用于血流感染病原微生物检测的参考品及其制备方法

摘要

本发明公开了一种用于血流感染病原微生物检测的参考品及其制备方法，包括如下步骤：（1）分别获得人源细胞和病原微生物的基因组DNA；（2）使用酶切法对人源细胞和病原微生物基因组DNA进行片段化；（3）片段化DNA的回收纯化；（4）片段化DNA的定值和混合；（5）片段化DNA和血浆混合；（6）血流感染检测参考品的提取与质检；使用上述制备方法制备得到血流感染病原微生物检测的参考品。所述参考品来源稳定，接近天然血浆样本，覆盖各类病原，定值更准确，可对基于高通量测序的血流感染检测的检测结果进行质量评估，可用于不同测序平台、检测流程、取样方式间结果的对比，制定基于高通量测序进行血流感染检测的技术标准。

说明书

技术领域

本发明涉及感染性疾病临床检测技术领域，特别涉及一种用于血流感染病原微生物检测的参考品及其制备方法。

背景技术

血流感染（bloodstream infection，BSI）是指病原微生物进入血流引起的播散感染，是危及人类生命的全身性感染疾病，主要病原微生物包括细菌、真菌及病毒等，可导致菌血症、败血症和脓毒症，严重者可引起休克、播散性血管内凝血（DIC）、多脏器功能衰竭乃至死亡。有统计数据显示，BSI占社区获得性（community-acquired，CA）和医院获得性（hospital-acquired HA）脓毒症和脓毒性休克病例的40%，约占ICU获得性病例的20%。近年来，随着侵袭性操作的不断增加及广谱抗菌药物、皮质激素等药物的不合理应用，BSI的发病率及病死率逐年上升，造成了患者住院时间的延长和经济负担的增加。因此，血流感染的控制越来越受到人们的关注，而血流感染的检测也有了更多需求。

无细胞DNA（cell-free DNA，cfDNA），即检测临床样本无菌体液中不含细胞基因组的游离片段化DNA，多数指的是血液分离血浆提取后的游离DNA。当发生血流感染时，病原体在血液中进行繁殖代谢或被白细胞吞噬，其细胞被破坏后会将胞内的DNA释放到血液中成为血浆游离DNA，因此血浆中会同时存在人源的游离DNA和病原体的游离DNA。从2015年开始，下一代测序（next-generation sequencing，NGS）方法的应用逐渐增多，市面上几种比较成熟的测序平台比如华大的BGI/MGI测序平台，赛默飞的Ion torrent，illumina公司的Miniseq/Nextseq/Hiseq等都可以对cfDNA进行检测。除了测序平台的区别，作为应用端开发的检测流程和方法更是多种多样，采血管等血液采集装置种类也数不胜数。如何对不同取样和检测流程的cfDNA检测进行效果对比和质量把控是一个尖锐的问题。虽然市面上有一些cfDNA的参考品，但几乎都是和血液肿瘤检测应用方向相关，暂未发现报道过血流感染检测的参考品。

由于二代测序技术在病原感染的临床应用近一两年才开始被临床认可，目前国外都缺乏统一的血流病原微生物感染参考品做参照以及操作规范标准，无法对不同测序平台和检测方法进行评估，因此亟需一种覆盖各类病原菌、且接近人天然血浆的血流感染病原微生物检测参考品。

发明内容

针对现有技术中的缺陷，本发明提出了一种用于血流感染病原微生物检测的参考品及其制备方法，包括如下步骤：（1）分别获得人源细胞和病原微生物的基因组DNA；（2）使用酶切法对人源细胞和病原微生物基因组DNA进行片段化；（3）片段化DNA的回收纯化；（4）片段化DNA的定值和混合；（5）片段化DNA和血浆混合；（6）血流感染检测参考品的提取与质检；使用上述制备方法可制备得到血流感染病原微生物检测的参考品。

