右美托咪定在制备改善糖尿病周围神经病变药物组合物中的应用

摘要

本发明公开了右美托咪定在制备改善糖尿病周围神经病变药物组合物中的应用，通过高脂高糖联合腹腔小剂量注射链脲佐菌素(STZ)的方法制备大鼠Ⅱ型糖尿病模型和大鼠RSC96细胞系在体外建立DPN模型，应用DEX、DEX和α2受体阻滞剂育亨宾，DEX和转染miR‑34a增强剂mimics，DEX和转染miR‑34a抑制剂antagomir，DEX和转染SIRT1过表达质粒，DEX和转染SIRT1沉默质粒对大鼠和细胞系的作用，通过检测细胞凋亡来判断DEX对DPN的影响，并首次探讨了其通过调节miR‑34a靶向调节SIRT1改善糖尿病大鼠周围神经病变的调控机制。

说明书

【技术领域】

本发明涉及糖尿病治疗药物技术领域，涉及右美托咪定在制备改善糖尿病周围神经病变药物组合物中的应用。

【背景技术】

糖尿病(Diabetes mellitus)是严重威胁人类身体健康的慢性代谢性疾病。目前已成为发达国家继脑血管疾病及肿瘤之后的第三大慢性非传染性疾病。长期高血糖对机体内环境有普遍的毒性，并可引起周围神经的病理反应。糖尿病患者普遍存在大血管和微血管病变，其中糖尿病周围神经病变(Diabetic peripheral neuropathy，DPN)是糖尿病常见的慢性并发症，随着糖尿病治疗手段的进步和临床疗效的提高，糖尿病患者的寿命明显提高，随着病程的延长，使该病的临床发病率达到47-91％，其中Ⅱ型糖尿病患者合并神经病变的发生率可达74.8％，严重时可导致溃疡、坏疽、甚至截肢，是糖尿病致残的主要原因之一，而感觉异常也更给患者带来极大的痛苦，常影响日常工作、睡眠，不但严重影响病人生活质量，而且造成巨大的经济和社会负担。虽然糖尿病周围神经病变一直倍受人们关注，但目前对糖尿病周围神经病变的发病机理依然存在着许多疑问，相关的知识多限于实验动物而且缺乏有效的糖尿病神经病变治疗药物。其发病机制较为复杂，目前尚未完全阐明。其发病机理多以糖尿病患者高血糖为始动因素，细胞凋亡及氧化应激在糖尿病及其并发症的发生、发展方面起着重要的作用，是目前国内外的研究热点。目前，对DPN，临床亦缺乏安全有效的治疗方法。即使严格控制血糖，也不能有效改善患者的临床症状。虽然醛糖还原酶抑制剂、抗氧化剂、非酶糖化产物抑制剂及维生素类在动物实验中取得了一定的成效，但临床应用效果却不尽如人意。因此，对于DPN及其治疗药物的研究具有重要的实际意义。

右美托咪定(DEX)作为一种新型的高效和高选择性的α2肾上腺素受体激动剂，已被证实对多个器官缺血再灌注损伤均有确切的保护作用，包括心脏、肾脏以及脊髓等。同样，随着DEX临床应用的增加，大量研究证实其在多种神经损伤模型中逐渐表现出神经保护作用，包括缺血再灌注损伤、创伤性损伤、外源性谷氨酸诱导损伤以及吸入麻醉药损伤等等。

研究证实，α2受体多与抑制性G蛋白偶联而介导抑制作用，进而启动细胞内信号传导机制从而产生分子生物学效应，包括抑制腺苷酸环化酶活性、降低细胞内cAMP水平、抑制蛋白激酶A磷酸化、激活钾离子通道、抑制电压门控钙离子通道等。基于α2受体在体内多种器官组织分布的特点，DEX可产生多种生物学效应：一方面，其可通过激动突触前膜α2受体，抑制去甲肾上腺素的释放；另一方面，还可通过激动突触后膜α2体，抑制交感神经活性，从而产生镇静、缓解焦虑、交感抑制和镇痛等生物学效应。因此，DEX已经作为麻醉剂的附属药物广泛应用临床其他科室。

