用于治疗恶性血液病的新双特异性抗体

摘要

本发明涉及用于治疗恶性血液病的新方法。特别地，本发明涉及使用包含能够结合人CD1d的第一结合部分和能够结合人Vγ9Vδ2‑TCR的第二结合部分的抗体来治疗恶性血液病。

说明书

技术领域

本发明涉及免疫学领域，更具体地涉及与人CD1d结合的抗体的领域。特别地，本发明涉及使用包含能够结合人CD1d的第一结合部分和能够结合人Vγ9Vδ2-TCR的第二结合部分的抗体来治疗恶性血液病。

背景技术

近年来，随着酪氨酸激酶抑制剂、Bcl-2抑制剂和单克隆抗体的引入，慢性淋巴细胞白血病(chronic lymphocytic leukemia，CLL)的治疗库(arsenal)显著增加。然而，需要长期或连续治疗、抗性以及毒性问题突出了对新治疗选择的需要。

在进行同种异体干细胞移植之后观察到的CLL中治愈响应表明了基于T细胞治疗的治疗潜力(van Gelder等.(2017)Bone Marrow Transplant 52：372)。最近在CLL中利用基于T细胞的治疗的尝试集中于开发嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor，CAR)T细胞，其中多样的非抗原特异性T细胞库被赋予识别肿瘤相关表面抗原的CAR。与CAR T细胞治疗在急性淋巴细胞白血病和弥漫性大B细胞淋巴瘤中所观察到的有希望的临床响应相反，CLL中的响应率和持续时间令人失望(Park等.(2018)N Engl J Med.378(5)：449-459；Chow等.(2018)Blood 132(8)：777-781)。毒性是CAR T细胞治疗的另一个重要问题，特别是在老年(elderly)CLL群体中(Brudno等.(2019)Blood Rev 34：45)。

固有(intrinsically)肿瘤应答性细胞毒性T淋巴细胞的选择性活化代表了可产生强效且集中的抗肿瘤应答的替代方法。Vγ9Vδ2-T细胞形成可以以不依赖于HLA的方式诱导广泛范围的恶性细胞凋亡的保守的T细胞亚群(Lo Presti等.(2017)Front Immunol.8：1401；de Weerdt等.(2018)Blood 132(21)：2260-2272；Gertner-Dardenne等.(2012)JImmunol.188(9)：4701-4708；Kunzmann等.(2000)Blood 96(2)：384-392)。Vγ9Vδ2-T细胞受体(T cell receptor，TCR)识别在高的磷酸抗原(尤其是甲羟戊酸途径产生的代谢物)水平下发生的CD277(BTN3A1)构象变化。在细胞应激(例如感染或恶性转化)期间，或通过使用氨基双膦酸盐(aminobisphosphonate，ABP)进行药理学操作，磷酸抗原会上调。另外，NK受体允许Vγ9Vδ2-T细胞通过应激配体(例如NKG2D配体MICA/B和ULBP4)识别恶性细胞。在活化之后，Vγ9Vδ2-T细胞功能包括细胞毒性、促炎性细胞因子的分泌和抗原呈递(Vantourout等.(2013)Nat Rev Immunol.13(2)：88-100)。

这些特征导致了旨在利用Vγ9Vδ2-T细胞的抗肿瘤潜力的临床试验，包括基于ABP的方法来诱导体内Vγ9Vδ2-T细胞增殖(Dieli等.(2007)Cancer Res.67(15)：7450-7457；Wilhelm等.(2003)Blood 102(1)：200-206；Kunzmann等.(2012)J Immunother.35(2)：205-213)。替代策略采用了离体扩增的Vγ9Vδ2-T细胞的过继转移(Abe等(2009)ExpHematol.37(8)：956-968；Wilhelm等.(2014)J Transl Med.12：45；Kobayashi等.(2011)Cancer Immunol Immunother.60(8)：1075-1084)。使用这两种策略，在恶性血液病中观察到目的响应(objective response)以及有限的毒性谱，从而确立了Vγ9Vδ2-T细胞治疗的可行性(Wilhelm等.(2003)Blood102(1)：200-206；Kunzmann等.(2012)J Immunother.35(2)：205-213；Abe等(2009)Exp Hematol.37(8)：956-968；Wilhelm等.(2014)J TranslMed.12：45)。然而，这些初步研究(pilot study)显示了响应的显著差异性。总之，虽然先前的研究已经显示了基于Vγ9Vδ2-T细胞的治疗的附带临床益处和安全性，但迄今为止观察到的响应率和持续时间仍不令人满意，这表明对于治疗CLL以及对于治疗另一些恶性血液病，例如多发性骨髓瘤和急性髓性白血病二者均需要新策略。

发明内容

现在，本发明人已经在78名CLL患者的大组群中的大多数中，特别是在患有晚期疾病的患者中，将CD1d鉴定为基于抗体的策略的合适靶标。此外，已经表明基于单结构域抗体(VHH)的CD1d特异性Vγ9Vδ2-T细胞接合剂(engager)(双特异性CD1d/Vγ9Vδ2抗体)诱导Vγ9Vδ2-T细胞的稳健活化和脱颗粒(degranulation)。这使得来自健康对照和CLL患者二者的Vγ9Vδ2-T细胞能够在有利的效应物与靶标比下裂解白血病细胞。此外，全反式视黄酸诱导CLL细胞上CD1d的上调，并使恶性细胞对由双特异性CD1d/Vγ9Vδ2抗体诱导的裂解敏感。此外，提供了这样的证据：当双特异性抗体结合时，Vγ9Vδ2-T细胞受体保留了其对磷酸抗原的响应性，因此氨基双膦酸盐可增强双特异性抗体介导的肿瘤特异性杀伤。总体而言，数据证明了该新CD1d特异性Vγ9Vδ2-T细胞接合剂在CLL中的免疫治疗潜力。

此外，本发明人已经表明，双特异性CD1d/Vγ9Vδ2-TCR抗体可诱导iNKT细胞和Vγ9Vδ2-T细胞的脱颗粒并控制另一些CD1d表达肿瘤细胞(包括多发性骨髓瘤细胞和急性髓性白血病细胞)的生长。此外，在小鼠多发性骨髓瘤模型中，与无抗体情况下的单独的iNKT细胞与γδT细胞的混合物相比，在双特异性CD1d/Vγ9Vδ2-TCR抗体下iNKT细胞和γδT细胞二者的输注显著延长了存活。

因此，在第一方面中，本发明涉及包含能够结合人CD1d的第一结合部分和能够结合人Vγ9Vδ2-TCR的第二结合部分的抗体，其用于治疗慢性淋巴细胞白血病(CLL)、多发性骨髓瘤(Multiple Myeloma，MM)或急性髓性白血病(Acute Myeloid Leukemia，AML)。

在另一方面中，本发明涉及用于治疗慢性淋巴细胞白血病、多发性骨髓瘤或急性髓性白血病的方法，其包括向有此需要的人对象施用包含能够结合人CD1d的第一结合部分和能够结合人Vγ9Vδ2-TCR的第二结合部分的抗体。

附图说明

图1：抗CD1d VHH介导的不变自然杀伤T(invariant natural killer T，iNKT)细胞的活化和抑制。在iNKT细胞与用载剂对照(载剂)或αGalCer(无论是否与抗CD1d VHH1D12(100nM)或1D22(1000nM)组合)脉冲的经CD1d转染的HeLa细胞共培养24小时之后，确定iNKT CD25表达和干扰素-γ(IFN-γ)产生。代表性点状图示出了如通过CD25表达所描绘的iNKT细胞被1D12显著活化(A)或被1D22抑制(B)，另外是iNKT细胞IFN-γ产生的显著提高(通过1D12)或降低(通过1D22)(C和D)。数据表示从不同供体获得的iNKT的3至4次单独实验的平均值+SD，**P＜0.01，***P＜0.001，其用单因素方差分析(one-way analysis ofvariance)及Tukey事后检验(Tukey’s post hoc test)来计算。

图2：Vδ1-sulf-CD1d相互作用被抗CD1d VHH 1D12阻止并且被1D22降低。将内源性或硫苷脂负载的CD1d-PE四聚体与PBS(对照)、1D12或1D22(4∶1的VHH∶CD1d比)一起孵育，在此之后使用四聚体对与CD3-APC组合的Jurkat-Vδ1细胞进行染色(终浓度四聚体2μg/ml)。四聚体结合被1D12阻止并且被1D22(A)降低。将C1R-CD1d细胞与DMSO对照或硫苷脂(25μg/ml)孵育，在此之后添加培养基或抗CD1d VHH(1000或100nM)，并孵育30分钟。接下来，添加Jurkat-Vδ1细胞，并将共培养物另外孵育24小时，在此之后通过流式细胞术确定CD69表达(B)。N＝3。

图3：靶向双特异性CD1d和Vγ9Vδ2-TCR的VHH对iNKT细胞和Vγ9Vδ2-T细胞的双重活化，其导致效应细胞脱颗粒和迅速的肿瘤细胞裂解。在仅存在培养基、单价1D12或双特异性1D12-5C8的情况下，将CD1d表达CCRF-CEM细胞与iNKT细胞或Vγ9Vδ2-T细胞或二者以效应物与靶标比为1∶2孵育。在存在1D12的情况下，观察到iNKT细胞的稳健脱颗粒(如通过CD107a表达所示的)，但仅在存在双特异性VHH的情况下，看到iNKT细胞和Vγ9Vδ2-T细胞同时脱颗粒(A)。因此，观察到活CCRF-CEM细胞显著降低(B)。数据表示从不同供体获得的iNKT/Vγ9Vδ2-T的3个单独实验的平均值+SD。

图4：双特异性1D12-5C8支持iNKT和Vγ9Vδ2-T细胞扩增并诱导肿瘤生长控制。在仅存在培养基或双特异性1D12-5C8的情况下，将iNKT、Vγ9Vδ2-T或混合物(2∶3的比)与MM.1s-CD1d细胞以效应物与靶标比为1∶10孵育。观察到明显的iNKT细胞扩增诱导，然而仅在存在1D12-5C8和iNKT细胞的情况下观察到Vγ9Vδ2-T扩增(A)。值得注意的是，在存在1D12-5C8的情况下，肿瘤生长受到控制(B)。数据表示从不同供体获得的配对iNKT/Vγ9Vδ2-T的3个单独实验的平均值+SD。

图5：抗CD1d VHH 1D12和抗CD1d 51.1 mAb而非抗CD1d VHH 1D22干扰1D12-5C8双特异性VHH的结合。将经CD1d转染的多发性骨髓瘤细胞(MM.1s)与PBS(阴性对照，NC)、抗CD1d VHH(1000nM)或抗CD1d mAb(100nM)一起孵育45分钟，在此之后添加PBS(NC)或生物素化的1D12-5C8双特异性VHH(100nM)，并另外孵育30分钟。在充分洗涤之后，将样品用抗链霉抗生物素蛋白-APC染色并通过流式细胞术进行分析。数据表示3个单独实验的平均值+SD，****P＜0.0001，其用双因素方差分析及Tukey事后检验来计算。

