用于诊断极急性组织损伤的体液的硒结合蛋白1检测

摘要

本发明涉及用于确定疑似患有极急性组织损伤的个体的体液中的硒结合蛋白1(SELENBP1)的量和检测SELENBP1的病理学升高水平的免疫测定、该免疫测定的诊断用途和含有针对SELENBP1的抗体的用于进行诊断测定的试剂盒。

说明书

技术领域

本发明涉及用于确定疑似患有极急性组织损伤的个体的体液中的硒结合蛋白1(SELENBP1)的量和检测SELENBP1的病理学升高水平的免疫测定、该免疫测定的诊断用途和含有针对SELENBP1的抗体的用于进行诊断测定的试剂盒。

背景技术

硒(Se)是哺乳动物的必需微量元素(Schwartz和Foltz(1958)J Biol Chem,248-251)。其与发展为2型糖尿病(Rayman和Stranges(2013)Free Radic Biol Med,65:1557-1564)、癌症(Clark,L.C.等人(1996)JAMA 276,1957–1963)和总死亡率(Rayman(2012)Lancet,379:1256-1268)的风险相关。硒可在人体中发现有多种生物形式。其主要掺入例如硒代蛋氨酸、硒代半胱氨酸、和麦角硒因(selenoneine)等氨基酸中，或掺入例如甲基硒代半胱氨酸等甲基化氨基酸中。其还存在于例如亚硒酸钠和硒酸盐等无机化合物中(Rayman(2012)Lancet,379:1256-1268)。面包、谷类、和肉是硒的主要膳食来源，但含量因土壤质量而异(Fairwearther-Tait等人(2011)Antioxid Redox Signal,14:7)。

人体中有两种蛋白与硒相关，硒蛋白和硒结合蛋白。硒蛋白以硒代半胱氨酸的形式在其一级结构中掺入硒。已知编码含硒代半胱氨酸的蛋白的25种人基因产生约100种基因产物。这组蛋白包括谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)、碘化甲腺氨酸脱碘酶(iodothyroninedeiodinase)和硫氧还蛋白还原酶，其在甲状腺激素新陈代谢、活性氧清除和细胞中氧化还原状态调节中起作用(Schomburg(2012)Nat Rev Endocrinol 8:160-171)。

存在两种硒结合蛋白，硒结合蛋白1(SELENBP1；同义词：SP56)和硒结合蛋白2(SELENBP2；同义词：对乙酰氨基酚结合蛋白56(AP56)。在人体中，目前仅已鉴定SELENBP1。

SELENBP1是56kD单体蛋白。其基因位于染色体1q21-22(Chang等人(1997)J CellBiochem 64:217-224)上。其氨基酸序列从UniProtKB数据库的编号Q13228-1获知并且由SEQ:ID NO.1(参见，例如，BC009084(mRNA))编码。SELENBP1可经受细胞类型特异性酪氨酸磷酸化(参见，Torrealba等人(2005)Am J Transplant 5:58-67)。

发现在发炎组织中例如在溃疡性结肠炎中(Poulsen等人(2012)BMCGastroenterol 12:76)SELENBP1表达下调。SELENBP1在作为多靶炎性疾病的贝赛特氏症(

US 2004/0170629 A1公开了通过借助于质谱法和免疫组织化学法评价平滑肌样品中SELENBP1水平来监测平滑肌异常的方法。发现与健康人相比，在某些持久性和/或慢性炎性疾病状态中，例如急性或血管慢性移植物排斥、动脉硬化、哮喘、与子宫相关的妊娠并发症、和癌症，SELENBP1表达不存在或强烈下调。该下调被认为是平滑肌细胞异常的诊断标志物，特别是在移植排斥中。

在医院的急诊医学和重症监护病房中，必须快速评估患者当前的致命或接近致命结果的风险，并建立有效诊断以优先考虑诊断和治疗措施。在极端的情况下，每一分钟都可以拯救患者的生命。标准诊断方法通常需要大量时间来完成，结果可能是不明确的，可能需要借助于进一步诊断来确认。有时，诊断设备的能力、或受过训练以操纵这些设备的人员数量有限。此外，有必要排除假阳性诊断，以保护患者免受不必要的诊断和治疗措施和情绪压力，并且将医疗费用保持在合理的范围内。

如果患者疑似或诊断患有极急性、或暴发性病理学事件，首要的医疗优先事项是系统地稳定患者的机体。随后进行特定病理的治疗。

常见的极急性病理学事件是心肌梗塞，病理组织学定义为由于长期缺血即减少的血流量造成的心肌细胞即心脏肌肉细胞的死亡(Thygesen等人(2018)Eur Heart J Vol.39(42),pp.3757-58；ehy462)。在工业化国家中，年发病率是每1,000居民中1-5人。如果不及时就诊和适当治疗，心肌梗塞通常是致命的。

目前，肌钙蛋白T、肌钙蛋白I和CK-MB(心肌特异性肌酸激酶)用作可靠的指示心肌损伤的血清标志物。特别地，近年来，由高灵敏度测定法测定的肌钙蛋白T和肌钙蛋白I的绝对水平或水平变化已成为诊断的金标准。出现症状后3至6小时内，肌钙蛋白T和肌钙蛋白I的血清水平增加。因此，在该窗口内，可靠诊断是不可能的，并且在启动拯救生命的措施之前可能会错过宝贵的时间。根据现有技术的所述试验的另一限制是，肌钙蛋白T和/或肌钙蛋白I由骨骼肌和心肌细胞释放，因此它们同时相对于其它组织不敏感，并且相对于心肌细胞为不完全特异性的。因此，发生于其它器官或组织中的极急性组织损伤不能由这些试验检测。

发明内容

因此，存在克服这些问题的医疗需求。因此，本发明的任务是提供快速和易于操作的生物化学试验，所述试验能够从例如血液、血浆、血清、或尿液等易于获得的试验样品中指示入院患者是否患有例如极急性病理损伤，特别是患有ACS或心肌梗塞。期望地，此类试验还允许由极急性病理学事件导致的损害程度的定量估计。此外，本发明的可选的任务是提供阿尔茨海默症的存在的生物化学试验。此类生物化学试验使得医师能够做出有根据的决定，是否有必要使患者全身稳定，并在可能的情况下启动疾病特异性治疗。

令人惊讶地，发现上述提及的问题可通过针对来自个体的体液的试验样品中的SELENBP1的免疫测定来解决。

发现在极急性组织损伤时，SELENBP1从受损细胞释放至循环。因此，该蛋白的检测量可用作指示正在进行或最近发生的极急性组织损伤的可靠生物标志物。此类试验样品中的SELENBP1的量可借助于免疫化学方法进行最佳测定。特异性结合SELENBP1的抗体能够完成该任务。这发生在哺乳动物的生物体中的各种组织或器官中，尽管并非在所有组织中。释放的SELENBP1的量如此之高，以至于与不具有此类极急性组织损伤的人(“健康对照”)相比，从血液、尿液、或器官和组织液(liquor)等体液的试验样品中检测的水平明确增加，因此可以区分。

