选提高0.06μM至0.08μM，且最优选提高0.068μM±0.01μM，和其中所产生的重组糖蛋白的糖基化谱被改变，使得与没有所述补充培养时相比，更类似于参考糖蛋白的糖基化谱。

在一个实施方案中，本发明提供了一种改变细胞培养物中产生的重组糖蛋白的岩藻糖基化谱的方法，该方法包括在细胞培养基中培养表达重组糖蛋白的真核细胞，其中细胞培养基补充了岩藻糖、锰和牛磺酸，使得细胞培养基中的锰浓度提高0.02μM至0.1μM，优选提高0.04μM至0.08μM，更优选提高0.06μM至0.08μM，且最优选提高0.068μM±0.01μM，和其中所产生的重组糖蛋白的岩藻糖基化谱被改变，使得与没有所述补充培养时相比，更类似于参考糖蛋白的岩藻糖基化谱。优选，改变的岩藻糖基化谱是参考糖蛋白的岩藻糖基化谱的至少90％，优选至少95％，更优选至少96％，更优选至少98％。

在另一个实施方案中，本发明提供了一种改变细胞培养物中产生的重组糖蛋白的半乳糖基化谱的方法，该方法包括在细胞培养基中培养表达重组糖蛋白的真核细胞，其中细胞培养基补充了岩藻糖、锰和牛磺酸，使得细胞培养基中的锰浓度提高0.02μM至0.1μM，优选提高0.04μM至0.08μM，更优选提高0.06μM至0.08μM，且最优选提高0.068μM±0.01μM，和其中所产生的重组糖蛋白的半乳糖基化谱被改变，使得与没有所述补充培养时相比，更类似于参考糖蛋白的半乳糖基化谱。优选，改变的半乳糖基化谱是参考糖蛋白的半乳糖基化谱的至少90％，优选至少95％，更优选至少96％，更优选至少98％。

在再一个优选的实施方案中，本发明提供了一种改变细胞培养物中产生的重组糖蛋白的岩藻糖基化谱和半乳糖基化谱的方法，该方法包括在细胞培养基中培养表达重组糖蛋白的真核细胞，其中细胞培养基补充了岩藻糖、锰和牛磺酸，使得细胞培养基中的锰浓度提高0.02μM至0.1μM，优选提高0.04μM至0.08μM，更优选提高0.06μM至0.08μM，且最优选提高0.068μM±0.01μM，和其中所产生的重组糖蛋白的岩藻糖基化谱和半乳糖基化谱被改变，使得与没有所述补充培养时相比，更类似于参考糖蛋白的岩藻糖基化谱和半乳糖基化谱。优选，改变的岩藻糖基化谱是参考糖蛋白的岩藻糖基化谱的至少90％，优选至少95％，更优选至少96％，更优选至少98％和改变的半乳糖基化谱是参考糖蛋白的半乳糖基化谱的至少90％，优选至少95％，更优选至少96％，更优选至少98％。

在一个实施方案中，本发明提供了一种改变细胞培养物中产生的重组糖蛋白的糖基化谱的方法，该方法包括在细胞培养基中培养表达重组糖蛋白的真核细胞，其中细胞培养基补充了岩藻糖、锰和牛磺酸，使得细胞培养基中的岩藻糖浓度提高0.4mM至1.6mM，使得细胞培养基中的锰浓度提高0.02μM至0.1μM，优选提高0.04μM至0.08μM，更优选提高0.06μM至0.08μM，且最优选提高0.068μM±0.01μM，和其中所产生的重组糖蛋白的糖基化谱被改变，使得与没有所述补充培养时相比，更类似于参考糖蛋白的糖基化谱。

在一个实施方案中，本发明提供了一种改变细胞培养物中产生的重组糖蛋白的糖基化谱的方法，该方法包括在细胞培养基中培养表达重组糖蛋白的真核细胞，其中细胞培养基补充了岩藻糖、锰和牛磺酸，使得细胞培养基中的岩藻糖浓度提高0.8mM，使得细胞培养基中的锰浓度提高0.02μM至0.1μM，优选提高0.04μM至0.08μM，更优选提高0.06μM至0.08μM，且最优选提高0.068μM±0.01μM，和其中所产生的重组糖蛋白的糖基化谱被改变，使得与没有所述补充培养时相比，更类似于参考糖蛋白的糖基化谱。

在一个实施方案中，本发明提供了一种改变细胞培养物中产生的重组糖蛋白的岩藻糖基化谱的方法，该方法包括在细胞培养基中培养表达重组糖蛋白的真核细胞，其中细胞培养基补充了岩藻糖、锰和牛磺酸，使得细胞培养基中的岩藻糖浓度提高0.4mM至1.6mM，使得细胞培养基中的锰浓度提高0.02μM至0.1μM，优选提高0.04μM至0.08μM，更优选提高0.06μM至0.08μM，且最优选提高0.068μM±0.01μM，和其中所产生的重组糖蛋白的岩藻糖基化谱被改变，使得与没有所述补充培养时相比，更类似于参考糖蛋白的岩藻糖基化谱。优选，改变的岩藻糖基化谱是参考糖蛋白的岩藻糖基化谱的至少90％，优选至少95％，更优选至少96％，更优选至少98％。

在一个实施方案中，本发明提供了一种改变细胞培养物中产生的重组糖蛋白的岩藻糖基化谱的方法，该方法包括在细胞培养基中培养表达重组糖蛋白的真核细胞，其中细胞培养基补充了岩藻糖、锰和牛磺酸，使得细胞培养基中的岩藻糖浓度提高0.8mM，使得细胞培养基中的锰浓度提高0.02μM至0.1μM，优选提高0.04μM至0.08μM，更优选提高0.06μM至0.08μM，且最优选提高0.068μM±0.01μM，和其中所产生的重组糖蛋白的岩藻糖基化谱被改变，使得与没有所述补充培养时相比，更类似于参考糖蛋白的岩藻糖基化谱。优选，改变的岩藻糖基化谱是参考糖蛋白的岩藻糖基化谱的至少90％，优选至少95％，更优选至少96％，更优选至少98％。

在一个实施方案中，本发明提供了一种改变细胞培养物中产生的重组糖蛋白的半乳糖基化谱的方法，该方法包括在细胞培养基中培养表达重组糖蛋白的真核细胞，其中细胞培养基补充了岩藻糖、锰和牛磺酸，使得细胞培养基中的岩藻糖浓度提高0.4至1.6mM，使得细胞培养基中的锰浓度提高0.02μM至0.1μM，优选提高0.04μM至0.08μM，更优选提高0.06μM至0.08μM，且最优选提高0.068μM±0.01μM，和其中所产生的重组糖蛋白的半乳糖基化谱被改变，使得与没有所述补充培养时相比，更类似于参考糖蛋白的半乳糖基化谱。优选，改变的半乳糖基化谱是参考糖蛋白的半乳糖基化谱的至少90％，优选至少95％，更优选至少96％，更优选至少98％。

在一个实施方案中，本发明提供了一种改变细胞培养物中产生的重组糖蛋白的半乳糖基化谱的方法，该方法包括在细胞培养基中培养表达重组糖蛋白的真核细胞，其中细胞培养基补充了岩藻糖、锰和牛磺酸，使得细胞培养基中的岩藻糖浓度提高0.8mM，使得细胞培养基中的锰浓度提高0.02μM至0.1μM，优选提高0.04μM至0.08μM，更优选提高0.06μM至0.08μM，且最优选提高0.068μM±0.01μM，和其中所产生的重组糖蛋白的半乳糖基化谱被改变，使得与没有所述补充培养时相比，更类似于参考糖蛋白的半乳糖基化谱。优选，改变的半乳糖基化谱是参考糖蛋白的半乳糖基化谱的至少90％，优选至少95％，更优选至少96％，更优选至少98％。

在再一个优选的方案中，本发明提供了一种改变细胞培养物中产生的重组糖蛋白的岩藻糖基化谱和半乳糖基化谱的方法，该方法包括在细胞培养基中培养表达重组糖蛋白的真核细胞，其中细胞培养基补充了岩藻糖、锰和牛磺酸，使得细胞培养基中的岩藻糖浓度提高0.4至1.6mM，使得细胞培养基中的锰浓度提高0.02μM至0.1μM，优选提高0.04μM至0.08μM，更优选提高0.06μM至0.08μM，且最优选提高0.068μM±0.01μM，和其中所产生的重组糖蛋白的岩藻糖基化谱和半乳糖基化谱被改变，使得与没有所述补充培养时相比，更类似于参考糖蛋白的岩藻糖基化谱和半乳糖基化谱。优选，改变的岩藻糖基化谱是参考糖蛋白的岩藻糖基化谱的至少90％，优选至少95％，更优选至少96％，更优选至少98％和改变的半乳糖基化谱是参考糖蛋白的半乳糖基化谱的至少90％，优选至少95％，更优选至少96％，更优选至少98％。