图6：在小鼠多发性骨髓瘤模型中，在存在iNKT和/或Vγ9Vδ2-T细胞的情况下，双特异性抗体1D12-5C8促进存活。图A示出了施用抗体1D12-5C8和/或iNKT细胞对存活的作用。图B示出了施用抗体1D12-5C8和/或Vγ9Vδ2-T细胞的作用。图C示出了施用抗体1D12-5C8和/或iNKT和Vγ9Vδ2-T细胞的混合物(“混合物(mix)”)的作用。

图7：CLL细胞上的CD1d表达。

在来自未经治疗CLL患者的CD5

图8：双特异性抗CD1d-Vδ2 VHH使Vγ9Vδ2-T细胞活化。

(A，B)在存在双特异性抗体1D7-5C8、布雷菲德菌素(brefeldin)、莫能菌素(monensin)和抗CD107a的情况下，通过流式细胞术测量的Vγ9Vδ2-T细胞的细胞因子产生和脱颗粒。(A)将健康供体来源的Vγ9Vδ2-T细胞与培养基对照、Jeko-1细胞(1∶1的比)、双特异性抗体1D7-5C8(100nM)、Jeko-1细胞和双特异性抗体1D7-5C8(1∶1的比，10pM)、或者Jeko-1细胞和双特异性抗体1D7-5C8(1∶1的比，100pM)一起培养。3次实验的代表性图。(B)将健康供体来源的Vγ9Vδ2-T细胞与Jeko-1细胞(1∶1的比)和指定浓度的双特异性抗体1D7-5C8一起培养(n＝3)。(B：非线性回归分析)。符号和误差条表示平均值和范围；垂直线和阴影区表示EC50和95％置信区间。

图9：双特异性抗CD1d-Vδ2 VHH诱导恶性B细胞裂解。

在存在指定浓度的双特异性抗体1D7-5C8的情况下，与健康供体来源的Vγ9Vδ2-T细胞以1∶1效应物与靶标比过夜培养之后靶细胞的裂解。(A)Jeko-1细胞系的特异性裂解(n＝3)。(B)WT或经CD1d转染的MM.1s细胞系上的CD1d表达(空白直方图：经CD1d染色、灰色填充直方图：荧光减一对照)。(C)WT或经CD1d转染的MM.1s细胞系的特异性裂解(n＝4)。(D)具有阴性、低或高CD1d表达的原代CLL细胞的特异性裂解(n＝4/组)。通过校正无Vγ9Vδ2-T细胞的情况下的背景细胞死亡来计算特异性裂解。数据表示平均值和SD。*P＜0.05，**P＜0.01，****P＜0.0001。(A：单因素ANOVA，随后进行Dunnett事后检验，与未经处理的情况进行比较；C：双因素ANOVA，随后进行Sidak事后检验，对每种浓度的WT与CD1d进行比较，D：双因素ANOVA，随后进行Tukey事后检验，对每种浓度的每个CD1d组进行比较)。

图10：双特异性抗CD1d-Vδ2 VHH使来自CLL患者的Vγ9Vδ2-T细胞活化并诱导自体肿瘤裂解

(A至C)患者来源的Vγ9Vδ2-T细胞的活化以及其细胞因子的产生和脱颗粒。通过耗竭CD19

图11：ATRA通过上调CD1d表达增强双特异性抗体1D7-5C8诱导的杀伤

(A)在48小时的ATRA处理之后，Jeko-1细胞上的CD1d表达。(B)在ATRA处理之后CD1d表达的时间曲线(n＝3)。(C)在用100nMATRA处理48小时之后，Jeko-1细胞的生存力(n＝4)。(D)在用ATRA预处理之后Jeko-1细胞的裂解。将Jeko-1细胞用100nM ATRA或培养基对照处理48小时，并将其在存在指定浓度的双特异性抗体1D7-5C8的情况下，与健康供体来源的Vγ9Vδ2-T细胞以1∶2效应物与靶标比培养过夜(n＝4)。(E)在不同浓度的ATRA或培养基对照处理48小时之后，原代CLL细胞上的CD1d表达(n＝17)。(F)用ATRA预处理之后CLL细胞的裂解。将原代CLL细胞用100nM ATRA或培养基对照处理48小时，并将其在存在指定浓度的双特异性抗体1D7-5C8的情况下与健康供体来源的Vγ9Vδ2-T细胞以1∶1效应物与靶标比培养过夜(n＝6)。通过校正无Vγ9Vδ2-T细胞情况下的背景细胞死亡来计算特异性裂解。数据表示平均值和SD。*P＜0.05，***P＜0.001，****P＜0.0001。(C：配对t检验；D、F：双因素ANOVA，随后进行Sidak事后检验，对对照与每个浓度的ATRA处理进行比较；E：Friedman检验，随后进行Dunnett事后检验，与培养基对照进行比较)。

图12：通过双特异性抗体1D7-5C8的Vγ9Vδ2-T细胞活化可通过调节磷酸抗原识别来修饰

(A)用美伐他汀(mevastatin)或帕米膦酸盐(pamidronate)预处理之后，Jeko-1细胞的特异性裂解。将Jeko-1细胞用25μM美伐他汀、50μM帕米膦酸盐或培养基对照处理2小时，并将其与健康供体来源的Vγ9Vδ2-T细胞以1∶2的比与100nM双特异性抗体1D7-5C8培养6小时(n＝3)。(B)来自健康供体PBMC的B细胞上的CD1d表达。(C)在用ABP预处理之后健康B细胞和CLL细胞的特异性裂解。将健康B细胞(分离自健康供体PBMC，经CFSE标记)和CLL细胞(分离自CLL PBMC，经CTV标记)以1∶1的比混合，并将其用50μM帕米膦酸盐或培养基对照预处理2小时。然后将靶细胞与健康供体来源的Vγ9Vδ2-T细胞以1∶1∶1(Vγ9Vδ2-T细胞：B细胞：CLL细胞)的比与指定浓度的双特异性抗体1D7-5C8培养6小时(n＝4)。(D)在阻断CD1d或CD277之后Jeko-1细胞的特异性裂解。将Jeko-1细胞与抗CD1d抗体(5μg/mL)、抗CD277抗体(10μg/mL)、抗CD1d和抗CD277抗体或培养基对照孵育10分钟。然后将靶细胞与健康供体来源的Vγ9Vδ2-T细胞以1∶3的比与10pM双特异性抗体1D7-5C8培养过夜(n＝3)。通过校正无Vγ9Vδ2-T细胞的情况下的背景细胞死亡来计算特异性裂解。数据表示平均值和SD。*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。(A：双因素ANOVA，随后进行Dunnett事后检验，对对照与每种预处理进行比较；C：双因素ANOVA，随后进行Sidak事后检验，对未经处理与经ABP预处理进行比较；D：单因素ANOVA，随后进行Dunnett事后检验，与培养基对照进行比较)。

具体实施方式

本文中使用的术语“抗体”意指免疫球蛋白分子、免疫球蛋白分子的片段或其任一种的衍生物，其具有在通常的生理条件下以显著时段的半衰期与抗原特异性结合的能力，所述时段例如至少约30分钟、至少约45分钟、至少约1小时、至少约2小时、至少约4小时、至少约8小时、至少约12小时、约24小时或更多、约48小时或更多、约3、4、5、6、7或更多天等，或任意其他相关的功能上限定的时期(例如足以诱导、促进、增强、和/或调节与与抗原结合的抗体相关的生理应答的时间和/或足以使抗体募集效应物活性的时间)。与抗原相互作用的结合区(或结合结构域)包含免疫球蛋白分子的重链和轻链二者的可变区。抗体(Ab)的恒定区可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，所述因子包括免疫系统的多种细胞(例如效应细胞和T细胞)以及补体系统的组分，例如C1q，补体活化经典途径中的第一组分。然而，在一些实施方案中，抗体的Fc区已被修饰成具有惰性，“惰性”意指这样的Fc区，其至少不能结合任何Fcγ受体，诱导Fc介导的FcR交联，或诱导Fc介导的通过单独蛋白质(例如抗体)两个Fc区进行的靶抗原的交联。在另一个实施方案中，惰性Fc区另外不能结合C1q。在一个实施方案中，该抗体在第234位和第235位包含突变(Canfield和Morrison(1991)J Exp Med173：1483)，例如，在第234位的Leu至Phe突变和在第235位的Leu至Glu突变。在另一个实施方案中，抗体包含第234位的Leu至Ala突变、第236位的Leu至Ala突变和第329位的Pro至Gly突变。

如上所述，除非另有说明或与上下文明显矛盾，否则本文中使用的术语抗体包括保留与抗原特异性相互作用(例如结合)的能力的抗体片段。已经表明抗体的抗原结合功能可通过全长抗体的片段来进行。涵盖在术语“抗体”之内的结合片段的一些实例包括：(i)Fab’或Fab片段，由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段或如WO2007059782中所述的单价抗体；(ii)F(ab’)2片段，包含在铰链区通过二硫键连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)基本上由VH和CH1结构域组成的Fd片段；和(iv)基本上由抗体的单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段。此外，尽管Fv片段的两个结构域VL和VH由分开的基因编码，但它们可使用重组方法通过合成接头连接起来，使得它们能够成为单蛋白质链，其中VL和VH区配对形成单价分子(称为单链抗体或单链Fv(single chain Fv，scFv)，参见例如Bird等.，Science 242，423-426(1988)和Huston等.，PNAS USA 85，5879-5883(1988))。除非另有说明或上下文明确指出，否则这样的单链抗体涵盖在术语抗体之内。尽管这样的片段通常被包括在抗体的含义之内，但是它们共同且各自独立地是本发明的独特特征，表现出不同的生物学特性和效用。在本发明情况下的这些和其他可用的抗体片段在本文中进一步讨论。还应理解，除非另有指明，否则术语抗体还包括多克隆抗体、单克隆抗体(mAb)、嵌合抗体和人源化抗体，以及保留与通过任意已知技术(例如酶切割、肽合成和重组技术)提供的抗原特异性结合的能力的抗体片段(抗原结合片段)。如此产生的抗体可具有任意同种型。

本文中使用的术语“免疫球蛋白重链”、“免疫球蛋白的重链”或“重链”意指免疫球蛋白的链之一。重链通常由重链可变区(本文中缩写为VH)和限定免疫球蛋白同种型的重链恒定区(本文中缩写为CH)构成。重链恒定区通常由三个结构域CH1、CH2和CH3构成。重链恒定区可还包含铰链区。本文中使用的术语“免疫球蛋白”意指结构上相关的糖蛋白的类别，其由两对多肽链、一对轻(L)链和一对重(H)链组成，所有四对链均可能通过二硫键相互连接。在免疫球蛋白(例如IgG)的结构内，两条重链通过所谓的“铰链区”中的二硫键相互连接。与重链同样地，每条轻链通常由数个区构成；轻链可变区(本文中缩写为VL)和轻链恒定区(本文中缩写为CL)。轻链恒定区通常由一个结构域CL构成。此外，VH和VL区可进一步细分为高变的区(或高变区，其可能是序列高变的和/或形成结构上限定的环)，也称为互补决定区(complementarity determining region，CDR)，散布有更保守的区，称为框架区(framework region，FR)。每个VH和VL通常由三个CDR和四个FR构成，从氨基端至羧基端按以下顺序布置：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。CDR序列可通过使用多种方法来确定，所述方法例如由Choitia和Lesk(1987)J.Mol.Biol.196：901或Kabat等.(1991)Sequenceof protein of immunological interest，fifth edition.NIH publication提供的方法。用于CDR确定和氨基酸编号的多种方法可在