由于DEX发挥神经保护作用涉及的途径复杂，环节众多，使得研究难以深入。现有的研究结果很不一致，且均未能对其机制进行很好的解释。例如，抑制儿茶酚胺释放、激活细胞外信号调节激酶(ERK)使星型胶质细胞脑源性神经营养因子(BDNF)的表达增加、通过激活磷脂肌醇信号途径(PKCα)和环磷腺苷效应元件结合蛋白(CREB)促进胶质细胞源性神经生长因子(GDNF)的释放、增强抗氧化物酶如SOD的活性以降低脂质过氧化、上调DNA修复酶8-羟基鸟嘌呤DNA糖苷酶(OGG1)、提高谷胱甘肽/氧化型谷胱甘肽(GSH/GSSG)比值水平以减弱氧化应激、抑制炎症反应并降低炎症因子水平、咪唑啉I受体的参与等等。众多的机制研究中尚无一种确切的机制能够阐释右美托咪定的神经保护作用。

MiRNAs是一类在进化上高度保守的单链非编码小RNA，由19-25个核苷酸组成，主要通过与靶基因mRNA的3'非翻译区(3'UTR)的不完全互补结合，抑制其翻译或促进其降解，从而在转录后水平对基因的表达进行调控。据推测，人类基因组上约有三分之一的基因都受到miRNA的调控，包括细胞增殖、分化、凋亡、代谢、激素分泌及个体发育等各种人类生理病理过程都有miRNA参与调控。已有研究表明，miRNA的功能性紊乱可能与神经系统的病理学过程相关，包括脑肿瘤、唐氏综合症、阿尔茨海默病、精神分裂症以及脑梗塞等。许多miRNA在脑及脊髓中高度表达，它们与神经组织的发育、神经元的分化等功能有关，可能对维持成熟神经元存活并发挥功能至关重要。

高血糖损伤背根神经节(DRG)神经元的神经纤维可导致DPN，研究指出miR-34a在高血糖DRG神经元中呈高表达，并抑制轴突生长，从而可加重高血糖状态下DRG神经元损伤，进一步促进DPN，并且DEX可通过抑制miR-34a的表达、从而靶向上调SIRT1抑制大鼠海马神经元损伤。此外，有研究表明miR-34a可通过靶向下调Sirt1，上调Bax和caspase-3的表达，以及下调Bcl-2的表达，从而促进心肌细胞凋亡。敲除Sirt1基因可上调Bax和caspase-3的表达、下调Bcl-2的表达，从而促进猪前脂肪细胞凋亡。我们前期研究结果显示DEX可抑制DPN，且DEX在DPN中可下调Bax和caspase-3的表达、上调Bcl-2的表达。但就DPN中Bax、caspase-3以及Bcl-2是如何被调控的具体作用机制还不明确。

因此，需要找到新的思路，为临床上治疗DPN提供理论支持。

【发明内容】

针对现有技术中对于DEX在DPN中通过miR-34a结合，靶向上调SIRT1的机制研究尚未有报道，本发明右美托咪定在制备改善糖尿病周围神经病变药物组合物中的应用，着眼于DEX通过与miR-34a结合，靶向上调SIRT1，从而下调Bax和caspase-3的表达、上调Bcl-2的表达，进而抑制DPN。

右美托咪定在制备改善糖尿病周围神经病变药物组合物中的应用。

进一步的，所述的右美托咪定在制备改善糖尿病周围神经病变药物组合物中的应用，所述药物组合物是以右美托咪定为主要成分，加上药学中可接受的辅料或辅助性成分制备成临床上可接受的药物制剂。

进一步的，所述的右美托咪定在制备改善糖尿病周围神经病变药物组合物中的应用，所述药物制剂包括口服制剂和注射制剂两种剂型。

进一步的，所述的右美托咪定在制备改善糖尿病周围神经病变药物组合物中的应用，所述口服制剂为口服胶囊，所述注射制剂为静脉注射液。

进一步的，所述的右美托咪定在制备改善糖尿病周围神经病变药物组合物中的应用，是将右美托咪定通过注射给药的方式定位注射至腹部皮下组织，产生改善糖尿病周围神经病变的作用。

通常而言，作为药物，均是在制备成制剂后才临床应用。本发明所述的药物组合物，作为药物组合物可根据本领域公知的方法制备。可通过将本发明药物组合物与一种或多种药学上可接受的固体或液体赋形剂和/或辅剂结合，制成适于人或动物使用的任何剂型。本发明所述的右美托咪定在药物组合物中的含量通常为0.1-95.0％(w/w)。