在再一个优选的实施方案中，本发明提供了一种改变细胞培养物中产生的重组糖蛋白的岩藻糖基化谱和半乳糖基化谱的方法，该方法包括在细胞培养基中培养表达重组糖蛋白的真核细胞，其中细胞培养基补充了岩藻糖、锰和牛磺酸，使得细胞培养基中的岩藻糖浓度提高0.8mM，使得细胞培养基中的锰浓度提高0.02μM至0.1μM，优选提高0.04μM至0.08μM，更优选提高0.06μM至0.08μM，且最优选提高0.068μM±0.01μM，和其中所产生的重组糖蛋白的岩藻糖基化谱和半乳糖基化谱被改变，使得与没有所述补充培养时相比，更类似于参考糖蛋白的岩藻糖基化谱和半乳糖基化谱。优选，改变的岩藻糖基化谱是参考糖蛋白的岩藻糖基化谱的至少90％，优选至少95％，更优选至少96％，更优选至少98％和改变的半乳糖基化谱是参考糖蛋白的半乳糖基化谱的至少90％，优选至少95％，更优选至少96％，更优选至少98％。

在再一个优选的实施方案中，补充后培养基中的牛磺酸浓度为12.5mM至50mM之间，例如12.5、15、17.5、20、22.5、25、27.5、30、32.5、35、37.5、40、42.5或50mM。在优选实施方案中，补充后培养基中的牛磺酸终浓度为15mM至35mM，例如15、17.5、20、22.5、25、27.5、30、32.5或35mM。在优选实施方案中，补充后培养基中的牛磺酸终浓度为20mM至30mM，例如20、22.5、25、27.5或30mM。在最优选的实施方案中，培养基中的牛磺酸终浓度为25mM。

在一个实施方案中，本发明提供了一种改变细胞培养物中产生的重组糖蛋白的糖基化谱的方法，该方法包括在细胞培养基中培养表达重组糖蛋白的真核细胞，其中细胞培养基补充了岩藻糖、锰和牛磺酸，并且补充后细胞培养基中的牛磺酸终浓度为12.5mM至50mM，更优选15mM至35mM，再更优选20mM至30mM，最优选25mM，和其中所产生的重组糖蛋白的糖基化谱被改变，使得更类似于参考糖蛋白的糖基化谱。

在一个实施方案中，本发明提供了一种改变细胞培养物中产生的重组糖蛋白的岩藻糖基化谱的方法，该方法包括在细胞培养基中培养表达重组糖蛋白的真核细胞，其中细胞培养基补充了岩藻糖、锰和牛磺酸，并且补充后细胞培养基中的牛磺酸浓度为12.5mM至50mM，更优选15mM至35mM，再更优选20mM至30mM，最优选25mM，和其中所产生的重组糖蛋白的岩藻糖基化谱被改变，使得与没有所述补充培养时相比，更类似于参考糖蛋白的岩藻糖基化谱。优选，改变的岩藻糖基化谱是参考糖蛋白的岩藻糖基化谱的至少90％，优选至少95％，更优选至少96％，更优选至少98％。

在另一个实施方案中，本发明提供了一种改变细胞培养物中产生的重组糖蛋白的半乳糖基化谱的方法，该方法包括在细胞培养基中培养表达重组糖蛋白的真核细胞，其中细胞培养基补充了岩藻糖、锰和牛磺酸，并且补充后细胞培养基中的牛磺酸终浓度为12.5mM至50mM，更优选15mM至35mM，再更优选20mM至30mM，最优选25mM，和其中所产生的重组糖蛋白的半乳糖基化谱被改变，使得与没有所述补充培养时相比，更类似于参考糖蛋白的半乳糖基化谱。优选，改变的半乳糖基化谱是参考糖蛋白的半乳糖基化谱的至少90％，优选至少95％，更优选至少96％，更优选至少98％。

在再另一个优选的实施方案中，本发明提供了一种改变细胞培养物中产生的重组糖蛋白的岩藻糖基化谱和半乳糖基化谱的方法，该方法包括在细胞培养基中培养表达重组糖蛋白的真核细胞，其中细胞培养基补充了岩藻糖、锰和牛磺酸，并且补充后细胞培养基中的牛磺酸终浓度为12.5mM至50mM，更优选15mM至35mM，再更优选20mM至30mM，最优选25mM，和其中所产生的重组糖蛋白的岩藻糖基化谱和半乳糖基化谱被改变，使得与没有所述补充培养时相比，更类似于参考糖蛋白的岩藻糖基化谱和半乳糖基化谱。优选，改变的岩藻糖基化谱是参考糖蛋白的岩藻糖基化谱的至少90％，优选至少95％，更优选至少96％，更优选至少98％和改变的半乳糖基化谱是参考糖蛋白的半乳糖基化谱的至少90％，优选至少95％，更优选至少96％，更优选至少98％。

在一个实施方案中，本发明提供了一种改变细胞培养物中产生的重组糖蛋白的糖基化谱的方法，该方法包括在细胞培养基中培养表达重组糖蛋白的真核细胞，其中细胞培养基补充了岩藻糖、锰和牛磺酸，使得细胞培养基中的岩藻糖浓度提高0.4至1.6mM，补充后细胞培养基中的牛磺酸终浓度为12.5mM至50mM，更优选15mM至35mM，再更优选20mM至30mM，最优选25mM，和其中所产生的重组糖蛋白的糖基化谱被改变，使得与没有所述补充培养时相比，更类似于参考糖蛋白的糖基化谱。

在一个实施方案中，本发明提供了一种改变细胞培养物中产生的重组糖蛋白的糖基化谱的方法，该方法包括在细胞培养基中培养表达重组糖蛋白的真核细胞，其中细胞培养基补充了岩藻糖、锰和牛磺酸，使得细胞培养基中的岩藻糖浓度提高0.8mM，补充后细胞培养基中的牛磺酸终浓度为12.5mM至50mM，更优选15mM至35mM，再更优选20mM至30mM，最优选25mM，和其中所产生的重组糖蛋白的糖基化谱被改变，使得与没有所述补充培养时相比，更类似于参考糖蛋白的糖基化谱。

在一个实施方案中，本发明提供了一种改变细胞培养物中产生的重组糖蛋白的岩藻糖基化谱的方法，该方法包括在细胞培养基中培养表达重组糖蛋白的真核细胞，其中细胞培养基补充了岩藻糖、锰和牛磺酸，使得细胞培养基中的岩藻糖浓度提高0.4至1.6mM，补充后细胞培养基中的牛磺酸终浓度为12.5mM至50mM，更优选15mM至35mM，再更优选20mM至30mM，最优选25mM，和其中所产生的重组糖蛋白的岩藻糖基化谱被改变，使得与没有所述补充培养时相比，更类似于参考糖蛋白的岩藻糖基化谱。优选，改变的岩藻糖基化谱是参考糖蛋白的岩藻糖基化谱的至少90％，优选至少95％，更优选至少96％，更优选至少98％。

在一个实施方案中，本发明提供了一种改变细胞培养物中产生的重组糖蛋白的岩藻糖基化谱的方法，该方法包括在细胞培养基中培养表达重组糖蛋白的真核细胞，其中细胞培养基补充了岩藻糖、锰和牛磺酸，使得细胞培养基中的岩藻糖浓度提高0.8mM，补充后细胞培养基中的牛磺酸终浓度为12.5mM至50mM，更优选15mM至35mM，再更优选20mM至30mM，最优选25mM，和其中所产生的重组糖蛋白的岩藻糖基化谱被改变，使得与没有所述补充培养时相比，更类似于参考糖蛋白的岩藻糖基化谱。优选，改变的岩藻糖基化谱是参考糖蛋白的岩藻糖基化谱的至少90％，优选至少95％，更优选至少96％，更优选至少98％。

在一个实施方案中，本发明提供了一种改变细胞培养物中产生的重组糖蛋白的半乳糖基化谱的方法，该方法包括在细胞培养基中培养表达重组糖蛋白的真核细胞，其中细胞培养基补充了岩藻糖、锰和牛磺酸，使得细胞培养基中的岩藻糖浓度提高0.4至1.6mM，补充后细胞培养基中的牛磺酸终浓度为12.5mM至50mM，更优选15mM至35mM，再更优选20mM至30mM，最优选25mM，和其中所产生的重组糖蛋白的半乳糖基化谱被改变，使得与没有所述补充培养时相比，更类似于参考糖蛋白的半乳糖基化谱。优选，改变的半乳糖基化谱是参考糖蛋白的半乳糖基化谱的至少90％，优选至少95％，更优选至少96％，更优选至少98％。

在另一个实施方案中，本发明提供了一种改变细胞培养物中产生的重组糖蛋白的半乳糖基化谱的方法，该方法包括在细胞培养基中培养表达重组糖蛋白的真核细胞，其中细胞培养基补充了岩藻糖、锰和牛磺酸，使得细胞培养基中的岩藻糖浓度提高0.8mM，补充后细胞培养基中的牛磺酸终浓度为12.5mM至50mM，更优选15mM至35mM，再更优选20mM至30mM，最优选25mM，和其中所产生的重组糖蛋白的半乳糖基化谱被改变，使得与没有所述补充培养时相比，更类似于参考糖蛋白的半乳糖基化谱。优选，改变的半乳糖基化谱是参考糖蛋白的半乳糖基化谱的至少90％，优选至少95％，更优选至少96％，更优选至少98％。