本文中使用的术语“同种型”是指由重链恒定区基因编码的免疫球蛋白(亚)类(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgD、IgA、IgE或IgM)或其任意同种异型，例如IgG1m(za)和IgG1m(f)[SEQ ID NO：407])。因此，在一个实施方案中，抗体包含IgG1类或其任意同种异型的免疫球蛋白的重链。此外，每个重链同种型均可与kappa(κ)或lambda(λ)轻链组合。

本文中使用的术语“嵌合抗体”是指其中可变区来源于非人物种(例如，来源于啮齿动物)并且恒定区来源于不同物种例如人的抗体。嵌合抗体可通过抗体工程来产生。“抗体工程”是用于不同种类的抗体修饰的通用术语，并且其是技术人员公知的过程。因此，嵌合抗体可以是遗传改造重组抗体。一些嵌合抗体可以是遗传改造的或经酶促改造的。产生嵌合抗体在技术人员的知识范围内，并因此，嵌合抗体的产生可通过除本文中所述之外的其他方法来进行。开发用于治疗应用的嵌合单克隆抗体以降低抗体的免疫原性。它们通常可包含对目的抗原具有特异性的非人(例如鼠)可变区，以及人恒定抗体重链和轻链结构域。在嵌合抗体的情况下使用的术语“可变区”或“可变结构域”是指包含免疫球蛋白的重链和轻链二者的CDR和框架区的区。

本文中使用的术语“人源化抗体”是指遗传改造的非人抗体，其包含人抗体恒定结构域和被修饰以与人可变结构域具有高水平序列同源性的非人可变结构域。这可通过将一起形成抗原结合位点的六个非人抗体互补决定区(CDR)移植到同源人接纳体框架区(FR)上来实现。为了完全重建亲本抗体的结合亲和力和特异性，可需要将来自亲本抗体(即非人抗体)的框架残基替换为人框架区(回复突变)。结构同源性建模可帮助鉴定框架区中对于抗体的结合特性重要的氨基酸残基。因此，人源化抗体可包含非人CDR序列、任选地包含针对非人氨基酸序列的一个或更多个氨基酸回复突变的主要人框架区，以及完全人恒定区。任选地，可应用不一定是回复突变的另外的氨基酸修饰以获得具有优选特征例如亲和力和生物化学特性的人源化抗体。非人来源的抗体的氨基酸序列不同于人来源的抗体，并因此，非人抗体在施用于人患者时具有潜在的免疫原性。然而，尽管抗体是非人来源的，但其CDR区段负责抗体与其靶抗原结合的能力，并且人源化旨在维持抗体的特异性和结合亲和力。因此，进行非人治疗性抗体的人源化以使其在人中的免疫原性最小化，而同时这样的人源化抗体维持非人来源抗体的特异性和结合亲和力。

术语“多特异性抗体”是指对至少两种不同的(例如至少三种)通常不重叠的表位具有特异性的抗体。这样的表位可以在同一或不同的靶标上。如果表位在不同的靶标上，则这样的靶标可以在同一细胞或者不同的细胞或细胞类型上。

术语“双特异性抗体”是指对至少两种不同的，通常不重叠的表位具有特异性的抗体。这样的表位可以在同一或不同的靶标上。如果表位在不同的靶标上，则这样的靶标可以在同一细胞或者不同的细胞或细胞类型上。在一个实施方案中，双特异性抗体包含第一和第二重链。

可用于本发明的双特异性抗体分子的一些实例包括(i)具有包含不同抗原结合区的两个臂的单抗体，(ii)对两种不同表位具有特异性的单链抗体，例如通过额外的肽接头串联连接的两个scFv；(iii)双可变结构域抗体(DVD-IgTM)，其中每条轻链和重链包含通过短肽连接串联的两个可变结构域；(iv)化学连接的双特异性(Fab’)2片段；(v)

不同类别的双特异性抗体的一些实例包括但不限于(i)具有互补CH3结构域以迫使异二聚化的IgG样分子；(ii)重组IgG样双靶向分子，其中所述分子的两侧各自包含至少两种不同抗体的Fab片段或Fab片段的一部分；(iii)IgG融合分子，其中全长IgG抗体与额外的Fab片段或Fab片段的一部分融合；(iv)Fc融合分子，其中单链Fv分子或稳定的双抗体与重链恒定结构域、Fc区或其部分融合；(v)Fab融合分子，其中不同的Fab片段融合在一起，与重链恒定结构域、Fc区或其部分融合；以及(vi)基于ScFv、双抗体的抗体和重链抗体(例如，结构域抗体，

具有互补CH3结构域分子的IgG样分子的一些实例包括但不限于

重组IgG样双靶向分子的一些实例包括但不限于双靶向(Dual Targeting，DT)-Ig(GSK/Domantis，WO2009058383)、二合一抗体(Two-in-one Antibody)(Genentech，Bostrom，等2009.Science 323，1610-1614)、交联Mab(Cross-linked Mab)(KarmanosCancer Center)、mAb2(F-Star)、ZybodiesTM(Zyngenia，LaFleur等.MAbs.2013 Mar-Apr；5(2)：208-18)、使用共同轻链的方法，κλBodies(NovImmune，WO2012023053)和

IgG融合分子的一些实例包括但不限于双可变结构域(Dual Variable Domain，DVD)-IgTM(Abbott)、双结构域双头抗体(Unilever；Sanofi Aventis)、IgG样双特异性(ImClone/Eli Lilly，Lewis等.Nat Biotechnol.2014 Feb；32(2)：191-8)、Ts2Ab(MedImmune/AZ，Dimasi等.J Mol Biol.2009 Oct 30；393(3)：672-92)和BsAb(Zymogenetics，WO2010111625)、HERCULES(Biogen Idec)、scFv融合体(Novartis)、scFv融合体(Changzhou Adam Biotech Inc)和TvAb(Roche)。

Fc融合分子的一些实例包括但不限于ScFv/Fc融合体(Academic Institution，Pearce等Biochem Mol Biol Int.1997Sep；42(6)：1179)、SCORPION(EmergentBioSolutions/Trubion，Blankenship JW，等.AACR100th Annual meeting 2009(摘要#5465)；Zymogenetics/BMS，WO2010111625)、双亲和力再靶向技术(Dual AffinityRetargeting Technology)(Fc-DARTTM)(MacroGenics)和Dual(ScFv)2-Fab(国家抗体医学研究中心-中国(National Research Center for Antibody Medicine-China))。

Fab融合双特异性抗体的一些实例包括但不限于F(ab)2(Medarex/AMGEN)、Dual-Action或Bis-Fab(Genentech)、

基于ScFv、双抗体的抗体和结构域抗体的一些实例包括但不限于双特异性T细胞接合剂(Bispecific T Cell Engager)

在本发明的上下文中，“结合部分”是能够与靶标特异性结合的抗体部分。结合部分可例如包含：完整的免疫球蛋白分子，例如单克隆抗体。或者，结合部分可包含抗原结合功能片段，包括但不限于Fab、F(ab’)、F(ab’)2、Fv、dAb、Fd、互补决定区(CDR)片段、单链抗体(scFv)、二价单链抗体、单链噬菌体抗体、双特异性双链抗体、三抗体(triabody)、四抗体(tetrabody)、单结构域抗体

本文中使用的术语“特异性结合”是指结合部分或抗体与预定的抗原或靶标(例如人CD1d)的结合，当通过例如表面等离子体共振(surface plasmon resonance，SPR)技术在BIAcore 3000仪器中使用抗原作为配体以及结合部分或抗体作为分析物进行确定时，通常以对应于以下K

在本发明的上下文中，“竞争(competition)”或“能够竞争”或“竞争(compete)”是指在存在结合结合配偶体的另一分子(例如，不同的CD1d抗体)的情况下，特定抗体(例如CD1d抗体)结合特定结合配偶体(例如CD1d)的倾向性的任何可检测的显著降低。通常来说，竞争意指由另一CD1d抗体或部分的存在引起的CD1d抗体或部分之间的结合至少约25％降低，例如至少约50％，例如至少约75％，例如至少90％降低，如通过例如ELISA分析或流式细胞术使用足量的两种或更多种竞争性抗体或部分确定的。用于通过竞争性抑制来确定结合特异性的另外的方法可见于例如Harlow等.，Antibodies：A Laboratory Manual，ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，1988)，Colligan等.，eds.，Current Protocols in Immunology，Greene Publishing Assoc，and WileyInterScience N.Y.，(1992，1993)，和Muller，Meth.Enzymol.92，589-601(1983))中。

如上所述，在一个主要方面中，本发明提供了包含能够结合人CD1d的第一结合部分和能够结合人Vγ9Vδ2-TCR的第二结合部分的抗体，其用于治疗慢性淋巴细胞白血病、多发性骨髓瘤或急性髓性白血病。术语“与Vγ9Vδ2-TCR结合”意指抗体结合Vγ9Vδ2-TCR，但不排除在不存在另一亚基的情况下抗体与一个单独的亚基结合，即与单独的Vγ9链结合或与单独的Vδ2链结合。例如，如在本文中表2中可见，抗体5C8是结合Vγ9Vδ2-TCR的抗体，但当单独表达Vδ2链时其也结合Vδ2链。

术语“第一”和“第二”结合部分不指其在抗体中的取向/位置，即，其不具有对于N-或C-端的意义。术语“第一”和“第二”仅用于正确和一致地指代权利要求书和说明书中的两个不同的结合部分。在一个优选实施方案中，第一结合部分和第二结合部分通过一个或更多个酰胺键彼此偶联，优选地通过接头，更优选包含氨基酸GGGGS(SEQ ID NO：159)的接头彼此偶联。包含通过肽接头(GGGGS)连接的第一和第二结合部分的抗体的两个非限制性实例示出于表1(SEQ ID NO：160和SEQ ID NO：164)中。在另一个优选实施方案中，抗体是双特异性抗体，例如全长双特异性抗体。当在本文中使用时，术语“全长抗体”是指包含所有重链和轻链恒定结构域和可变结构域的抗体，所述恒定结构域和可变结构域对应于通常存在于该同种型的野生型抗体中的那些。

在本发明的上下文中，“能够使Vγ9Vδ2 T细胞活化”意指在存在根据本发明的抗体的情况下，特别是在存在表达CD1d的靶细胞的情况下，Vγ9Vδ2 T细胞被活化。优选地，Vγ9Vδ2 T细胞的活化可通过基因表达和/或(表面)标志物表达(例如，活化标志物，如CD25、CD69或CD107a)和/或分泌蛋白(例如，细胞因子或趋化因子)谱来测量。在一个优选实施方案中，抗体能够诱导活化(例如，CD69和/或CD25表达的上调)，从而导致Vγ9Vδ2 T细胞的脱颗粒(以CD107a表达的提高为标志；实施例3)和细胞因子产生(例如，TNFα、IFNγ)。优选地，Vγ9Vδ2 T细胞的活化在体内发生，特别是在已施用根据本发明的抗体的人体中发生，并且该人体包含Vγ9Vδ2 T细胞，并且优选CD1d+靶细胞。优选地，本发明的抗体能够将Vγ9Vδ2T细胞上的CD107a表达提高至至少10％，更优选至少20％，更优选至少40％，最优选至少90％(当将其用于如实施例3中所述的测定中时)，其中例如10％意指细胞的总数目的10％对于CD107a呈阳性。在另一个实施方案中，在存在本发明的方法中使用的抗体的情况下，对于CD107a呈阳性的细胞的数目提高1.5倍，例如2倍，例如5倍。