本发明药物组合物或含有它的药物组合物可以单位剂量形式给药，给药途径可为肠道或非肠道，如口服、静脉注射、肌肉注射、皮下注射、鼻腔、口腔粘膜、眼、肺和呼吸道、皮肤、阴道、直肠等。

给药剂型可以是液体剂型、固体剂型或半固体剂型。液体剂型可以是溶液剂(包括真溶液和胶体溶液)、乳剂(包括o/w型、w/o型和复乳)、混悬剂、注射剂(包括水针剂、粉针剂和输液)、滴眼剂、滴鼻剂、洗剂和搽剂等；固体剂型可以是片剂(包括普通片、肠溶片、含片、分散片、咀嚼片、泡腾片、口腔崩解片)、胶囊剂(包括硬胶囊、软胶囊、肠溶胶囊)、颗粒剂、散剂、微丸、滴丸、栓剂、膜剂、贴片、气(粉)雾剂、喷雾剂等；半固体剂型可以是软膏剂、凝胶剂、糊剂等。

本发明药物组合物可以制成普通制剂、也可以制成缓释制剂、控释制剂、靶向制剂及各种微粒给药系统。为了将本发明药物组合物制成片剂，可以广泛使用本领域公知的各种赋形剂，包括稀释剂、黏合剂、润湿剂、崩解剂、润滑剂、助流剂。稀释剂可以是淀粉、糊精、蔗糖、葡萄糖、乳糖、甘露醇、山梨醇、木糖醇、微晶纤维素、硫酸钙、磷酸氢钙、碳酸钙等；润湿剂可以是水、乙醇、异丙醇等；黏合剂可以是淀粉浆、糊精、糖浆、蜂蜜、葡萄糖溶液、微晶纤维素、阿拉伯胶浆、明胶浆、羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、乙基纤维素、丙烯酸树脂、卡波姆、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇等；崩解剂可以是干淀粉、微晶纤维素、低取代羟丙基纤维素、交联聚乙烯吡咯烷酮、交联羧甲基纤维素钠、羧甲基淀粉钠、碳酸氢钠与枸橼酸、聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯、十二烷基磺酸钠等；润滑剂和助流剂可以是滑石粉、二氧化硅、硬脂酸盐、酒石酸、液体石蜡、聚乙二醇等。

还可以将片剂进一步制成包衣片，例如糖包衣片、薄膜包衣片、肠溶包衣片，或双层片和多层片。

为了将给药单元制成胶囊剂，可以将有效成分本发明药物组合物与稀释剂、助流剂混合，将混合物直接置于硬胶囊或软胶囊中。也可将有效成分本发明药物组合物先与稀释剂、黏合剂、崩解剂制成颗粒或微丸，再置于硬胶囊或软胶囊中。用于制备本发明药物组合物片剂的各稀释剂、黏合剂、润湿剂、崩解剂、助流剂品种也可用于制备本发明药物组合物的胶囊剂。

为将本发明药物组合物制成注射剂，可以用水、乙醇、异丙醇、丙二醇或它们的混合物作溶剂并加入适量本领域常用的增溶剂、助溶剂、pH调剂剂、渗透压调节剂。增溶剂或助溶剂可以是泊洛沙姆、卵磷脂、羟丙基-β-环糊精等；pH调剂剂可以是磷酸盐、醋酸盐、盐酸、氢氧化钠等；渗透压调节剂可以是氯化钠、甘露醇、葡萄糖、磷酸盐、醋酸盐等。如制备冻干粉针剂，还可加入甘露醇、葡萄糖等作为支撑剂。

此外，如需要，也可以向药物制剂中添加着色剂、防腐剂、香料、矫味剂或其他添加剂。

和现有技术相比，本发明具有如下优点：

1、本发明着眼于DEX通过与miR-34a结合，靶向上调SIRT1，从而下调Bax和caspase-3的表达、上调Bcl-2的表达，进而抑制DPN。目前对于DEX在DPN中通过miR-34a结合，靶向上调SIRT1的机制研究尚未有报道，因此，本发明研究DEX通过miR-34a靶向调节SIRT1改善糖尿病大鼠周围神经病变的调控机制，从而为DPN的机制研究提供一种新的思路，也为临床上治疗DPN提供理论支持。