在再另一个优选的实施方案中，本发明提供了一种改变细胞培养物中产生的重组糖蛋白的岩藻糖基化谱和半乳糖基化谱的方法，该方法包括在细胞培养基中培养表达重组糖蛋白的真核细胞，其中细胞培养基补充了岩藻糖、锰和牛磺酸，使得细胞培养基中的岩藻糖浓度提高0.4至1.6mM，补充后细胞培养基中的牛磺酸终浓度为12.5mM至50mM，更优选15mM至35mM，再更优选20mM至30mM，最优选25mM，和其中所产生的重组糖蛋白的岩藻糖基化谱和半乳糖基化谱被改变，使得与没有所述补充培养时相比，更类似于参考糖蛋白的岩藻糖基化谱和半乳糖基化谱。优选，改变的岩藻糖基化谱是参考糖蛋白的岩藻糖基化谱的至少90％，优选至少95％，更优选至少96％，更优选至少98％和改变的半乳糖基化谱是参考糖蛋白的半乳糖基化谱的至少90％，优选至少95％，更优选至少96％，更优选至少98％。

在再另一个优选的实施方案中，本发明提供了一种改变细胞培养物中产生的重组糖蛋白的岩藻糖基化谱和半乳糖基化谱的方法，该方法包括在细胞培养基中培养表达重组糖蛋白的真核细胞，其中细胞培养基补充了岩藻糖、锰和牛磺酸，使得细胞培养基中的岩藻糖浓度提高0.8mM，补充后细胞培养基中的牛磺酸终浓度为12.5mM至50mM，更优选15mM至35mM，再更优选20mM至30mM，最优选25mM，和其中所产生的重组糖蛋白的岩藻糖基化谱和半乳糖基化谱被改变，使得与没有所述补充培养时相比，更类似于参考糖蛋白的岩藻糖基化谱和半乳糖基化谱。优选，改变的岩藻糖基化谱是参考糖蛋白的岩藻糖基化谱的至少90％，优选至少95％，更优选至少96％，更优选至少98％和改变的半乳糖基化谱是参考糖蛋白的半乳糖基化谱的至少90％，优选至少95％，更优选至少96％，更优选至少98％。

在一个实施方案中，本发明提供了一种改变细胞培养物中产生的重组糖蛋白的糖基化谱的方法，该方法包括在细胞培养基中培养表达重组糖蛋白的真核细胞，其中细胞培养基补充了岩藻糖、锰和牛磺酸，使得细胞培养基中的锰浓度提高0.06μM至0.08μM，补充后细胞培养基中的牛磺酸终浓度为12.5mM至50mM，更优选15mM至35mM，再更优选20mM至30mM，最优选25mM，和其中所产生的重组糖蛋白的糖基化谱被改变，使得与没有所述补充培养时相比，更类似于参考糖蛋白的糖基化谱。

在一个实施方案中，本发明提供了一种改变细胞培养物中产生的重组糖蛋白的糖基化谱的方法，该方法包括在细胞培养基中培养表达重组糖蛋白的真核细胞，其中细胞培养基补充了岩藻糖、锰和牛磺酸，使得细胞培养基中的锰浓度提高0.068μM±0.01μM，补充后细胞培养基中的牛磺酸终浓度为12.5mM至50mM，更优选15mM至35mM，再更优选20mM至30mM，最优选25mM，和其中所产生的重组糖蛋白的糖基化谱被改变，使得与没有所述补充培养时相比，更类似于参考糖蛋白的糖基化谱。

在一个实施方案中，本发明提供了一种改变细胞培养物中产生的重组糖蛋白的岩藻糖基化谱的方法，该方法包括在细胞培养基中培养表达重组糖蛋白的真核细胞，其中细胞培养基补充了岩藻糖、锰和牛磺酸，使得细胞培养基中的锰浓度提高0.06μM至0.08μM，补充后细胞培养基中的牛磺酸终浓度为12.5mM至50mM，更优选15mM至35mM，再更优选20mM至30mM，最优选25mM，和其中所产生的重组糖蛋白的岩藻糖基化谱被改变，使得与没有所述补充培养时相比，更类似于参考糖蛋白的岩藻糖基化谱。优选，改变的岩藻糖基化谱是参考糖蛋白的岩藻糖基化谱的至少90％，优选至少95％，更优选至少96％，更优选至少98％。

在一个实施方案中，本发明提供了一种改变细胞培养物中产生的重组糖蛋白的岩藻糖基化谱的方法，该方法包括在细胞培养基中培养表达重组糖蛋白的真核细胞，其中细胞培养基补充了岩藻糖、锰和牛磺酸，使得细胞培养基中的锰浓度提高0.068μM±0.01μM，补充后细胞培养基中的牛磺酸终浓度为12.5mM至50mM，更优选15mM至35mM，再更优选20mM至30mM，最优选25mM，和其中所产生的重组糖蛋白的岩藻糖基化谱被改变，使得与没有所述补充培养时相比，更类似于参考糖蛋白的岩藻糖基化谱。优选，改变的岩藻糖基化谱是参考糖蛋白的岩藻糖基化谱的至少90％，优选至少95％，更优选至少96％，更优选至少98％。

在另一个实施方案中，本发明提供了一种改变细胞培养物中产生的重组糖蛋白的半乳糖基化谱的方法，该方法包括在细胞培养基中培养表达重组糖蛋白的真核细胞，其中细胞培养基补充了岩藻糖、锰和牛磺酸，使得细胞培养基中的锰浓度提高0.06μM至0.08μM，补充后细胞培养基中的牛磺酸终浓度为12.5mM至50mM，更优选15mM至35mM，再更优选20mM至30mM，最优选25mM，和其中所产生的重组糖蛋白的半乳糖基化谱被改变，使得与没有所述补充培养时相比，更类似于参考糖蛋白的半乳糖基化谱。优选，改变的半乳糖基化谱是参考糖蛋白的半乳糖基化谱的至少90％，优选至少95％，更优选至少96％，更优选至少98％。

在另一个实施方案中，本发明提供了一种改变细胞培养物中产生的重组糖蛋白的半乳糖基化谱的方法，该方法包括在细胞培养基中培养表达重组糖蛋白的真核细胞，其中细胞培养基补充了岩藻糖、锰和牛磺酸，使得细胞培养基中的锰浓度提高0.068μM±0.01μM，补充后细胞培养基中的牛磺酸终浓度为12.5mM至50mM，更优选15mM至35mM，再更优选20mM至30mM，最优选25mM，和其中所产生的重组糖蛋白的半乳糖基化谱被改变，使得与没有所述补充培养时相比，更类似于参考糖蛋白的半乳糖基化谱。优选，改变的半乳糖基化谱是参考糖蛋白的半乳糖基化谱的至少90％，优选至少95％，更优选至少96％，更优选至少98％。

在再另一个优选的实施方案中，本发明提供了一种改变细胞培养物中产生的重组糖蛋白的岩藻糖基化谱和半乳糖基化谱的方法，该方法包括在细胞培养基中培养表达重组糖蛋白的真核细胞，其中细胞培养基补充了岩藻糖、锰和牛磺酸，使得细胞培养基中的锰浓度提高0.06μM至0.08μM，补充后细胞培养基中的牛磺酸终浓度为12.5mM至50mM，更优选15mM至35mM，再更优选20mM至30mM，最优选25mM，和其中所产生的重组糖蛋白的岩藻糖基化谱和半乳糖基化谱被改变，使得与没有所述补充培养时相比，更类似于参考糖蛋白的岩藻糖基化谱和半乳糖基化谱。优选，改变的岩藻糖基化谱是参考糖蛋白的岩藻糖基化谱的至少90％，优选至少95％，更优选至少96％，更优选至少98％和改变的半乳糖基化谱是参考糖蛋白的半乳糖基化谱的至少90％，优选至少95％，更优选至少96％，更优选至少98％。

在再另一个优选的实施方案中，本发明提供了一种改变细胞培养物中产生的重组糖蛋白的岩藻糖基化谱和半乳糖基化谱的方法，该方法包括在细胞培养基中培养表达重组糖蛋白的真核细胞，其中细胞培养基补充了岩藻糖、锰和牛磺酸，使得细胞培养基中的锰浓度提高0.068μM±0.01μM，补充后细胞培养基中的牛磺酸终浓度为12.5mM至50mM，更优选15mM至35mM，再更优选20mM至30mM，最优选25mM，和其中所产生的重组糖蛋白的岩藻糖基化谱和半乳糖基化谱被改变，使得与没有所述补充培养时相比，更类似于参考糖蛋白的岩藻糖基化谱和半乳糖基化谱。优选，改变的岩藻糖基化谱是参考糖蛋白的岩藻糖基化谱的至少90％，优选至少95％，更优选至少96％，更优选至少98％和改变的半乳糖基化谱是参考糖蛋白的半乳糖基化谱的至少90％，优选至少95％，更优选至少96％，更优选至少98％。