类似地，对于iNKT细胞，在本发明的上下文中“能够使……活化”意指在存在根据本发明应用的抗体的情况下，特别是在存在CD1d分子的情况下，优选在细胞表面上存在CD1d分子的情况下，iNKT cell细胞表现不同。使用标志物，例如CD25(实施例1)、CD69、CD107a(实施例3)，或者细胞因子/趋化因子，例如IFNγ(实施例1)、TNFα、IL-2来确定iNKT细胞是否被活化。优选地，iNKT细胞的活化在体内发生，特别是在已施用根据本发明的抗体的人体中发生，并且该人体包含iNKT细胞，并且优选CD1d+靶细胞。其中，CD1d+靶细胞意指有助于疾病致病性的CD1d+细胞，而不是正常的CD1d表达细胞。优选地，本发明的抗体能够将iNKT细胞上的CD107a表达提高至至少20％，更优选地至至少30％，最优选地至至少40％(当将其用于如实施例3中所述的测定中时)，其中例如10％意指细胞的总数目的10％对于CD107a呈阳性。在另一个实施方案中，在存在本发明的方法中使用的抗体的情况下，对于CD107a呈阳性的细胞的数目提高了1.5倍，例如2倍，例如5倍。此外，优选地，与“载剂”对照相比，本发明中使用的抗体能够将iNKT细胞上的CD25表达提高至至少10倍，更优选地至至少20倍，最优选地至至少30倍，如在FACS中使用别藻蓝蛋白(allophycocyanin，APC)缀合的CD25通过流式细胞术的平均荧光强度所测量的(当将本发明的结合分子用于实施例1中所述的测定中时)。优选地，本发明的抗体能够将通过iNKT细胞的IFNγ表达提高至少1.5倍，例如至少2倍或至少3倍(当将其用于如实施例1中所述的测定中时)。

如上所述，在第一主要方面中，本发明提供了包含能够结合人CD1d的第一结合部分和能够结合人Vγ9Vδ2-TCR的第二结合部分的抗体，其用于治疗慢性淋巴细胞白血病、多发性骨髓瘤或急性髓性白血病。

因此，本发明中使用的抗体是多特异性抗体。抗体可以是双特异性的，或者甚至包含能够结合抗原的另一些结合部分。能够结合人CD1d的数种抗体描述于WO2016122320中。这些抗体是可用于作为本发明中使用的抗体中的第一结合部分的序列的非限制性实例。这些抗体VHH 1至VHH 21示出于表1中。

第二结合部分能够与Vγ9Vδ2-TCR结合，优选与Vδ2链结合。与TCR的Vδ2链或Vγ9链结合的数种这样的抗体描述于WO2015156673中，并示出于表1和表2中。

表1 VHH(CDR)、TCR链以及本发明中使用的抗体中包含的多种VHH序列的名称。

表2：来自WO2015156673：VHH与表达Vγ9或Vδ2链(分别与非Vδ2或Vγ9链配对)、表达完整的Vγ9Vδ2 TCR或不表达任何Vγ9Vδ2 TCR链的γδT细胞的结合。“-”指示平均荧光指数(Mean Fluorescence Index，MFI)低于1.5，“+/-”指示MFI为1.5至4.5，“+”指示MFI为4.6至20，并且“++”指示MFI高于20。

在本发明的一个实施方案中，所述抗体与另外的药剂，例如另外的治疗剂组合使用。在一个实施方案中，所述抗体与能够上调CD1d表达的化合物，例如全反式视黄酸(all-trans retinoic acid，ATRA)组合使用。化合物上调CD1d表达的能力可例如使用Li等.(2014)Blood 124：2201中描述的方法进行评价。

在另一个实施方案中，所述抗体与能够上调CD1d表达的化合物(例如全反式视黄酸)以及EZH2抑制剂(例如他泽司他(tazemetostat))组合使用。在另一个实施方案中，所述抗体用于与氨基双膦酸盐组合使用。

在本发明的另一个实施方案中，所述抗体用于年长患者，例如高于65岁，例如高于70岁的患者。

在另一个实施方案中，本发明涉及用于治疗慢性淋巴细胞白血病(CCL)的方法，其包括以下步骤：

i)选择CD1d+CLL患者，以及

ii)向所述患者施用包含能够结合人CD1d的第一结合部分和能够与人Vγ9Vδ2-TCR结合的第二结合部分的抗体。CD1d+CLL患者的选择可通过使用本文中实施例中描述的测定表征来自所述患者的CLL细胞来进行。

抗体可具有适合于指定用途的任意抗体形式。然而，在一个优选实施方案中，抗体的第一和/或第二结合部分是单结构域抗体。单结构域抗体(sdAb，也称为

像完整抗体一样，单结构域抗体也能够与特定抗原选择性地结合。单结构域抗体可仅包含免疫球蛋白链的可变结构域，即CDR1、CDR2和CDR3和框架区。其中，单结构域抗体的分子量为仅约12至15kDa，比由两条重链和两条轻链构成的常见抗体(150至160kDa)或者甚至由一条轻链和部分重链构成的Fab片段(53kDa)要小得多。单结构域抗体的形式在与其靶标结合时具有较少空间位阻的优点。

在一个实施方案中，本发明中使用的抗体能够与具有根据SEQ ID NO：64至84中任一个的序列的单结构域抗体竞争与人CD1d结合，优选地，其中所述抗体与具有根据SEQ IDNO：64至84中任一个的序列的单结构域抗体结合人CD1d上相同的表位。用于确定抗体表位的方法是本领域已知的。

在另一个实施方案中，所述抗体能够使iNKT细胞活化。本发明人已经表明，抗体1D12(VHH 12)能够使iNKT细胞活化，而与iNKT细胞的外源配体(例如α-半乳糖基神经酰胺)的存在无关。本发明还提供了这样的见解，即通过Vδ1+T细胞的CD1d识别可被这样的抗体阻断，并且根据本发明的抗体中第二结合部分的存在使得能够使Vδ2+T细胞活化。这样的三重作用抗体，即能够降低CD1d限制性Vδ1+T细胞的活化，和使iNKT细胞活化，以及同时允许Vδ2+T细胞的活化，产生了偏向Th1型抗肿瘤应答的微环境。Vδ1+T细胞的活化降低、iNKT细胞的活化和Vδ2+T细胞的活化协同作用于肿瘤侵袭性微环境，从而促进了有效的肿瘤细胞杀伤。

在另一个实施方案中，本发明中使用的抗体能够降低Vδ1 T细胞活化。在该情况下降低Vδ1 T细胞活化意味着Vδ1 T细胞不再能够识别其在CD1d分子上的配体，所述CD1d分子与如本发明中限定的抗体结合。这样的降低的Vδ1 T细胞活化可例如通过测量Vδ1+T细胞上的活化标志物CD69的表达来确定。在较低活化的Vδ1+T细胞(例如如实施例2中使用的Jurkat细胞)中观察到较低的CD69表达水平。特别是当在Vδ1+肿瘤细胞的情况下使用时，阻断意指根据本发明的抗体的存在对肿瘤细胞生长和/或生存力具有负面影响。优选地，如当在如实施例2中所述的测定中进行测试时，与“载剂”对照相比，通过根据本发明的抗体将Jurkat细胞上的CD69表达提高小于5倍，例如小于2倍。

在另一个实施方案中，所述抗体的第一结合部分包含：

i)分别根据SEQ ID NO：1、2和3的CDR1、CDR2和CDR3序列，

ii)分别根据SEQ ID NO：4、5和6的CDR1、CDR2和CDR3序列，

iii)分别根据SEQ ID NO：7、8和9的CDR1、CDR2和CDR3序列，

iv)分别根据SEQ ID NO：10、11和12的CDR1、CDR2和CDR3序列，

v)分别根据SEQ ID NO：13、14和15的CDR1、CDR2和CDR3序列，

vi)分别根据SEQ ID NO：16、17和18的CDR1、CDR2和CDR3序列，

vii)分别根据SEQ ID NO：19、20和21的CDR1、CDR2和CDR3序列，

viii)分别根据SEQ ID NO：22、23和24的CDR1、CDR2和CDR3序列，

ix)分别根据SEQ ID NO：25、26和27的CDR1、CDR2和CDR3序列，

x)分别根据SEQ ID NO：28、29和30的CDR1、CDR2和CDR3序列，

xi)分别根据SEQ ID NO：31、32和33的CDR1、CDR2和CDR3序列，

xii)分别根据SEQ ID NO：34、35和36的CDR1、CDR2和CDR3序列，

xiii)分别根据SEQ ID NO：37、38和39的CDR1、CDR2和CDR3序列，

xiv)分别根据SEQ ID NO：40、41和42的CDR1、CDR2和CDR3序列，

xv)分别根据SEQ ID NO：43、44和45的CDR1、CDR2和CDR3序列，

xvi)分别根据SEQ ID NO：46、47和48的CDR1、CDR2和CDR3序列，

xvii)分别根据SEQ ID NO：49、50和51的CDR1、CDR2和CDR3序列，

xviii)分别根据SEQ ID NO：52、53和54的CDR1、CDR2和CDR3序列，

xix)分别根据SEQ ID NO：55、56和57的CDR1、CDR2和CDR3序列，

xX)分别根据SEQ ID NO：58、59和60的CDR1、CDR2和CDR3序列，或

xxi)分别根据SEQ ID NO：61、62和63的CDR1、CDR2和CDR3序列。

CDR1、CDR2和CDR3序列或框架区可以在物种之间交换。例如，可以从美洲驼免疫球蛋白分子中选择CDR序列，并将其与人免疫球蛋白分子中的CDR序列交换，以获得具有来源于美洲驼CDR序列的特异性的人免疫球蛋白分子。这可以是有利的，因为与包含原始美洲驼框架序列的抗体相比，人序列对人的免疫原性可能较低。这样的序列交换被称为人源化。因此，如由本发明提供的免疫球蛋白分子可具有人来源的免疫球蛋白序列或来源于另一些动物，例如但不限于骆驼科、美洲驼、鲨鱼的免疫球蛋白序列，并且具有被根据本发明的CDR序列替代的CDR1、CDR2和CDR3序列以便提供人CD1d结合。换言之，根据本发明的抗体可包含具有如本文中所公开的CDR的人源化单结构域抗体。例如，单结构域抗体可具有人框架序列和如本文中所公开的CDR区。

在另一个实施方案中，抗体的第一结合部分包含SEQ ID NO：64至84或161中所示的序列中的任一个。

如上所述，本发明中使用的抗体能够结合人Vγ9Vδ2-TCR。在一个实施方案中，所述抗体能够结合Vγ9，而在另一实施方案中，所述抗体能够结合Vδ2。

在一个实施方案中，所述抗体能够与具有根据SEQ ID NO：139至156中任一个的序列的单结构域抗体竞争与人Vγ9Vδ2-TCR结合，优选地，其中所述抗体与具有根据SEQ IDNO：139至156中任一个的序列的单结构域抗体结合人Vγ9Vδ2-TCR上相同的表位。

