抗Cyclophilin A的单克隆抗体及其在治疗炎症中的应用

摘要

本发明公开了抗Cyclophilin A的单克隆抗体或其抗原结合部分及其应用。该单克隆抗体或其抗原结合部分含有名称为VH的重链可变区和名称为VL的轻链可变区，VH和VL均由决定簇互补区和框架区组成；VH和VL的决定簇互补区均由CDR1、CDR2和CDR3组成；VH的CDR1的氨基酸序列如SEQ ID No.1中第11位‑第18位所示；VH的CDR2的氨基酸序列如SEQ ID No.1中第36位‑第42位所示；VH的CDR3的氨基酸序列如SEQ ID No.1中第81位‑第94位所示；VL的CDR1的氨基酸序列如SEQ ID No.2中第28位‑第38位所示；VL的CDR2的氨基酸序列如SEQ ID No.2中第56位‑第58位所示；VL的CDR3的氨基酸序列如SEQ ID No.2中第95位‑第103位所示。该单克隆抗体可以特异性识别CypA，拮抗CypA的作用并抑制CypA调控的相关炎性因子的表达。

说明书

技术领域

本发明涉及生物医学技术领域，尤其是涉及抗Cyclophilin A的单克隆抗体及其在治疗炎症中的应用。

背景技术

Cyclophilin A（亲环素A，CypA）具有肽基脯氨酰顺/反异构酶活性，是一种在生物界广泛存在、高度保守的蛋白质。CypA广泛分布在细胞内，当细胞受到外界刺激或处于活性氧应激状态时，也能够分泌到细胞外。CypA是免疫抑制药物Cyclosporin A（环孢菌素A，CsA）在细胞内的主要受体。CypA-CsA复合物与钙调磷酸酶结合后，能够抑制T细胞的活化。CypA还参与细胞凋亡、转录调控、信号转导、病毒复制等多种生物学过程。

CypA在炎症调控中也发挥了重要作用。将CypA在细胞外作用于小鼠骨髓来源的巨噬细胞后，IL-1β、IL-6、TNFα等促炎细胞因子的表达水平显著升高。CypA还有助于维持细胞内核转录因子-κB (NF-κB) p65亚基的稳定性，并促进p65入核，从而促进IL-6等促炎细胞因子的表达。在心血管系统炎症动脉粥硬化发生过程中，CypA表达显著增加，从而促进白细胞迁移，并诱导MMP-9、IL-6与TNF-α的表达。另外，脂多糖（LPS）诱导的急性肺损伤、脓毒血症、系统性红斑狼疮等炎症相关疾病的发生过程中，均可观察到CypA与炎症的联系。因此，有必要利用特异性抗体拮抗CypA的作用并抑制CypA调控的相关信号通路，促进其在病毒、细菌等因素诱发的炎症相关疾病治疗中的应用。

发明内容

本发明提供了抗CypA单克隆抗体或其抗原结合部分，所述单克隆抗体或其抗原结合部分含有名称为V

所述V

所述V

所述V

所述V

所述V

所述V

其中所述重链可变区和轻链可变区的框架区可为鼠源或人源化的。

所述单克隆抗体还可包含恒定区，并且所述恒定区是鼠源或人源化的。

所述抗原结合部分可选自Fab片段、Fab’片段、F(ab’)2片段、Fv片段、sc-Fv和双体中的至少一种。

“Fab片段”包含一条轻链以及一条重链的CH1和可变区。Fab分子的重链不能与另一个重链分子形成二硫键。

“Fab’片段”含有一条轻链以及一条重链的部分或片段，所述部分或片段含有VH结构域和CH1结构域以及在CH1和CH2结构域之间的区域。

“F(ab’)2片段”含有两条轻链和两条重链，所述重链含有在CH1和CH2结构域之间的恒定区的一部分，使得在两条重链之间形成链间二硫键。F(ab’)2片段因而由两个Fab’片段组成，而两个Fab’片段通过两条重链之间的二硫键连接在一起。

