一种心脏血栓动物模型及其构建方法

摘要

本发明涉及医学技术领域，特别涉及一种心脏血栓动物模型及其构建方法。该构建方法包括：将氯膦酸盐制剂导入动物腹腔；0.5～2天后，对处于麻醉状态的动物的左冠状动脉前降支进行结扎；结扎0.5～2天后，再次将氯膦酸盐制剂导入动物腹腔。本发明通过心梗造模+术前及术后注射少量氯膦酸盐脂质体，短期内清除巨噬细胞的方法制备小鼠心梗模型，造模小鼠形成左心室血栓的成功率达到90％以上。该方法简单易行，各种体型的实验动物均可广泛推广应用，左心室血栓形成率高，效果稳定，造模时间短，更接近临床上心梗后左心室血栓形成的病理生理状态。

说明书

技术领域

本发明涉及医学技术领域，特别涉及一种心脏血栓动物模型及其构建方法。

背景技术

随着人口老龄化的加剧，目前心血管疾病尤其是急性心肌梗死已经成为我国最主要的死亡原因之一，并呈现逐年上升的趋势，虽然经皮冠脉介入技术日益普及，多数心肌梗死患者能够得到及时救治，恢复心肌血供，但仍有部分患者，因缺血时间过长，心肌缺血坏死，进而引起心室收缩功能障碍，导致左心室血栓形成等严重并发症，形成的左心室血栓随时有梗阻流出道或脱落进入体循环造成脑梗死或其他重要脏器缺血坏死等风险，严重危及患者生命。如何挽救左心室血栓形成的患者已成为临床上亟待解决的热点问题之一。因此，制备左心室血栓动物模型用于该部分病人的治疗研究显得尤为必要。

目前制作左心室血栓动物模型的方法较少，且流程繁琐。有新西兰学者报道左心室血栓模型的制备方法：先通过抽取家兔血液在体外放置3个小时后形成血栓，然后正中切开胸骨并在心脏表面缝制荷包，再通过荷包将体外形成的血栓注入左心室，这种方法操作复杂，不仅需要大量时间制作血栓，术中还需超声引导，且血栓不能附着于左室内侧壁，造模后易立即进入体循环造成动物死亡，与临床上常见的心梗后左心室血栓情况有明显不同。另外，也有国内学者报道了类似的造模方法：将血栓一端注射至心腔，另一端留于心脏外并固定，这种方法可使造模动物长期存活，但也造成血栓过于稳固，不易脱落，与临床上的病理生理状态相去甚远。有国外学者通过诱导猪心脏骤停的方法迫使血流停止数分钟，血液淤滞形成左室血栓，随后进行心肺复苏，心室除颤恢复血流动力学，这种方法使机体重要脏器尤其是大脑缺血时间过长，造成不可逆性损伤，且所形成的血栓易溶解，效果不稳定。

综上所述，当前用于制备左心室血栓动物模型的方法效果均不够理想，且没有适用于体积更小的小鼠左室血栓模型构建方法，因此，亟需一种新的简易造模方法用于后续科学研究。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种心脏血栓动物模型及其构建方法。该方法为一种可靠的、快速稳定的、更接近临床状态的左心室血栓模型的制备方法。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种心脏血栓动物模型的构建方法，包括如下步骤：

步骤(1)将氯膦酸盐制剂导入动物腹腔；

步骤(2)0.5～2天后，对处于麻醉状态的动物的左冠状动脉前降支进行结扎；

步骤(3)结扎0.5～2天后，再次将氯膦酸盐制剂导入动物腹腔。

巨噬细胞是血栓溶解的重要效应分子，通过使用巨噬细胞清除剂—氯膦酸盐脂质体，可短暂清除小鼠体内巨噬细胞，诱导心梗后左室血栓形成，为后续治疗研究提供稳定、可靠的左心室血栓小动物模型。本发明采用氯膦酸盐脂质体短期清除巨噬细胞+心肌梗死的方法，成功构建了一种更接近临床状态的心梗后左心室血栓动物模型。本发明所述的左心室血栓动物模型可以用作各种相关研究。