如实施例部分所示，与健康人的对照组相比，来自诊断有急性冠状动脉综合征(ACS)的患者的SELENBP1浓度显著增加。ACS是一种表现为冠状动脉血流量减少的综合征。这种情况下，心肌无法正常运作，并且心肌组织就会死亡。ACS包括三种主要心脏事件：a)ST段抬高心肌梗塞(ST elevation myocardial infarction,STEMI)，b)非ST段抬高心肌梗塞(non-ST elevation myocardial infarction,NSTEMI)，和c)不稳定型心绞痛。

由于在患有心肌缺血的患者的ACS发作后，SELENBP1迅速增加，SELENBP1构成用于遭受例如ACS事件等极急性组织损伤的患者的新型和对诊断有帮助的生物标志物。

发现循环SelenBP1的浓度可借助于特异性免疫测定进行最佳评价。如实施例4-5中所述，产生针对SELENBP1的单克隆抗体并建立免疫测定。

令人惊讶地，该任务可由以下免疫化学方法来解决：

用于确定来自疑似患有极急性组织损伤的受试者的试验样品中的极急性组织损伤的免疫测定，所述免疫测定包括以下步骤：

a)使取自疑似患有极急性组织损伤的受试者的试验样品与特异性结合SELENBP1的至少一个表位的抗体相接触，以形成抗体:SELENBP1复合物；

b)检测所述试验样品中的抗体:SELENBP1复合物的量；和

c)基于抗体:SELENBP1复合物的检测量评价极急性组织损伤的程度。

优选地，根据本发明的免疫测定是用于诊断目的、特别是用于体外诊断目的的。

在优选的实施方案中，本发明涉及用于确定来自疑似患有急性冠状动脉综合征的受试者的试验样品中的极急性组织损伤的免疫测定，所述免疫测定包括以下步骤：

a)使取自疑似患有由ACS导致的极急性组织损伤的受试者的试验样品与特异性结合SELENBP1的至少一个表位的抗体相接触，以形成抗体:SELENBP1复合物；

b)检测所述试验样品中的抗体:SELENBP1复合物的量；和

c)基于抗体:SELENBP1复合物的检测量评价极急性组织损伤的程度。

在更优选的实施方案中，本发明涉及用于确定来自疑似患有心肌梗塞的受试者的试验样品中的极急性组织损伤的免疫测定，所述免疫测定包括以下步骤：

a)使取自疑似患有由心肌梗塞导致的极急性组织损伤的受试者的试验样品与特异性结合SELENBP1的至少一个表位的抗体相接触，以形成抗体:SELENBP1复合物；

b)检测所述试验样品中的抗体:SELENBP1复合物的量；和

c)基于抗体:SELENBP1复合物的检测量评价极急性组织损伤的程度。

在其它实施方案中，根据本发明的免疫测定包括基于抗体:SELENBP1复合物的检测量计算SELENBP1的量的步骤。

可选地，根据本发的方法可描述如下：

一种鉴定表现出极急性组织损伤的需要医疗干预的受试者的方法，所述方法包括以下步骤：

a)使取自疑似患有极急性组织损伤的受试者的试验样品与特异性结合SELENBP1的至少一个表位的抗体相接触，以在所述试验样品中形成抗体:SELENBP1复合物；

b)检测抗体:SELENBP1复合物的量；

c)由步骤b计算SELENBP1的量；

其中在来自所述受试者的所述未稀释试验样品中，SELENBP1的量等于或大于0.32nmol/l、优选等于或大于0.39nmol/l，表明所述受试者需要医疗干预。

在优选的实施方案中，本发明涉及一种鉴定表现出由急性冠状动脉综合征导致的极急性组织损伤的需要医疗干预的受试者的方法，所述方法包括以下步骤：

a)使取自疑似患有由急性冠状动脉综合征导致的极急性组织损伤的受试者的试验样品与特异性结合SELENBP1的至少一个表位的抗体相接触，以在所述试验样品中形成抗体:SELENBP1复合物；

b)检测抗体:SELENBP1复合物的量；

c)由步骤b计算SELENBP1的量；

其中在来自所述受试者的所述未稀释试验样品中，SELENBP1的量等于或大于0.32nmol/l、优选等于或大于0.39nmol/l，表明所述受试者需要医疗干预。

在更优选的实施方案中，本发明涉及一种鉴定表现出由心肌梗塞导致的极急性组织损伤的需要医疗干预的受试者的方法，所述方法包括以下步骤：

a)使取自疑似患有由心肌梗塞导致的极急性组织损伤的受试者的试验样品与特异性结合SelenBP1的至少一个表位的抗体相接触，以在所述试验样品中；形成抗体:SELENBP1复合物；

b)检测抗体:SELENBP1复合物的量；

c)由步骤b计算SELENBP1的量；

其中在来自所述受试者的所述未稀释试验样品中，SELENBP1的量等于或大于0.32nmol/l、优选等于或大于0.39nmol/l，表明所述受试者需要医疗干预。

本发明的可选实施方案是鉴定表现出极急性组织损伤的需要医疗干预的受试者的方法，所述方法包括以下步骤：

a)使取自疑似患有极急性组织损伤的受试者的试验样品与特异性结合SELENBP1的至少一个表位的抗体相接触，以在所述试验样品中形成抗体:SELENBP1复合物；

b)检测抗体:SELENBP1复合物的量；

c)由步骤b计算SELENBP1的量；

其中取自受试者的所述试验样品是尿液、或器官和组织液；和

其中在来自所述受试者的所述未稀释试验样品中，SELENBP1的量等于或大于0.1nmol/l、优选等于或大于0.15nmol/l、更优选等于或大于0.2nmol/l，表明所述受试者需要医疗干预。

任选地，前述四种方法各自可在步骤c)之后包括附加步骤：C’)基于所述受试者的体液的所述未稀释样品中的所述SELENBP1的检测量，定量所述受试者中的极急性组织损伤的程度。

具体实施方式

根据本发明的术语“免疫测定”优选是指试验样品中的任何免疫组织化学检测法。特别地，所述术语是指借助于针对所述蛋白或肽的至少一个表位的至少一种合适的抗体的蛋白或肽的检测方法。

根据本发明的术语“受试者”优选是指个体，其为任何哺乳动物，优选人类，与其健康状态无关。根据本发明的术语“医学”、“医药”、或“医学的”优选包括人类医学以及兽医学，特别是人类医学。

医学中存在对疾病状态的不同时间进程的已确立的分类。有极急性疾病、急性疾病、亚急性疾病、和慢性疾病。然而，由于病程的异质性(heterogeneity)，没有对于所有疾病普遍接受的时间间隔。最精确的参数是本申请的范围内提及的疾病的发作：极急性疾病通常表现非常急性且强烈的病程。症状通常在几小时内出现。它们通常但不完全是由于异常的创伤事件导致生物体发生剧烈变化。在严重的情况下，症状可危及生命。急性疾病通常发展迅速，且通常持续时间短。通常，根据本发明的术语“急性”优选是指具有1至几天的时间范围的病程。亚急性疾病是指介于急性和慢性疾病之间的病程。它们在几天后变得明显，并且可长达1周的时间。慢性疾病发展相对慢。它们至少需要一周时间，可以持续数月或数年。