“Fv片段”包含来自重链和轻链的可变区，但是缺少恒定区。

“单链Fv”或“scFv”，是指包含抗体的VH结构域和VL结构域的抗体片段，其中这些结构域以单一多肽链形式存在。通常，Fv多肽还包含VH结构域和VL结构域之间的多肽接头，所述接头使scFv能够形成期望的结构以进行抗原结合。

“双体”指具有两个抗原结合位点的小抗体片段，所述片段在同一多肽链中包含重链可变结构域(VH)和与之连接的轻链可变结构域(VL)(VH-VL或VL-VH)。通过使用短得不能让同一链上的两个结构域之间发生配对的接头，各结构域被迫与另一条链的互补结构域发生配对，从而产生两个抗原结合位点。

可选地，根据上述的单克隆抗体或其抗原结合部分，所述单克隆抗体是下述任一种：

a）由上述的V

b）含有a）所述单链抗体的融合抗体；

c）含有上述的V

d）含有上述的V

e）由保藏号为CGMCC No.21909的杂交瘤细胞系QH01产生的单克隆抗体。

本发明还提供了与上述的单克隆抗体或其抗原结合部分相关的生物材料，所述生物材料为B1）至B17）中的任一种：

B1）编码上述的单克隆抗体或其抗原结合部分的核酸分子；

B2）含有B1）所述核酸分子的表达盒；

B3）含有B1）所述核酸分子的重组载体；

B4）含有B2）所述表达盒的重组载体；

B5）含有B1）所述核酸分子的重组微生物；

B6）含有B2）所述表达盒的重组微生物；

B7）含有B3）所述重组载体的重组微生物；

B8）含有B4）所述重组载体的重组微生物；

B9）含有B1）所述核酸分子的动物细胞系；

B10）含有B2）所述表达盒的动物细胞系；

B11）含有B3）所述重组载体的动物细胞系；

B12）含有B4）所述重组载体的动物细胞系；

B13）含有B1）所述核酸分子的植物细胞系；

B14）含有B2）所述表达盒的植物细胞系；

B15）含有B3）所述重组载体的植物细胞系；

B16）含有B4）所述重组载体的植物细胞系；

B17）产生上述的单克隆抗体的动物细胞系。

B9）和/或B17）动物细胞系例如为保藏号为CGMCC No.21909的杂交瘤细胞系QH01。

可选地，根据上述的生物材料，B1）所述核酸分子为编码上述的单克隆抗体或其抗原结合部分的基因。

所述基因可为如下A）或B）所述的DNA分子：

A）所述V

B）与A）限定的DNA分子具有90％以上的同一性且编码所述单克隆抗体或其抗原结合部分的DNA。

上述生物材料中，B2）所述的表达盒，是指能够在宿主细胞中表达所述单克隆抗体或其抗原结合部分的DNA，该DNA不但可包括启动所述单克隆抗体或其抗原结合部分基因转录的启动子，还可包括终止所述单克隆抗体或其抗原结合部分基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。可用现有的表达载体构建含有所述单克隆抗体基因表达盒的重组载体。

上述生物材料中，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。

上述生物材料中，所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌。

上述生物材料中，所述动物细胞系和植物细胞系均可为非繁殖材料。

上述生物材料中，“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比（%）表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。上述生物材料中，90％以上的同一性可为至少91%、92%、95%、96%、98%或99%的同一性的DNA分子。

