用于制备治疗病毒性肺炎的山豆根黄酮类药物组合物

摘要

本发明公开了一种药物组合物，包括：山豆根黄酮类提取物100份、黄岑甙5‑10份、黄藤素5‑10份、栀子苷5‑10份。本发明还公开了此药物组合物在制备治疗病毒性肺炎药物中的用途，本发明的药物组合物一方面可抑制炎性因子TNF‑α和IL‑6的分泌，另一方面可促进抗病毒因子IFN‑γ的分泌，最终减少炎症损伤，减轻病毒感染导致的肺组织损伤，当药物组合物的添加量不低于5mg/kg·d时，治疗效果较好，为病毒性肺炎的治疗提供了一种新思路。

说明书

技术领域

本发明涉及药物制备领域。更具体地说，本发明涉及一种用于制备治疗病毒性肺炎的山豆根黄酮类药物组合物。

背景技术

病毒性肺炎是上呼吸道感染病毒后，向下蔓延至下呼吸道，直至支气管、肺部的炎症。引起病毒性肺炎的主要病毒包括病毒性肺炎病毒、呼吸道合胞病毒副病毒性肺炎病毒等，现有技术中长期使用抗生素进行治疗，但容易引起副作用或继发其他病疾如水痘、麻疹病毒性肺炎等。目前，病毒性肺炎始终是一种难治的急危重病，因此，亟需一种能有效治疗病毒性肺炎的药物。

发明内容

本发明的一个目的是解决至少上述问题，并提供一种用于制备治疗病毒性肺炎的山豆根黄酮类药物组合物，其一方面抑制炎性因子TNF-α和IL-6的分泌，另一方面可促进抗病毒因子IFN-γ的分泌，最终减少炎症损伤，减轻病毒感染导致的肺组织损伤，治疗效果好。

为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种药物组合物，包括如下重量份的组分：

山豆根黄酮类提取物100份、黄岑甙5-10份、黄藤素5-10份、栀子苷5-10份。

优选的是，所述山豆根黄酮类提取物的制备如下：

S1、取山豆根片粉碎过20-40目筛后用体积分数为65％的乙醇浸泡18-24h，抽滤后取抽滤渣在85-90℃下干燥12-24h，得山豆根粉；

S2、向提取溶剂中依次加入山豆根粉、酶，搅拌均匀，于30-40℃下反应30-45min后过滤，得酶解液和酶解渣；所述山豆根粉、所述酶、所述提取溶剂的重量比为100：1-1.5：400-500，所述酶为纤维素酶或果胶酶；

S3、将S2中的酶解渣置于提取溶剂中，在150W、40℃下超声15-20min后过滤，反复提取至少两次，合并滤液以及S2中的酶解液，得到总提取液，再将总提取液在4000r/min下离心10min，取上清液；每次超声提取过程中，料液比为0.05-0.06g/mL；

S4、将S3中的上清液过0.45μm滤膜，洗脱，洗脱液旋蒸浓缩，得山豆根黄酮类提取物。

优选的是，所述提取溶剂的制备过程为，取摩尔比分别为1：1的氯化胆碱、乙二醇，搅拌混合均匀，于75℃水浴下加热搅拌至溶液清澈，冷却至室温，得混合液；将混合液溶于去离子水中，得提取溶剂；所述混合液与所述去离子水的体积为5：1。

优选的是，所述黄岑甙、所述黄藤素、所述栀子苷的重量比为4：4：3。

药物组合物在制备治疗病毒性肺炎药物中的应用。

优选的是，其剂型为注射剂、颗粒剂或片剂。

优选的是，所述药物组合物的给药剂量为不低于5mg/kg·d。

本发明至少包括以下有益效果：

第一、本发明首先将山豆根脱脂，避免山豆根中的脂肪影响后续的黄酮类化合物的提取；将山豆根粉进行酶解，可破坏细胞壁，使有效成分逸出更多；超声辅助提取时，超声波促使黄酮类化合物更多地分散在复合溶剂中，增大接触面积，进一步使黄酮类化合物逸出；采用氯化胆碱和乙二醇制备的复合提取溶剂黏度小、流动性好、扩散率大，其在样品孔隙中能更好地渗透，提取出更多的黄酮类化合物；整体上可提高山豆根黄酮类化合物的提取效率。