本发明提供一种用于血流感染病原微生物检测的参考品的制备方法，包括如下步骤：

S1：分别获得人源细胞和病原微生物的基因组DNA；

S2：使用酶切法对S1得到的人源细胞和病原微生物基因组DNA进行片段化；

S3：片段化DNA的回收纯化；

S4：片段化DNA的定值和混合；

每一种人源细胞和病原微生物的片段化DNA单独设计一套探针引物并验证有效性；进行数字PCR定值，按照数字PCR绝对定量结果进行片段化DNA混合操作，混合后再次进行数字PCR确认混合比例准确性；

S5：片段化DNA和血浆的混合；

将定值好的人源细胞和病原微生物片段化DNA混合物投入到血浆中，进行充分混合；

S6：血流感染检测参考品的提取与质检；

提取cfDNA，对提取的cfDNA的片段大小和浓度进行测定并计算cfDNA提取效率，采用数字PCR对片段化DNA浓度和不同病原微生物间DNA比例关系进行质检验证。

进一步的，所述S1中所述人源细胞为Hela细胞系或炎黄细胞系；所述病原微生物为细菌、真菌、病毒中的任意一种。

进一步的，所述S1中所述人源细胞由培养获得，所述病原微生物的基因组DNA由培养后DNA提取或人工合成获得。

进一步的，所述S2中所述片段化使用的酶为NEB的Fragmentase或翊圣的OnePot。

进一步的，所述S3中采用Beckman的AMPure XP磁珠进行纯化，所述磁珠为1×磁珠。

进一步的，所述S4中数字PCR的操作步骤如下：针对每种病原微生物设计特异引物和探针，取片段化DNA溶液，使用QX200数字PCR仪，对片段化DNA溶液进行精确定量，每个做3个重复，每个重复做三个复孔数字PCR，取平均值，确定病原微生物基因组片段化DNA拷贝数。

进一步的，所述S5中混合时间为1 h，所述血浆是天然血浆或人工制造的血浆。

进一步的，所述S6中所述提取cfDNA的步骤使用市售的cfDNA提取试剂盒，所述测定并计算cfDNA提取效率使用Qsep100和Qubit4.0，Qsep100和Qubit4.0为仪器型号名称。

本发明还提供一种用于血流感染病原微生物检测的参考品，所述参考品通过所述的制备方法制备得到。

本发明还提供所述的用于血流感染病原微生物检测的参考品的应用，所述应用选自如下任意一种或多种：

（1）对基于高通量测序的血流感染检测的检测结果进行质量评估；

（2）对不同测序平台、检测流程、取样方式间结果的对比；

（3）制定基于高通量测序进行血流感染检测的技术标准。

综上，与现有技术相比，本发明达到了以下技术效果：

（1）本发明的参考品可以自主定值和制作，来源稳定可靠。

（2）本发明酶切的cfDNA片段大小和峰形接近天然的血浆样本。

（3）本发明的参考品检测范围能覆盖各类病原，包括病毒、细菌、真菌，以及不可培养和高致病性的病原。

（4）本发明的参考品模仿人的临床血浆样本基质状态，避免由于基质不同造成实验误差。

（5）本发明的制备方法采用数字PCR对含量进行定值，定值更准确。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为本发明的用于血流感染病原微生物检测的参考品的制备方法的流程示意图；

图2为本发明实施例1中Hela细胞DNA酶切后的峰图；

图3为本发明实施例1中EB病毒DNA酶切后的峰图；

图4为本发明实施例1中铜绿假单胞菌DNA酶切后的峰图；

图5为本发明实施例1中近平滑念珠菌DNA酶切后的峰图；

图6为本发明实施例2中PCR扩增靶标的电泳图。

具体实施方式

为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。

本发明公开了一种覆盖各类病原菌、且接近人天然血浆的用于血流感染病原微生物检测的参考品的制备方法，具体步骤如下，流程如图1所示：

S1：分别提取培养得到的人源细胞和病原微生物的基因组DNA；如不能培养得到的病原微生物，可人工合成其靶标片段，再通过PCR扩增的方式得到200bp的病原微生物特异片段。