因此，还提供了根据本发明应用的抗体，其中第二结合部分能够与以下单结构域抗体竞争与Vγ9Vδ2-TCR结合：5E3(SEQ ID NO：139)、6H1(SEQ ID NO：140)、5G3(SEQ IDNO：141)、5C1(SEQ ID NO：142)、5D3(SEQ ID NO：143)、6E3(SEQ ID NO：144)、6H4(SEQ IDNO：145)、6C1(SEQ ID NO：146)、6H3(SEQ ID NO：147)、6G3(SEQ ID NO：148)、5C8(SEQ IDNO：149)、5F5(SEQ ID NO：150)、6A1(SEQ ID NO：151)、6E4(SEQ ID NO：152)、5C7(SEQ IDNO：153)、5D7(SEQ ID NO：154)、5B11(SEQ ID NO：155)或6C4(SEQ ID NO：156)。优选地，第二结合部分与如由以下结合部分识别的相同的表位序列结合：5E3、6H1、5G3、5C1、5D3、6E3、6H4、6C1、6H3、6G3、5C8、5F5、6A1、6E4、5C7、5D7、5B11或6C4。

在另一个实施方案中，第二结合部分包含：

i)分别根据SEQ ID NO：85、86和87的CDR1、CDR2和CDR3序列，

ii)分别根据SEQ ID NO：88、89和90的CDR1、CDR2和CDR3序列，

iii)分别根据SEQ ID NO：91、92和93的CDR1、CDR2和CDR3序列，

iv)分别根据SEQ ID NO：94、95和96的CDR1、CDR2和CDR3序列，

v)分别根据SEQ ID NO：97、98和99的CDR1、CDR2和CDR3序列，

vi)分别根据SEQ ID NO：100、101和102的CDR1、CDR2和CDR3序列，

vii)分别根据SEQ ID NO：103、104和105的CDR1、CDR2和CDR3序列，

viii)分别根据SEQ ID NO：106、107和108的CDR1、CDR2和CDR3序列，

ix)分别根据SEQ ID NO：109、110和111的CDR1、CDR2和CDR3序列，

x)分别根据SEQ ID NO：112、113和114的CDR1、CDR2和CDR3序列，

xi)分别根据SEQ ID NO：115、116和117的CDR1、CDR2和CDR3序列，

xii)分别根据SEQ ID NO：118、119和120的CDR1、CDR2和CDR3序列，

xiii)分别根据SEQ ID NO：121、122和123的CDR1、CDR2和CDR3序列，

xiv)分别根据SEQ ID NO：124、125和126的CDR1、CDR2和CDR3序列，

xv)分别根据SEQ ID NO：127、128和129的CDR1、CDR2和CDR3序列，

xvi)分别根据SEQ ID NO：130、131和132的CDR1、CDR2和CDR3序列，

xvii)分别根据SEQ ID NO：133、134和135的CDR1、CDR2和CDR3序列，或

xviii)分别根据SEQ ID NO：136、137和138的CDR1、CDR2和CDR3序列。

在另一个实施方案中，所述抗体的第二结合部分包含SEQ ID NO：139至156或162或163中所示的序列中的任一个。在另一个实施方案中，所述抗体包含SEQ ID NO：164中所示的序列。

在另一个实施方案中，所述抗体包含另外的肿瘤靶向部分。肿瘤靶向部分包含能够与肿瘤抗原特异性结合的结合部分。肿瘤抗原是由肿瘤细胞产生的蛋白质，其引发免疫应答，特别是T细胞介导的免疫应答。抗原结合部分的选择将取决于待治疗癌症的特定类型。肿瘤抗原是本领域公知的，并且包括例如胶质瘤相关抗原、癌胚抗原(carcinoembryonic antigen，CEA)、EGFRvIII、白介素-11受体α(Interleukin-11receptor alpha，IL-11Rα)、白介素-13受体亚基α-2(IL-13Ra或CD213A2)、表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)、B7H3(CD276)、Kit(CD117)、碳酸酐酶(CA-IX)、CS-1(也称为CD2亚群1)、黏蛋白1、细胞表面相关(MUC1)、BCMA、由裂点簇区(breakpoint cluster region，BCR)和艾贝尔森鼠白血病病毒致癌基因同源物1(Abl)组成的致癌基因融合蛋白bcr-abl、受体酪氨酸蛋白激酶ERBB2(HER2/neu)、β-人绒毛膜促性腺激素、甲胎蛋白(alphafetoprotein，AFP)、间变性淋巴瘤激酶(anaplastic lymphomakinase，ALK)、CD19、CD123、周期蛋白B1、凝集素反应性AFP、Fos相关抗原1、肾上腺素受体β3(ADRB3)、甲状腺球蛋白、酪氨酸酶；肝配蛋白A型受体2(ephrin type-A receptor 2，EphA2)、晚期糖基化终末产物的受体(RAGE-1)、肾遍在1(renal ubiquitous 1，RU1)、肾遍在2(renal ubiquitous 2，RU2)、滑膜肉瘤、X断裂点2(SSX2)、A激酶锚固蛋白4(A kinaseanchor protein 4，AKAP-4)、淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶(lymphocyte-specificprotein tyrosine kinase，LCK)、前顶体蛋白结合蛋白sp32(OY-TES1)、配对盒蛋白Pax-5(PAX5)、由T细胞3识别的鳞状细胞癌抗原(Squamous Cell Carcinoma AntigenRecognized By T Cells 3，SART3)、C型凝集素样分子-1(C-type lectin-like molecule-1，CLL-1或CLECL1)、岩藻糖基GM1、globoH糖神经酰胺的己糖部分(GloboH)、MN-CA IX、上皮细胞黏附分子(Epithelial cell adhesion molecule，EPCAM)、EVT6-AML、转谷氨酰胺酶5(transglutaminase 5，TGS5)、人端粒酶逆转录酶(human telomerase reversetranscriptase，hTERT)、聚唾液酸、胎盘特异性1(placenta-specific 1，PLAC1)、肠羧酸酯酶、LewisY抗原、唾液酸化Lewis黏附分子(sialyl Lewis adhesion molecule，sLe)、淋巴细胞抗原6复合物、基因座K 9(LY6K)、热休克蛋白70-2突变型(heat shock protein 70-2mutated，mut hsp70-2)、M-CSF、禽v-myc、骨髓细胞瘤病病毒致癌基因神经母细胞瘤来源同源物(MYCN)、Ras同源家族成员C(Ras Homolog Family Member C，RhoC)、酪氨酸酶相关蛋白2(Tyrosinase-related protein 2，TRP-2)、细胞色素P4501B1(Cytochrome P4501B1，CYP1B1)、CCCTC结合因子(锌指蛋白)样(BORIS或印记位点调节物兄弟(Brother ofthe Regulator of Imprinted Site))、蛋白酶、前列腺-特异性抗原(prostate-specificantigen，PSA)、配对盒蛋白Pax-3(PAX3)、前列腺酸性磷酸酶(prostatic acidphosphatase，PAP)、癌症/睾丸抗原1(NY-ESO-1)、癌症/睾丸抗原2(LAGE-1a)、LMP2、神经细胞黏附分子(neural cell adhesion molecule，NCAM)、肿瘤蛋白p53(p53)、p53突变体、大鼠肉瘤(Ras)突变体、糖蛋白100(gp100)、prostein、OR51E2、泛连接蛋白3(pannexin 3，PANX3)、前列腺干细胞抗原(prostate stem cell antigen，PSCA)、高分子量黑素瘤相关抗原(high molecular weight-melanoma-associated antigen，HMWMAA)、甲型肝炎病毒细胞受体1(Hepatitis A virus cellular receptor 1，HAVCR1)、血管内皮生长因子受体2(vascular endothelial growth factor receptor 2，VEGFR2)、血小板来源生长因子受体β(Platelet-derived growth factor receptor beta，PDGFR-beta)、豆荚蛋白(legumain)、人乳头瘤病毒E6(human papilloma virus E6，HPV E6)、人乳头瘤病毒E7(human papilloma virus E7，HPV E7)、存活素(survivin)、端粒酶、精子蛋白17(spermprotein 17，SPA17)、阶段特异性胚胎抗原4(Stage-specific embryonic antigen-4，SSEA-4)、酪氨酸酶、TCRγ替代阅读框蛋白(TCR Gamma Alternate Reading FrameProtein，TARP)、威尔姆斯瘤蛋白(Wilms tumor protein，WT1)、前列腺癌肿瘤抗原1(prostate-carcinoma tumor antigen-1，PCTA-1)、黑素瘤凋亡抑制剂(melanomainhibitor of apoptosis，ML-IAP)、MAGE、黑素瘤相关抗原1(MAGE-Al)、黑素瘤癌睾丸抗原1(melanoma cancer testis antigen-1，MAD-CT-1)、黑素瘤癌睾丸抗原2(melanomacancer testis antigen-2，MAD-CT-2)、由T细胞1识别的黑素瘤抗原(MelanA/MARTl)、X抗原家族成员1A(XAGE1)、延伸因子2突变型(elongation factor 2mutated，ELF2M)、ERG(TMPRSS2ETS融合基因)、N-乙酰基氨基葡萄糖基转移酶V(NA17)、中性粒细胞弹性蛋白酶、肉瘤易位断裂点、乳腺分化抗原(NY-BR-1)、ephrinB2、CD20、CD22、CD24、CD30、CD33、CD38、CD44v6、CD97、CD171、CD179a、雄激素受体、胰岛素生长因子(insulin growth factor，IGF)-I、IGF-II、IGF-I受体、神经节苷脂GD2(GD2)、邻乙酰基GD2神经节苷脂(OAcGD2)、神经节苷脂GD3(aNeu5Ac(2-8)aNeu5Ac(2-3)bDGalp(1-4)bDGlcp(1-1)Cer)、神经节苷脂GM3(aNeu5Ac(2-3)bDGa3p(1-4)bDGlcp(1-1)Cer)、G蛋白偶联受体C类5组成员D(G protein-coupled receptor class C group 5，member D，GPRC5D)、G蛋白偶联受体20(G protein-coupled receptor 20，GPR20)、X染色体开放阅读框61(chromosome X open readingframe 61，CXORF61)、叶酸受体(FRα)、叶酸受体p、受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(Receptortyrosine kinase-like orphan receptor 1，ROR1)、Fms样酪氨酸激酶3(Fms-LikeTyrosine Kinase 3，Flt3)、肿瘤相关糖蛋白72(Tumor-associated glycoprotein 72，TAG72)、Tn抗原(TN Ag或(GalNAca-Ser/Thr))、血管生产素结合细胞表面受体2(Tie 2)、肿瘤内皮标志物1(tumor endothelial marker 1，TEM1或CD248)、肿瘤内皮标志物7相关(tumor endothelial marker 7-related，TEM7R)、密封蛋白-6(claudin 6，CLDN6)、甲状腺刺激激素受体(thyroid stimulating hormone receptor，TSHR)、尿路斑块蛋白2(uroplakin 2，UPK2)、间皮素、蛋白酶丝氨酸21(Testisin或PRSS21)、表皮生长因子受体(EGFR)、成纤维细胞活化蛋白α(FAP)、嗅觉受体51E2(Olfactory receptor 51E2，OR51E2)、位于染色体12p上的ETS易位变体基因6(ETV6-AML)、CD79a；CD79b；CD72；白细胞相关免疫球蛋白样受体1(Leukocyte-associated immunoglobulin-like receptor 1，LAIR1)；IgA受体的Fc片段(Fc fragment of IgA receptor，FCAR或CD89)；白细胞免疫球蛋白样受体亚家族A成员2(Leukocyte immunoglobulin-like receptor subfamily A member 2，LILRA2)；CD300分子样家族成员f(CD300 molecule-like family member f，CD300LF)；C型凝集素结构域家族12成员A(C-type lectin domain family 12 member A，CLEC12A)；骨髓基质细胞抗原2(BST2)；含EGF样模块的黏蛋白样激素受体样2(EGF-like module-containingmucin-like hormone receptor-like 2，EMR2)；淋巴细胞抗原75(lymphocyte antigen75，LY75)；磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(Glypican-3，GPC3)；Fc受体样5(Fc receptor-like 5，FCRL5)；免疫球蛋白λ样多肽1(immunoglobulin lambda-like polypeptide 1，IGLL1)；叶酸受体(FRα)；间皮素；EGFR变体III(EGFR variant III，EGFRvIII)；B细胞成熟抗原(B-cell maturation antigen，BCMA)；GD2；CLL-1；CA-IX；MUC1；HER2；及其任意组合。在一个优选实施方案中，肿瘤抗原选自叶酸受体(FRα)、间皮素、EGFRvIII、IL-13Ra、CD123、CD19、CD33、BCMA、GD2、CLL-1、CA-IX、MUC1、HER2，及其任意组合。在一个实施方案中，肿瘤靶向部分是与以下特异性结合的免疫球蛋白：PD-L1、EGFR、CD40、Her2、MUC-1、CEA、c-met、CD19、CD20、BCMA、Her3、AFP、CAIX或CD38。