第二、本发明中山豆根黄酮类提取物具有治疗病毒性肺炎的疗效，黄岑甙具有抗炎、抗变态反应作用，黄藤素具有抗炎、清热解毒等功效，栀子苷具有清热缓燥止痛的效果，四者结合制备治疗病毒性肺炎的药物，一方面抑制炎性因子TNF-α和IL-6的分泌，另一方面可促进抗病毒因子IFN-γ的分泌，最终减少炎症损伤，减轻病毒感染导致的肺组织损伤，当受试药物的添加量不低于5mg/kg·d时，治疗效果较好，为病毒性肺炎的治疗提供了一种新思路。

本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。

<实施例1>

药物组合物，包括：山豆根黄酮类提取物100份、黄岑甙5份、黄藤素5份、栀子苷5份；

其中，山豆根黄酮类提取物采用常规回流提取法，制备如下：

称取山豆根粉末5g，加入80mL 70％乙醇，加热回流提取2h后过滤，取滤液即得提取液；将所述提取液过0.45μm滤膜，洗脱，洗脱液旋蒸浓缩，得山豆根黄酮类提取物；洗脱过程具体为，使用预处理后的D101大孔树脂上样，吸附平衡后，先去离子水洗脱再用90％乙醇洗脱，得洗脱液后于45℃旋蒸再进行浓缩；树脂床体积、所述去离子水、所述90％乙醇的体积比为1：3：8；

注射液制备：按山豆根黄酮类提取物：黄岑甙：黄藤素：栀子苷为100：5：5：5的重量份比称取各组分，总计重量为5g，加注射用水200mL进行搅拌溶解后用10％NaOH调节pH至7.5，搅拌均匀后添加0.1g活性炭，搅拌均匀，于90-100℃下保温30min后过滤，得到滤液，向滤液中添加0.5g Na

<实施例2>

药物组合物，包括：山豆根黄酮类提取物100份、黄岑甙10份、黄藤素10份、栀子苷10份；

其中，山豆根黄酮类提取物采用超声提取法，制备如下：

称取山豆根粉5g，置于超声仪中，加入80mL 70％乙醇，超声提取30min后过滤，取滤液即为提取液；将所述提取液过0.45μm滤膜，洗脱，洗脱液旋蒸浓缩，得山豆根黄酮类提取物；洗脱过程具体为，使用预处理后的D101大孔树脂上样，吸附平衡后，先去离子水洗脱再用90％乙醇洗脱，得洗脱液后于45℃旋蒸再进行浓缩；树脂床体积、所述去离子水、所述90％乙醇的体积比为1：3：8；

注射液制备：按山豆根黄酮类提取物：黄岑甙：黄藤素：栀子苷为100：10：10：10的重量份比称取各组分，总计重量为5g，加注射用水200mL进行搅拌溶解后用10％NaOH调节pH至7.5，搅拌均匀后添加0.1g活性炭，搅拌均匀，于90-100℃下保温30min后过滤，得到滤液，向滤液中添加0.5g Na

<实施例3>

药物组合物，包括：山豆根黄酮类提取物100份、黄岑甙8份、黄藤素8份、栀子苷6份；

其中，山豆根黄酮类提取物制备如下：

S1、取山豆根片粉碎过40目筛后用体积分数为65％的乙醇浸泡20h，抽滤后取抽滤渣在90℃下干燥18h，得山豆根粉；

S2、向提取溶剂中依次加入山豆根粉、酶，搅拌均匀，于35℃下反应40min后过滤，得酶解液和酶解渣；所述山豆根粉、所述酶、所述提取溶剂的重量比为100：1.2：450，所述酶为纤维素酶或果胶酶；所述提取溶剂为体积分数为70％的乙醇；

S3、将S2中的酶解渣置于提取溶剂中，在150W、40℃下超声20min后过滤，反复提取三次，合并滤液以及S2中的酶解液，得到总提取液，再将总提取液在4000r/min下离心10min，取上清液；每次超声提取过程中，料液比为0.055g/mL；

S4、将S3中的上清液过0.45μm滤膜，洗脱，洗脱液旋蒸浓缩，得山豆根黄酮类提取物；具体地，洗脱过程为，使用预处理后的D101大孔树脂上样，吸附平衡后，先去离子水洗脱再用90％乙醇洗脱，得洗脱液后于45℃旋蒸再进行浓缩；树脂床体积、所述去离子水、所述90％乙醇的体积比为1：3：8；

注射液制备：按山豆根黄酮类提取物：黄岑甙：黄藤素：栀子苷为100：8：8：6的重量份比称取各组分，总计重量为5g，加注射用水200mL进行搅拌溶解后用10％NaOH调节pH至7.5，搅拌均匀后添加0.1g活性炭，搅拌均匀，于90-100℃下保温30min后过滤，得到滤液，向滤液中添加0.5g Na