本发明还提供了用于治疗炎症性疾病的产品，其包括上述的单克隆抗体或其抗原结合部分或上述的生物材料。所述产品还可包括奥司他韦和阿奇霉素中的至少一种。

本发明还提供了检测亲环素A的试剂盒，其包括上述的单克隆抗体或其抗原结合部分。

上述的单克隆抗体或其抗原结合部分、上述生物材料或上述产品的应用也属于本发明的保护范围之内。该应用为下述任一应用：

X1、在制备治疗炎症性疾病的药物中的应用；

X2、在治疗炎症性疾病中的应用；

X3、在制备检测CypA的产品中的应用；

X4、在检测CypA中的应用。

所述炎症性疾病可为肺炎、类风湿关节炎、系统性红斑狼疮、动脉粥样硬化等。

所述肺炎可为由病毒引起的肺炎、细菌引起的肺炎、LPS引起的肺炎及IL-1β增多引起的肺炎。

本发明提供的单克隆抗体或其抗原结合部分可以特异性识别CypA，干预CypA与其胞外受体的结合，从而抑制机体炎症反应。同时，本发明首次利用IL-1β、病毒或细菌诱导的肺炎模型评价抗CypA单克隆抗体（以下简称anti-CypA单抗）治疗炎症的效果。

参据的生物材料（株）：QH01。

建议的分类命名：小鼠杂交瘤细胞。

保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。

保藏机构简称：CGMCC。

地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

保藏日期：2021年3月22日。

保藏中心登记入册编号：CGMCC No.21909。

附图说明

图1为表1 anti-CypA单抗亚型鉴定结果。

图2为anti-CypA单抗检测组织中CypA的表达。

图3为anti-CypA单抗检测细胞中CypA的表达。

图4为anti-CypA单抗治疗LPS诱导的肺炎模型中小鼠的肺指数。

图5为anti-CypA单抗治疗LPS诱导的肺炎模型中小鼠细胞因子的表达。

图6为anti-CypA单抗治疗IL-1β诱导的肺炎模型中小鼠的肺指数。

图7为anti-CypA单抗治疗IL-1β诱导的肺炎模型中小鼠细胞因子的表达。

图8为anti-CypA单抗治疗A型流感病毒诱导的肺炎模型中小鼠的肺指数。

图9为anti-CypA单抗治疗A型流感病毒诱导的肺炎模型中小鼠IL-1β的表达。

图10为anti-CypA单抗治疗A组链球菌诱导的肺炎模型中小鼠的肺指数。

图11为anti-CypA单抗治疗A组链球菌诱导的肺炎模型中小鼠IL-1β的表达。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

雌性C57BL/6小鼠购自北京维通利华实验动物有限责任公司；雌性C57BL/6小鼠在下文中简称小鼠。

IAV-WSN由本实验室保存（记载于Zheng, W., Fan, W., Zhang, S., et al.(2019). Naproxen Exhibits Broad Anti-influenza Virus Activity in Mice byImpeding Viral Nucleoprotein Nuclear Export. Cell Reports 27, 1875-1885e1875）。

A组链球菌由中国科学院微生物研究所病原微生物与免疫学重点实验室王北难研究员提供（记载于Li, N., Ren, A., Wang, X., et al. (2015). Influenza viralneuraminidase primes bacterial coinfection through TGF-beta-mediatedexpression of host cell receptors. Proc Natl Acad Sci U S A 112, 238-243）。

采用Prism 9 （GraphPad）统计软件对数据进行处理，采用two-tailed Student’st test检验。

实施例1、anti-CypA单抗的制备

用重组CypA(记载于Li, W., Liu, W., Chen, C., Fan, W., Zhang, H., Liu,W., and Sun, L. (2018). [Effect of extracellular cyclophilin A oninflammatory response and anti-inflammatory activity of antibody againstcyclophilin A]. Sheng wu gong cheng xue bao = Chinese journal ofbiotechnology 34, 90-101.)，按20ug /只小鼠（体重约20g），肌肉注射初次免疫SPF 级BALB/c雌性小鼠。之后每周进行1次加强免疫，共计5次。加强免疫结束1周后用免疫原50ug，腹腔冲击免疫小鼠。眼眶取血，ELISA检测免疫小鼠的血清中的抗体效价，筛选抗体效价较高的小鼠进行杂交瘤融合。