在一个实施方案中，本发明提供了一种改变细胞培养物中产生的重组糖蛋白的糖基化谱的方法，该方法包括在细胞培养基中培养表达重组糖蛋白的真核细胞，其中细胞培养基补充了岩藻糖、锰和牛磺酸，使得培养基中的岩藻糖浓度提高0.4至1.6mM，使得细胞培养基中的锰浓度提高0.06μM至0.08μM和补充后细胞培养基中的牛磺酸终浓度为12.5mM至50mM，更优选15mM至35mM，再更优选20mM至30mM，最优选25mM，和其中所产生的重组糖蛋白的糖基化谱被改变，使得与没有所述补充培养时相比，更类似于参考糖蛋白的糖基化谱。

在一个实施方案中，本发明提供了一种改变细胞培养物中产生的重组糖蛋白的糖基化谱的方法，该方法包括在细胞培养基中培养表达重组糖蛋白的真核细胞，其中细胞培养基补充了岩藻糖、锰和牛磺酸，使得培养基中的岩藻糖浓度提高0.8mM，使得细胞培养基中的锰浓度提高0.06μM至0.08μM和补充后细胞培养基中的牛磺酸终浓度为12.5mM至50mM，更优选15mM至35mM，再更优选20mM至30mM，最优选25mM，和其中所产生的重组糖蛋白的糖基化谱被改变，使得与没有所述补充培养时相比，更类似于参考糖蛋白的糖基化谱。

在一个实施方案中，本发明提供了一种改变细胞培养物中产生的重组糖蛋白的糖基化谱的方法，该方法包括在细胞培养基中培养表达重组糖蛋白的真核细胞，其中细胞培养基补充了岩藻糖、锰和牛磺酸，使得培养基中的岩藻糖浓度提高0.4至1.6mM，使得细胞培养基中的锰浓度提高0.068μM±0.01μM和补充后细胞培养基中的牛磺酸终浓度为12.5mM至50mM，更优选15mM至35mM，再更优选20mM至30mM，最优选25mM，和其中所产生的重组糖蛋白的糖基化谱被改变，使得与没有所述补充培养时相比，更类似于参考糖蛋白的糖基化谱。

在一个实施方案中，本发明提供了一种改变细胞培养物中产生的重组糖蛋白的糖基化谱的方法，该方法包括在细胞培养基中培养表达重组糖蛋白的真核细胞，其中细胞培养基补充了岩藻糖、锰和牛磺酸，使得培养基中的岩藻糖浓度提高0.8mM，使得细胞培养基中的锰浓度提高0.068μM±0.01μM和补充后细胞培养基中的牛磺酸终浓度为12.5mM至50mM，更优选15mM至35mM，再更优选20mM至30mM，最优选25mM，和其中所产生的重组糖蛋白的糖基化谱被改变，使得与没有所述补充培养时相比，更类似于参考糖蛋白的糖基化谱。

在一个实施方案中，本发明提供了一种改变细胞培养物中产生的重组糖蛋白的岩藻糖基化谱的方法，该方法包括在细胞培养基中培养表达重组糖蛋白的真核细胞，其中细胞培养基补充了岩藻糖、锰和牛磺酸，使得培养基中的岩藻糖浓度提高0.4至1.6mM，使得细胞培养基中的锰浓度提高0.06μM至0.08μM和补充后细胞培养基中的牛磺酸终浓度为12.5mM至50mM，更优选15mM至35mM，再更优选20mM至30mM，最优选25mM，和其中所产生的重组糖蛋白的岩藻糖基化谱被改变，使得与没有所述补充培养时相比，更类似于参考糖蛋白的岩藻糖基化谱。优选，改变的岩藻糖基化谱是参考糖蛋白的岩藻糖基化谱的至少90％，优选至少95％，更优选至少96％，更优选至少98％。

在一个实施方案中，本发明提供了一种改变细胞培养物中产生的重组糖蛋白的岩藻糖基化谱的方法，该方法包括在细胞培养基中培养表达重组糖蛋白的真核细胞，其中细胞培养基补充了岩藻糖、锰和牛磺酸，使得培养基中的岩藻糖浓度提高20mM，使得细胞培养基中的锰浓度提高0.06μM至0.08μM和补充后细胞培养基中的牛磺酸终浓度为12.5mM至50mM，更优选15mM至35mM，再更优选20mM至30mM，最优选25mM，和其中所产生的重组糖蛋白的岩藻糖基化谱被改变，使得与没有所述补充培养时相比，更类似于参考糖蛋白的岩藻糖基化谱。优选，改变的岩藻糖基化谱是参考糖蛋白的岩藻糖基化谱的至少90％，优选至少95％，更优选至少96％，更优选至少98％。

在一个实施方案中，本发明提供了一种改变细胞培养物中产生的重组糖蛋白的岩藻糖基化谱的方法，该方法包括在细胞培养基中培养表达重组糖蛋白的真核细胞，其中细胞培养基补充了岩藻糖、锰和牛磺酸，使得培养基中的岩藻糖浓度提高0.4至1.6mM，使得细胞培养基中的锰浓度提高0.068μM±0.01μM和补充后细胞培养基中的牛磺酸终浓度为12.5mM至50mM，更优选15mM至35mM，再更优选20mM至30mM，最优选25mM，和其中所产生的重组糖蛋白的岩藻糖基化谱被改变，使得与没有所述补充培养时相比，更类似于参考糖蛋白的岩藻糖基化谱。优选，改变的岩藻糖基化谱是参考糖蛋白的岩藻糖基化谱的至少90％，优选至少95％，更优选至少96％，更优选至少98％。

在一个实施方案中，本发明提供了一种改变细胞培养物中产生的重组糖蛋白的岩藻糖基化谱的方法，该方法包括在细胞培养基中培养表达重组糖蛋白的真核细胞，其中细胞培养基补充了岩藻糖、锰和牛磺酸，使得培养基中的岩藻糖浓度提高0.8mM，使得细胞培养基中的锰浓度提高0.068μM±0.01μM和补充后细胞培养基中的牛磺酸终浓度为12.5mM至50mM，更优选15mM至35mM，再更优选20mM至30mM，最优选25mM，和其中所产生的重组糖蛋白的岩藻糖基化谱被改变，使得与没有所述补充培养时相比，更类似于参考糖蛋白的岩藻糖基化谱。优选，改变的岩藻糖基化谱是参考糖蛋白的岩藻糖基化谱的至少90％，优选至少95％，更优选至少96％，更优选至少98％。

在另一个实施方案中，本发明提供了一种改变细胞培养物中产生的重组糖蛋白的半乳糖基化谱的方法，该方法包括在细胞培养基中培养表达重组糖蛋白的真核细胞，其中细胞培养基补充了岩藻糖、锰和牛磺酸，使得培养基中的岩藻糖浓度提高0.4至1.6mM，使得细胞培养基中的锰浓度提高0.06μM至0.08μM和补充后细胞培养基中的牛磺酸终浓度为12.5mM至50mM，更优选15mM至35mM，再更优选20mM至30mM，最优选25mM，和其中所产生的重组糖蛋白的半乳糖基化谱被改变，使得与没有所述补充培养时相比，更类似于参考糖蛋白的半乳糖基化谱。优选，改变的半乳糖基化谱是参考糖蛋白的半乳糖基化谱的至少90％，优选至少95％，更优选至少96％，更优选至少98％。

在另一个实施方案中，本发明提供了一种改变细胞培养物中产生的重组糖蛋白的半乳糖基化谱的方法，该方法包括在细胞培养基中培养表达重组糖蛋白的真核细胞，其中细胞培养基补充了岩藻糖、锰和牛磺酸，使得培养基中的岩藻糖浓度提高0.8mM，使得细胞培养基中的锰浓度提高0.06μM至0.08μM和补充后细胞培养基中的牛磺酸终浓度为12.5mM至50mM，更优选15mM至35mM，再更优选20mM至30mM，最优选25mM，和其中所产生的重组糖蛋白的半乳糖基化谱被改变，使得与没有所述补充培养时相比，更类似于参考糖蛋白的半乳糖基化谱。优选，改变的半乳糖基化谱是参考糖蛋白的半乳糖基化谱的至少90％，优选至少95％，更优选至少96％，更优选至少98％。