S2：使用酶切法对人源细胞和病原微生物基因组DNA进行片段化。

片段化酶为NEB公司的Fragmentase，也可以使用有等同效果的其他商业化酶，比如翊圣OnePot等；

S3：片段化DNA的回收纯化。

纯化磁珠采用Beckman公司的AMPure XP磁珠，采用1×磁珠进行纯化；

S4：片段化DNA的定值和混合。

每一种人源细胞和病原微生物的片段化DNA单独设计一套探针引物并验证有效性。采用伯乐（Biorad）的QX200系统进行数字PCR定值，按照数字PCR绝对定量结果进行片段化DNA混合操作，混合后再次进行数字PCR确认混合比例准确性；

S5：片段化DNA和血浆的混合。

将定值好的人源细胞和病原微生物片段化DNA混合物按照一定拷贝数投入到一定体积的血浆中，随后进行充分混合，混合时间是1h。血浆可以天然血浆也可以是人工制造的血浆。

S6：血流感染检测参考品的提取与质检。

选择市售的cfDNA提取试剂盒进行cfDNA提取，本发明采用凯杰（Qiagen）公司的

实施例1片段化病原微生物基因组DNA参考品制备

（1）人源细胞和病原微生物基因组DNA酶切片段化处理：

选择血流感染常见三种病原：EB病毒、铜绿假单胞菌、近平滑念珠菌，分别代表病毒、细菌、真菌，Hela细胞作为人源细胞。采用酶切法分别对Hela细胞、EB病毒、铜绿假单胞菌、近平滑念珠菌的基因组DNA进行酶切处理，按照下表进行酶切体系配制（20μl）：

酶切在37℃条件下进行，DNA投入量和酶切时间经过优化如下表所示：

片段化完成后使用XP磁珠和80%乙醇进行纯化一次，纯化后洗脱的DNA使用

（2）数字PCR定值：

三种病原定值使用的引物和探针见下表，F/R为引物，probe为探针：

各取1μl复溶后的片段化DNA溶液，使用

试剂在QX200数字PCR仪上进行操作，对片段化DNA溶液进行精确定量，每个做3个重复，每个重复做三个复孔数字PCR，取平均值，详见下表。

根据病原微生物基因组片段化DNA拷贝数与酶切后人源DNA进行混合，人源DNA终浓度10~30 ng/ml。

实施例2片段化基因组与PCR扩增片段混合参考品制备

因为部分病原微生物由于致病性或者体外不生长等原因，很难通过培养的方式得到纯培养进行基因组DNA制备，比如支原体、结核菌、立克次体、霉菌等，所以需要通过人工合成和PCR扩增的方式获得DNA。

（1）PCR扩增片段获得：

本实施例以结核分枝杆菌、解脲支原体、土曲霉为代表，通过生物信息学手段获得每个病原的两段物种特异序列，再通过病原特异引物扩增得到两个靶标片段，靶标片段均在200bp左右，病原特异的引物序列如下表所示：

靶标片段PCR扩增体系和程序如下：

PCR结束后产物进行电泳检测，电泳结果如图6所示，1~3分别代表结核分枝杆菌、解脲支原体和土曲霉靶标1的PCR产物凝胶电泳结果；4是无核酸酶水扩增产物的凝胶电泳结果，作为阴性对照，5~6分别代表结核分枝杆菌、解脲支原体和土曲霉靶标2的PCR扩增电泳结果；电泳结果表明，所有靶标扩增条带单一明亮无杂带，阴性对照无扩增，经过Sanger测序验证为目的条带可以用于下一步制作。