<实施例4>

药物组合物，包括：山豆根黄酮类提取物100份、黄岑甙8份、黄藤素8份、栀子苷6份；

其中，山豆根黄酮类提取物制备如下：

S1、取山豆根片粉碎过40目筛后用体积分数为65％的乙醇浸泡20h，抽滤后取抽滤渣在90℃下干燥18h，得山豆根粉；

S2、向提取溶剂中依次加入山豆根粉、酶，搅拌均匀，于35℃下反应40min后过滤，得酶解液和酶解渣；所述山豆根粉、所述酶、所述提取溶剂的重量比为100：1.2：450，所述酶为纤维素酶或果胶酶；所述提取溶剂的制备过程为，取摩尔比分别为1：1的氯化胆碱、乙二醇，搅拌混合均匀，于75℃水浴下加热搅拌至溶液清澈，冷却至室温，得混合液；将混合液溶于去离子水中，得提取溶剂；所述混合液与所述去离子水的体积为5：1；

S3、将S2中的酶解渣置于提取溶剂中，在150W、40℃下超声20min后过滤，反复提取三次，合并滤液以及S2中的酶解液，得到总提取液，再将总提取液在4000r/min下离心10min，取上清液；每次超声提取过程中，料液比为0.055g/mL；

S4、将S3中的上清液过0.45μm滤膜，洗脱，洗脱液旋蒸浓缩，得山豆根黄酮类提取物；具体地，洗脱过程为，使用预处理后的D101大孔树脂上样，吸附平衡后，先去离子水洗脱再用90％乙醇洗脱，得洗脱液后于45℃旋蒸再进行浓缩；树脂床体积、所述去离子水、所述90％乙醇的体积比为1：3：8；

注射液制备：按山豆根黄酮类提取物：黄岑甙：黄藤素：栀子苷为100：8：8：6的重量份比称取各组分，总计重量为5g，加注射用水200mL进行搅拌溶解后用10％NaOH调节pH至7.5，搅拌均匀后添加0.1g活性炭，搅拌均匀，于90-100℃下保温30min后过滤，得到滤液，向滤液中添加0.5g Na

<实施例5>

药物组合物，包括：山豆根黄酮类提取物100份、黄岑甙8份、黄藤素8份、栀子苷6份；

其中，山豆根黄酮类提取物制备：同实施例4；

颗粒药物的制备：按山豆根黄酮类提取物：黄岑甙：黄藤素：栀子苷为100：8：8：6的重量份比称取各组分，加入无菌水溶解，喷雾干燥后即得颗粒剂药物。

<实施例6>

药物组合物，包括：山豆根黄酮类提取物100份、黄岑甙8份、黄藤素8份、栀子苷6份；

其中，山豆根黄酮类提取物制备：同实施例4；

片剂药物的制备：按山豆根黄酮类提取物：黄岑甙：黄藤素：栀子苷为100：8：8：6的重量份比称取各组分，总计重量为100g，添加医用面粉浆25g、淀粉125g、医用滑石粉5g，混合均匀后压片，制成片剂。

<山豆根黄酮类提取物得率测定>

试验方法：

1、芦丁曲线的制备：

芦丁标准溶液(0.2mg/mL)：精密称取芦丁对照品(120℃干燥至恒重)10.0mg，加适量70％乙醇溶解，转移至50mL容量瓶，用70％乙醇定容至刻度，摇匀，备用；

标准曲线的绘制：

分别取芦丁标准溶液0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0mL于10mL容量瓶中，用70％乙醇补至4.0mL，加入0.3mL 5％亚硝酸钠，摇匀，放置6min，加0.3mL10％硝酸铝，摇匀，放置6min，加4.0mL的4％NaOH溶液，加70％乙醇水溶液至刻度，摇匀，放置15min进行显色，显色后用紫外可见分光光度计在510nm处测定吸光度，以体积分数70％的乙醇水溶液为空白对照校正零点，以吸光度为纵坐标，芦丁质量浓度为横坐标，绘制芦丁标准曲线；

样品吸光度的测定：

取1.0mL样品置于10mL容量瓶中，加入0.3mL 5％亚硝酸钠，摇匀，放置6min，加0.3mL10％硝酸铝，摇匀，放置6min，加4.0mL的4％NaOH溶液，加70％乙醇水溶液至刻度，摇匀，放置15min进行显色，显色后用紫外可见分光光度计在510nm处测定吸光度。则：

总黄酮得率(％)＝100％×(X×V)/(v×M×1000)

X：从标准曲线上得出的芦丁质量(mg)；

v：吸取待测液体的体积(mL)；

V：提取液/上清液的总体积(mL)；

M：山豆根粉质量(g)