在另一个实施方案中，本发明提供了一种改变细胞培养物中产生的重组糖蛋白的半乳糖基化谱的方法，该方法包括在细胞培养基中培养表达重组糖蛋白的真核细胞，其中细胞培养基补充了岩藻糖、锰和牛磺酸，使得培养基中的岩藻糖浓度提高0.4至1.6mM，使得细胞培养基中的锰浓度提高0.068μM±0.01μM和补充后细胞培养基中的牛磺酸终浓度为12.5mM至50mM，更优选15mM至35mM，再更优选20mM至30mM，最优选25mM，和其中所产生的重组糖蛋白的半乳糖基化谱被改变，使得与没有所述补充培养时相比，更类似于参考糖蛋白的半乳糖基化谱。优选，改变的半乳糖基化谱是参考糖蛋白的半乳糖基化谱的至少90％，优选至少95％，更优选至少96％，更优选至少98％。

在另一个实施方案中，本发明提供了一种改变细胞培养物中产生的重组糖蛋白的半乳糖基化谱的方法，该方法包括在细胞培养基中培养表达重组糖蛋白的真核细胞，其中细胞培养基补充了岩藻糖、锰和牛磺酸，使得培养基中的岩藻糖浓度提高0.8mM，使得细胞培养基中的锰浓度提高0.068μM±0.01μM和补充后细胞培养基中的牛磺酸终浓度为12.5mM至50mM，更优选15mM至35mM，再更优选20mM至30mM，最优选25mM，和其中所产生的重组糖蛋白的半乳糖基化谱被改变，使得与没有所述补充培养时相比，更类似于参考糖蛋白的半乳糖基化谱。优选，改变的半乳糖基化谱是参考糖蛋白的半乳糖基化谱的至少90％，优选至少95％，更优选至少96％，更优选至少98％。

在再另一个优选的实施方案中，本发明提供了一种改变细胞培养物中产生的重组糖蛋白的岩藻糖基化谱和半乳糖基化谱的方法，该方法包括在细胞培养基中培养表达重组糖蛋白的真核细胞，其中细胞培养基补充了岩藻糖、锰和牛磺酸，使得培养基中的岩藻糖浓度提高0.4至1.6mM，使得细胞培养基中的锰浓度提高0.06μM至0.08μM和补充后细胞培养基中的牛磺酸终浓度为12.5mM至50mM，更优选15mM至35mM，再更优选20mM至30mM，最优选25mM，和其中所产生的重组糖蛋白的岩藻糖基化谱和半乳糖基化谱被改变，使得与没有所述补充培养时相比，更类似于参考糖蛋白的岩藻糖基化谱和半乳糖基化谱。优选，改变的岩藻糖基化谱是参考糖蛋白的岩藻糖基化谱的至少90％，优选至少95％，更优选至少96％，更优选至少98％和改变的半乳糖基化谱是参考糖蛋白的半乳糖基化谱的至少90％，优选至少95％，更优选至少96％，更优选至少98％。

在再另一个优选的实施方案中，本发明提供了一种改变细胞培养物中产生的重组糖蛋白的岩藻糖基化谱和半乳糖基化谱的方法，该方法包括在细胞培养基中培养表达重组糖蛋白的真核细胞，其中细胞培养基补充了岩藻糖、锰和牛磺酸，使得培养基中的岩藻糖浓度提高0.8mM，使得细胞培养基中的锰浓度提高0.06μM至0.08μM和补充后细胞培养基中的牛磺酸终浓度为12.5mM至50mM，更优选15mM至35mM，再更优选20mM至30mM，最优选25mM，和其中所产生的重组糖蛋白的岩藻糖基化谱和半乳糖基化谱被改变，使得与没有所述补充培养时相比，更类似于参考糖蛋白的岩藻糖基化谱和半乳糖基化谱。优选，改变的岩藻糖基化谱是参考糖蛋白的岩藻糖基化谱的至少90％，优选至少95％，更优选至少96％，更优选至少98％和改变的半乳糖基化谱是参考糖蛋白的半乳糖基化谱的至少90％，优选至少95％，更优选至少96％，更优选至少98％。

在再另一个优选的实施方案中，本发明提供了一种改变细胞培养物中产生的重组糖蛋白的岩藻糖基化谱和半乳糖基化谱的方法，该方法包括在细胞培养基中培养表达重组糖蛋白的真核细胞，其中细胞培养基补充了岩藻糖、锰和牛磺酸，使得培养基中的岩藻糖浓度提高0.4至1.4mM，使得细胞培养基中的锰浓度提高0.068μM±0.01μM和补充后细胞培养基中的牛磺酸终浓度为12.5mM至50mM，更优选15mM至35mM，再更优选20mM至30mM，最优选25mM，和其中所产生的重组糖蛋白的岩藻糖基化谱和半乳糖基化谱被改变，使得与没有所述补充培养时相比，更类似于参考糖蛋白的岩藻糖基化谱和半乳糖基化谱。优选，改变的岩藻糖基化谱是参考糖蛋白的岩藻糖基化谱的至少90％，优选至少95％，更优选至少96％，更优选至少98％和改变的半乳糖基化谱是参考糖蛋白的半乳糖基化谱的至少90％，优选至少95％，更优选至少96％，更优选至少98％。

在再另一个优选的实施方案中，本发明提供了一种改变细胞培养物中产生的重组糖蛋白的岩藻糖基化谱和半乳糖基化谱的方法，该方法包括在细胞培养基中培养表达重组糖蛋白的真核细胞，其中细胞培养基补充了岩藻糖、锰和牛磺酸，使得培养基中的岩藻糖浓度提高0.8mM，使得细胞培养基中的锰浓度提高0.068μM±0.01μM和补充后细胞培养基中的牛磺酸终浓度为12.5mM至50mM，更优选15mM至35mM，再更优选20mM至30mM，最优选25mM，和其中所产生的重组糖蛋白的岩藻糖基化谱和半乳糖基化谱被改变，使得与没有所述补充培养时相比，更类似于参考糖蛋白的岩藻糖基化谱和半乳糖基化谱。优选，改变的岩藻糖基化谱是参考糖蛋白的岩藻糖基化谱的至少90％，优选至少95％，更优选至少96％，更优选至少98％和改变的半乳糖基化谱是参考糖蛋白的半乳糖基化谱的至少90％，优选至少95％，更优选至少96％，更优选至少98％。

在一个实施方案中，之前任一个实施方案的方法进一步包括从细胞培养物分离所产生的重组糖蛋白的步骤。在一个特定的实施方案中，分离步骤包括蛋白A纯化。

根据本发明可以利用对细胞培养敏感并能够表达重组糖蛋白的任何真核细胞或细胞类型并且特别是与本发明之前的任一个实施方案一起使用。例如，根据本发明可以利用植物细胞、酵母细胞、动物细胞、昆虫细胞、禽类细胞或哺乳动物细胞。根据本发明可以使用的哺乳动物细胞实例包括BALB/c小鼠骨髓瘤系(NSO/1，ECACC No:85110503)；人成视网膜细胞(CruCell，Leiden，The Netherlands))；通过SV40转化的猴肾细胞CV1系(COS-7，ATCC CRL 1651)；人胚胎肾系(293或为在悬浮培养生长而亚克隆的293细胞，Graham等，J.Gen Virol.，36:59(1977))；幼仓鼠肾细胞(BHK，ATCC CCL 10)；中国仓鼠卵巢细胞±DHFR(CHO，Urlaub和Chasin，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，77:4216(1980))，例如中国仓鼠卵巢细胞系M(CHO-M)；小鼠睾丸支持细胞(TM4，Mather，Biol.Reprod.，23:243-251(1980))；猴肾细胞(CVl ATCC CCL 70)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76，ATCC CRL-1 587)；人宫颈癌细胞(HeLa，ATCC CCL 2)；犬肾细胞(MDCK，ATCC CCL 34)；Buffalo大鼠肝细胞(BRL 3A，ATCCCRL 1442)；人肺细胞(W138，ATCC CCL 75)；人肝细胞(Hep G2，HB 8065)；小鼠乳腺肿瘤(MMT 060562，ATCC CCL5 1)；TRI细胞(Mather等，Annals N.Y.Acad.Sci.,383:44-68(1982))；MRC5细胞；和FS4细胞。

可以选择或工程化适用于本发明的真核细胞，以产生高水平的糖蛋白。常常，将细胞遗传工程化，以产生高水平的糖蛋白，例如，通过引入编码目标重组糖蛋白的基因和/或通过引入调控编码目标重组糖蛋白的基因(不管是内源性的或是引入的)表达的控制元件。

还可以或替换地选择或工程化真核细胞，以允许在无血清培养基中培养。

在一个实施方案中，真核细胞包含载体，所述载体包含了编码之后被糖基化的蛋白质的多核苷酸。

在另一个实施方案中，根据本发明可以利用表达至少一种糖蛋白的商业或非商业可获得的杂交瘤细胞系。在优选实施方案中，真核细胞是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。在优选实施方案中，CHO细胞包含载体，所述载体包含了编码之后被糖基化的蛋白质的多核苷酸。例如，CHO-K1(ATCC CCL-61)、CHO-DUKX(ATCC CRL-9096)、Lec1 ATCC CRL-1735、CHO-DG44(ThermoFisher)、CHO-M(Selexis)、CHO-S(ThermoFisher)或CHO Pro-5(ATCC CRL-1781)是合适的。

