一种含泰山霉素的杀菌组合物

摘要

本发明提供了一种含泰山霉素的杀菌组合物，可用于防治番茄/马铃薯晚疫病、黄瓜霜霉病和辣椒疫霉病等多种卵菌病害，还可防治棉花和茄子的猝倒病等作物苗期病害，应用价值大，经济和社会效益十分显著，可广泛用于农业生产领域。

说明书

技术领域

本发明属于植物保护领域，涉及一种含泰山霉素的杀菌组合物，具体涉及一种含泰山霉素的防治卵菌纲病害的杀菌组合物。

背景技术

由卵菌纲真菌引起的病害是世界范围内的问题，许多重要蔬菜和水果上均有发生。重要的病害包括番茄和马铃薯晚疫病，葡萄、黄瓜等的霜霉病，辣椒疫霉等。卵菌纲病害如霜霉病、疫病等是非常重要的病害，其造成的损失也是不容忽视的。我国1997年蔬菜和瓜类霜霉病、疫病用药费用为7.96亿元，占十六类作物病害总费用的32.5%。在国外历史上曾因马铃薯晚疫病的发生，导致数万人饥饿而死。由于缺乏有效的抗病品种，目前化学防治仍是防治卵菌病害最有效的方法之一，但随着一些内吸性杀菌剂的不合理及频繁使用，抗性问题已日益突出。因此，采用复配的方式解决抗性成为需要。

代森锌、代森锰锌、肟菌酯、氰霜唑、吡唑醚菌酯、烯酰吗啉等杀菌剂是传统生产中防治卵菌病害的药剂。但是长期使用化学农药，带来了杀菌剂抗性产生、环境污染严重、食品安全等问题。有必要筛选防治卵菌病害的绿色、安全的新型药剂应用于农业防控中。氟吡菌胺（fluopicolide）是拜耳公司开发的一种新型吡啶酰胺类内吸性杀菌剂，主要用于防治卵菌纲病原菌引起的病害如霜霉病和疫病等。氟吡菌胺具有独特的作用方式，主要作用于细胞膜和细胞间的特异性蛋白而表现杀菌活性，与其他类杀菌剂无交互抗性，对病原菌的各主要形态均有很好的抑制活性，同时具有保护和治疗作用，而且持效性很好。氟吡菌胺有良好的内吸性，能通过茎叶吸收，由植株下部向上部方向传导，沿植株木质部向整株作物分布。

发明内容

针对现有技术中防治卵菌纲药剂抗性产生快的问题，本发明提供一种含泰山霉素的杀菌组合物，可用于防治黄瓜、葡萄、辣椒和马铃薯等多种蔬菜水果的卵菌病害，且具有协同增效作用。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案。

一株极细链格孢（

优选地，所述发酵液可以包含或不包含菌体。所述菌体可以为菌丝体或孢子。

所述提取物为极细链格孢菌SDTF016的发酵液的乙酸乙酯提取物。所述提取物中的主要有效成分为邻苯二甲酸二丁酯、4-甲基-5-噻唑乙醇、2-甲氧基雷锁酚、对羟基苯乙醇、4-香豆酸和烟酸。