可根据常规技术，例如(Rowe等.，Handbook of Pharmaceutical Excipients，2012 June，ISBN 9780857110275)中公开的那些，将多肽(例如抗体)与可药用的载体或稀释剂以及任意其他已知的辅料和赋形剂一起配制。可药用的载体或稀释剂以及任意其他已知的辅料和赋形剂应适合于多肽或抗体以及选择的施用方式。对药物组合物的载体和其他组分的适合性基于对本发明的所选择的化合物或药物组合物的所期望生物学特性没有显著的负面影响(例如，小于对抗原结合的显著性影响(10％或更低的相对抑制，5％或更低的相对抑制等))来确定。药物组合物还可包含稀释剂、填充剂、盐、缓冲剂、洗涤剂(例如非离子洗涤剂，例如吐温20或吐温80)、稳定剂(例如糖或不含蛋白质的氨基酸)、防腐剂、组织固定剂、增溶剂和/或适合于包含在药物组合物中的其他材料。另一些可药用的赋形剂和载体包括与本发明的抗体在生理上相容的任意和所有合适的溶剂、分散介质、包衣、抗细菌和抗真菌剂、等张剂、抗氧化剂和吸收延迟剂等。

本发明提供了治疗疾病或病症的方法，其包括向有此需要的对象施用如本文中所限定的抗体。在一个实施方案中，对象是人。本发明的方法涉及施用有效量的抗体。“治疗”或其变化形式是指出于减轻、改善、阻止或消除(治愈)症状或疾病状态的目的而施用有效量的根据本发明的治疗活性多肽。“有效量”或“治疗有效量”是指在所需的剂量下和时段内有效达到所期望治疗结果的量。多肽(例如抗体)的治疗有效量可根据因素，例如个体的疾病阶段、年龄、性别和体重以及抗体在个体中引发期望应答的能力而变化。治疗有效量也是其中治疗有益作用胜过抗体或抗体部分的任何毒性或有害作用的量。

施用可通过任意合适的途径进行，但是其通常是肠胃外的，例如静脉内、肌内或皮下。用于抗体的有效剂量和剂量方案取决于待治疗的疾病或病症，并且可由本领域技术人员确定。

本发明中使用的抗体也可以以组合治疗施用，即与和待治疗的疾病或病症相关的其他治疗剂组合施用。因此，在一个实施方案中，含抗体的药物与一种或更多种另一些治疗剂例如细胞毒性剂、化学治疗剂或抗血管生成剂组合。这样的组合施用可以是同时的、分开的或依次的。因此，在另一个实施方案中，本发明提供了用于治疗或预防疾病(例如癌症)的方法，所述方法包括向有此需要的对象施用与放射治疗和/或手术组合的治疗有效量的本发明的抗体或药物组合物。

在另一方面中，本发明涉及用于治疗慢性淋巴细胞白血病、多发性骨髓瘤或急性髓性白血病的方法，其包括向有此需要的人对象施用包含能够结合人CD1d的第一结合部分和能够结合人Vγ9Vδ2-TCR的第二结合部分的抗体。在一个实施方案中，所述方法具有本文中所述的抗体或用途的另外的特征中的任一个。

本发明中使用的抗体，例如多肽，特别是抗体，通常是重组产生的，即通过在合适的宿主细胞中表达编码该多肽的核酸构建体，随后从细胞培养物中纯化所产生的重组多肽。核酸构建体可通过本领域公知的标准分子生物学技术来产生。通常使用载体将构建体引入到宿主细胞中。合适的核酸构建体、载体是本领域已知的。适合于多肽(例如抗体)重组表达的宿主细胞是本领域公知的，并且包括CHO、HEK-293、Expi293F、PER-C6、NS/0和Sp2/0细胞。或者，表达可以在酵母，例如毕赤酵母(Pichia pastoris)、多形汉逊酵母(Hansenulapolymorpha)或酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或者细菌中进行。

实施例

材料

细胞系

将用CD1d稳定转导的经人EB病毒(Epstein-Barr virus)转化的B淋巴母细胞细胞系C1R，以及人细胞系JY在补充有以下的Iscove改良Dulbecco培养基(目录no.12-722F；Lonza，Basel，Switzerland)中培养：10％(v/v)胎牛血清(目录no.SV30160.03；HyClone GEHealthcare，Chalfont，St Giles，UK)、0.05mmβ-巯基乙醇、100IU/ml青霉素钠、100μg/ml硫酸链霉素和2.0mm 1-谷氨酰胺(目录no.10378-016；Life Technologies，Carlsbad，CA)。将用CD1d稳定转导的人宫颈腺癌细胞系HeLa在补充有以下的Dulbecco改良Eagle培养基(目录no.BE12-709F；Lonza)中培养：10％(v/v)胎牛血清、0.05mmβ-巯基乙醇、100IU/ml青霉素钠、100μg/ml硫酸链霉素和2.0mm 1-谷氨酰胺。将具有或不具有mcherry/luc并用CD1d稳定转导的人骨髓瘤细胞系MM.1s、人急性T淋巴细胞白血病细胞系CCRF-CEM、用Vδ1硫苷脂CD1d限制性TCR转导的人急性T细胞白血病细胞系Jurkat，以及人急性髓性白血病细胞系MOLM-13和NOMO-1在补充有以下的RPMI-1640(目录no.BE12-115F；Lonza)培养基中培养：10％(v/v)胎牛血清、0.05mmβ-巯基乙醇、100IU/ml青霉素钠、100μg/ml硫酸链霉素和2.0mm 1-谷氨酰胺。CCRF-CEM和MM.1s的遗传特征通过PCR单基因座技术来确定，并发现与公开的DNA谱相同。将细胞进行支原体阴性检测，并频繁通过流式细胞术测试纯度(转染子)。

流式细胞术和单克隆抗体

在该研究中使用了以下抗体：异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate，FITC)缀合的Vδ2、FITC CD69、藻红蛋白(phycoerythrin，PE)和别藻蓝蛋白(allophycocyanin，APC)缀合的CD25(目录no 555432和#340907)，以及APC CD3购自BDBiosciences(Franklin Lakes，NJ)。藻红蛋白-花青7缀合的Vα24(目录no.PN A66907)和Vβ11 PE(目录no.IM2290)购自Beckman Coulter(Brea，CA)。7-氨基放线菌素D(7-aminoactinomycin D，7-AAD)购自Sigma(St Louis，MO)，PEVγ9购自Biolegend(SanDiego，USA)，PE CD107a购自Miltenyi(Miltenyi Biotec，Bergisch Gladbach，Germany)和FITC膜联蛋白V购自VPS Diagnostics(Hoever，the Netherlands)(目录no.A700)。四聚体在内部制成。除非另有指明，否则在4°下在FACS缓冲液(补充有0.1％BSA和0.02％叠氮化钠的PBS)中进行流式细胞术染色，持续30分钟。在FACS Fortessa(BD Biosciences)上对样品进行分析。

DC、iNKT和Vγ9Vδ2-T细胞系的产生

moDC和原代人iNKT和γδT细胞如前所述(De Bruin等(2016)Clin Immunol 169：128)产生。简言之，使用CD14 MicroBeads(Miltenyi Biotec，Bergisch Gladbach，Germany)从外周血单个核细胞中分离单核细胞，并将其在存在1000U/ml粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(Sanofi Leukine，Bridgewater，NJ)和20ng/ml IL-4(目录no.204-IL/CF；R&D Systems，Minneapolis，MN)的情况下，在完全RPMI-1640培养基中培养5至7天，并随后在存在或不存在100ng/mlα-GalCer(目录no.KRN7000；Funakoshi，Tokyo，Japan)的情况下用100ng/ml脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)(目录no.L6529；Sigma)成熟，持续48至72小时。使用磁珠分选从健康志愿者的外周血单个核细胞中纯化iNKT细胞，并将其每周在补充有1％人AB血清、10U/ml IL-7(目录no.207-IL/CF；R&D Systems)和10ng/ml IL-15(目录no.34-8159；eBioscience)的Yssel培养基中用成熟的α-GalCer负载的moDC进行刺激。使用磁珠分选从健康志愿者的外周血单个核细胞中纯化γδT细胞，并将其每周在补充有1％人AB血清、100U/ml IL-2(BioVision，Mountain View，California，USA)、10U/ml IL-7和10ng/ml IL-15的Yssel培养基中用帕米膦酸盐(10μM)(PCH，Pharmachemie BV，Haarlem，The Netherlands)负载的moDC进行刺激。或者，将γδT细胞每周在如上所述补充的RPMI-1640培养基中用经辐照的饲养细胞(两个供体的1×10

抗CD1d和抗γδTCR特异性VHH的产生

抗CD1d和抗γδTCR特异性VHH如前所述(Lameris R等(2016)Immunology 149(1)：111；De Bruin等(2016)Clin Immunol 169：128)鉴定并产生。无标签1D12(SEQ ID NO：75)、1D22(SEQ ID NO：84)和1D12-5C8(SEQ ID NO：160)由UPE(Utrecht，the Netherlands)产生。

体内异种移植小鼠多发性骨髓瘤(multiple myeloma，MM)模型

通过将CD1d

实施例1

iNKT细胞活化的调节

为了评价1D12和1D22刺激或抑制iNKT细胞活化的能力，将5×10

实施例2

Jurkat-Vδ1细胞活化的调节

已知iNKT细胞对接在CD1d的F’袋极端，这与硫苷脂-CD1d限制性Vδ1-T细胞相反，后者更多对接在A’袋。因此，我们评价了1D12和1D22对硫苷脂-CD1d限制性Vδ1-T细胞的作用。为了评价1D12和1D22对Jurkat-Vδ1细胞活化的作用，将1×10