根据本发明的术语“组织损伤”优选是指组织中细胞或细胞组的任何病理生理损伤，最终导致这些细胞的功能的丧失或这些细胞的丧失。这种丧失可以是通过过度激发、炎症、电穿孔或辐射的外伤性诱导，即细胞完整性的物理、化学、电损伤，它可以是坏死的或内源性或外源性细胞凋亡。共同点为组织损伤导致受影响的细胞的功能障碍以及新陈代谢和氧化还原状态的急剧变化。任选地，这些细胞可最终进入死亡相关途径(细胞凋亡、坏死、铁死亡或类似途径)并死亡，细胞质和细胞外液之间的屏障被破坏，或者细胞膜变得显著渗漏，并且细胞碎片和细胞质组分被释放至细胞外液并最终进入循环。

根据本发明的术语“极急性组织损伤”优选是指发生在如上所定义的极急性病程的典型时间范围内涉及组织损伤的病理生理学事件。作为极急性组织损伤的相关物，相关细胞信号、释放至循环中的碎片和/或细胞质组分，在经历病理生理学事件后不久，即在几小时后，变为可检测的。

根据本发明的术语“试验样品”优选是指来自疑似患有极急性组织损伤的哺乳动物的体液的样品。为了由根据本发明的免疫测定检测此类极急性组织损伤，例如血液、血浆、血清、尿液、或器官和组织液等试验样品必须取自所述受试者。根据目前可行的方法，此类试验样品的体积优选为约1000至1μl、优选为约100至10μl。

根据本发明的术语“SELENBP1的病理学升高水平”优选是指所述试验样品中的SELENBP1的浓度，其比健康人中的明显更高，或相对于患有由于遭受引起循环中SELENBP1的量病理学上提高的极急性组织损伤而导致的慢性炎症疾病的人中的个体基线值明显提高。

根据本发明的术语“抗体(Ab)”优选是指免疫球蛋白(Ig)家族的蛋白。哺乳动物中存在IgA、IgD、IgE、IgG和IgM的亚家族。它们由以Y形方式排列的两条重链和两条轻链组成。在“Y”的尖部，Ab具有高度可变且抗原特异性区(Fab的可变区)，这允许识别抗原的特异性表位。通过其对抗原表位特异的互补位区，抗体能够精确地将这两个区域结合在一起。在免疫测定中，蛋白或肽分析物为抗原。

根据本发明的术语“抗体”优选是指单克隆抗体、多克隆抗体、单链抗体、双特异性抗体或双抗体、二价抗体、多特异性抗体、合成抗体、适配子、镜像异构适配子(spiegelmer)、人抗体或人源化抗体、及其片段或变体诸如，例如，Fab、Fv或scFv片段、或任何这些的化学修饰衍生物，例如，抗体-药物缀合物、结构域抗体、纳米抗体或抗体模拟物(DARPins，设计的锚蛋白重复蛋白)。最优选单克隆抗体，因为它们与SelenBP1或就其结合特性而言的等价物具有高特异性和选择性结合特性。在本发明的另一个实施方案中，抗体针对SELENBP1抗原，其为天然存在的SELENBP1的生理学或病理生理学衍生物。

根据本发明的术语“分析物”优选是指分析物抗体可以与其相互作用并且能够结合(一种或多种)分析物抗体以形成包括[分析物抗体-抗原分子]的特定复合物的任何分子。根据本发明，抗原分子，或分析物，为SELENBP1。

根据本发明的术语“特异性结合”优选是指根据本发明的抗体实质上不结合(与之“交叉反应”)存在于待分析的所述试验样品中的不属于SELENBP1的其它蛋白、肽、或物质。优选地，特异性结合的蛋白应比任何其它相关蛋白、肽或物质以至少3倍高、更优选10倍高、甚至更优选50倍高的亲和力结合。非特异性结合可为可容许的。其仍可被明确辨别并测定，例如根据其在蛋白质印迹上的大小、或通过在试验样品中的相对较高的丰度。

根据本发明的术语“量”优选是指蛋白的绝对量，所述蛋白的相对量或浓度、以及与其相关或可由此推导出的任何值或参数。此类值或参数包括来自通过直接或间接测定获得自所述蛋白的、全部特定物理或化学性质的强度信号值。应理解，与前述量或参数相关的值也可通过所有标准数学运算来获得。

根据本发明的术语“表位”、或“SELENBP1的表位”优选是指抗原(在本例中为分析物SELENBP1)的特异性部分，根据本发明的抗体与之结合。该表位是可由所述Ab结合的SELENBP1的特定氨基酸序列。根据特定抗体，该表位可有所不同。优选地，此类表位允许抗体的特异性结合，使得可以避免与来自其它蛋白的表位的交叉反应。

根据本发明的术语“抗体:SELENBP1复合物”优选是指SELENBP1与结合SELENBP1的表位的本发明的抗体的复合物。该术语同等地是指由根据本发明的抗体结合的SELENBP1的状态。

根据本发明的术语“鉴定”和“鉴定需要医学干预的受试者”优选是指评价受试者是否易感于医疗干预。如本领域技术人员所理解的，此类评价通常不旨在对于100％的待鉴定的受试者都是正确的。然而，需要可以正确鉴定统计学显著的部分的受试者。一部分是否为统计学显著的可以由本领域技术人员使用本领域公知的统计学方法来确定。

根据本发明的术语“检测抗体:SELENBP1复合物的量”优选是指确定量或浓度，优选定量或相对。这是为了提供试验样品中的SELENBP1的绝对量或相对量的直接或间接方法，优选与包括已知量的SELENBP1的校正或标准化样品一起。可直接或间接进行测定。直接测定涉及基于以下信号测定一种或多种反应离析物和/或反应产物的量或浓度，所述信号获得自一种或多种反应离析物和/或反应产物本身/它们本身，并且其强度与反应体积中一种或多种反应离析物和/或反应产物的分子数直接相关。此类信号可例如通过测定一种或多种反应离析物和/或反应产物的特定物理或化学性质的强度或值来获得。间接测定包括通过光学、电学和/或电子装备来合适地进行的、借助于荧光团、发色团、离子浓度来测定例如获得自例如可测定的细胞或跨膜反应、配体、或酶促反应产物的次要组分(即不是反应离析物或反应产物本身的组分)或生物读出系统的信号，本说明书中称为“标记手段”。对于酶促反应产物的测定，优选底物的量为饱和的。任选地，在反应之前，底物还可标记有可检测的标签。优选地，反应伙伴(reaction partner)与底物接触足够的时间，这相当于产生一种或多种反应产物例如可测定的信号的可检测量所需的时间。代替测定一种或多种反应产物的量或浓度，可测定一种或多种反应产物的给定(例如，可检测的)量或浓度的出现所需的时间。

根据本发明，术语“检测抗体:SELENBP1复合物的量”可优选通过本领域技术人员已知的用于确定反应离析物和/或反应产物的量的所有方法来实现。所述方法包括可在各种夹心、竞争、或其它测定形式中利用标记的分子的免疫测定装置和方法。所述测定将产生指示反应离析物和/或反应产物的存在与否的信号。此外，信号强度可优选地与反应体积中反应离析物和/或反应产物的量直接或间接相关(例如，成反比)。优选地，所述方法包括生物传感器、与免疫测定耦合的光学装置、生物芯片、例如光谱仪或色谱法装置等分析装置。此外，方法包括任选地使用预处理或预涂覆的微板、微阵列、或管阵列、全自动的或机器人的免疫测定的基于ELISA的方法(例如可在Roche-Elecsys