在尤为优选的实施方案中，真核细胞是Selexis SURE CHO-M细胞系(CHO-M)。在优选实施方案中，CHO-M细胞包含载体，所述载体包含了编码之后被糖基化的蛋白质的多核苷酸。

在一个实施方案中，以大规模生产其糖基化谱通过之前任一个实施方案的方法改变的重组糖蛋白，大规模表示至少500或1,000升的培养体积，优选至少5,000或8,000升和最优选10,000或20,000升。

在一个实施方案中，以小规模或实验室规模生产其糖基化谱通过之前任一个实施方案的方法改变的重组糖蛋白，该规模表示1、5、10或100升的培养体积。

在一个实施方案中，其糖基化谱通过之前任一个实施方案的方法改变的重组糖蛋白是IgG型的免疫球蛋白。在优选实施方案中，重组糖蛋白是抗体。在更优选实施方案中，重组糖蛋白是单克隆抗体。在最优选的实施方案中，重组糖蛋白是治疗性单克隆抗体。

之前任一个实施方案的其中产生重组糖蛋白的方法的细胞培养可以进行1至18天，例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18天。在一个实施方案中，细胞培养进行4至18天，例如，4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18天。在优选实施方案中，细胞培养进行8至16天，例如，8、9、10、11、12、13、14、15或16天。在更优选的实施方案中，细胞培养进行10至14天，例如，10、11、12、13或14天。在最优选的实施方案中，之前任一个实施方案的方法的细胞培养进行14天。

之前任一个实施方案的方法中的补充可以连续地或不连续地从培养开始进行到培养结束。例如，添加剂或补充剂的一种或多种成分可以作为来自储液的单一丸剂或两种或更多种丸剂加入，而相同添加剂或补充剂的其他成分可以作为补料培养基的一部分加入。此外，添加剂或补充剂中的任何一种或多种成分可以从细胞培养开始就存在于基础培养基中。因此，补充可以发生在培养开始时，和/或培养开始后，例如在生长期和/或生产期的过程中进行。

在一个实施方案中，细胞培养基的补充可以从培养开始时进行。在优选实施方案中，从培养开始进行的细胞培养基的补充是补充了牛磺酸。在更优选实施方案中，从培养开始进行的细胞培养基的补充是补充后细胞培养基中的牛磺酸终浓度为12.5至50mM。在最优选的实施方案中，从培养开始进行的细胞培养基的补充是在补充后细胞培养基中的牛磺酸终浓度为25mM。

在一个实施方案中，培养基的补充从培养进行的第3天开始每隔一天进行，优选作为补料的一部分。在优选实施方案中，从培养进行的第3天开始每隔一天进行的培养基补充是补充了岩藻糖。在更优选的实施方案中，从培养进行的第3天开始每隔一天进行的培养基补充是补充了岩藻糖，使得细胞培养基中的岩藻糖浓度提高0.4至1.6mM。在再更优选的实施方案中，从培养进行的第3天开始每隔一天进行的培养基补充是补充了岩藻糖，使得细胞培养基中的岩藻糖浓度提高0.8mM。

在优选实施方案中，培养基的补充从培养进行的第3天开始每隔一天进行，直至培养的第13天，优选作为补料的一部分。在更优选的实施方案中，从培养进行的第3天开始每隔一天进行的直至培养第13天的培养基补充是补充了岩藻糖。在更优选的实施方案中，从培养进行的第3天开始每隔一天进行的直至培养第13天的培养基补充是补充了岩藻糖使得细胞培养基中的岩藻糖浓度提高0.4至1.6mM。在再更优选的实施方案中，从培养进行的第3天开始每隔一天进行的直至培养第13天的培养基补充是补充了岩藻糖使得细胞培养基中的岩藻糖浓度提高0.8mM。

在一个实施方案中，之前任一个实施方案的方法中的培养基补充从培养进行的第5天开始每隔一天进行，优选作为补料的一部分。在优选实施方案中，从培养进行的第5天开始每隔一天进行的培养基补充是补充了锰。在更优选的实施方案中，从培养进行的第5天开始每隔一天进行的培养基补充是补充了锰，使得细胞培养基中的锰浓度提高0.04μM至0.08μM。在再更优选的实施方案中，从培养进行的第5天开始每隔一天进行的培养基补充是补充了锰，使得细胞培养基中的锰浓度提高0.068μM±0.01μM。

在优选实施方案中，培养基的补充从培养进行的第5天开始每隔一天进行，直至培养的第9天，优选作为补料的一部分。在更优选的实施方案中，从培养进行的第5天开始每隔一天进行的培养基补充是补充了锰。在更优选的实施方案中，从培养进行的第5天开始每隔一天进行的培养基补充是补充了锰，使得细胞培养基中的锰浓度提高0.04μM至0.08μM。在再更优选的实施方案中，从培养进行的第5天开始每隔一天进行的培养基补充是补充了锰，使得细胞培养基中的锰浓度提高0.068μM±0.01μM。

在优选实施方案中，在之前任一个实施方案中的给培养基补充锰是作为氯化锰(MnCl

在一个实施方案中，之前任一个实施方案的方法中的培养基补充从培养开始时进行牛磺酸补充，从培养进行的第3天开始每隔一天补充岩藻糖以及从培养进行的第5天开始每隔一天补充锰，任选以氯化锰方式。在优选实施方案中，培养基补充从培养开始时进行牛磺酸补充，从培养进行的第3天开始每隔一天补充岩藻糖直至培养的第13天以及从培养进行的第5天开始每隔一天补充锰，任选以氯化锰方式，直至培养的第9天，优选分别作用补料的一部分。在另一个优选的实施方案中，培养基补充从培养开始时进行牛磺酸补充，补充后细胞培养基中的牛磺酸浓度为12.5至50mM，从培养进行的第3天开始每隔一天补充岩藻糖，使得细胞培养基中的岩藻糖浓度提高0.4至1.6mM，以及从培养进行的第5天开始每隔一天补充锰，任选以氯化锰方式，使得细胞培养基中的锰浓度提高0.04μM至0.08μM。在更优选的实施方案中，培养基补充从培养开始时进行牛磺酸补充，补充后细胞培养基中的牛磺酸浓度为12.5至50mM，从培养进行的第3天开始每隔一天补充岩藻糖，直至培养的第13天，使得细胞培养基中的岩藻糖浓度提高0.4至1.6mM，以及从培养进行的第5天开始每隔一天补充锰，任选以氯化锰方式，直至培养的第9天，使得细胞培养基中的锰浓度提高0.04μM至0.08μM。在另一个优选的实施方案中，培养基补充从培养开始时进行牛磺酸补充，补充后细胞培养基中的牛磺酸终浓度为25mM，从培养进行的第3天开始每隔一天补充岩藻糖，使得细胞培养基中的岩藻糖浓度提高0.8mM，以及从培养进行的第5天开始每隔一天补充锰，任选以氯化锰方式，使得细胞培养基中的锰浓度提高0.068μM±0.01μM。在最优选的实施方案中，培养基补充从培养开始时进行牛磺酸补充，补充后细胞培养基中的牛磺酸终浓度为25mM，从培养进行的第3天开始每隔一天补充岩藻糖，直至培养的第13天，使得细胞培养基中的岩藻糖浓度提高0.8mM，以及从培养进行的第5天开始每隔一天补充锰，任选以氯化锰方式，直至第9天，使得细胞培养基中的锰浓度提高0.068μM±0.01μM。

在一个实施方案中，在细胞培养的生产期过程中进行细胞培养基的补充。

在一个实施方案中，在之前任一个实施方案的方法中的细胞培养在35至40℃之间进行，例如，在35、36、37、38、39或40℃或其中的任何温度下进行。在优选实施方案中，细胞培养在36至38℃之间进行，例如，在36、37或38℃或其中的任何温度下进行。在最优选的实施方案中，细胞培养在37℃下进行。

在一个实施方案中，在之前任一个实施方案的方法中的细胞培养在pH 6至9之间进行，例如，在pH 6、7、8或9下进行。在优选实施方案中，细胞培养在pH 7.05±0.05下进行。

在特别优选的实施方案中，之前任一个实施方案的细胞培养是补料-分批培养。

在一个实施方案中，之前任一个实施方案的方法中的糖蛋白是VEGF拮抗剂，优选抗VEGF抗体(参见实施例1-5)。在优选实施方案中，VEGF拮抗剂(优选抗VEGF抗体)的岩藻糖基化谱被改变。在更优选的实施方案中，改变的岩藻糖基化谱是参考VEGF拮抗剂(优选抗VEGF抗体)的岩藻糖基化谱的至少90％，优选至少95％，更优选至少96％，更优选至少98％。在另一个优选实施方案中，VEGF拮抗剂(优选抗VEGF抗体)的半乳糖基化谱被改变。在更优选的实施方案中，改变的半乳糖基化谱是参考VEGF拮抗剂(优选抗VEGF抗体)的半乳糖基化谱的至少90％，优选至少95％，更优选至少96％，更优选至少98％。在另一个再更优选的实施方案中，VEGF拮抗剂(优选抗VEGF抗体)的岩藻糖基化谱和半乳糖基化谱被改变。在最优选的实施方案中，改变的岩藻糖基化谱是参考VEGF拮抗剂(优选抗VEGF抗体)的岩藻糖基化谱的至少90％，优选至少95％，更优选至少96％，更优选至少98％和改变的半乳糖基化谱是参考VEGF拮抗剂(优选抗VEGF抗体)的半乳糖基化谱的至少90％，优选至少95％，更优选至少96％，更优选至少98％。