细胞融合实验，取小鼠脾细胞与SP2/0细胞，采用PEG法进行融合。融合完细胞用半固体培养基（含HAT）进行筛选培养。单克隆细胞初次筛选，将96孔培养板中的单克隆细胞上清全部弃去，添加200ul/孔，20%新生牛IMDM培养基（含HT），做第一次筛选。单克隆细胞二次筛选，用重组CypA蛋白包板，对挑选的克隆采用ELISA方法，做第二次筛选；单克隆细胞三次筛选，将二次筛选得到的阳性的细胞株，分别用重组CypA蛋白和“标签蛋白”包板，采用ELISA方法，做第三次筛选。获得能分泌anti-CypA单抗的3株杂交瘤细胞株，将该3株杂交瘤分泌的anti-CypA单抗分别命名为QH01、QH09和QH12。分泌QH01的杂交瘤细胞株已于2021年3月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称 CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编 100101），保藏号为 CGMCC No.21909。

将获得的杂交瘤细胞注射BALB/c鼠腹腔，细胞浓度为1.5×10

实施例2、anti-CypA单抗的亚型鉴定

用包被液（碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液，pH9.6）稀释“亚类包被抗体”（Goat Anti-Mouse Ig，Human ads-UNLB），终浓度为2ug/ml，包被酶标板，100ul/孔，4℃，过夜，后用洗液（含0.05%吐温的PBS）洗涤3次。封闭液（含2%脱脂奶粉的 PBS）封闭，200ul/孔，37℃孵育2h，后用洗液洗涤3次。分别加入实施例1制备的anti-CypA单抗QH01、QH09和QH12，同时设置阴性对照（SP2/0培养上清），均为100ul/孔，37℃孵育1h，后用洗液洗涤3次。用PBS稀释各型亚类二抗，100ul/孔，分别加入适当的孔中，37℃孵育1h，取出后用洗液洗涤3次。加入显色液（1%A液+10%B液（A液：1%TMB in DMSO；B液：含0.1% CH

分析结果如图1中的表1所示，QH01重链为IgG2b，轻链为κ；QH09和QH12重链为IgG1，轻链为κ。

实施例3、检测anti-CypA单抗对组织和细胞中CypA的特异性识别

使用含Protease Inhibitor Cocktail（Roche，#5871）的Lysis Buffer（150 mMNaCl，20 mM HEPES，1 mM EDTA，1% Triton100，10%甘油）裂解293T细胞及C57BL/6小鼠肺组织，分别加入适量的5×SDS-PAGE蛋白上样缓冲液，98℃加热10min获得293T细胞上样液和小鼠肺组织上样液。293T细胞上样液（293T Lysis）和小鼠肺组织上样液（Mouse LungLysis）分别进行SDS-PAGE电泳，以实施例1制备的anti-CypA单抗（QH01/QH09/QH12）以及抗β-肌动蛋白抗体（Santa Cruz公司，产品目录号为sc-1616-R）作为一抗，HRP标记的山羊抗小鼠的单克隆抗体（Jackson，产品目录号为115035003）作为二抗，进行Western印迹分析。

3株anti-CypA单抗QH01、QH09和QH12）对293T细胞和C57BL/6小鼠肺组织中CypA的特异性识别结果分别如图2和图3所示，3株 anti-CypA单抗均能特异性识别细胞和组织中的CypA蛋白（分子量约18kDa）。

实施例4、anti-CypA单抗对LPS诱导小鼠肺炎的治疗效果

一、小鼠分组和小鼠肺炎模型的构建

取6-8周龄雌性C57BL/6小鼠随机分为空白组（PBS）、未治疗组（LPS）、治疗组1（LPS+QH01）、治疗组2（LPS+QH09）、治疗组3（LPS+QH12）共5组，每组5只（体重19±3g）。C57BL/6小鼠按200μL/10g体重腹腔注射阿弗汀麻醉，小鼠麻醉后，空白组每只小鼠经鼻腔滴注50 μLPBS，未治疗组、治疗组1、治疗组2和治疗组3每只小鼠经鼻腔滴注3 μg 脂多糖（LPS）（溶于50μL PBS）。治疗组1每只小鼠于LPS诱导后24 h腹腔注射anti-CypA单抗QH01（10mg/kg体重，溶于100 μL PBS）。治疗组2每只小鼠于LPS诱导后24 h腹腔注射anti-CypA单抗QH09（10mg/kg体重，溶于100 μL PBS）。治疗组3每只小鼠于LPS诱导后24 h腹腔注射anti-CypA单抗QH12（10mg/kg体重，溶于100 μL PBS）。空白组和未治疗组小鼠在相同时间注射100 μLPBS。在治疗后第7天进行肺指数检测和肺组织细胞因子表达水平的检测。