根据本发明的术语“需要医疗干预”优选是指所述受试者表现已知与严重极急性生理学事件相关的症状和/或体征。

根据本发明的术语“医疗干预”优选包括本领域中发现的适合预防或治疗受试者中由于特定病理学事件引起的所有极急性、急性和/或慢性损伤以及预防或治疗所述受试者由于该特定病理学事件而遭受的所有个体痛苦的任何预防性和/或治疗性处理方案。其可包括本领域中已知的对需要医疗干预的此类患者有益的任何药学上、手术的、物理疗法的、饮食的、或心理学方法。

根据本发明的术语“评价极急性组织损伤的程度”优选是指对抗体:SELENBP1复合物的量是否指示应该开始医学治疗的医学评估。所述量还可以指示医学上需要哪种治疗范围以及必须在哪个时间范围内开始治疗。该量的阈值可根据疑似极急性组织损伤导致的病理学事件和根据所述受试者的一般体质而变化。

根据本发明的术语“基于抗体:SelenBP1复合物的检测量诊断”优选是指具有医学资格的人，优选地医师，但也可以是护士或护理人员，可基于理由作出分析样品的患者是否需要紧急医疗干预的决定。优选地，还可估计严重程度，分别诊断。

然而，已知在慢性炎性疾病期间还存在持续的组织损伤，在大多数情况下，这种损伤或多或少是可控的。这种组织损伤可通过组织再生或愈合过程来克服或抵消。因此，在慢性炎症或缺血性疾病中还存在持续的细胞损失。因此，还可通过本发明的免疫测定来检测稳定量的SELENBP1释放至循环。然而，在各个的试验样品中检测的量远低于在患有极急性组织损伤的患者中发现的SelenBP1的量的值。因此，根据本发明的免疫测定不承担错误诊断将引起极急性组织损伤的疾病代替炎性疾病或最小组织损伤的风险。

已观察到在一些罕见病理学病例中，针对SELENBP1的自身抗体例如在诸如卵巢早衰(POF)或不规则排卵等卵巢病症的亚组和卵巢癌的亚组中发现(Yi等人(2017)Reproduction 153:277-284)。这些针对SELENBP1的自身抗体可以在理论上通过结合循环SELENBP1而偏向本发明的免疫测定的定量检测，因而使它们无法通过本发明的诊断性SELENBP1抗体进行检测，从而错误地降低试验样品中检测的SELENBP1浓度。然而，自身抗体的血清水平通常相当低，使得它们经常无法被检测到。在这些报道的SELENBP1自身抗体中也是如此。与未观察到自身抗体的健康人或患有卵巢疾病的女性相比，对应于SELENBP1浓度的指示的OD(光密度)水平几乎没有升高。因此，在这种自身抗体疾病和引起极急性组织损伤的巧合病理事件的非常罕见的情况下，偏差将是最小的，如果有的话。

因此，在本发明的方法的其它的实施方案中，如果所述试验样品中的SELENBP1的量高于0.32nmol/l、优选高于0.35nmol/l，则另外需要由本发明的免疫测定诊断极急性组织损伤。

特别地，根据本发明的免疫测定优选是指免疫测定，其中疑似的极急性组织损伤是由于极急性缺氧事件、软组织创伤、急性肝衰竭、暴发性软组织疾病、暴发性中毒、暴发性感染和/或阿尔茨海默症导致的。

低氧血症必须与缺氧区分开来。虽然缺氧描述了其中生物体、器官或组织持续暴露于供氧减少的状态，但低氧血症描述了血液中、特别是动脉血中氧分压异常低。

根据本发明的术语“极急性缺氧事件”优选是指生物体中作为缺氧的因果的、巧合的、或结果的任何病理学事件。该事件可以已在系统或局部变得明显。此类疾病或疾病状态包括，但不限于，冠状动脉疾病、ST段抬高心肌梗塞(STEMI)、非ST段抬高心肌梗塞(NSTEMI)、不稳定型心绞痛、急性心肌梗塞、急性前壁透壁心肌梗塞、急性下壁透壁心肌梗塞、其它部位的急性透壁心肌梗塞、未注明部位的急性透壁心肌梗塞、急性心内膜下心肌梗塞、急性心肌梗塞(未注明)、继发性心肌梗塞、继发性前壁心肌梗塞、继发性下壁心肌梗塞、继发性其它部位心肌梗塞、继发性未注明部位心肌梗塞、急性心肌梗塞后心包积血、急性心肌梗塞后房间隔缺损、急性心肌梗塞后室间隔缺损、急性心肌梗塞后无心包积血的心壁破裂、急性心肌梗塞后腱索断裂、急性心肌梗塞后乳头肌破裂、急性心肌梗塞后的心房、耳廓和心室血栓形成、不导致心肌梗塞的冠状动脉血栓形成、Dressler综合征、急性缺血性心力衰竭(未明确)、肺栓塞、提及急性肺源性心脏病的肺栓塞、不提及急性肺源性心脏病的肺栓塞、肺血管破裂、肺血管狭窄(stenosis of pulmonary vessel)、肺血管狭窄(strictureof pulmonary vessel)、房室传导阻滞、左前分支传导阻滞、左后分支传导阻滞、左束支传导阻滞、右分支传导阻滞、双分支传导阻滞、三分支传导阻滞、非特异性心室内传导阻滞、窦房传导阻滞(sinoatrial block)、窦房传导阻滞(sinoauricular block)、未以其它方式注明的(NOS)心脏传导阻滞、阿-斯综合征(Stokes-Adams syndrome)、成功复苏的心脏骤停、心室纤维性颤动和扑动、充血性心力衰竭、右心室衰竭、左心室衰竭、提及NOS心力衰竭的肺水肿、心内血栓形成(心尖、心房、心耳、心室)、动脉栓塞、动脉血栓形成、腹主动脉栓塞和血栓形成、上肢动脉栓塞和血栓形成、下肢动脉栓塞和血栓形成、髂动脉栓塞和血栓形成、动脉狭窄、动脉破裂、静脉栓塞、静脉血栓形成、门静脉血栓形成、布加综合征(Budd-Chiarisyndrome)(暴发性肝静脉血栓形成)、腔静脉栓塞和血栓形成、肾静脉栓塞和血栓形成、血栓性移行性静脉炎、血栓性静脉炎、下肢浅部血管血栓性静脉炎、下肢深部血管血栓性静脉炎、股静脉血栓性静脉炎、胸手术后急性肺功能不全、非胸手术后急性肺功能不全、急性低氧性呼吸衰竭(AHRF)、心源性肺水肿(CPE)、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、术中低氧血症、肺泡通气不足、影响呼吸控制的癫痫发作、宫颈颈骨折(cervical neck fracture)、一氧化碳中毒、窒息、高原病、自由潜水黑视症、心脏局部缺血、动脉粥样硬化性狭窄、弥散性血管内凝血。

创伤(损伤)是由外力导致的对身体的伤害。其可由事故、手术、武器、跌倒、撞击、窒息、咬、蛰、或由动物的其它事件或其它原因引起。其可导致外部和/或内部损伤。它们可由另一个人、动物或自己造成。在本申请的范围内，术语创伤还应包括烧伤、烫伤、由包括气体的化学物质造成的组织损伤或辐射伤。应理解，导致试验样品中升高的SELENBP1水平的创伤必须足够严重以需要立即就医。根据本发明的免疫测定不涉及轻微创伤。