优选地，所述提取物的制备方法包括以下步骤：

（1）将极细链格孢菌SDTF016在真菌发酵液中发酵，获得发酵液；

（2）将发酵液过滤除菌、除蛋白，获得滤液；

（3）将滤液以乙酸乙酯为淋洗液过硅胶柱，获得流出液；

（4）流出液去除淋洗液获得固体的泰山霉素粗提物。

更优选地，上述步骤中还包括进一步纯化粗提物的过程，包括以下步骤：

（i）将粗提物溶解后以液相色谱分离并收集214 nm波长下有吸收峰的流出液；

（ii）将流出液去除溶剂获得提取物泰山霉素。

一种含上述提取物的杀菌组合物，包括泰山霉素和杀菌剂A；

所述杀菌剂A选自氟吡菌胺、氟醚菌酰胺、烯酰吗啉、氟噻唑吡乙酮、霜霉威盐酸盐、氰霜唑、甲霜灵、精甲霜灵、噁霜灵和霜脲氰中的至少一种。

优选地，所述提取物和杀菌剂A的质量比为1:200-5000；优选为1:1000-5000。

优选地，所述提取物和杀菌剂A在组合物中的含量为1%-100%（w/w）；更优选为20%-55%（w/w）。

优选地，所述组合物中还包括其他有效成分，如杀菌剂、杀虫剂或/和生长调节剂，用于扩大防治谱、省力方便施用。

优选地，所述组合物中还包括辅料，所述辅料可以为填料、溶剂、崩解剂、增稠剂、防冻剂、表面活性剂等用于有效成分稳定存在和易于均匀施用。

本发明具有以下优点：

本发明提供了一种含泰山霉素的杀菌组合物，可用于防治番茄/马铃薯晚疫病、黄瓜霜霉病和辣椒疫霉病等多种卵菌病害，还可防治棉花和茄子等作物的猝倒病等作物苗期病害，应用价值大，经济和社会效益十分显著，可广泛用于农业生产领域。

生物保藏信息

极细链格孢（

附图说明

图1为菌株SDTF016在真菌培养基上生长的菌丝透射电镜照片；

图2为泰山霉素粗提物高效液相色谱图。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明做进一步说明，但本发明不受下述实施例的限制。

实施例1 极细链格孢SDTF016的分离和鉴定

于泰安市采集泰山附近农田土壤，从中分离真菌菌株。具体分离、纯化过程为：称取10 g过筛土壤样品，放入装有90 mL无菌水和少量玻璃珠的250 mL灭菌三角瓶中，将三角瓶置于37℃、180 rpm摇床上振荡30 min，使之充分悬浮，用无菌水将悬液稀释至10

采用Ezup柱式真菌基因组DNA抽提试剂盒（上海生工生物工程股份有限公司）提取菌株基因组DNA，以通用引物ITS1和ITS4为引物PCR扩增真菌ITS序列，获得大小约为500 bp的目的条带，PCR产物进行测序。目的基因长度557bp，将测序获得序列与GenBank中已知的基因组序列进行同源性比对分析，并且选择同源性相近的基因组序列进行完整的系统进化分析并构建该菌株的系统发育树。根据系统发育树可知，试验菌株序列与极细链格孢菌的序列一致性为100%；并且系统进化树分析结果表明，试验菌株与极细链格孢菌模式菌株处于同一分支，具有最近的遗传距离和亲缘关系。因此根据扫描电镜观察结果、生理生化试验，以及对ITS序列分析后，最终将SDTF016鉴定为极细链格孢（

实施例2 极细链格孢SDTF016发酵液的获得及发酵产物的提取

采用多因素正交试验优化泰山变种的发酵条件（培养基碳源、氮源、无机盐组成与含量、发酵时间12-120h、发酵温度20-37℃、转速90-150rpm），采用以下优化后条件进行发酵：用直径为7 mm的打孔器在极细链格孢SDTF016菌株的PDA平板菌落边缘打取菌饼，接于150 mL液体真菌培养基（MgSO

将上述发酵液经真空泵抽滤后，得到菌丝和除菌发酵液，除菌发酵液进一步过0.2μm膜得到去除蛋白和杂质的深黄色透明无菌发酵液，加入装有200-300目层析硅胶的层析柱中，以乙酸乙酯为溶剂，进行柱层析，收集流出液，根据活性监测结果合并流出液，将收集的透明液体在旋转蒸发仪40 ℃条件下蒸干乙酸乙酯，得到淡黄色固体，即极细链格孢SDTF016菌株代谢产物粗提物。将粗提物用乙腈溶解后经Agilent 1200 LC高效液相色谱仪进行样品分析，发现在214 nm下的出峰图如图2所示。