（2）PCR片段定值

采用数字PCR的方法对扩增产物结核分枝杆菌靶标1、支原体靶标1、土曲霉靶标1进行数字PCR定值确定拷贝数，使用的引物探针如下：

数字PCR定值采用BIORAD数字PCR Advanced Kit for Probes试剂在QX200数字PCR仪上进行操作，反应体系及反应程序参照实施例1中（2）数字PCR定值。因为每种病原菌所用引物探针不同，需单独配制PCR体系检测。

由于扩增产物浓度高，进行梯度稀释，稀释10

（3）血流感染参考品制备

根据（2）得到的拷贝数结果与实施例1的基因组片段化参考品进行病原靶标等拷贝数混合，

制备得到6种病原的（包含三种不可培养病原）的血流感染DNA参考品，将此DNA参考品按照一定投入量与真实人血浆（10 ml）在混匀仪上4°C温和混匀0.5~1 h，制备得到本发明的血流感染检测参考品，本实施例中各病原靶标浓度均为1×10

（4）血流感染参考品cfDNA提取测试及病原比例准确性验证采用Qiagen公司的

从结果看出，在50~200ng投入量的范围内，投入的DNA量越多，cfDNA提取的效率越高。

取1μl提取的参考品cfDNA，采用数字PCR的方法对参考品中的EB病毒、铜绿假单胞菌、近平滑念菌株和结核分枝杆菌进行数字PCR定值验证，数字PCR定值采用

数字PCR定值结果如下：

从数字PCR的检测结果来看，各病原微生物拷贝数接近1：1，说明参考品中病原微生物比例是符合预期的1：1的；1μl样本中4种病原微生物拷贝数在440~500copies之间，说明参考品中4种病原微生物的浓度为4.4×10

实施例3本发明的血流感染微生物检测参考品的荧光PCR检测及NGS检测

以实施例2中提取的参考品cfDNA为样本，选取近平滑念珠菌、EB病毒、铜绿假单胞菌和结核分枝杆菌作为检测靶标，分别做下游应用的检测：

（1）荧光PCR检测

取2 μl的cfDNA，采用ABclonal的荧光PCR试剂进行检测，每个做3个重复，每个重复做三个复孔，引物探针信息如下：

分别按照如下体系配制4个病原菌的荧光PCR反应体系：

将配制好的体系在ABI 7500仪器上进行检测，反应程序及结果如下：

从结果来看，4种病原微生物的3个重复间CV值在均小于5%，说明本发明的血流感染检测参考品中病原微生物检出稳定；而且4种靶标检出Ct值接近，说明4种病原微生物拷贝数接近1：1。

（2）NGS检测

采用赛哲生物科技有限公司的靶向测序试剂盒进行NGS扩增文库构建，具体步骤如下：

建库结束后，使用1×磁珠进行纯化，然后按照

从NGS检测结果来看，本发明的血流感染检测参考品中靶标均有检出，且检出reads接近1：1，说明参考品中4种病原菌的拷贝数也接近1：1。

综合以上实施例，本发明提供了一种用于血流感染病原微生物检测的参考品及其制备方法，包括如下步骤：（1）分别获得人源细胞和病原微生物的基因组DNA；（2）使用酶切法对人源细胞和病原微生物基因组DNA进行片段化；（3）片段化DNA的回收纯化；（4）片段化DNA的定值和混合；（5）片段化DNA和血浆混合；（6）血流感染检测参考品的提取与质检；使用上述制备方法制备得到血流感染病原微生物检测的参考品。本发明的参考品可以自主定值和制作，来源稳定可靠，本发明酶切的cfDNA片段大小和峰形接近天然的血浆样本，模仿人的临床血浆样本基质状态，避免由于基质不同造成实验误差，检测范围能覆盖各类病原，包括病毒、细菌、真菌，以及不可培养和高致病性的病原。本发明的制备方法采用数字PCR对含量进行定值，定值更准确。本发明的参考品可对基于高通量测序的血流感染检测的检测结果进行质量评估，可用于开展不同测序平台、检测流程、取样方式间结果的对比，方便制定基于高通量测序进行血流感染检测的技术标准。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。