一种外泌体的糖基化研究方法

摘要

本发明公开了一种外泌体的糖基化研究方法，包括如下步骤：1)将分泌外泌体的细胞与非天然单糖共培养，细胞泌出含有非天然单糖的外泌体；2)将功能性探针标记到非天然糖上,所述的功能性探针具有第一标记；3)检测第一标记，获取外泌体信息。本发明方法操作简单，无需复杂的样品前处理；且无需裂解外泌体。

说明书

技术领域

本发明涉及一种外泌体的糖基化研究方法。

背景技术

外泌体的表面被糖蛋白覆盖，外泌体蛋白的糖基化在跨膜信号传递、调节外泌体与受体细胞之间的功能和生理模式以及肿瘤的进展和转移中起着重要的调节作用，因此研究外泌体的糖基化有助于理解外泌体参与的生理功能以及发展疾病相关诊断和治疗标志物。

尽管外泌体的糖基化在生理过程中的重要性已逐渐被认识，然而外泌体的糖代谢机制不明，糖链组成结构复杂，修饰位点多样，因此糖基化的表征及其功能研究十分困难。目前研究外泌体糖基化的主要方法有凝集素阵列、质谱法和液相色谱法。凝集素有亲和力不足，组织渗透性差的不足，质谱法和液相色谱法操作繁琐，会破坏外泌体的完整性和活性。因此，不适用于外泌体糖基化的功能研究。

CN201910145354.8公开了一种PD-L1外泌体的体外快速检测平台及检测方法，属于快速检测技术领域。检测平台包括样品初滤区、纳滤区、显色物垫区、显色区和吸水垫区。所述显色区上的捕获抗体和显色物垫区上的显色物标记抗体中至少有一种为外泌体PD-L1抗体。检测方法为先将待检样品经过初滤膜进行初步过滤，再经过纳滤膜进行过滤，得到外泌体；外泌体与显色物标记抗体特异性地结合，与显色物标记抗体特异性结合的外泌体再与捕获抗体结合，形成双抗体夹心；所述捕获抗体和显色物标记抗体至少有一种为外泌体PD-L1抗体。此平台集成全血分离，外泌体纯化以及PD-L1外泌体特异检测。

CN202010083389.6公开一种基于适配体传感器的高灵敏检测血清中PD-L1的方法，属于用药辅助诊断领域。目前血清外泌体PD-L1中的检测是基于抗原抗体杂交的酶联免疫技术，具有检测成本高、操作难度大等缺点。该发明以PD-L1适配体为例，通过酶切辅助靶循环及Q-PCR实现检测信号的多重放大，建立了一种PD-L1超敏检测传感器。

CN202010140177.7构建一种只有当外泌体膜上的磷脂双分子层和相应膜蛋白同时存在才能触发的核酸扩增反应，实现高特异性的外泌体检测，并借助磁珠将其富集。方法包括如下步骤：(1)外泌体的分离与检测：1)探针序列的设计：CD63适配体探针、胆固醇探针、连接子探针和骨干探针；2)离心细胞培养上清液或血清样品，得到粗制的外泌体样本；3)使用CD63适配体探针与外泌体表面的CD63蛋白结合，将胆固醇探针锚固在脂质双层中；4)连接子探针充当接头，与胆固醇探针中的连接序列L1和CD63适配体探针中的连接序列L2杂交形成邻近连接，形成一个与胆固醇探针和CD63适配体探针中的主链序列区B1和B2序列杂交的骨架的封闭环；5)最后，通过邻近连接触发的RCA获得了ssDNA产物；(2)外泌体的富集：将CD9蛋白抗体连接至磁珠表面，构建得到抗CD9 MB，使用直径为1μm的抗CD9 MB、浓度为0.5ug/ml的抗CD9MB、捕获时间为40min，富集得到外泌体。

以上专利均与外泌体的糖基化无直接关系，因此，同样不适用于外泌体的糖基化功能研究。

CN202010060063.1涉及一种用于分离临床样本中的糖基化外泌体的凝集素-大分子载体偶联复合物，所述凝集素-大分子载体偶联复合物包括：大分子载体；和偶联在大分子载体外侧的凝集素。该发明提供的凝集素-大分子载体偶联复合物可以简便、快速、精准分离临床样本中的糖基化外泌体，分离效率高，重复性好，分离后的外泌体形态完整，无破裂或碎裂，可直接用于糖基化外泌体液体检测，或直接进行免疫学相关检测，或直接提取外泌体内相关核酸进行基因检测分析。该发明是采用凝集素-大分子载体偶联复合物来分离糖基化外泌体，本发明的方法和该发明完全不同。