作为优选，氯膦酸盐为氯膦酸二钠。

作为优选，氯膦酸盐制剂的剂型为脂质体或注射液。

作为优选，氯膦酸盐脂质体的浓度为1～10mg/mL。

在本发明提供的具体实施例中，氯膦酸盐脂质体的浓度为5mg/mL。

作为优选，步骤(1)或步骤(3)中，氯膦酸盐脂质体的导入剂量为1～5μL/g(体重)。

优选地，步骤(1)或步骤(3)中，氯膦酸盐脂质体的导入剂量为3～5μL/g(体重)。

更优选地，步骤(1)或步骤(3)中，氯膦酸盐脂质体的导入剂量为3～4μL/g(体重)。

在本发明提供的具体实施例中，1天后，对处于麻醉状态的动物的左冠状动脉前降支进行结扎；结扎1天后，再次将氯膦酸盐制剂导入动物腹腔。

作为优选，左冠状动脉前降支结扎的位置为左心耳下缘与心尖连线中点处。

作为优选，结扎具体为以6-0带针缝合线于左心耳下缘与心尖连线中点处横向进针，针深度1～2mm，跨度3～4mm，结扎。

在本发明中，动物为小鼠、大鼠、兔、犬、猫、猪、猴、狒狒、猩猩中的一种。但本发明动物并非限定于此。

本发明还提供了由上述构建方法制备的心脏血栓动物模型。

本发明提供了一种心脏血栓动物模型及其构建方法。该构建方法包括如下步骤：将氯膦酸盐制剂导入动物腹腔；0.5～2天后，对处于麻醉状态的动物的左冠状动脉前降支进行结扎；结扎0.5～2天后，再次将氯膦酸盐制剂导入动物腹腔。本发明与现有技术相比具有如下优点：

本发明的制备方法通过心梗造模+术前及术后注射少量氯膦酸盐脂质体，短期内清除巨噬细胞的方法制备小鼠心梗模型，造模小鼠形成左心室血栓的成功率达到90％以上。该方法简单易行，各种体型的实验动物均可广泛推广应用，左心室血栓形成率高，效果稳定，造模时间短，更接近临床上心梗后左心室血栓形成的病理生理状态。

附图说明

图1为流程示意图；

图2为小鼠造模手术后第3及28天超声检测左心室血栓图，形态、位置与人类左心室血栓相似，其中，(A)术后第3天左心室血栓如箭头所示；(B)术后第28天左心室血栓如箭头所示；(C)人类左心室血栓如箭头所示；

图3为小鼠造模手术后第3及28天心脏切片Masson染色检测左心室血栓图，其中，(A)术后第3天Masson染色，左心室血栓如虚线范围所示；(B)术后第28天Masson染色，左心室血栓如虚线范围所示；

图4为采用不同氯磷酸盐脂质体注射剂量的小鼠术后3天存活率及左心室血栓形成率，其中(A)术后第3天小鼠存活率；(B)术后第3天小鼠左心室血栓率。

具体实施方式

本发明公开了一种心脏血栓动物模型及其构建方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明中所用试剂或仪器均可由市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1

本实施例心脏血栓动物模型构建方法流程示意图如图1所示，具体操作如下：

(1)实验动物：苏州大学实验动物中心提供的6-8周C57BL/6小鼠，雄性，体重20-22g。

(2)手术前1天，对小鼠进行称重标记，并以3μL/g或5μL/g剂量腹腔注射浓度为5mg/mL的氯膦酸盐脂质体，优选剂量为3μL/g。

(3)手术当天，以80mg/kg剂量戊巴比妥腹腔注射麻醉小鼠，脱毛膏脱去胸前区毛发。

(4)将小鼠固定于手术操作台，含75％酒精棉球进行皮肤消毒，剪开颈部皮肤，钝性分离颈部肌肉与其他软组织，暴露气管，选用16号静脉留置针经口进行气管插管，肉眼判断留置针套管进入气管后即为插管成功，并连通小动物呼吸机；呼吸比：1:1.3，频率：110次/min，潮气量：1.3-1.5mL/10g。

(5)纵行切开胸骨左缘皮肤，钝性分离胸大肌、胸小肌，暴露第3、4肋间，于肋间处进入胸腔，暴露心包及左肺。

(6)棉球遮挡保护左肺，撕开心包，暴露心脏。

(7)以6-0带针缝合线于左心耳下缘与心尖连线中点处横向进针，针深度约1-2mm，跨度约3-4mm，结扎前降支，心脏变白，室壁运动明显减弱即为心梗造模成功。

(8)取出棉球，以4-0非吸收性缝线逐层关胸，缝合肋间、肌层和皮肤。

(9)待小鼠恢复自主呼吸后，拔出器官插管，放置保温毯中直至自然苏醒。

(10)术后第1天，再次以3μL/g或5μL/g剂量腹腔注射浓度为5mg/mL的氯膦酸盐脂质体，优选剂量为3μL/g。

(11)术后第3天通过Vevo 2100小动物超声成像系统检测小鼠左心室血栓：将小鼠以3％异氟烷进行诱导麻醉，1.5％异氟烷维持麻醉。麻醉后小鼠固定于检测台，连接温度及心率监测设备，将超声探头至于胸骨左缘，在B模式下检测左心室血栓。

(12)在心梗造模后第3天和28天取材：正中开胸暴露心脏，分别以PBS及4％多聚甲醛灌流并固定心脏，取出心脏后根据常规方法制备心脏石蜡切片，Masson染色进行病理分析。

由图2-4可知，本发明采用氯膦酸盐脂质体短期清除巨噬细胞+心肌梗死的方法，成功构建了一种更接近临床状态的心梗后左心室血栓动物模型。造模小鼠形成左心室血栓的成功率达到90％以上，方法简单易行，效果稳定，造模时间短。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。