2、本发明所述的右美托咪定在制备改善糖尿病周围神经病变药物组合物中的应用，提出了一个新的改善糖尿病周围神经病变的药物靶点。

3、本发明所述的右美托咪定在制备改善糖尿病周围神经病变药物组合物中的应用，发现将右美托咪定用于改善糖尿病周围神经病变的治疗，扩大了右美托咪定的适用范围。

【附图说明】

图1是本发明实施例中各组间机械缩足反应阈值之间的比较的图。

图2是本发明实施例中各组间热缩足潜伏期的比较的图。

图3是本发明实施例中各组间运动神经传导速度和感觉神经传导速度的比较的图。

图4是本发明实施例中各组间坐骨神经的组织学改变(HE染色)坐骨神经的图。

图5是本发明实施例中免疫组化染色Bax、Bcl-2、Caspase-3表达的图。

图6是本发明实施例中各组间miR-34a的表达差异的图。

图7是本发明实施例中各组间SIRT1 mRNA的表达差异的图。

图8是本发明实施例中各组间Bax，Bcl-2，Caspase-3 SIRT1 western染色的情况的图。

图9是本发明实施例中各组间TUNEL细胞凋亡的情况的图。

【具体实施方式】

以下结合实施例对本发明的具体实施方式做进一步说明。

实施例：

右美托咪定在制备改善糖尿病周围神经病变药物组合物中的应用：

实验方法

(一)DEX对糖尿病大鼠神经功能障碍、神经细胞凋亡及miR-34a、SIRT1的影响

1、试验动物

本实验选用健康成年雄性SD大鼠，体重120-150g，由广西医科大学实验动物中心提供。实验前成对地饲养在饲养笼中，实验后则单独饲养，保持饲养环境一致，室温维持在20-25℃，正常昼夜节律，无强光及强噪声刺激，保证自由摄食及饮水。

2、Ⅱ型糖尿病大鼠动物模型的建立

采用高脂高糖联合腹腔小剂量注射链脲佐菌素(STZ)的方法制备Ⅱ型糖尿病模型。大鼠每笼5只，自由摄食饮水，环境安静，室温控制在25℃左右，相对湿度55-60％，12小时交替照明。标准饲料由依托单位实验动物中心提供，饲料配方：碳水化合物60％、蛋白质22％、脂肪10％、纤维素等其它成分8％。

高脂高糖配方为：动物脂肪10％、蔗糖20％、蛋黄粉10％、胆酸盐0.5％、常规饲料59.5％。适应性喂养一周后，从172只SD大鼠中随机抽取26只为正常对照组(A)，其余146只为高脂高糖喂养组(B)。A组给予标准大鼠饲料喂养，B组给予高脂高糖饲料喂养。8周后，A组及B组各处死6只大鼠，检测血糖、血脂、胰岛素水平。剩余B组140只大鼠空腹18小时后，腹腔注射小剂量链脲佐菌素(STZ)35mg/kg(以pH4.2的0.1mol/L柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液配成2％的浓度)，剩余A组20只大鼠仅注射相同剂量的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液作为对照。七天后用美国强生血糖仪测量空腹尾静脉血糖≥11.1mmol/L作为Ⅱ型糖尿病模型造模成功的标准。

3、实验分组及处理：

取常规饲料喂养的大鼠20只，为正常对照组，取糖尿病模型成功大鼠60，采用随机数字表法，将其随机分为4组(n＝20)：

①C组(正常对照组)：每日等量盐水腹膜腔注射，连续14d；

②D组(糖尿病对照组)：每日等量盐水腹膜腔注射，连续14d；

③DEX组(右美托咪定组)：右美托咪定10μg/kg/d(药物浓度2μg/ml)腹膜腔注射；，连续14d；

④DY组(右美托咪定+育亨宾组)：右美托咪定10μg/kg/d(药物浓度2μg/ml)腹膜腔注射加育亨宾500μg/kg/d(药物浓度50μg/ml)，连续14d；