将上述极细链格孢SDTF016菌株代谢产物粗提物用乙腈溶解后经在岛津LC-20AP制备液相色谱进行样品的制备，所用色谱柱为大连依利特C

将泰山霉素采用超高分辨液质联用（UPLC-MS）和核磁共振波谱分析可知，其主要成分包含邻苯二甲酸二丁酯、4-甲基-5-噻唑乙醇、2-甲氧基雷锁酚、对羟基苯乙醇、4-香豆酸和烟酸6种。6种主要成分在发酵液中的重量百分含量为0.01%-0.05wt%，平均含量为0.02%，是一种在214 nm紫外吸收波长的混合活性物质。

实施例3 极细链格孢SDTF016发酵液和提取物对卵菌病害的效果

将极细链格孢SDTF016按照实施例2中的发酵方法发酵，获得除菌发酵液并提取泰山霉素。将泰山霉素以0.1% TX-100水溶液配制成不同浓度的溶液，测定喷雾不同浓度泰山霉素后分别接种黄瓜霜霉菌、葡萄霜霉菌、番茄晚疫病菌、辣椒疫霉菌和瓜果腐霉菌的毒力，EC

实施例4 极细链格孢SDTF016发酵液/泰山霉素和氟吡菌胺对黄瓜霜霉病的联合毒力

将极细链格孢SDTF016按照实施例2中的发酵方法发酵获得除菌发酵液（泰山霉素含量约0.022%）并提取泰山霉素，并配制0.02%泰山霉素水溶液；然后分别将发酵液或泰山霉素水溶液稀释500倍，将50%氟吡菌胺可湿性粉剂（WP）以清水稀释500倍，然后分别将发酵液或泰山霉素的稀释液和氟吡菌胺稀释液等体积混合。将黄瓜苗喷雾接种黄瓜霜霉病菌（

表1 发酵液和泰山霉素与氟吡菌胺混用对黄瓜霜霉病的防治作用

表中数据经新复极差法统计，含相同字母者为差异不显著。

结果如表1所示：发酵液和0.02%泰山霉素水溶液分别稀释500倍喷雾，处理后7天，对黄瓜霜霉病防治效果达55.0%-60.5%。50%氟吡菌胺WP稀释500倍喷雾，药后7天的防效为71.3%。将发酵液和0.02%泰山霉素水溶液分别与氟吡菌胺混用，有效成分用量较单用均减少1/2，两组合分别混合后各稀释500倍喷雾，处理后7天的防效分别为93.0%和90.7%，增效十分显著。这说明，在黄瓜霜霉病发生初期，氟吡菌胺和发酵液或泰山霉素混用后喷雾进行防治表现了良好的协同增效作用。

将极细链格孢SDTF016按照实施例2中的发酵方法发酵获得除菌发酵液并提取泰山霉素，然后将用1%吐温-80将氟吡菌胺配制母液，然后按照泰山霉素:氟吡菌胺=1:1000-1:5000分别将泰山霉素加入氟吡菌胺母液中，然后稀释5-7各浓度进行保护作用毒力测定，计算共毒系数（CTC）。

表2 泰山霉素和氟吡菌胺混用对黄瓜霜霉病保护作用的联合毒力

结果如表2所示：泰山霉素和氟吡菌胺分别按1∶1000、1∶2000、1∶4000混用，对黄瓜霜霉病的保护EC

实施例5 泰山霉素和氟吡菌胺对致病疫霉的联合毒力

将极细链格孢SDTF016按照实施例2中的发酵方法发酵获得除菌发酵液并提取泰山霉素，然后将用1%吐温-80将氟吡菌胺配制母液，然后按照泰山霉素:氟吡菌胺=1:400-1:5000分别将泰山霉素加入氟吡菌胺母液中，然后稀释5-7各浓度对致病疫霉（