在一个实施方案中，之前任一个实施方案的方法中的糖蛋白是抗CD20抗体(参见实施例6)。在优选实施方案中，抗CD20抗体的岩藻糖基化谱被改变。在更优选的实施方案中，改变的岩藻糖基化谱是参考抗CD20抗体的岩藻糖基化谱的至少90％，优选至少95％，更优选至少96％，更优选至少98％。在另一个优选实施方案中，抗CD20抗体的半乳糖基化谱被改变。在更优选的实施方案中，改变的半乳糖基化谱是参考抗CD20抗体的半乳糖基化谱的至少90％，优选至少95％，更优选至少96％，更优选至少98％。在另一个再更优选的实施方案中，抗CD20抗体的岩藻糖基化谱和半乳糖基化谱被改变。在最优选的实施方案中，改变的岩藻糖基化谱是参考抗CD20抗体的岩藻糖基化谱的至少90％，优选至少95％，更优选至少96％，更优选至少98％和改变的半乳糖基化谱是参考抗CD20抗体的半乳糖基化谱的至少90％，优选至少95％，更优选至少96％，更优选至少98％。

尽管已经在附图和前述说明中详细说明和描述了本发明，但是这样的说明和描述被认为是说明性的或示例性的而不是限制性的。本发明不限于所公开的实施方案。通过研究附图、公开内容和从属权利要求，本领域技术人员在实践要求保护的发明时可以理解和实现所公开的实施方案的其他变化。

详细描述本质上仅是示例性的，并不旨在限制应用和使用。以下实施例进一步说明本发明，但并不限制本发明的范围。本领域技术人员可以根据本发明的描述进行各种变化和修改，并且此类变化和修改也包括在本发明中。

实施例

为了调节抗VEGF抗体的岩藻糖基化谱以更类似于已获得监管批准用于人类治疗的参考抗VEGF抗体的岩藻糖基化谱，在本例中是比没有培养基补充的情况下生产抗VEGF抗体时更高，进行了一系列补料分批培养实验，测试培养基和补料补充不同浓度的鸟苷、岩藻糖和甘露糖的影响。甘露糖和鸟苷在从头岩藻糖基化途径中起关键作用，甘露糖作为该过程的底物，而鸟苷作为三磷酸鸟苷的成分，这是酶促过程中底物活化所必需的，而岩藻糖作为所谓的岩藻糖基化的补救合成途径的底物(Gramer等，Biotechnol Bioeng 108:1591-1602(2011))。

细胞培养

源自普通CHO K1细胞的中国仓鼠卵巢细胞系(CHO-M)购自Selexis(Selexis SA，瑞士)。CHO-M细胞适于在无血清、化学限定的G11.2基础培养基(Irvine Scientific US)中生长。通过用编码抗VEGF抗体的重组DNA转染，将CHO-M细胞系进行基因工程化，以表达抗VEGF抗体。

实验在工作体积为1-10L的实验室规模的AMBR小型摇瓶/实验室台式生物反应器(Sartorius Stedim Biotech GmbH，Goettingen，德国)中进行，或在100L工艺生物反应器中进行。实施例中使用的生产规模和最大培养体积为5000L。

将CHO-M细胞在有氧条件下培养12天(溶解氧(DO)水平设置为40％并用空气和纯氧气混合物控制)。通过必要时调整曝气速率将pCO

通过最初在无血清、化学限定的基础培养基G11.2(Irvine Scientific US)中培养细胞12天来进行补料-分批培养。从培养的第3天(接种后)起每隔一天，将浓缩的补料溶液(补料A和补料B)以shot-wise模式添加到培养基中。

下面概括了实施例中使用的培养基和附加补充剂的供应商和目录号。

基础培养基和补料的详细组成可以在表1中找到。

表1：基础培养基、补料A和补料B的化合物(第3、5、7、9、11、13天*)。

在培养的第3、5、7、9和11天，向细胞培养物中加入添加后总培养体积的4％的补料A和添加后总培养体积的0.4％的补料B，其中补料A额外补充了两个不同浓度之一的鸟苷(Sigma-Aldrich，目录号No.：G6264)、岩藻糖(L-(-)-岩藻糖；Sigma-Aldrich，目录号No.：F2252)或甘露糖(D-(+)-甘露糖；Sigma-Aldrich，目录号No.：M6020)：鸟苷为20或60mM，岩藻糖为10或20mM和甘露糖为20或60mM。

纯化

对于质量分析，使用蛋白A色谱从发酵液中亲和纯化获得的抗体。这种捕获提供了对于带有Fc的分子的特别的选择性，从而在单个步骤中去除了99.5％以上的污染物。

分析

使用台盼蓝染色方法通过Countess

通过Cedex Bio HT分析仪(Roche，Mannheim，德国)测量了葡萄糖浓度

通过ABL80血气分析仪(Radiometer，Bronshoj，丹麦)测定溶解的二氧化碳含量(pCO2)。

为了原位pH计重新校准，使用S47 SevenMulti pH计(Mettler Toledo，Zurich，瑞士)进行在线pH测量。

通过Advanced Model 2020多样品渗透压计(Advanced Instruments，Norwood，MA)测定摩尔渗透压浓度。

通过蛋白A亲和HPLC测定了蛋白质效价。

本发明抗体的N-聚糖谱测定如下：经由用PNGase F在37℃下柱上消化3小时，将各个抗体样品变性和去糖基化后，将N-聚糖用荧光标记试剂(2-AB)标记。使用净化柱(HILIC)将多余的染料与标记的N-聚糖分离。然后在酰胺固定相上使用亲水性相互作用液相色谱(HILIC-UHPLC)分离标记的纯化的N-聚糖，并使用荧光检测确定标记的聚糖的相对数量。具体而言，借助

使用相应峰的面积％值计算释放的聚糖的量。与各自的参考抗体相比，评估了本发明抗体的四种主要聚糖(G0F、G1F、G1’F、G2F)。抗VEGF抗体的接受标准是：G0F：≥73.4面积％，G1F：4-12.9面积％，G1'F：2.3-5.6面积％，G2F：0.5-1.7面积％，总主要无岩藻糖基化(MAF)：1.9-3.7面积％。抗CD20抗体的接受标准是：G0F：40-56面积％；G1F：28-38面积％；G1'F：9-13面积％和G2F：5-12面积％。

结果

图1显示了不同补充剂对培养12天后的抗VEGF抗体的总主要无岩藻糖基化形式的影响。

补料-分批培养实验表明了与测试的岩藻糖替代品鸟苷和甘露糖相比，补充岩藻糖的补料导致抗VEGF抗体的总主要无岩藻糖基化形式(MAF)的最显著减少。在60mM的较高测试浓度下，补充鸟苷的补料似乎在降低总MAF方面是次佳的。这与补充岩藻糖补料后的测量结果形成对比，其中总MAF的降低在10mM的较低测试岩藻糖浓度下最有效。在甘露糖的情况下也是如此，与补充60mM甘露糖的补料相比，20mM的较低浓度在减少总的主要无岩藻糖基化形式方面更有效。因此，选择了岩藻糖进行进一步实验。

为了进一步分析岩藻糖对抗VEGF抗体岩藻糖基化谱的影响，进行了一系列补料-分批培养实验，测试补充不同浓度岩藻糖的补料培养基的影响。

除非另有说明，细胞培养、分离和分析均按上述实施例进行。

补料-分批培养进行了12天。在培养的第3、5、7、9和11天，向细胞培养物补加添加后总培养体积4％的补料A和添加后总培养体积的0.4％的补料B，其中补料A额外补充了浓度为10mM、20mM或40mM的岩藻糖(L-(-)-岩藻糖；Sigma-Aldrich，目录号No.：F2252)。

结果

在添加相应的含有岩藻糖的补料后，抗VEGF抗体的总主要无岩藻糖基化形式的浓度依赖性降低如图2所示。

与前述参考抗VEGF抗体相比，抗VEGF抗体的生物相似性在总主要无岩藻糖基化形式(MAF)(即岩藻糖基化谱)方面得到改善。补料-分批培养实验表明了与培养基缺乏岩藻糖的对照实验相比，在培养的第12天测量的抗VEGF抗体的总主要无岩藻糖基化形式因所有测试浓度的岩藻糖补料而减少，这带来了更类似于参考抗VEGF抗体的总MAF量。总MAF的这种减少是浓度依赖性的，因为以40mM的浓度补加岩藻糖时，实现了最显著的减少。然而，为了避免细胞培养物摩尔渗透压浓度的增加以及随之而来的不良副作用，选择了补充浓度为20mM的岩藻糖的补料用于进一步的实验。尽管用20mM岩藻糖的补料补充导致抗VEGF抗体的岩藻糖基化谱更类似于参考抗VEGF抗体的岩藻糖基化谱，但与参考抗VEGF抗体相比，抗VEGF抗体的半乳糖基化程度低于可接受的。

3.