试验样本：取实施例1-实施例2中的提取液，实施例3-实施例4中S3步骤中的上清液进行测定，每个实施例测定三次，取平均值；

结果：实施例1中山豆根黄酮类提取物得率为0.54％，实施例2中山豆根黄酮类提取物得率为0.63％，实施例3中山豆根黄酮类提取物得率为0.93％，实施例4中山豆根黄酮类提取物得率为3.84％，从上述结果中可以看出，将酶法和超声结合起来提取山豆根黄酮可提高山豆根黄酮的得率，利用氯化胆碱与乙二醇组成的提取溶剂，可显著提高山豆根黄酮的得率；这主要是因为，将山豆根脱脂，可避免山豆根中的脂肪影响后续的黄酮类化合物的提取；将山豆根粉进行酶解，可破坏细胞壁，使有效成分逸出更多；超声辅助提取时，超声波促使黄酮类化合物更多地分散在复合溶剂中，增大接触面积，进一步使黄酮类化合物逸出；采用氯化胆碱和乙二醇制备的复合提取溶剂黏度小、流动性好、扩散率大，其在样品孔隙中能更好地渗透，提取出更多的黄酮类化合物。

<药物毒性试验>

试验小鼠：C57BL/6小鼠，SPF级，体重13-16g，雌雄各半；

分组：将试验小鼠按雌雄对等比例随机分成5组，每组10只，其中一组为空白组，另外分别为第一组、第二组、第三组、第四组；试验前禁食12h，只供水；

受试溶液：按照配比取药物组合物中各组分溶于无菌水中，得受试溶液，按需配制；

给药：空白组灌胃无菌生理盐水0.3mL，第一组灌胃同体积的药物溶液5mg/kg，第二组灌胃同体积的药物溶液50mg/kg，第三组灌胃同体积的药物溶液250mg/kg，第四组灌胃同体积的药物溶液500mg/kg，一次性灌胃；

结果观察：给药后连续观察14天，每天上午、下午各观察一次，记录每组试验鼠的存活率，具体结果见表1；

表1一次性灌胃后试验小鼠存活率统计

结果分析：连续观察14天后，空白组、第一组、第二组试验小鼠均未出现死亡，第三组存活率90％，第四组存活率60％，说明在施加剂量不超过50mg/kg时药物相对安全、无毒。

1、H1N1肺炎小鼠模型的建立

试验小鼠：C57BL/6小鼠，SPF级，体重13-16g，雌雄各半；

病毒：甲型流感病毒A/PR/8/34(H1N1)；

受试溶液：按照配比取本发明中药物组合物中各组分溶于无菌水中，得受试溶液；按需配制；

奥司他韦药物溶液：使用磷酸奥司他韦胶囊；去胶囊壳，内容物用无菌水溶解，按需配制成奥司他韦药物溶液；磷酸奥司他韦胶囊为常用的抗病毒药物；

分组及造模：用随机区组法将C57BL/6小鼠分为阳性对照组、模型组、药物组(共三组，施加剂量分别为1mg/kg、mg/kg、15mg/kg)、奥司他韦组(2.5mg/kg)，每组12只；除正常组以外，其余各组小鼠在乙醚浅麻醉后，以H1N1流感病毒尿囊液(LD

给药：每日一次，正常组和模型组每日以无菌生理盐水灌胃0.3mL，药物组中分别给予同体积的受试溶液1mg/kg、5mg/kg、10mg/kg，奥司他韦组每日给予同体积的奥司他韦药物溶液2.5mg/kg，连续给药5天，各组小鼠于末次给药2h后称重，摘眼球取血，脱颈处死，保留肺组织；

小鼠血清样品制作：小鼠摘眼球取血置于离心管中，冰上静置2h后于4℃、4000r/min下离心10min，取上清液，即为血清样品；

小鼠肺匀浆样品制作：取脱颈处死的小鼠右中肺，加9倍无菌生理盐水后在冰上充分研磨制作成匀浆，将匀浆在4℃、2500r/min下离心20min，取上清液，即为肺匀浆样品；

肺指数测定：小鼠处死前称重并记录。放血处死动物后，打开胸腔摘取全肺，用生理盐水洗涤2次，摘除器官及肺门淋巴组织，置于滤纸上控干水分后，用分析天平精密称定；

肺指数＝100％×肺重/体重，检测结果见表2；

TNF-α、IL-6、IFN-γ检测：采用双抗体夹心ABC-ELISA法，按照试剂盒说明书分别测定小鼠血清样品和小鼠肺匀浆样品中TNF-α、IL-6、IFN-γ蛋白的含量，检测结果见表2。