二、肺指数检测

乙醚麻醉小鼠，称重。将小鼠的血液采集干净，小鼠呈仰卧位固定。打开胸腔，剔除掉食道和心脏，分离出肺组织并称重。小鼠肺称重计算肺指数=小鼠肺重÷小鼠体重。肺指数是判断肺部炎症严重程度非常重要的指标，炎症会导致肺指数增高。

三、肺组织细胞因子表达水平的检测

（1）取肺泡灌洗液

乙醚麻醉小鼠，并脱颈处死；心脏采血收集鼠全血，注射器头固定小鼠四肢；打开胸腔，使用眼科剪（弯）垂直在气管最粗处（喉结处附近）剪开小口后眼科剪（弯）再垂直于切口剪出T字切口，将剪好的注射器卸下注射器头，将注射器头小心插入气管，并用线绑定两次固定注射器头，注射器吸1mL PBS后用止血钳夹住注射器头卡槽处，将注射器安上，缓慢推入肺中，5-10s后再缓慢吸出（1mL能回收约0.8mL），再用止血钳夹住注射器头旋转褪下注射器，将肺泡灌洗液缓慢小心地注入EP管中；重复灌洗，既得细胞灌洗液。

（2）酶联免疫吸附法（ELISA）检测细胞因子

利用ELISA试剂盒（MM-0132M1，MM-0040M1，Meilunbio）检测小鼠肺泡灌洗液中白细胞介素（IL）-1β，肿瘤坏死因子（TNF）-α的表达水平。步骤参照说明书。

四、实验结果

（1）肺指数检测

结果如图4所示，LPS诱导小鼠肺损伤后应用三株抗体治疗，LPS+QH01治疗组的肺指数相比于LPS未治疗组明显下降且有统计学差异（P＜0.05），另外LPS+QH09治疗组、LPS+QH12治疗组的肺指数相比于LPS未治疗组无明显变化（P＞0.05）。

（2）肺组织细胞因子表达水平的检测

检测了各组小鼠中支气管肺泡灌洗液中的细胞因子IL-1β和TNF-α的变化。结果如图5所示，左侧图为IL-1β的变化，右侧图为TNF-α的变化，LPS+ QH01治疗组的细胞因子IL-1β和TNF-α相比于LPS未治疗组明显下降且有统计学差异（P＜0.05），另外LPS+QH09治疗组、LPS+QH12治疗组的细胞因子IL-1β和TNF-α相比于LPS未治疗组无明显变化（P＞0.05）。

实施例5、 anti-CypA单抗对IL-1β诱导小鼠肺炎的治疗效果

一、小鼠分组和小鼠肺炎模型的构建

取6-8周龄雌性C57BL/6小鼠随机分为空白组（PBS）、未治疗组（IL-1β）、治疗组1（IL-1β+QH01）、治疗组2（IL-1β+QH09）、治疗组3（IL-1β+QH12）共5组，每组5只（体重19±3g）。C57 BL/6小鼠按200μL/10g体重腹腔注射阿弗汀麻醉，小鼠麻醉后，空白组每只小鼠经鼻腔滴注50 μL PBS，未治疗组、治疗组1、治疗组2和治疗组3每只小鼠按50μg/kg体重鼻腔滴入PBS溶解的IL-1β（MCE，HY-P7073 Recombinant Mouse Interleukin-1 beta 50μg）50μL。治疗组1每只小鼠于IL-1β诱导后24 h腹腔注射anti-CypA单抗QH01（10mg/kg，溶于100 μL PBS）。治疗组2每只小鼠于IL-1β诱导后24 h腹腔注射anti-CypA单抗QH09（10mg/kg，溶于100 μL PBS）。治疗组3每只小鼠于IL-1β诱导后24 h腹腔注射anti-CypA单抗QH12（10mg/kg，溶于100 μL PBS）。空白组和未治疗组小鼠在相同时间注射100 μL PBS。在治疗后第7天进行肺指数检测和肺组织细胞因子表达水平的检测。