4、坐骨神经传导速度的测定：

测定动物坐骨神经NCV。分别采用在体直接和间接测定方法，即刺激针电极置于坐骨切迹处的坐骨神经传出部位，于踝关节坐骨神经经过部位用针电极记录。参考电极在刺激电极与记录电极之间，与记录电极1cm处的皮下。用单脉冲方波作用刺激电极，波宽0.1ms，刺激强度1.5倍阈值，计算机记录从刺激神经开始到远端肌肉出现动作电位的时间，即潜伏期。在动物体表准确测定刺激电极到记录电极之间的距离。计算坐骨结节到踝关节处的MNCV。MNCV(m/s)刺激电极与记录电极间的距离/潜伏期。

上述测定之后，坐骨切迹处的刺激电极置位置不变，将上述踝关节处的记录电极也作为刺激电极，并于大鼠足趾骨间肌肉处用针电极记录，参考电极在刺激电极与记录电极之间，与记录电极1cm处的皮下，其他条件保持不变。分别用两刺激电极刺激神经，计算机分别记录刺激神经开始到远端肌肉出现动作电位的时间，即潜伏期，计算平均值。在动物体表分别准确测定两刺激电极到记录电极之间的距离。代入公式MNCV(m/s)两刺激电极与记录电极之间传导距离之差/两刺激电极与记录电极之间传导潜伏期之差。

5、机械缩足反应阈值(MWT)的测定及热缩足潜伏期(TWL)的测定

每组大鼠分别于给药前以及给药结束1d后测定机械刺激缩足反射阈值和热缩足反射潜伏期。测定在安静环境下进行，室温维持在20-25℃。

MWT的测定：将有机玻璃箱置于金属网格上，待测大鼠置于有机玻璃箱里适应20min安静后，用标有不同刻度的vonFrey纤维丝垂直刺激大鼠后肢足底中部，持续时间低于4s，若大鼠出现缩足、舔足或逃避等行为时为阳性反应，否则为阴性反应。刺激力度从2.0g开始，为阴性反应时，逐步加大刺激力度，直至第一次出现阳性反应为止，再连续测定阈值上下5次，刺激间隔时间为30s，最大刺激力度为26.0g，记算出50％缩足时反应阈值，取平均值记为MWT。

TWL的测定：采用BME-410A型全自动热痛刺激仪。主要参数：光源为12V/l0W卤素灯，刺激光面积小于20mm

6、坐骨神经取材

①光学显微镜观察

测完神经传导速度后，取大鼠右侧坐骨神经(坐骨切迹至远端1cm及0.1cm)标本，标本放于滤纸上吸干修整，用4％多聚甲醛固定24小时后，流水充分冲洗，80％酒精1h，95％酒精过夜，无水乙醇1h，二甲苯透明30min，65℃软蜡浸蜡，常规包埋制成石蜡块。轮转式切片机连续切片厚度4μm，于45℃蒸馏水中铺片，待组织完全铺平后捞于载玻片上。65-70℃温箱烤片30min，进行HE染色。

②超微结构观察

0.1cm坐骨神经标本置于预冷的2.5％戊二醛固定。前固定：更换新的2.5％戊二醛固定液，固定2小时或过夜，用吸管吸出固定液，加入0.1M二甲砷酸钠缓冲液，间隔2小时换液一次，共换液3-4次；后固定：吸出缓冲液，在通风橱中加入4℃1％锇酸浸泡2小时，吸出锇酸，加入0.1M二甲砷酸钠缓冲液冲洗2次，每次15分钟；脱水置换：吸去缓冲液，注入乙醇，逐级剃度脱水，每级10-15分钟；浸透：移入浸透液(不完全包埋液：环氧丙烷＝1:1)中室温浸透1小时；再移入不完全包埋液：环氧丙烷＝2:1中浸透1小时；完全包埋液浸透过夜；包埋聚合：转移至包埋板(填有完全包埋液)包埋样品，标记；而后放至60℃温箱聚合48小时；超薄切片：对包埋块做适当的定位修整，切片厚度选择在50nm左右；电子染色：醋酸铀染色30-45分钟，柠檬酸铅染色30分钟。

7、背根神经节取材

心脏取血后，迅速左心室行升主动脉插管，剪开右心耳，快速灌注PBS缓冲液200-300ml冲洗血液，直至由右心耳流出的液体清亮无色，再灌入4％多聚甲醛/磷酸盐缓冲液固定，先快后慢，进液总量约400-500ml，直至肝脏变白，大鼠变硬灌注时间大约40分钟左右，取梨状肌上缘经后入路取与坐骨神经相关的双侧第4、5、6背根神经节，在相同的固定液中后固定，常规脱水，石蜡包埋，连续切片，片厚约3μm，于45℃蒸馏水中铺片，贴于多聚赖氨酸处理的玻片上，烤干后4℃保存。进行SIRT1，Bax、bcl-2、caspase-3免疫组化染色。