表3 泰山霉素和氟吡菌胺混用对致病疫霉的联合毒力

结果如表3所示：泰山霉素和氟吡菌胺分别按照质量比1:400、1:1000、1:2000、1:3000、1:4000、1:5000混用，对致病疫霉菌的EC

实施例6 泰山霉素和氟醚菌酰胺、烯酰吗啉、氟噻唑吡乙酮、霜霉威盐酸盐、氰霜唑、甲霜灵、恶霜灵、霜脲氰对黄瓜霜霉病菌的联合毒力

将极细链格孢SDTF016按照实施例2中的发酵方法发酵获得除菌发酵液并提取泰山霉素，然后将用1%吐温-80将氟醚菌酰胺、烯酰吗啉、氟噻唑吡乙酮、霜霉威盐酸盐、氰霜唑、甲霜灵、噁霜灵、霜脲氰分别配制成母液，然后按照泰山霉素:杀菌剂=1:100-1:5000（w/w）分别将泰山霉素加入各药剂的母液中，然后稀释5-7各浓度对黄瓜霜霉病菌（

实施例7 泰山霉素.氟吡菌胺悬浮剂（SC）的制备

按照以下重量百分比的配方称取原料和助剂：

配方中的填充剂可为白炭黑、硅藻土；润湿分散剂可为Morwet EFW、十二烷基硫酸钠、EL80、农乳500号；增稠剂可为高效聚硅氧烷、黄原胶、硅酸镁铝；防冻剂为乙二醇；按照常规的悬浮剂制备方法，将氟吡菌胺气流预粉碎，然后与泰山霉素和部分助剂混合加水获得料浆，然后球磨至规定细度，出料后加入剩余辅料制备成悬浮剂剂型。

实施例8 泰山霉素.氟醚菌酰胺可湿性粉剂（WP）的制备

按照以下重量百分比的配方称取原料和助剂：

配方中的填充剂可为白炭黑、硅藻土、膨润土、高岭土、轻钙、凹凸棒土；润湿剂可为Morwet EFW、十二烷基硫酸钠、EL80、农乳500号；分散剂可以为Morwet D-425、TERSPERSE2700；按照常规的可湿性粉剂制备方法，将原药和助剂气流粉碎后制备成可湿性粉剂。

实施例9 泰山霉素.甲霜灵悬浮剂（WP）的制备

按照以下重量百分比的配方称取原料和助剂：

配方中的填充剂可为白炭黑、硅藻土、膨润土、高岭土、轻钙、凹凸棒土；润湿剂可为Morwet EFW、十二烷基硫酸钠、EL80、农乳500号；分散剂可以为Morwet D-425、TERSPERSE2700；按照常规的可湿性粉剂制备方法，将甲霜灵以部分填充剂吸附，然后与泰山霉素和助剂气流粉碎后制备成可湿性粉剂。

实施例10 泰山霉素.霜脲氰可湿性粉剂（SC）的制备

按照以下重量百分比的配方称取原料和助剂：

配方中的填充剂可为白炭黑、硅藻土；润湿分散剂可为Morwet EFW、十二烷基硫酸钠、EL80、农乳500号；增稠剂可为高效聚硅氧烷、黄原胶、硅酸镁铝；防冻剂为乙二醇；按照常规的悬浮剂制备方法，将霜脲氰、泰山霉素和部分助剂混合加水获得料浆，然后球磨至规定细度，出料后加入剩余辅料制备成悬浮剂剂型。

实施例11 泰山霉素.霜霉威盐酸盐水剂（AS）的制备

按照以下重量百分比的配方称取原料和助剂：

配方中的乳化剂可为Morwet EFW、十二烷基硫酸钠、农乳500号；防冻剂为乙二醇；按照常规的水剂制备方法，将泰山霉素、霜霉威盐酸盐和乳化剂、防冻剂加水混匀过滤后出料获得泰山霉素.霜霉威盐酸盐水剂。