二、肺指数检测

方法同实施例4。

三、肺组织细胞因子表达水平的检测

方法同实施例4。

四、实验结果

（1）肺指数检测

IL-1β诱导小鼠肺损伤后应用三种抗体治疗，结果如图6所示，IL-1β+QH01治疗组的肺指数相比于IL-1β未治疗组明显下降且有统计学差异（P＜0.05），另外IL-1β+QH09、IL-1β+QH12治疗组的肺指数相比于IL-1β未治疗组无明显变化（P＞0.05）。

（2）肺组织细胞因子表达水平的检测

检测了各组小鼠中支气管肺泡灌洗液中的细胞因子IL-1β和TNF-α的变化。结果如图7所示，左侧图为IL-1β的变化，右侧图为TNF-α的变化，IL-1β+QH01治疗组的细胞因子IL-1β和TNF-α相比于IL-1β未治疗组明显下降且有统计学差异（P＜0.05），另外IL-1β+QH09治疗组、IL-1β+QH12治疗组的细胞因子IL-1β和TNF-α相比于IL-1β未治疗组无明显变化（P＞0.05）。

实施例6、anti-CypA单抗对A型流感病毒（IAV）诱导小鼠肺炎的治疗效果

一、小鼠分组和小鼠肺炎模型的构建

取6-8周龄雌性C57BL/6小鼠随机分为空白组（PBS）、未治疗组（IAV）、治疗组1（IAV+QH01）、治疗组2（IAV+OSE（抗流感病毒药物奥司他韦））、治疗组3（IAV+QH01+OSE）共5组，每组5只，体重19±3 g。C57 BL/6小鼠按200 μL/10g体重腹腔注射阿弗汀麻醉，小鼠麻醉后，空白组小鼠向鼻腔滴入50 μL PBS，治疗组、治疗组1、治疗组2和治疗组3小鼠向鼻腔滴入50μL PBS重悬的IAV-WSN（2000 PFU）。治疗组1的小鼠于IAV感染后24 h腹腔注射QH01（10 mg/kg体重，溶于100 μL PBS）。治疗组2的小鼠于IAV感染后24 h按照10 mg/kg的剂量腹腔注射0.2 mg（200 μL 生理盐水溶解）OSE，并每隔24 h注射0.2 mg OSE一次。治疗组3的小鼠于IAV感染后24 h腹腔注射QH01（10 mg /kg体重，溶于100 μL PBS）和按照10 mg/kg的剂量腹腔注射0.2 mg（200 μL 生理盐水溶解）OSE，并每隔24 h注射0.2 mg OSE一次。空白组及未治疗组按照治疗组2的注射时间给予同剂量生理盐水。在IAV感染后7天处死各组小鼠并进行后续检测实验。

二、肺指数检测

方法同实施例4。

三、肺组织IL-1β表达水平的检测

方法同实施例4。

四、实验结果

（1）肺指数检测

IAV感染小鼠诱导肺炎模型后，用QH01抗体、OSE（oseltamivir，奥司他韦）和QH01+OSE联用分别进行治疗，实验终点到达后处死小鼠，计算肺指数。结果如图8所示，IAV+QH01治疗组的肺指数相比于IAV未治疗组明显下降（P＜0.05）；另外，IAV+QH01+OSE治疗组的肺指数相比于IAV未治疗组下降最明显（P＜0.01），表现出最好的治疗效果。