8、免疫组化检测SIRT1，Bax，bcl-2、caspase-3的表达：

①采用通用型二步免疫组化法，石蜡切片，常规脱蜡，水化。

②热修复抗原：0.0lM柠檬酸盐缓冲液(PH6.0)，微波炉大火加热3-4min至沸腾，放入片子，中火2min，小火3min，微火5min，小火3min，自然冷却后，PBS(pH7.2-7.6)洗涤3次，每次5min。

③3％H

④滤纸吸干，甩去多余液体，滴加一抗(Bax、bcl-2、caspase-3、SIRT1稀释浓度1:200)阴性对照片只滴加PBS，4℃过夜，次日37℃下复温30min，PBS洗涤5min，进行3次。

⑤每张切片滴加二抗，即通用型。

试剂1：聚合物辅助剂(Polymer Helper)，37℃下孵育20-30min，PBS冲洗3次，每次2min。

试剂2：辣根酶标记羊抗兔/小鼠IgG多聚体37℃下孵育30min，PBS冲洗3次，每次2min。

⑥每张切片滴加新鲜配置的DAB溶液，显微镜下观察3-10min；蒸馏水冲洗，苏木素复染，酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。

结果判断：SIRT1、Bcl-2在胞浆中出现特异性棕黄色颗粒，Bax、Caspase-3在胞浆或胞核中出现特异性棕黄色颗粒者为阳性，阴性对照无特异性着色。阳性细胞百分比记分采用人工计数，按视野内阳性细胞所占总细胞数的比例记分，≤25％、26-50％、51-75％、>75％分别记分为1、2、3、4分。着色强度记分，按阳性细胞着色(颜色)无、弱(淡黄)、中(棕黄)、强(棕褐)分别记分0、1、2、3分。

结果判定：本实验中每张切片随机取5个400倍视野，每个视野均进行阳性细胞百分比记分与着色强度记分。上述两种记分结果相加，0-1分为阴性；2-3分为弱阳性(+)；4-5分为中等阳性(++)；6-7分为强阳性(+++)。平均光密度(Meandensity)通过Motic ImagesAdvanced 3.2图像采集分析系统对免疫组化结果进行半定量分析。每只大鼠观察3张切片，每张切片在400倍光镜下选取5个互不重叠视野，测量每个视野中所有阳性像素的平均光密度，各取均值为一只大鼠的结果，然后进行统计分析。

9、提取总RNA，RT-PCR测量miR-34a、β-actin、SIRT1、Bax，Bcl-2、caspase-3cDNA含量：

①背根神经节组织总RNA提取

采用硫氰酸肌-酚-氯仿一步法提取脊髓组织总RNA：提取过程所用物品均经无RNA酶处理，所有操作过程均在超净工作台内的冰上进行。

②RNA浓度、纯度测定

吸取2ul样品，用RNase-free water稀释至100:l，紫外分光光度计测定A260、A280值，并计算出RNA浓度及纯度(以A260/A280比值评估RNA纯度，正常范围为(1.65-2.00)。调整各样品的RNA浓度至同一数值。

③RNA完整性鉴定

配制含EB的1％琼脂糖凝胶，电泳槽中加入1×TBE缓冲液，浸过凝胶2mm左右。取RNA样品2μg，加上样缓冲液2μl，80V电压电泳至示踪剂迁移至凝胶的3/4处，紫外灯下观察18S和28S条带情况，可见28S的宽度和亮度约是18S的2倍，且边缘清晰，即可用于反转录。置于-80℃冰箱保存。

④RT-PCR检测miR-34a、β-actin、SIRT1、Bax，Bcl-2、caspase-3

登录Genebank，查询大鼠miR-34a、β-actin、SIRT1、Bax，Bcl-2、caspase-3cDNA全长序列，primier5.0引物设计软件设计引物序列，引物由大连宝生物有限公司合成。

U6作为内参

上游引物为5’-CTCGCTTCG-GCAGCACA-3’，

下游引物为5’-AACGCTTCAC-GAATTTGCGT-3’，

miR-34a

上游引物为5’-CCCACTCACCGTACTAA-3’，

下游引物为5’-GTGGTTTCAAGGCCAGATGT-3’