为了评价1D12和1D22对Jurkat-Vδ1细胞上CD1d-四聚体结合的作用，将内源性或硫苷脂负载的CD1d-PE四聚体与PBS(对照)、1D12或1D22(VHH∶CD1d的比为约4∶1)在室温下孵育30分钟，在此之后向与CD3-APC组合的Jurkat-Vδ1细胞添加四聚体(终浓度四聚体2μg/ml)，并将其在4℃下孵育45分钟。通过流式细胞术对数据进行分析。硫苷脂负载的CD1d四聚体与1D12的孵育完全阻止了与Jurkat-Vδ1细胞的结合，而1D22仅具有有限的影响(图2A)。这些数据支持抗CD1d VHH调节特异性CD1d限制性T细胞的反应性的能力，这与已知的mAb(例如51.1mAb)形成鲜明对比，后者阻断广泛的CD1d限制性T细胞的CD1d-TCR相互作用(Nambiar等.(2015)MAbs 7：638；Migalovich Sheikhet等.(2018)Front Immunol 9：753)。

实施例3

双特异性抗CD1d-抗Vγ9Vδ2 TCR VHH对iNKT和Vγ9Vδ2-T细胞的双活化

先前，出于抗肿瘤治疗目的，已将良好表征的抗Vγ9Vδ2-TCR VHH与对肿瘤相关抗原具有特异性的VHH融合。CD1d在多种(血液)恶性病上以及肿瘤相关巨噬细胞和髓样来源的抑制细胞上表达，并因此可将其用作抗癌治疗靶标。为了评价1D12-5C8诱导iNKT和Vγ9Vδ2-T细胞的双活化导致肿瘤靶标裂解的能力，在存在单独的培养基、单价1D12或双特异性1D12-5C8的情况下，将1×10

为了确定1D12-5C8支持iNKT和Vγ9Vδ2-T扩增并控制肿瘤生长的能力，将来自同一供体的新鲜分离的iNKT和Vγ9Vδ2-T扩增1周。随后将5×10

如图3a中可见，仅在存在双特异性构建体的情况下，观察到iNKT和Vγ9Vδ2-T细胞的稳健的同时脱颗粒。此外，效应细胞活化导致活肿瘤细胞的显著降低(图3b)。

在体内不利的效应物与靶标比通常需要扩增肿瘤靶向效应细胞以控制肿瘤生长。为了研究在这样的环境下双特异性1D12-5C8VHH是否可诱导效应细胞扩增和肿瘤控制二者，将MM.1s-CD1d细胞与1D12-5C8孵育，在此之后以效应物与靶标的比为1∶10添加iNKT、Vγ9Vδ2-T细胞或其混合物。在7天共培养之后，通过流式细胞术量化这些细胞来评价1D12-5C8诱导扩增和控制肿瘤生长的能力。如图4a中可见，在存在双特异性构建体的情况下观察到iNKT的扩增。然而，仅在存在iNKT细胞和双特异性构建体二者的情况下，Vγ9Vδ2-T细胞才显示出扩增。此外，通过与效应细胞组合的双特异性构建体诱导了稳健的肿瘤生长控制(图4b)。类似地，在急性髓性白血病肿瘤细胞系MOLM-13和NOMO-1下观察到肿瘤生长控制和效应细胞扩增(未示出)，强调了该双特异性抗CD1d-抗Vγ9Vδ2-TCR VHH的强抗肿瘤效力和广泛适用性。

实施例4

1D12和1D12-5C8的结合竞争

为了评价1D12结合是否会干扰1D12-5C8结合，将1×10

为了评价1D12与1D12-5C8之间的竞争，将CD1d表达MM细胞依次与PBS、1D12、1D22(其不应干扰1D12-5C8结合)或抗CD1d mAb 51.1孵育，随后与生物素化1D12-5C8孵育。然后通过流式细胞术分析链霉抗生物素蛋白-APC的结合来确定1D12-5C8与CD1d复合的能力。如图5中可见，1D12或抗CD1d mAb 51.1(而非1D22)的预孵育极大降低了1D12-5C8结合。

实施例5

体内异种移植小鼠多发性骨髓瘤(MM)模型

在体内模型中研究双特异性CD1d/Vδ2结合抗体1D12-5C8的抗肿瘤效力，其中小鼠i.v.接种有MM.1s.mCherry/luc.CD1d细胞以建立播散性MM模型，随后从肿瘤接种之后7天开始接种3次i.v.输注的人iNKT细胞、人γδT细胞或其混合物(无论是否与1D12-5C8组合)。而每两周一次i.p.给药单独的1D12-5C8没有作用(中位存活：47天相对于49.5天，P＞0.05)，与单独的iNKT(中位存活58.5天)相比，1D12-5C8和I型NKT细胞的组合处理显著(p＜0.0001)延长了存活，其中在研究终止(第90天)时所有小鼠仍活着。与用仅人γδT细胞进行处理相比，人γδT细胞和1D12-5C8的处理显示出中位存活从48天提高至60天的趋势(p＝0.16)。与无抗体的单独的细胞混合物(中位存活55天)相比，在每两周一次i.p.给药1D12-5C8下I型NKT细胞和γδT细胞二者的输注显著延长了存活，其中7/8只小鼠在研究终止(第90天)时仍活着(p＞0.0001)。

实施例6：双特异性CD1d/Vγ9Vδ2抗体用于治疗恶性血液病的用途

6.1材料与方法

从来自Sanquin Blood Supply(Amsterdam，the Netherlands)的未经治疗CLL患者或年龄匹配健康对照(healthy control，HC)血沉棕黄层(buffy coat)的外周血(peripheral blood，PB)样品中分离外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclearcell，PBMC)，并将其冷冻保存。通过CD5、CD19、κ和λ免疫表型分析在HC中排除了单克隆B细胞淋巴细胞增多的存在。通过CD19选择(130-050-301，磁性微珠，Miltenyi Biotec，Bergisch Gladbach，Germany)从HC PBMC中获得健康B细胞。该研究通过阿姆斯特丹UMC(Amsterdam UMC)的医学伦理委员会的批准。根据赫尔辛基宣言(Declaration ofHelsinki)，获得了来自所有对象的书面知情同意。

培养基补充有10％胎牛血清(F7524)、0.05mMβ-巯基乙醇(M6250，二者均来自Merck，Kenilworth，NJ，USA)、200mM L-谷氨酰胺(25030-123)和10,000U/mL青霉素/链霉素(15140-122，二者均来自Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，USA)。将野生型(WT)的或用CD1d稳定转导的多发性骨髓瘤细胞系MM.1s(来自Dr.W.Song，Dana Farber CancerCenter，Boston，MA，USA的惠赠)以及套细胞淋巴瘤细胞系Jeko-1在Roswell ParkMemorial Institute 1640培养基(52400-025，Thermo Fisher Scientific)中进行培养。将用CD40L转染的NIH-3T3成纤维细胞在补充的Iscove改良Dulbecco培养基(12440-053，Thermo Fisher Scientific)中进行培养。

Vγ9Vδ2-T细胞系如前所述(de Bruin等.(2017)Oncoimmunology 7(1)：e1375641.)产生。简言之，使用与抗小鼠IgG微珠(130-048-401，Miltenyi Biotec)组合的FITC缀合的抗Vδ2 TCR(表4)从HC PBMC中分离Vδ2

将细胞用抗体和生存力染料(表4)进行染色，并在LSR Fortessa或FACS Canto细胞仪(BD Biosciences，Franklin Lakes，NJ，USA)上进行测量。将样品用Flowjo MacV10进行分析。Cytofix/Cytoperm试剂用于检测胞内细胞因子(BD Biosciences)。将相对CD1d表达限定为几何MFI(经CD1d染色)一几何MFI(荧光减一)。

预先产生了与TCR的Vδ2链结合的CD1d特异性VHH 1D7(SEQ ID NO：70)(WO2016122320)和Vγ9Vδ2特异性VHH 5C8(SEQ ID NO：149)(WO2015156673)。简言之，通过美洲驼免疫接种产生了VHH，并通过随后的噬菌体展示和筛选进行了鉴定。为了产生CD1d-Vδ2双特异性VHH，将VHH 5C8(C端)用Gly

为了评估结合，将经CD1d转染的MM.1s或Vγ9Vδ2-T细胞系与双特异性抗体1D7-5C8在37℃下孵育30分钟。通过与兔抗美洲驼和PE缀合的山羊抗兔抗体在4℃下依次孵育20分钟，检测结合的双特异性抗体1D7-5C8(表4)。

将Vγ9Vδ2-T细胞系与双特异性抗体1D7-5C8或培养基对照在37℃下孵育30分钟。随后，在存在布雷菲德菌素A(10μg/mL；B7651，Sigma-Aldrich，St.Louis，MO，USA)、GolgiStop(554724，BD Biosciences)和抗CD107a(表4)的情况下，将Vγ9Vδ2-T细胞与Jeko-1细胞以1∶1的比共培养4小时。

在使用自体Vγ9Vδ2-T细胞的测定中，使用磁珠(Miltenyi Biotec；在耗竭之后，±50％的细胞是CD19

对于细胞毒性测定，将靶细胞用羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(carboxyfluoresceinsuccinimidyl ester，CFSE；C1157，Thermo Fisher Scientific)或Cell Trace Violet(CTV；C34557，Thermo Fisher Scientific)标记，并将其与双特异性抗体1D7-5C8或培养基对照在37℃下孵育30分钟。除非另有说明，否则然后将靶细胞与Vγ9Vδ2-T细胞系以1∶1的比共培养过夜。使用Mitotracker Orange(在37℃下25分钟孵育，M7510)和To-pro-3(在室温下10分钟孵育；T3605，二者均来自Thermo Fisher Scientific)测量生存力。

如果要求如此，则将靶细胞用25μM美伐他汀(M2537，Sigma-Aldrich)、50μM氨基双膦酸盐(帕米膦酸盐，#12J08RD，TEVA Pharmachemie，Haarlem，the Netherlands)或培养基对照预处理2小时。

如果要求如此，除非另有说明，否则将细胞与指定浓度的全反式视黄酸(ATRA；R2625，Sigma-Aldrich)培养48小时。将ATRA洗掉，然后进行细胞毒性测定。

如果要求如此，则将靶细胞与5μg/mL抗CD1d mAb(克隆51.1，350304，Biolegend，San Diego，CA，USA)和/或10μg/mL抗CD277 mAb(克隆103.2，Creative Biolabs，Shirley，NY，USA)预孵育10分钟。

对于用患者来源的Vγ9Vδ2-T细胞进行的细胞毒性测定，通过磁珠选择(130-050-101，Miltenyi Biotec；≥90％纯度)从患者PBMC中富集CD3

对于增殖测定，通过耗竭CD19

表4：

6.2大多数CLL患者在细胞表面上表达CD1d

为了评估CD1d作为CLL中基于抗体的治疗的靶标的适合性，我们对78名未经治疗患者组群中CLL细胞上CD1d的表面表达进行了分析。在每个患者样品中，CD1d均一表达(图7A)。然而，在所述组群之间CD1d的表达高度变化(中位相对MFI 131.2±135.1；图7B)。我们将组群分类为三组，其各自包含约三分之一的组群，基于阴性或极低(neg/dim)(相对MFI＜50)、低(相对MFI＞50且＜150)或高(相对MFI＞150)CD1d水平。