急性肝衰竭(暴发性肝衰竭)表征为在肝疾病后快速发作的严重并发症。其与约80-90％的肝细胞的功能丧失相关。在大多数情况下，急性肝衰竭是由可最终导致多器官衰竭的全身炎症综合征(SIRS)引起的。因此，其主要原因是细菌和/或真菌败血症。常见原因包括药物过量、对药物的特异反应、过量酒精和/或药物消耗、暴发性甲型和乙型病毒性肝炎、妊娠期急性脂肪肝、雷氏综合征(Reye syndrome)、威尔森氏病(Wilson’s disease)、例如死帽等蘑菇中毒、或其可为特发性的。

急性肾衰竭通常是由于外伤性、医源性或SIRS伴或不伴败血症或特发性、暴发性肝衰竭或胆道暴发性疾病或横纹肌溶解引起的脱水、药物治疗、动脉低血压的结果。其在短的时间延迟内显现出来。也存在暴发性产后肾衰竭或由于严重内出血、急进性肾小球肾炎(RPGN)、肾乳突坏死、肺气肿性肾盂肾炎等引起的病例。

软组织包括连接、支持、或围绕身体的其它结构和器官的组织，而不是骨骼等硬组织。软组织包括肌腱、韧带、筋膜、皮肤、纤维组织、脂肪、滑膜、肌肉、神经和血管。存在各种暴发性软组织疾病，包括但不限于，隔室综合征、急性爆发性坏死性淋巴细胞心肌炎、严重的坏死性软组织病、梭菌性肌坏死、急性狼疮性肺炎、黑-里二氏综合征(Hamman-Richsyndrome)、爆发性坏死性软组织感染(例如，由化脓性链球菌(S.pyogenes)或潘顿-瓦伦丁杀白血球素阳性金黄色葡萄球菌(Panton-Valentine leucocidin-positive S.aureus))、暴发性深层组织感染、暴发性坏死性筋膜炎(富尼埃氏坏疽(Fournier’sgangrene))、暴发性坏死性肌炎和化脓性肌炎、暴发性软组织假瘤、气性坏疽。

炎症是身体对病原体、受损细胞、刺激物或生物体中许多其它病理学变化的复合生物反应。有五个炎性症状：发热、疼痛、发红、肿胀、和功能丧失。暴发性炎性疾病包括但不限于，暴发性结肠炎、暴发性脑膜炎、暴发性空肠回肠炎、成人斯蒂尔氏病(AOSD)、肉芽肿伴多血管炎、淋巴瘤样肉芽肿病、天疱疮、血栓性血小板减少性紫癜、暴发性噬血细胞性淋巴组织细胞增多症、格林-巴利综合征(急性炎性脱髓鞘性多发性神经根神经病)、暴发性心肌炎、暴发性炎性脑白质病、暴发性增殖性玻璃体视网膜病变、暴发性眼部弓形体病、暴发性硬化性腹膜炎等。

几种细菌感染是极急性病程的主要原因。这些包括但不限于败血症、肺腺鼠疫、暴发性细菌性脑膜炎、流行性脑脊髓膜炎、霍乱、威尔氏病(钩端螺旋体病感染)、暴发性嗜麦芽寡养单胞菌软组织感染、暴发性细菌性腹膜炎、暴发性细菌性眼内炎、暴发性肺炎支原体肺炎、暴发性革兰氏阴性大疱性蜂窝组织炎、暴发性社区获得性鲍氏不动杆菌感染、暴发性细菌败血症、暴发性脑膜炎球菌败血症和溶血-尿液毒综合征。

同样地，几种病毒感染可诱发极急性病程。这些包括但不限于，埃博拉病毒、拉沙热、拉布雷亚热(Lábrea fever)、狂犬病、暴发性病毒性心肌炎或出血热或组织损伤热的其它原因。

几种真菌感染也可导致极急性病程。这些包括但不限于，暴发性真菌性鼻窦炎、暴发性侵袭性真菌性窦炎、暴发性非侵袭性真菌性窦炎、暴发性真菌性蝶窦炎、暴发性毛霉菌病、暴发性真菌性腹膜炎、暴发性真菌性脑膜炎、暴发性真菌性大脑炎、暴发性真菌性心包炎、暴发性真菌性肺炎、暴发性真菌性脑膜脑炎。

这也适用于例如原发性阿米巴脑膜脑炎等原生动物感染。

具有极急性病程的其它疾病包括暴发性先兆子痫。

存在各种暴发性过敏反应，包括但不限于，哮喘发作、急性过敏症、暴发性过敏性牙槽炎样超敏反应、暴发性过敏性紫癜。

极急性病程的另一主要诱因是中毒。公知的快速起效的中毒包括但不限于，重金属、氢化物、高钾血症(例如，由于氯化钾注射)、秋水仙碱中毒，来自蛇、蜘蛛、蜈蚣、蝎子、蜜蜂、黄蜂、毛虫、锥蜗牛、黄貂鱼、海绵、水母、海葵、河豚鱼、鲈鱼类、蝎子鱼类、瞻星鱼类、蝾螈、毒蛙、毒箭蛙、吉拉毒蜥、墨西哥念珠毒蜥(Mexican beaded lizard)、鼩鼱、吸血蝙蝠的各种毒液。

并且，由淡水蓝藻细菌和例如有害费氏藻种(Pfiesteria spec.)和毒性甘比尔鞭毛虫(Gambierdiscus toxicus)等鞭毛藻类的感染可导致暴发性中毒，特别是暴发性肝损伤。特别地，来自它们的细胞壁的脂多糖，各自地细胞膜可为有毒的。导致中毒的蓝藻细胞蛋白的实例为微囊藻素，例如微囊藻素-LA(参见，Ibelings和Havens(2008)Adv Exp MedBiol 619:675-732)。