发明内容

本发明的主要目的，在于提供一种外泌体的糖基化研究方法。

本发明解决其技术问题的所采用的技术方案是：

一种外泌体的糖基化研究方法，包括如下步骤：

1)将分泌外泌体的细胞与非天然糖共培养，细胞泌出具有非天然糖的外泌体；

2)将功能性探针标记到非天然糖上,所述的功能性探针具有可被检测的第一标记；

3)检测第一标记，获取外泌体信息。

优选地，所述的非天然糖包括可用于N-糖基化、O-糖基化、GPI锚定蛋白、糖脂代谢标记的非天然糖中的至少一种。

优选地，所述的一种外泌体的糖基化研究方法，非天然糖可直接投入细胞培养基中与细胞共培养，或将其包裹于功能材料中与细胞共培养。

优选地，所述的第一标记包括发光染料、生物素化探针、纳米材料中的至少一种。

优选地，所述的发光染料包括现有激光共聚焦显微镜可激发的以及近红外激发的染料，

优选地，所述的发光染料的激发波长范围为248-1100nm。

优选地，所述的生物素化探针包括生物素化小分子、生物素化微珠中的至少一种。

优选地，所述的纳米材料包括各种纳米无机或有机材料中的至少一种。

优选地，所述的步骤2)的检测方法包括发光检测、质谱、色谱鉴定中的至少一种。

所述的外泌体信息包括但不限于外泌体的糖组、糖蛋白组信息、外泌体的糖基化的功能、外泌体特定蛋白糖基化的功能。

本技术方案与背景技术相比，具有如下优点：

1、本发明采用非天然糖与分泌外泌体的细胞共培养，用功能性探针标记非天然糖，在功能性探针的第一标记的作用下，即可检测外泌体的糖基化，本发明方法操作简单，无需复杂的样品前处理；

2、本发明所采用的非天然糖的化学修饰分子小，不影响天然糖的结构和功能；

3、本发明无需裂解外泌体，保持外泌体的完整性和活性，适用于外泌体糖基化的功能研究和原位检测；

4、本发明所采用非天然糖与分泌外泌体的细胞共培养，用功能性探针标记非天然糖，亲和力强，受空间位阻影响小。

附图说明

下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。

图1为本发明的原理示意图。

图2为外泌体的物理性质表征。(A)未代谢标记的A735分泌的外泌体的TEM成像及NTA测定的粒径统计；(B)代谢标记的A735分泌的外泌体的TEM成像图及NTA测定的粒径统计。

图3为流式细胞术鉴定未代谢标记的和代谢标记的A375分泌的外泌体的CD63表达。

图4为生物正交条件优化。(A)DBCO-Cy5浓度优化；(B)20μg/mL DBCO-Cy5条件下未代谢标记和代谢标记的外泌体的生物正交流式结果。

图5为流式细胞术表征糖代谢标记和生物正交反应对外泌体PD-L1和PD-1结合的影响

具体实施方式

以下实施例中，以表达PD-L1的外泌体的糖基化研究为例。

参见图1，将细胞与叠氮修饰的唾液酸代谢底物Ac

(1)细胞培养。将A375细胞(黑色素瘤)消化后重悬于含有1％FBS和1％双抗的DMEM培养基中，培养过夜。A375细胞贴壁后除去DMEM培养基，加入含有50μM Ac

(2)外泌体分离。收集培养基，以3000g，20min离心去除细胞碎片；将上清收集，以16500g，45min离心除去大囊泡，收集上清后以100,000g，2h离心收集外泌体，并用PBS于100,000g，2h离心清洗外泌体；

(3)外泌体与乳胶醛珠偶联。用BCA法定量外泌体的总蛋白浓度，将10μg外泌体与4μL乳胶醛珠于室温孵育2h，加入FBS使其终浓度为1％，室温孵育30min封闭，于6000rpm，3min离心去除上清，再以1％FBS离心清洗两次，重悬获得外泌体-乳胶醛珠复合物；

(4)生物正交反应。将获得的外泌体-乳胶醛珠复合物与1～20μM DBCO-Cy5于37℃反应1h，并以1％FBS清洗3次，于流式细胞仪上测定荧光强度。

2.外泌体的物理鉴定

通过透射电子显微镜(TEM)以及纳米粒子跟踪分析仪(NTA)来分析代谢标记和未代谢标记外泌体的物理性质。取10μL外泌体滴加于铜网上沉淀1min，再加磷钨酸10μL染色1min，常温干燥。由图2可知，正常培养的外泌体和糖代谢标记外泌体均呈杯状，符合外泌体的形貌。经NTA测定颗粒平均粒径在粒径在50-200nm之间，符合外泌体的尺寸范围。因此糖代谢标记不影响外泌体的物理性质。

3.外泌体的免疫鉴定

通过流式细胞术考察未代谢标记和代谢标记的外泌体的特异性靶标CD63的表达，选用APC标记的CD63抗体和IgG-APC进行验证，结果表明实验组与对照组均高表达CD63蛋白，因此糖代谢标记不影响外泌体的免疫性质。

4.生物正交表征糖代谢标记

Ac

5.糖代谢标记和生物正交反应对外泌体功能的影响

研究表明，A375细胞分泌的外泌体表面的PD-L1可与T细胞表面PD-1相互作用，抑制T细胞活性，因此以A375外泌体的PD-L1与PD-1的识别为模型验证糖代谢标记和生物正交反应对外泌体功能的影响。

首先验证验证糖代谢标记对PD-1识别的影响。制备未代谢标记的和代谢标记的A375外泌体与乳胶醛珠复合物，并与2ug/mLbiotin-PD-1孵育2h(对照为不加biotin-PD-1)，离心清洗后与SA-PE孵育30min后于流式测定荧光强度。结果表明糖代谢标记不影响PD-1的识别(图5A)。为考察生物正交反应对PD-1识别的影响，制备代谢标记的A375外泌体与乳胶醛珠复合物后与10μM DBCO-Cy5于37℃孵育1h后离心清洗，并与biotin-PD-1及SA-PE孵育后于流式鉴定(对照为不加DBCO-Cy5或者不加biotin-PD-1)。流式结果表明生物正交标记不影响PD-1的识别(图5B)。因此糖代谢标记和生物正交反应不影响外泌体的功能，可作为外泌体糖基化功能研究的工具。

以上所述，仅为本发明较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。