（2）肺组织细胞因子表达水平的检测

IAV感染小鼠诱导肺炎模型后，用QH01抗体、OSE和QH01+OSE联用分别进行治疗，实验终点到达后处死小鼠，收集肺泡灌洗液，检测IL-1β的含量。结果如图9所示，IAV+QH01治疗组中IL-1β的含量相比于IAV未治疗组明显下降（P＜0.01）；另外，IAV+QH01+OSE治疗组IL-1β的含量相比于IAV未治疗组下降最明显（P＜0.001）。

实施例7、anti-CypA单抗对A组链球菌（GAS）诱导小鼠肺炎的治疗效果

一、小鼠分组和小鼠肺炎模型的构建

取6-8周龄雌性C57BL/6小鼠随机分为空白组（PBS）、未治疗组（GAS）、治疗组1（GAS+QH01）、治疗组2（GAS+AZM（阿奇霉素））、治疗组3（GAS+QH01+AZM）共5组，每组5只，体重19±3 g。C57BL/6小鼠按200 μL/10g体重腹腔注射阿弗汀麻醉，小鼠麻醉后，空白组小鼠向鼻腔滴入50 μL PBS，未治疗组、治疗组1、治疗组2和治疗组3向鼻腔滴入50 μL PBS重悬的GAS（1×10

二、肺指数检测

方法同实施例4。

三、肺组织IL-1β表达水平的检测

方法同实施例4。

四、实验结果

（1）肺指数检测

GAS感染小鼠诱导肺炎模型后，用QH01抗体、AZM（azithromycin，阿奇霉素）和QH01+AZM联用分别进行治疗，实验终点到达后处死小鼠，计算肺指数。结果如图10所示，GAS+QH01治疗组的肺指数相比于GAS未治疗组明显下降（P＜0.05）；另外，GAS+QH01+AZM治疗组肺指数下降最明显（P＜0.01），表现出更好的治疗效果。

（2）肺组织细胞因子表达水平的检测

GAS感染小鼠诱导肺炎模型后，用QH01抗体、AZM和QH01+AZM联用分别进行治疗，实验终点到达后处死小鼠，收集肺泡灌洗液，检测IL-1β的含量。结果如图11所示，GAS+QH01治疗组中IL-1β的含量相比于GAS未治疗组明显下降（P＜0.01）；另外，GAS+QH01+AZM治疗组IL-1β的含量相比于GAS未治疗组下降最明显（P＜0.001）。

实施例8、anti-CypA单抗QH01的序列检测

1 RNA的提取

利用Trizol（Invitrogen）裂解杂交瘤细胞系QH01后，提取杂交瘤细胞系QH01的RNA。RNA提取的具体操作步骤如下：每1mL Trizol加入200μL三氯甲烷，充分震荡后静置10min；4℃、13000rpm离心15min；吸取400μL上清加至400μL预冷异丙醇中，混匀后-20℃静置过夜；4℃、13000rpm离心15min；弃上清，加入70%（v/v）乙醇水溶液；4℃、13000rpm离心10min；弃上清，加入70%（v/v）乙醇水溶液；弃上清，加入40μL水溶解，得到RNA溶液。

2 cDNA的获得

吸取16μL步骤1制备的RNA溶液，加入1μL浓度为100nM的Oligo dT（Invitrogen）；70℃反应5min；立即放置冰上；分别加入1μL RNA酶抑制剂（Takara），1μL浓度为10mM的dNTP（Takara），1μL MLV反转录酶和5μL 5×缓冲液（Promega）；42℃反应60min；80℃处理10min，得到cDNA溶液。

3 PCR扩增及测序

3.1 PCR扩增

第一步PCR扩增：

以步骤2获得的cDNA溶液为模板，分别采用重链引物对（由重链引物F1和重链引物R1组成）和轻链引物对（由轻链引物F1和轻链引物R1组成）进行PCR扩增，依次获得编码重链的片段和编码轻链的片段。引物序列如下：