根据Rai分类，来自患有晚期疾病的患者的CLL细胞上CD1d表达较高(图7C)。具有突变(M-CLL)或未突变(U-CLL)免疫球蛋白重链(IgVH)基因的患者之间CD1d水平无差异(图7D)。

总之，CD1d在来自约三分之二的CLL患者，特别是患有晚期疾病的患者中的白血病细胞的表面上表达。

6.3双特异性抗CD1d-Vδ2 VHH诱导Vγ9Vδ2-T细胞的效应物应答

接下来，我们通过使用Gly

我们首先确定了与CD1d和Vγ9Vδ2-T细胞的结合以双特异性形式保留。双特异性抗体1D7-5C8以高亲和力与培养的Vγ9Vδ2-T细胞(表观Kd 0.36nM)和经CD1d转染的MM.1s细胞(表观Kd 0.40nM))结合，类似于用我们的单价VHH获得的数据(Lameris等.(2016)Immunology 149(1)：111)；de Bruin等.(2016)Clin Immunol 169：128)。

随后，我们测试了双特异性抗体是否可诱导Vγ9Vδ2-T细胞活化。为此，将Vγ9Vδ2-T细胞与Jeko-1细胞一起培养，所述Jeko-1细胞是以中等水平自然表达CD1d的恶性B细胞系(Li等.(2014)Med Sci(Basel)2(2)：82)。Vγ9Vδ2-T细胞不产生IFN-γ且几乎不响应于暴露于单独的靶细胞或单独的双特异性抗体1D7-5C8而脱颗粒，但这在包含Jeko-1细胞和双特异性抗体1D7-5C8二者的培养物中剂量依赖性地增强(图8A)。在约3pM达到了对Vγ9Vδ2-T细胞的半最大活化作用(EC50 IFN-γ：2.6pM，TNF-α：3.5pM，CD107a：3.1pM；图8B)。

总之，我们产生了在低的皮摩尔浓度下引发靶细胞依赖性Vγ9Vδ2-T细胞活化的双特异性抗CD1d-Vδ2 VHH。

6.4双特异性抗体1D7-5C8促进CD1d依赖性细胞毒性

然后，我们评价了Vγ9Vδ2-T细胞的活化是否还导致CD1d

接下来，我们使用经CD1d转染的和野生型CD1d阴性MM.1s细胞对双特异性抗体1D7-5C8诱导的细胞毒性进行分析(图9B)。当MM.1s细胞暴露于单独的Vγ9Vδ2-T细胞时，在过夜共培养期间观察到野生型和CD1d+细胞二者的裂解均小于20％(图9C)。双特异性抗体1D7-5C8明显提高了CD1d+细胞的裂解，但对野生型细胞的裂解没有作用，表明通过双特异性抗体1D7-5C8触发的Vγ9Vδ2-T细胞介导的细胞毒性是CD1d特异性的。

然后，我们在具有可变CD1d表达水平的样品中测试了双特异性抗体1D7-5C8针对原代CLL细胞的效力。同样，在过夜共培养之后，少数CLL靶细胞在暴露于单独的Vγ9Vδ2-T细胞时被杀伤(图9D)。双特异性抗体1D7-5C8增强了针对具有低或高CD1d表达的CLL细胞的细胞毒性，但不增强针对具有阴性CD1d表达的CLL细胞的细胞毒性。此外，与CD1d

综上，双特异性抗CD1d-Vδ2 VHH以CD1d依赖性方式强效增强了Vγ9Vδ2-T细胞介导的针对肿瘤细胞的细胞毒性。

6.5双特异性抗CD1d-Vδ2 VHH诱导了来自CLL患者的Vγ9Vδ2-T细胞对自体白血病细胞的裂解

由于来自CLL患者的Vγ9Vδ2-T细胞可以被功能性抑制(de Weerdt等.(2018)Blood 132(21)：2260；Coscia等.(2012)Blood 120(16)：3271)，因此我们评估了CLL患者来源的Vγ9Vδ2-T细胞是否可被双特异性抗体1D7-5C8活化。在与双特异性抗体1D7-5C8过夜培养之后，CLL患者的PBMC级分中存在的Vγ9Vδ2-T细胞使活化标志物CD25上调了平均20.8倍，至与在将PBMC与ABP培养时观察到的水平(20.5倍，图10A)相当且并没有显著性差异的水平。

双特异性抗体1D7-5C8还诱导了患者来源的Vγ9Vδ2-T细胞产生IFN-γ和TNF-α(图10B)，并且另外触发了Vγ9Vδ2-T细胞脱颗粒(图10C)。

接下来，我们评价了双特异性抗体1D7-5C8对Vγ9Vδ2-T细胞效应物应答的诱导是否也能够裂解自体白血病细胞。为此，我们通过在存在或不存在双特异性抗体1D7-5C8的情况下以5∶1(±1∶20 Vδ2∶CLL)或20∶1(±1∶5 Vδ2∶CLL)的CD3∶PBMC的比将磁分离的CD3

然后，我们确定了将双特异性抗体1D7-5C8添加至通过CD19磁分离(2∶1的CD19

总之，这些数据表明，双特异性抗体1D7-5C8能够使CLL患者来源的Vγ9Vδ2-T细胞活化，并因此使得能够以相对低的E∶T比自体肿瘤裂解，并促进Vγ9Vδ2-T细胞增殖。

6.6ATRA上调CD1d表达并增强双特异性抗CD1d-Vδ2 VHH诱导的细胞毒性

ATRA可提高B细胞上CD1d的表达(Allan等.(2011)J Immunol.186(9)：5261)。由于双特异性抗体1D7-5C8诱导靶标裂解的能力取决于CD1d表达水平，因此我们假设ATRA诱导的CD1d上调可提高细胞毒性。ATRA导致Jeko-1细胞上CD1d表达的上调，这可用10pM ATRA检测，并随着剂量走高而进一步提高(图11A)。在培养两天之后出现峰CD1d表达(图11B)。

在不存在双特异性抗体的情况下，ATRA不会直接诱导细胞死亡，ATRA预处理也不会提高Vγ9Vδ2-T细胞介导的细胞毒性(图11C和D)。然而，与对照Jeko-1细胞相比，用ATRA预处理的Jeko-1细胞对双特异性抗体1D7-5C8诱导的细胞死亡更为敏感(图11D)。

接下来，我们测试了ATRA是否还提高原代CLL细胞上CD1d表达。在1nM ATRA下，CD1d水平提高了2.6倍，并且在100nM ATRA下发生最高表达(平均提高3.7倍，图11E)。在ATRA处理之后有相当大的变化(在100nM ATRA之后的相对MFI：504.6±366.0)，其可部分通过基线CD1d表达来解释(r

与Jeko-1细胞一样，在不存在双特异性抗体1D7-5C8的情况下，对原代CLL细胞进行ATRA预处理不会影响其对Vγ9Vδ2-T细胞介导的裂解的敏感性(图11F)，但确实会使原代CLL细胞对双特异性抗体1D7-5C8介导的细胞死亡敏感。

总之，ATRA通过上调CD1d表达，提高了肿瘤细胞对由双特异性抗CD1d-Vδ2 VHH诱导的Vγ9Vδ2-T细胞介导的裂解的易感性。

6.7 Vγ9Vδ2-T细胞对磷酸抗原识别的调节改变了双特异性抗CD1d-Vδ2VHH诱导的靶标裂解

在先前的工作中，我们发现Vδ2特异性VHH 5C8在抑制磷酸抗原CD277介导的Vγ9Vδ2-T细胞活化方面无效(de Bruin等.(2017)J Immunol.198(1)：308)。因此，我们想知道，通过双特异性抗体1D7-5C8诱导的Vγ9Vδ2-T细胞活化的水平是否可受磷酸抗原CD277复合物的残余识别的影响。因为甲羟戊酸途径通常在恶性细胞中过度活跃，因此我们假设ABP可增强双特异性抗体1D7-5C8诱导的特异性地针对肿瘤细胞的细胞毒性。

在用ABP帕米膦酸盐预处理之后，Jeko-1细胞对Vγ9Vδ2-T细胞介导的细胞毒性更为敏感(图12A)。相比之下，用美伐他汀预处理降低了胞内磷酸抗原水平(Boutin等.(2018)Front Immunol.9：828)，导致裂解降低。在存在双特异性抗体1D7-5C8的情况下观察到相似的模式，其中帕米膦酸盐预处理导致双特异性抗体1D7-5C8诱导的Jeko-1细胞裂解提高，而美伐他汀则降低了双特异性抗体1D7-5C8诱导的裂解。总之，这表明当双特异性抗体1D7-5C8与TCR结合时，Vγ9Vδ2-TCR仍可通过感知BTN3A1构象的变化来检测磷酸抗原。

健康B细胞表达低水平的CD1d(图12B)。为了测试ABP对CLL和健康B细胞的作用，我们进行了混合共培养实验，其中将来自健康供体的B细胞和CLL细胞用帕米膦酸盐预处理2小时，并随后在存在双特异性抗CD1d-Vδ2 VHH的情况下与来自第三供体的Vγ9Vδ2-T细胞以1∶1∶1的比培养6小时。Vγ9Vδ2-T细胞对健康B细胞的裂解是最小的，不论是否进行ABP预处理和是否存在双特异性抗体1D7-5C8(10pM双特异性抗体1D7-5C8；无ABP：4.8％±0.6，有ABP：5.4％±4.5，图12C)。相比之下，虽然通过双特异性抗体1D7-5C8触发了CLL细胞的Vγ9Vδ2-T细胞裂解，但在帕米膦酸盐预处理之后，在存在双特异性抗体1D7-5C8的情况下，CLL细胞更倾向于Vγ9Vδ2-T细胞裂解(10pM双特异性抗体1D7-5C8；无ABP：19.6％±4.8，有ABP：25.1％±5.2)。

为了进一步确定在存在双特异性抗体1D7-5C8的情况下识别CD277的能力并评估双特异性抗体1D7-5C8诱导的与CD277-Vγ9Vδ2 TCR依赖性靶细胞识别的相对贡献，我们对阻断CD277和CD1d的作用进行了评价。双特异性抗体1D7-5C8诱导的Jeko-1细胞的细胞毒性(29.6％±0.9，无双特异性抗体1D7-5C8情况下的裂解：3.7％±1.3)通过CD277阻断抗体(克隆103.2(Harly等.(2012)Blood 120(11)：2269)，18.2％±2.0)降低了平均11.4％，确定了Vγ9Vδ2-TCR对配体识别的剩余作用(图12D)。双特异性抗体1D7-5C8诱导的裂解也在CD1d阻断抗体下降低了平均15.9％(至13.7％±1.0)，而在同时阻断CD277时则下降了20.2％(至9.4％±0.8)。

综上，这些数据表明，与双特异性抗体1D7-5C8结合的Vγ9Vδ2-T细胞的Vγ9Vδ2-TCR仍可识别靶细胞上CD277中的磷酸抗原诱导的构象变化，从而允许在存在ABP的情况下进一步提高双特异性抗体1D7-5C8诱导的肿瘤细胞裂解的可能性。