应理解，在极急性组织损伤中，SELENBP1仅可从以合理的量组成型表达的SELENBP1的组织中释放至循环。这对于大部分的组织是适用的，但不是对于所有组织。详细地，表达可被发现于脉络膜、虹膜、视网膜、角膜(Okonuki等人(2007)Exp Eye Res 84:823-831)、食管(Silvers等人(2010)Clin Cancer Res 16:2009-2021)、甲状腺(Brown等人(2006)Mol Carcinog45:613-626；Sofiadis等人(2012)Eur J Endocrinol 166:657-667)、心脏(Chang等人(1997)J Cell Biochem 64:217-224)、冠状动脉(Torrealba等人(2005)AmJTransplant 5:58-67)、乳腺小叶单元和导管细胞(Zhang等人(2013)PLoS One8:e63702；Kim等人(2006)Proteomics 6:3466-3476)、肺(Chang等人(1997)JCell Biochem 64:217-224；Chen等人(2004)J Pathol 202:321-329；Li等人(2004)Proteomics 4:3394-3400)、肝(Raucci等人(2011)Biochim Biophys Acta1814:513-522；Chang等人(1997)J CellBiochem 64:217-224；Huang等人(2012)Clin Cancer Res 18:3042-3053；Kim等人(2006)Proteomics 6:3466-3476)、胰胆管导管(Kim等人(2006)Proteomics 6:3466-3476)、肾(Chang等人(1997)J Cell Biochem 64:217-224；Torrealba等人(2005)Am J Transplant5:58-67；Kim等人(2006)Proteomics 6:3466-3476)、脾(Chang等人(1997)J Cell Biochem64:217-224)、胃(Xi等人(2011)Hum Pathol 42:1620-1628；Zhang等人(2011)Med Oncol28:951-957；Zhang等人(2011)Med Oncol 28:481-487；He等人(2004)Proteomics 4:3276-3287；Wu等人(2009)Oncol Rep 21:1429-1437)、结肠(Chang等人(1997)J Cell Biochem64:217-224；Pohl等人(2009)PLoS 4:e7774；Poulsen等人(2012)BMC Gastroenterol 12:76)、脂肪组织(Montes Nieto等人(2013)J Clin Endocrinol Metab 98:E576-585；McClain等人(2013)Virchow’sArch 463:85-92)、卵巢(Huang等人(2006)Int J Cancer118:2433-2440；Zhang等人(2010)Hum Pathol 41:255-261)、子宫(Torrealba等人(2005)Am JTransplant 5:58-67；Zhang等人(2010)Diagn Pathol 5:80)、前列腺(Yang等人(1998)Cancer Res 58:3150-3153；Kim等人(2006)Proteomics 6:3466-3476)、内皮(Kim等人(2006)Proteomics 6:3466-3476)、平滑肌(Kim等人(2006)Proteomics 6:3466-3476；Kim等人(2006)Proteomics 6:3466-3476)。

优选地，根据本发明的免疫测定是指极急性缺氧事件，其选自包括心肌梗塞、急性冠状动脉综合征、肺栓塞和血栓形成的组。

进一步优选地，根据本发明的免疫测定是指SelenBP1的病理学升高水平，其在极急性组织损伤导致的症状的发作时为可检测的。

迄今为止，SELENBP1表达不由白细胞、胫骨神经、膀胱或脑垂体中的基因表达的微阵列分析或系列分析(SAGE)显示。

因此，根据本发明的免疫测定是仅针对于在如上列出的组成型表达SELENBP1的组织中的至少一种中的极急性组织损伤的检测。即，公开了根据本发明的免疫测定，其中疑似极急性组织损伤发生在脉络膜、虹膜、视网膜、角膜、甲状腺、心脏、冠状动脉、乳腺小叶单元和导管细胞、肺、肝、胰胆管导管、肾、脾、胃、结肠、脂肪组织、卵巢、子宫、前列腺、内皮、和平滑肌中。

根据本发明的术语“标记”优选是指由直接或间接方法标记。直接标记涉及标签直接(共价地或非共价地)耦合至待标记的分子。间接标记涉及第二配体结合(共价地或非共价地)至待标记的分子。此类第二配体可特异性结合待标记的分子，具有在检测条件下的至少3倍高、优选至少10倍、且更优选至少50倍高的亲和性。所述第二配体可以与合适的标记工具偶联和/或可结合与第二配体结合的第三配体。第二、第三、或甚至高级配体的使用通常用于增加信号。合适的第二和高级配体可包括抗体、二抗、和公知的链霉亲和素-生物素系统(Vector Laboratories,Inc.)。此外，待标记的分子或底物还可“标记有”本领域已知的一种或多种标签。然后，此类标签可为高级配体的靶标。合适的标签包括生物素、地高辛、His-标签、谷胱甘肽-S-转移酶、FLAG-标签(N-DYKDDDDK-C)、绿色荧光蛋白(GFP)、myc-标签、甲型流感病毒血球凝集素(HA)、麦芽糖结合蛋白等。在肽或多肽的情况下，标签通常位于或靠近N-末端和/或C-末端。

此外，待标记的分子或底物还可提供有本领域已知的合适的“间隔物(spacer)”以避免在大分子的情况下由于空间限制对结合特性的任何限制。

根据本发明的术语“标记方式”优选是指任何直接或间接可检测的标记方式，选自以下的组：酶促标签、同位素或放射性标签、化学发光标签、生物发光标签、荧光标签、磁性标签(例如，“磁珠”，包括顺磁性和超顺磁性标签)、染料标签(生色团)、和本领域已知的其它标记。合适的标签是通过本领域已知的合适的方法可检测的。合适的标签可进一步包括金颗粒、乳胶珠、吖啶酯(acridan ester)、鲁米诺、和钌。优选地合适的是非放射性标签。

酶促活性标签包括，例如，辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、荧光素酶、及其衍生物。用于检测的合适的底物包括二氨基联苯胺(DAB)、3,3′-5,5′-四甲基-联苯胺、NBT-BCIP(4-硝基氯化四氮唑蓝(4-nitro blue tetrazolium chloride)和5-溴代-4-氯代-3-吲哚基-磷酸盐、CDP-Star

合适的酶-底物组合可引起显色反应产物(生色团)、荧光、化学-或生物发光的增加或减少，这可根据本领域已知的方法(例如，使用光度计、光电倍增管、和感光胶片或照相机系统)来测定。相同的理论应用于测定酶促反应的终点或进行或发展。

合适的荧光标签包括荧光染料和蛋白(例如，GFP及其衍生物)、Cy3、Cy5、TexasRed、荧光素、和Alexa染料(例如，Alexa 568)。其它合适的荧光标签是市售可得的，例如，来自Molecular Probes(Oregon,USA)。并且，包括量子点作为荧光标签的用途。荧光蛋白的实例包括但不限于，绿色、黄色、青色、蓝色、和红色荧光蛋白。

合适的化学发光或生物发光标签包括但不限于原核(例如，细菌lux编码的)或真核(例如，萤火虫luc编码的)荧光素酶，以及拥有不同的或改变的光学特性的变体，例如产生不同颜色的光的荧光素酶，例如源自北美萤火虫(Photinus pyralis)、源自海绵居蟹皮海绵(sponge Suberities domuncula)、和小菇(Mycena fungi)。此外，光蛋白，例如钙激活的光蛋白和它们的特别设计的变体可为合适的，其能够产生通常在200nm至1100nm的范围内、或在可见光谱(即，约350nm和800nm之间)中的光，例如，来自海洋珊瑚虫长薮枝螅水母(Obelia longissima)的奥贝林(obelin)、或水母素(Aequorin)，例如来自发冷光水母维多利亚多管发光水母(Aequorea victoria)或来自其它生物体的可为合适的，任选在膜中。

在优选实施方案中，根据本发明的免疫测定是分光光度法免疫测定。

合适的放射性标签包括<35>S、<125>I、<32>P、和<33>P等。放射性标签可通过任何已知的和合适的方法来检测，例如，感光胶片或磷相仪(phosphor-imager)。

根据本发明的合适的检测方法还包括沉淀(特别是免疫沉淀)、电化学发光(电力产生的化学发光)、生物发光、RIA(放射免疫测定)、ELISA(酶联免疫吸附试验)、夹心酶免疫试验、夹心免疫测定(ECLIA)、解离增强镧系元素荧光免疫测定(DELFIA

本领域已知的其它方法(例如，凝胶电泳法、2D凝胶电泳法、SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS-PAGE)、蛋白免疫印迹法、和质谱法)可任选地与如上所述的标记或其它检测方法组合使用。