为了改变抗VEGF抗体的半乳糖基化谱以更类似于参考抗VEGF抗体的半乳糖基化谱，进行了一系列补料-分批培养实验，测试在不同的时间补料补充不同浓度锰的影响，锰是β-1,4-半乳糖基转移酶的辅因子。

除非另有说明，细胞培养、分离和分析按实施例1进行。

补料-分批培养进行了11天。在培养的第3、5、7和9天；第5、7和9天；或第9天，以表2中所示的浓度，以四水氯化锰(II)(MnCl

结果

补料补充锰后糖基化谱分析的结果显示于表2中。在培养的第5天和第9天之间可以观察到添加锰对半乳糖基化的最有利影响，在该时期可以以最高比生产率来表征细胞。因此，在培养的第5、7和9天，在随后的补料-分批实验中，补料A补充1.7μM氯化锰。尽管通过用锰补充补料可以改善抗VEGF抗体的半乳糖基化谱，但还可以看出锰的添加会导致无岩藻糖基化糖型水平的显著增加(例如G0随锰增加，G0F随锰减少)。必须考虑进一步补充培养基以改变抗VEGF抗体的岩藻糖基化谱，以更类似于参考抗VEGF抗体的岩藻糖基化谱。

表2：不同MnCl

*从9个市售抗VEGF抗体批次的糖基化谱的平均数和标准偏差计算的。

4.

为了应对如后续实验计划的将细胞培养时间延长至14天时不希望的摩尔渗透压浓度增加和岩藻糖基化的进一步抑制，进行了一系列补料-分批培养实验，其中细胞培养基补充了渗透保护剂。选择牛磺酸作为可能的渗透保护剂，因为本领域已知补充牛磺酸也可以增加细胞培养物中产生的糖蛋白的效价。

除非另有说明，否则细胞培养、分离和分析按实施例1进行。

补料-分批培养进行14天。在培养开始时(接种后第0天)将牛磺酸(Sigma-Aldrich，目录号：T4571)以12.5mM、25mM或50mM的浓度添加到培养基中。此外，在培养第5、7和9天，以四水氯化锰(II)(MnCl

结果

图3显示了基础培养基补充牛磺酸对抗VEGF抗体的总主要无岩藻糖基化形式的浓度依赖性影响。

令人惊讶地，在基础培养基补充牛磺酸后，观察到抗VEGF抗体的总主要无岩藻糖基化形式的浓度依赖性降低。补料-分批培养实验表明了与在缺乏牛磺酸的基础培养基中培养相比，在所有补充牛磺酸的培养物中，培养14天后抗VEGF抗体的总主要无岩藻糖基化形式(MAF)的量减少。高浓度牛磺酸补充剂(50mM)显示出岩藻糖基化谱，其最接近参考抗VEGF抗体的岩藻糖基化谱的相应范围。然而，对于接下来的实验，选择25mM牛磺酸的浓度用于培养基补充，以避免细胞培养物摩尔渗透压浓度进一步增加并保持牛磺酸作为渗透保护剂的作用。

5.

接下来，研究了除了补料补充岩藻糖和锰，通过基本培养基的牛磺酸补充，抗VEGF抗体的糖基化谱的可改变性。

除非另有说明，否则细胞培养、分离和分析按实施例1进行。

细胞培养

源自普通CHO K1细胞的中国仓鼠卵巢细胞系(CHO-M)购自Selexis(Selexis SA，瑞士)。CHO-M细胞适于在无血清、化学限定的G11.2基础培养基(Irvine Scientific US)中生长。通过用编码抗VEGF抗体的重组DNA转染，将CHO-M细胞系进行基因工程化，以表达抗VEGF抗体。

在培养开始时(接种后第0天)，通过在补充有25mM牛磺酸(Sigma-Aldrich，目录号：T4571)的无血清、化学限定的基础培养基G11.2(Irvine Scientific US)中培养细胞，进行补料-分批培养14天。

从培养的第3天(接种后)起每隔一天，以shot-wise模式将补充20mM岩藻糖的添加后总培养体积的4％的补料A和添加后总培养体积的0.4％的补料B分开添加到培养基中。此外，在培养的第5、7和9天(接种后)，以四水氯化锰(II)(MnCl

实施例5中使用的介质和附加补充剂的供应商和目录号概括如下。

实施例5中使用的基础培养基和补料的详细组成见表3。

表3：基础培养基、补料A(第3、11、13天)、补料A(第5、7、9天)和补料B(第3、5、7、9、11、13天)溶液的化合物

结果

牛磺酸、岩藻糖和锰对抗VEGF抗体的总主要无岩藻糖基化形式的影响显示于图4中。

补料-分批培养实验表明，与在缺乏牛磺酸和岩藻糖的基础培养基中培养相比，通过添加25mM牛磺酸到基础培养基可以减少培养14天后抗VEGF抗体的总主要无岩藻糖基化形式(MAF)的量。此外，通过对含有牛磺酸的细胞培养实施20mM岩藻糖补料，可以进一步降低抗VEGF抗体的总MAF量。将牛磺酸和岩藻糖添加到细胞培养物中的协作效应使得岩藻糖基化谱在参考抗VEGF抗体的岩藻糖基化谱的相应范围内拟合良好。

图5说明了从培养的第3天(接种后)开始，根据对发酵液样品的每日分析的岩藻糖基化谱。

分析显示出补料补充20mM岩藻糖，结合补料补充1.7μM锰和培养基补充25mM牛磺酸结合补料补充1.7μM锰可以单独减少总主要无岩藻糖基化糖型(MAF)(图5中的点划线以及虚线)。然而，只有当所有三种成分一起补充时才观察到最低的MAF谱(图5中的点线)。该MAF谱完全在总MAF谱的范围内，即参考抗VEGF抗体的岩藻糖基化谱的至少90％，优选至少95％，更优选至少96％，更优选至少98％。

相似地，根据每日分析的各个样品的非半乳糖基化糖型(G0)谱显示于图6中。

实验表明了补料补充20mM岩藻糖，结合补料补充1.7μM锰和培养基补充25mM牛磺酸结合补料补充1.7μM锰可以单独减少非半乳糖基化糖型(G0)的量(图6中点划线以及虚线)。然而，仅在培养基和补料中分别补充所有三种成分时才观察到最低的G0谱，其在半乳糖基化谱的范围内，即参考抗-VEGF抗体的半乳糖基化谱的至少90％，优选至少95％，更优选至少96％，更优选至少98(图6中的点线)。总而言之，鉴于非半乳糖基化糖型(G0)谱，即半乳糖基化谱，通过培养物组合补充牛磺酸、锰和岩藻糖，可以提高抗VEGF抗体与参考抗VEGF抗体的相似性。

6.

在抗CD20抗体的类似补料-分批实验中，可以实现在向培养基补充岩藻糖、锰和牛磺酸后糖基化谱的改变方面的相同效果。

除非另有说明，细胞培养、补料方案、分离和分析如实施例5中所述进行。

通过在无血清、化学限定的基础培养基G11.2(Irvine Scientific US)中培养细胞12天进行补料-分批培养，该培养基在培养开始(接种后第0天)时补充有25mM牛磺酸(Sigma-Aldrich，目录号：T4571)。

从培养的第3天(接种后)起每隔一天，将补充20mM岩藻糖的添加后总培养体积的4％的补料A和添加后总培养体积的0.4％的补料B以shot-wise模式分开添加到培养基中。此外，在培养的第5、7和9天(接种后)，以四水氯化锰(II)(MnCl

结果

表4显示了基于从培养的第3天(接种后)起对发酵液样品的每日分析，不同补料补充策略对抗CD20抗体糖基化谱的作用。

糖分析揭示了在补充有牛磺酸的培养基中培养3或4天，并补加补充了岩藻糖的补料，对抗CD20抗体的岩藻糖基化谱和半乳糖基化谱没有作用。仅从培养的第5天开始，将补充了岩藻糖和锰的补料加入细胞培养物中时，换言之，当所有三种成分岩藻糖、锰和牛磺酸都存在于细胞培养物中时，可以改变抗CD20抗体的岩藻糖基化谱和半乳糖基化谱，以更类似于参考抗CD20抗体的相应岩藻糖基化谱和半乳糖基化谱。

表4：岩藻糖、锰和牛磺酸补充对抗CD20抗体的糖基化谱的作用

**从13个市售抗CD20抗体批次的糖基化谱的平均数和标准偏差计算的。