重链引物F1： 5’- SARGTNMAGCTGSAGSAGTC-3’；

重链引物R1：5’-CTTGACCAGGCATCCTAGAGTCA-3’；

轻链引物F1：5’-GAYATTGTGMTSACMCARWCTMCA-3’；

轻链引物R1：5’-GGATACAGTTGGTGCAGCATC-3’。

其中，R=a或 g；Y=c或t；M=a或c；K=g或t；S=c或g；W=a或t；V=a，c或g；N=a，c，g或t。

PCR反应条件：98℃预变性2min；98℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸10min。

第二步PCR扩增：

以第一步PCR扩增产物为模板，分别采用重链引物对（由重链引物F2和重链引物R2组成）和轻链引物对（由轻链引物F2和轻链引物R2组成）进行PCR扩增，依次获得编码重链的片段和编码轻链的片段。引物序列如下：

重链引物F2：5’-ATGGAATGGACCTGGGTCTTTCT-3’；

重链引物R2：5’-CTTGACCAGGCATCCTAGAGTCA-3’；

轻链引物F2：5’- ATGAAGTTGCCTGTTAGGCTGTTG-3’；

轻链引物R2：5’-GGATACAGTTGGTGCAGCATC-3’。

PCR反应条件：98℃预变性2min；98℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸10min。

3.2测序

分别将编码重链的片段和编码轻链的片段进行测序。测序结果如下：anti-CypA单抗QH01的重链可变区（V

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

序列表

<110> 中国科学院微生物研究所

<120> 抗Cyclophilin A的单克隆抗体及其在治疗炎症中的应用

<130> 210983

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 124

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Gly Ile Arg Gly Gln Thr Ala Gly Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Tyr

1 5 10 15

Asn Ala Ile His Trp Leu Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp

20 25 30

Leu Gly Val Ile Trp Ile Gly Asp Ala Thr Asp Tyr Asn Ala Ala Phe

35 40 45

Ile Ser Arg Leu Thr Ile Ser Arg Asp Lys Ser Lys Ser Gln Val Phe

50 55 60

Phe Lys Met Ser Arg Leu Gln Ser Asn Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys

65 70 75 80

Ala Arg Gly Pro Asp Ser Ser Thr Tyr Gly Trp Phe Ala Tyr Trp Gly

85 90 95

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser

100 105 110

Val Tyr Pro Leu Ala Pro Val Cys Gly Asp Lys Leu

115 120

<210> 2

<211> 124

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Gly Asp Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu

1 5 10 15

Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His

20 25 30

Thr Asn Arg Asn Ala Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln

35 40 45

Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Tyr Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val

50 55 60

Pro Asp Arg Phe Ser Gly Gly Gly Ser Gly Thr Gly Phe Thr Leu Lys

65 70 75 80

Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln

85 90 95

Gly Glu His Val His Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu

100 105 110

Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Gly Ser Ile Phe

115 120

<210> 3

<211> 372

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ggaattcgag gtcaaactgc aggagtctcc ggtttctcat taacttacaa tgctatacac 60

tggcttcgcc agcctccagg aaagggtctg gagtggctgg gagtgatatg gattggggac 120

gccacagact ataatgcagc tttcatatcc agactgacca tcagcaggga caaatccaag 180

agccaagttt tctttaaaat gagccgtcta caatctaatg acacagcctt atattactgt 240

gccagaggcc cagattcctc tacgtacggc tggtttgctt actggggcca agggactctg 300

gtcactgtct ctgcagccaa aacaacaccc ccatcagtct atccactggc ccctgtgtgt 360

ggagataagc tt 372

<210> 4

<211> 374

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ggtgatatct tgctgaccca atctccactc tccctgcctg tcagtcttgg agatcaagcc 60

tccatctctt gcagatctag tcagagcatt gtacatacta atcgaaacgc ctatttagaa 120

tggtacctgc agaaaccagg ccagtctcca aagctcctga tctacaaata ctccaaccga 180

ttttctgggg tcccagacag gttcagtggc ggtggatcag ggacaggatt cacactcaag 240

atcagcagag tggaggctga ggatctggga gtttattact gctttcaagg tgaacatgtt 300

cacctcacgt tcggtgctgg gaccaagctg gagctgaaac gggctgatgc tgcaccaact 360

ggatccatct tccc 374