β-actin:预扩增产物长度为540bp

上游引物：5’-CAGTAACAGTCCGCCTAGAA-3’

下游引物：5’-GATTACTGCTCTGGCTCCTA-3’

SIRT1：预扩增产物长度为520bp

上游特异性引物：5’-TGAAAGTGATGAGGAGGATAGAGCC-3’

下游特异性引物：5’-CAACCTGTTCCAGCGTGTCTATGT-3’

Bcl-2：预扩增产物长度为452bp

上游特异性引物：5‘GGAGGACAGGGTACGATAA-3’

下游特异性引物：5’CCACCGAACTCAAAGAAGG 3’

Bax：预扩增产物长度为275bp

上游特异性引物：5’-GAGGATGATTGCCGCCGTGGACA-3’

下游特异性引物：5’-GGTGGGGGTGAGGAGGCTTGAGG-3’

Caspase-3：预扩增产物长度为402bp

上游特异性引物：5’-TGGCCCTGAAATACGAAGTC-3’

下游特异性引物：5’-ACCCGTCCCTTGAATTTCTC-3’

引物序列经NCBI nBlast比对无非特异性扩増，用于qRT-PCR实验。反应体系的配制，反应参数参考TaKaRa SYBR Premix Ex Taq(Perfect Real Time)试剂盒说明行，RealTime PCR的扩增曲线和融解曲线应用Bio-Rad CFX96 Real-Time PCR System的操作方法进行。运用Bio-Rad CFX96 Real Time PCR仪配套的Bio-Rad CFX Manager Softwarel.6数据分析软件，采用2^-△△Ct法开展数据分析。

10、Western blot测蛋白SIRT1、Bax，Bcl-2、caspase-3水平

1)配制相关试剂

2)提取背根神经节组织总蛋白，所有操作在冰浴中进行

3)蛋白浓度测定

4)SDS-PAGE蛋白电泳

5)免疫印迹

SDS-PAGE电泳结束后，将蛋白转移至PVDF膜上，5％脱脂奶粉封闭1.5h，PBST洗涤3次，用Sirt1抗体(1:1000)、Bcl-2抗体(1:2000)、Bax抗体(1:2000)、Caspase-3抗体(1:500)和β-actin(1:1000)4℃孵育过夜。次日PBST洗涤3次，用HRP标记的二抗(1:5000)室温孵育1.5h，PBST洗涤5次，ECL显色液显色。

6)Western blot结果分析

将扫描获得的图片，在Quantity One软件(Bio-Rad)下进行分析，每个蛋白带都有一个光密度值。β-actin作为内参照，再将各组的目的蛋白相对值除以β-actin相对值，即各组目的蛋白的相对表达量。

11、TUNEL法检测背根神经节细胞凋亡

每组随机取6张切片，采用TUNEL法检测大鼠背根神经节细胞凋亡。于40倍目镜下观察，TUNEL染色细胞核中棕黄染色为阳性细胞，即凋亡细胞。采用Image Pro Plus 6.0图像分析软件计数凋亡细胞和总细胞，计算凋亡细胞数占总细胞数的百分比，即凋亡指数(AI)。按TUNEL试剂盒进行染色。

实验结果：

1、右美托咪定对于大鼠血糖和体重的影响

本实验组已经成功的掌握了建立大鼠Ⅱ型糖尿病模型的技术，大鼠经过高糖、高脂饮食后八周，再注射STZ均可顺利建立糖尿病模型，而且血糖不会再下降，成模率非常高。

在链脲菌素(STZ)诱导糖尿病前，各组血糖水平无显著性差异。注射STZ后，血糖超过16.7mmol/l即为糖尿病，60只大鼠最终均发生糖尿病，注射STZ后3天内发生糖尿病。模型组(21.51±0.81mmol/l)、右美组(22.28±1.26mmol/l)和育亨宾组(21.80±0.87mmol/l)的血清葡萄糖浓度显著高于对照组(5.40±0.23mmol/l，p<0.05)。注射STZ后6周血糖(模型组22.95±1.06mmol/l，右美组22.09±0.76mmol/l，育亨宾组21.54±1.20mmol/l)高于对照组(5.51±0.37mmol/l)。而25ug/kg右美托咪定对三组大鼠血糖无显著影响(p<0.05，表1)。我们的结果也显示了体重的显著变化。在对照组，大鼠的体重随着时间的推移而增加。模型组、右美组和育亨宾组大鼠体重在第1-35天显著升高，在第35-70天显著降低(p<0.05)。研究结束时(第10周)，模型组、右美组和育亨宾组大鼠体重明显低于对照组。(p<0.05)。