如本发明中所定义的一种或多种抗原分子可直接或间接提供有标记方式，基本如上文中所描述的。

根据本发明的术语“第二标记工具”优选是指选自化学发光标签、生物发光标签、荧光标签、染料标签(生色团)、和本领域中已知的其它的组的任何直接或间接可检测的标记方式。术语“第二标记工具”的用途优选是指第二标记工具与前述的(主要或第一)标记工具不相同。合适的第二标记工具通过本领域已知的合适的检测方法基于共振能量转移(RET)原理为可检测的。优选地，第二标记工具包括本领域技术人员已知的适用于荧光共振能量转移(FRET)、生物发光共振能量转移(BRET)、或化学发光共振能量转移(CRET)的标记工具。合适的第二标记工具的选择将考虑第一标记工具的类别以保护RET信号是可检测的，并且是本领域技术人员已知的。此外，RET信号产生和合适的第二标记工具的选择向本领域技术人员提供关于复合物形成的类别和动力学以及形成的复合物的结构特征的附加信息。

在优选的实施方案中，根据本发明的免疫测定作为快速或即时检验(point-of-care test)来进行。

本发明的其它方面是结合来自包括人的哺乳动物的试验样品中的SELENBP1的至少一个表位的抗体用于确定所述哺乳动物中的极急性组织损伤的程度的用途，其中所述试验样品疑似显示SELENBP1的病理学升高水平。

根据本发明的术语“试剂盒”优选是指用于进行本发明的方法的上述工具的集合，优选地，单独提供或在单个容器内提供。容器优选包括用于进行根据本发明的方法的用户说明书。

在仍另一方面，公开了包括结合SELENBP1的至少一个表位的抗体的试剂盒。

优选地，在根据本发明的试剂盒中，所述抗体具有检测灵敏度，分别地在试验样品中SELENBP1的检测限为0.10nmol/l以下。

根据本发明的试剂盒中附加地包括含有SELENBP1用于校准目的的至少一种标准物。

在另一个实施方案中，根据本发明的所述试剂盒附加地包括针对肌钙蛋白T和/或肌钙蛋白I的至少一种抗体，和任选地附加地包括至少一种肌钙蛋白T和/或肌钙蛋白I校准标准物。

优选地，根据本发明的试剂盒适用于借助于试验片或盘、或作为快速检验在自动化分析仪上进行根据本发明的免疫测定。

使用免费可获得的统计学软件(R 3.5.1,The R Foundation for StatisticalComputing)进行全部统计学分析。当检验组之间的差异时，使用Wilcoxon秩和检验(rank-sum test)。报告置信区间(CI)和显著性，区间为0.95，相应地α为0.05。在以下实施例中，室温(RT)是指22℃。如果没有另外指出，“％”是指％w/w。

实施例1：可在来自患有急性冠状动脉综合征的患者的血液样品中检测到SELENBP1

在疑似患有急性冠状动脉综合征(ACS)患者的血清样品中测定循环SELENBP1。通过传统方法平行确认诊断。在疑似由ACS导致的症状的第一次发作后的几个时间点抽取血液样品。患者的平均SELENBP1浓度高于健康对照。浓度显示具有患者特异性特征的动态时间进程。

实施例2：健康对照的血液中的SELENBP1

来自对照成人的小组(n＝75)的高品质血清样品用于测定健康受试者的血液中的正常SELENBP1水平。仅微量的浓度是可检测的，主要低于SELENBP1检验的线性范围。获得的值呈正态分布，具有0.23nmol/l的平均值。健康对照组的SELENBP1浓度的值的95％百分位数多至0.32nmol/l，99％百分位数多至0.39nmol/l。

实施例3：重组SELENBP1的表达和纯化

在杆状病毒感染的昆虫细胞中表达重组人SELENBP1(rhSELENBP1)。使用分别含有BamHI和HindIII限制位点的引物P1(SEQ:ID NO.2)和P2(SEQ:ID NO.3)(Invitrogen,Thermo Fischer Scientific,Dreieich,Germany)、自根据SEQ:ID NO.1的肝cDNA通过PCR扩增编码rhSELENBP1(根据UniProtKB数据库No.Q13228-1)的cDNA序列。由BamHI和HindIII消化pFastBac1质粒(Thermo Fischer Scientific)，移除质粒片段并由产生pFastBac2-SelenBP1-His6质粒的PCR序列取代。转化DH10Bac大肠杆菌细胞并鉴定杆粒阳性细胞，培养并分离重组杆粒。通过Cellfectin(Thermo Fischer Scientific)将Sf9昆虫细胞与杆粒DNA一起转移，用于获得用于在“High Five”昆虫悬浮细胞中启动rhSELENBP1生物合成的重组病毒储液(stock)。72小时后，收获感染细胞、裂解并根据制造商的说明(Qiagen GmbH,Hilden,Germany)在Ni-NTA琼脂糖上使用亲和性色谱法从细胞提取物分离rhSELENBP1-His6。使用市售的二辛可宁酸(BCA)蛋白检验试剂盒(Pierce BCA,Thermo FischerScientific)确定纯化的rhSELENBP1的浓度。

实施例4：针对SELENBP1的抗体的免疫、分离和纯化

通过商业服务提供商(UNICUS Karlsburg OHG,Greifswald,Germany)、基本上如所述的(Hybsier等人(2017)Redox Biology 11:403-414)产生单克隆抗体(mAb)。简言之，在

实施例5：试验开发和表征

对于SELENBP1的定量分析，比较几种mAb组合并且选择一对合适的克隆用于mAb生产和纯化，基本上如所述(Hybsier等人(2017)Redox Biology 11:403-414)。选择两种合适的mAb(抗SELENBP1-mAb1和抗SELENBP1-mAb2)并建立两位点-非竞争性免疫测定(夹心试验)。调节至pH6.5的具有0.05MKH

如果没有另外指出，优化试验参数以提供信号/噪声比，并且通常使用以下方案。使用具有1％(v/v)Triton X-100的PBS洗涤板4次。然后，每孔添加具有10％(v/v)甘油和1％(w/v)BSA的85μl的PBS和15μl的样品，密封板并在室温下置于微板振荡器上1小时。其后，用PBS/BSA洗涤板4次，并用每孔100μl的具有0.05％(v/v)MACN-标记的抗SELENBP1-mAb2、0.1％(v/v)Triton X-100和5％(w/v)脱脂奶粉的PBS培养，在室温下置于振荡器上另外1小时。

最后，再次用PBS/BSA洗涤板4次并置于光度计(Mithras LB 940,Berthold,BadWildbad,Germany)中用于分析。在注射75μl的0.06％(v/v)H

标准物用于分析范围为0.3至38.2nmol/l rhSELENBP1的临床血清样品。定量基于RLU作为SELENBP1浓度的函数的线性回归，m和b为板特异性参数：SELENBP1＝e

低于线性测定范围的浓度是线性推算的。

实施例6：灵敏度

分析不同量的rhSELENBP1以评价LIA的函数试验灵敏度(FAS)。各个浓度一式三份测定。由1.2mmol/l BSA制备所有样品以模拟血清蛋白的常规浓度。FAS定义为具有低于20％的变异系数(CV)的允许可靠测定的rhSELENBP1浓度范围。