表1、右美托咪定对于血糖和体重的影响

*p<0.05于同一组的第1天相比，#p<0.05与同一组的第35天相比，&p<0.05与对照组的同一天相比.

2、机械缩足反应阈值(MWT)及热缩足潜伏期(TWL)的比较

各组糖尿病神经病变诱导前MWT和TWL均值比较，差异无统计学意义。注射STZ后4周，模型组、右美组和育亨宾组的平均MWT和TWL均明显低于对照组(p<0.05)。与模型组和育亨宾组相比，右美组的平均缩足阈值明显改善(p<0.05，图1、图2)。

图1各组间机械缩足反应阈值之间的比较(n＝20，*p<0.05与对照组比较；#p<0.05与模型组比较)。

图2各组间热缩足潜伏期的比较(n＝20，*p<0.05与对照组相比；#p<0.05与模型组相比)

3、运动神经传导速度(MNCV)和感觉神经传导速度(SNCV)各组间的比较

图3各组间运动神经传导速度和感觉神经传导速度的比较(n＝20，*p<0.05与对照组比较；#p<0.05与模型组比较)

模型组的MNCV和SNCV均显著低于对照组(p<0.05)。右美托咪定治疗的大鼠的MNCV和SNCV均显著高于DPN组和YOH组(p<0.05)(图3)。

4、各组间坐骨神经的病理改变

图4各组间坐骨神经的组织学改变(HE染色)坐骨神经(n＝20)。A，对照组。B，模型组。C，右美组。D，育亨宾组。

对照组坐骨神经HE染色显示结构正常(图4A)。模型组轴突轻度萎缩、突变，髓鞘轻度脱髓鞘溶解(图4B)。右美组坐骨神经形态变化(图4C)小于模型组。育亨宾组大鼠(图4D)形态学变化与模型组相似。

5、免疫组化染色Bax、Bcl-2、Caspase-3表达图5各组间Bcl-2、Bax和Caspase-3免疫组化染色的情况。(n＝20，*p<0.05与对照组比较，#p<0.05与模型组比较)

如图5所示，与对照组相比，模型组的Bax和Caspase-3表达水平明显升高，Bcl-2表达水平明显降低(p<0.05)。右美组的Bax和Caspase-3表达水平显著降低(p<0.05)；Bcl-2表达水平显著升高(p<0.05)；模型组和育亨宾组比较没有显著差异。

6、各组间miR-34a、SIRT1 mRNA的表达差异

图6各组间miR-34a的表达差异(n＝20，*p<0.05与对照组比较；#p<0.05与模型组比较)如图6所示，可见在模型组大鼠，miR-34a表达上调，而DEX抑制了miR-34a的表达。

图7各组间SIRT1 mRNA的表达差异(n＝20，*p<0.05与对照组比较；#p<0.05与模型组比较)

如图7所示，可见在DPN大鼠，SIRT1 mRNA表达下调，而DEX引起了SIRT1 mRNA表达的上调。

7、Western-blot检测

Western-blot检测蛋白发现，SIRT1、Bcl-2蛋白表达在DPN组下降，但是右美托咪定治疗组表达增加，差异有显著性。Bax、Caspase-3的表达在DPN组升高，但是在右美托咪定治疗组下降，两组比较有显著性差异。

图8各组间Bax，Bcl-2，Caspase-3SIRT1 western染色的情况

8、TUNEL染色细胞凋亡在各组间的情况

图9各组间TUNEL细胞凋亡的情况

从图9可见，模型组的细胞凋亡增多，而应用右美托咪定治疗后细胞凋亡的情况得到改善，而育亨宾组细胞凋亡的情况与模型组相似。

结论：

右美托咪定可以通过与miR-34a结合，靶向上调SIRT1，从而下调Bax和caspase-3的表达、上调Bcl-2的表达，进而抑制糖尿病周围神经病变。

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