实施例7：血清中的SELENBP1的稳定性

血清样品的处理与贮存在医院日常工作以及从参与临床试验的患者接收的血液样品的定期分析中是主要问题。因此，确定分析物在分别在不同温度下与在冷冻和冻融时在给定基质中的稳定性是重要的。

SELENBP1的稳定性通过将血清样品在室温或4℃下长期贮存，并分别通过反复冷冻和冻融循环进行分析。使用具有SST管的BD真空采血管系统(BD Vacutainer system)(Becton Dickinson GmbH,Heidelberg,Germany)抽取两个单独的血清样品，置于室温下30分钟使其凝固，并在室温下以2600rpm离心10分钟以从凝结的材料分离血清。从第一血清样品的上清液制备三种制剂：一个保持原样为(E)，分别补充有rhSELENBP1至5.7nmol/l的第二样品(C)和补充有rhSELENBP1至15.3nmol/l的第三样品(D)。第二血清样品的上清液保持原样为(A)或补充有rhSELENBP1至5.7nmol/l(B)。从制剂A-E中的每一个制备6份等分试验样品并置于4℃或室温。分别在1小时、3小时、6小时、1天、3天和7天后取等分试验样品。将等分试验样品贮存在-20℃下直至分析。从制剂B、D和E取10份以上等分试验样品用于确定重复冷冻-冻融循环后的稳定性。

在4℃下贮存长达7小时对血清中SELENBP1的浓度无影响，然而，室温下7小时的贮存期将免疫反应性SELENBP1降低至对照的73％(58–88％)。

相对于室温下延长的培养时间，冷冻几乎没有影响，并且在10个冷冻和冻融循环后观察到初始SELENBP1浓度略微降低至81％(72–90％)。

实施例8：检测组内和检测组间变异性

由各96孔板一式两份地分析添加有rhSELENBP1的标准血清的样品的重复(duplicate)，并用于计算板之间的CV(检测组间CV)。为了评价重复内的变异性，计算CV的数量。

由总计32个分析物中的一组rhSELENBP1的标准物来确定检测组间CV。标准物的平均浓度为4.6nmol/l(4.4–4.7nmol/l)。平均检测组间CV为9.9％。

为了评价检测组内变异性，分析了1394个重复并且计算CV的第5个百分位数、第50个百分位数和第95个百分位数。这分别产生了0.2％、3％、和12％的CV。

实施例9：分析物的比较

试验不同基质对测定及其精度的影响。

将rhSELENBP1添加至新鲜抽取的血清，以及添加至柠檬酸盐-血浆样品、肝素-血浆样品和EDTA-血浆样品。在室温下培养后，通过如上所述的发光免疫测定来确定SELENBP1浓度。

基质之间的结果的变异性低(平均CV：<12.5％)。这表明试验的所有基质适用于SELENBP1定量。

实施例10：SELENBP1不符合用于组织损伤的其它血液生物标志物

为了将由极急性组织损伤引起的释放至血液的SELENBP1的动力学与已确定的生物标志物进行比较，已将其浓度的动力学(dynamic)和特异性与作为心肌组织损伤的标志物的肌钙蛋白T(高灵敏度试验，hsTnT)和与指示肌肉、肝、或心脏损伤的ASAT(天冬氨酸转氨酶)相比较。这些标志物都不显示与SELENBP1浓度的显著关联。这表明来自受损组织的SELENBP1至血液中的释放与心肌坏死的程度不相关。

类似地，在循环SELENBP1和肌酸酐、钾、葡萄糖、血红蛋白、纤维蛋白原、凝血酶原时间、血小板计数、胆固醇或白细胞计数之间未发现相关性。

Seq ID No.1相当于编码SELENBP1的开放阅读框(UniProt KB Entry

No.Q13228-1)

SEQ：ID NO.2：atcggatccaccatggctacgaaatgtgggaattgtg(引物P1)

SEQ：ID NO.3：atcaagcttcagtgatggtgatggtgatgaatccagatgtcagagctacaatcgcc(引物P2)

序列表

<110> 贝里索尔股份有限公司(berYsol GmbH）

<120> 用于诊断极急性组织损伤的体液的硒结合蛋白1检测

<130> B019193-P-WO

<150> DE102018010217

<151> 2018-12-29

<160> 3

<170> BiSSAP 1.3.2

<210> 1

<211> 1419

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<223> "cDNA SELENBP1"

<220>

<223> cDNA SELENBP1

<400> 1

atggctacga aatgtgggaa ttgtggaccc ggctactcca cccctctgga ggccatgaaa 60

ggacccaggg aagagatcgt ctacctgccc tgcatttacc gaaacacagg cactgaggcc 120

ccagattatc tggccactgt ggatgttgac cccaagtctc cccagtattg ccaggtcatc 180

caccggctgc ccatgcccaa cctgaaggac gagctgcatc actcaggatg gaacacctgc 240

agcagctgct tcggtgatag caccaagtcg cgcaccaagc tggtgctgcc cagtctcatc 300

tcctctcgca tctatgtggt ggacgtgggc tctgagcccc gggccccaaa gctgcacaag 360

gtcattgagc ccaaggacat ccatgccaag tgcgaactgg cctttctcca caccagccac 420

tgcctggcca gcggggaagt gatgatcagc tccctgggag acgtcaaggg caatggcaaa 480

gggggttttg tgctgctgga tggggagacg ttcgaggtga aggggacatg ggagagacct 540

gggggtgctg caccgttggg ctatgacttc tggtaccagc ctcgacacaa tgtcatgatc 600

agcactgagt gggcagctcc caatgtctta cgagatggct tcaaccccgc tgatgtggag 660

gctggactgt acgggagcca cttatatgta tgggactggc agcgccatga gattgtgcag 720

accctgtctc taaaagatgg gcttattccc ttggagatcc gcttcctgca caacccagac 780

gctgcccaag gctttgtggg ctgcgcactc agctccacca tccagcgctt ctacaagaac 840

gagggaggta catggtcagt ggagaaggtg atccaggtgc cccccaagaa agtgaagggc 900

tggctgctgc ccgaaatgcc aggcctgatc accgacatcc tgctctccct ggacgaccgc 960

ttcctctact tcagcaactg gctgcatggg gacctgaggc agtatgacat ctctgaccca 1020

cagagacccc gcctcacagg acagctcttc ctcggaggca gcattgttaa gggaggccct 1080

gtgcaagtgc tggaggacga ggaactaaag tcccagccag agcccctagt ggtcaaggga 1140

aaacgggtgg ctggaggccc tcagatgatc cagctcagcc tggatgggaa gcgcctctac 1200

atcaccacgt cgctgtacag tgcctgggac aagcagtttt accctgatct catcagggaa 1260

ggctctgtga tgctgcaggt tgatgtagac acagtaaaag gagggctgaa gttgaacccc 1320

aacttcctgg tggacttcgg gaaggagccc cttggcccag cccttgccca tgagctccgc 1380

taccctgggg gcgattgtag ctctgacatc tggatttga 1419

<210> 2

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> "引物P1"

<220>

<223> 引物P1

<400> 2

atcggatcca ccatggctac gaaatgtggg aattgtg 37

<210> 3

<211> 56

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> "引物P2"

<220>

<223> 引物P2

<400> 3

atcaagcttc agtgatggtg atggtgatga atccagatgt cagagctaca atcgcc 56