表2各试验组中小鼠相关指标对比表

小鼠肺指数反应被病毒感染小鼠肺实变程度，肺指数越大，表示肺重量相对大，肺病理程度严重，从表2中可以看出，感染模型组肺指数最高，说明感染H1N1甲流病毒后，试验小鼠肺变程度大；连续给药5天后，药物组、奥司他韦组的肺指数明显优于模型组，药物组中施加5mg/kg、15mg/kg剂量的试验小鼠的肺指数与正常组和奥司他韦组接近；试验小鼠在感染了甲流病毒后，相较正常组的试验小鼠来说，模型组的试验小鼠的血清和肺匀浆中的TNF-α和IL-6均显著提高，IFN-γ含量显著降低，在连续给药5天后，药物组中施加5mg/kg、15mg/kg剂量的试验小鼠的血清和肺匀浆中的TNF-α和IL-6相较模型组的显著下降，IFN-γ含量相对有所提高，且与正常组和奥司他韦组接近；施加了本发明的受试药物后，受试药物一方面对炎性因子TNF-α和IL-6的分泌有抑制作用，另一方面可促进抗病毒因子IFN-γ的分泌；TNF-α、IL-6具有促炎活性和免疫调节作用，同时TNF-α、IL-6又是内源性的致热源，可作用与体温调节中暑引起发热症状，还可刺激内皮细胞和白细胞释放一系列炎性介质，从而导致肺组织损伤；IFN-γ作为抗病毒因子，以免疫调节作用为主，IFN-γ的分泌增加有助于抗病毒；整体上施加本发明的受试药物后，通过降低TNF-α和IL-6炎性因子的表达，减少了局部和全身的炎症损伤，可减轻甲流病毒感染导致的肺组织损伤，当受试药物的添加量不低于5mg/kg·d时，治疗效果较好。

<冠状病毒肺炎小鼠试验>

1、冠状病毒肺炎小鼠模型的建立

试验小鼠：C57BL/6小鼠，SPF级，体重13-16g，雌雄各半；

病毒：冠状病毒(HcoV-OC43)；

受试溶液：按照配比取本发明中药物组合物中各组分溶于无菌水中，得药物溶液；

奥司他韦药物溶液：使用磷酸奥司他韦胶囊；去胶囊壳，内容物用无菌水溶解，按需配制成奥司他韦药物溶液；磷酸奥司他韦胶囊为常用的抗病毒药物；

分组及造模：用随机区组法将C57BL/6小鼠分为正常组、模型组、药物组，每组12只；除正常组以外，其余各组小鼠在乙醚浅麻醉后，经滴注鼻腔感染HcoV-OC43冠状病毒毒株，每鼠30μL，正常组采用同法滴入等体积无菌生理盐水，感染后1h灌胃；

给药：每日一次，正常组和模型组每日以无菌生理盐水灌胃0.3mL，药物组中分别给予同体积的受试溶液1mg/kg、5mg/kg、10mg/kg，奥司他韦组每日给予同体积的奥司他韦药物溶液2.5mg/kg，连续给药5天，各组小鼠于末次给药2h后称重，摘眼球取血，脱颈处死，保留肺组织；

小鼠血清样品制作：小鼠摘眼球取血置于离心管中，冰上静置2h后于4℃、4000r/min下离心10min，取上清液，即为血清样品；

小鼠肺匀浆样品制作：取脱颈处死的小鼠右中肺，加9倍无菌生理盐水后在冰上充分研磨制作成匀浆，将匀浆在4℃、2500r/min下离心20min，取上清液，即为肺匀浆样品；

肺指数测定：小鼠处死前称重并记录。放血处死动物后，打开胸腔摘取全肺，用生理盐水洗涤2次，摘除器官及肺门淋巴组织，置于滤纸上控干水分后，用分析天平精密称定；

肺指数＝100％×肺重/体重，检测结果见表3；

TNF-α、IL-6、IFN-γ检测：采用双抗体夹心ABC-ELISA法，按照试剂盒说明书分别测定小鼠血清样品和小鼠肺匀浆样品中TNF-α、IL-6、IFN-γ蛋白的含量，检测结果见表3。

表3各试验组中小鼠相关指标对比表

从表3中可以看出，感染模型组肺指数最高，说明感染冠状病毒后，试验小鼠肺变程度大，连续给药5天后，药物组、奥司他韦组的肺指数明显优于模型组，药物组中施加5mg/kg、15mg/kg剂量的试验小鼠的肺指数与正常组和奥司他韦组接近；试验小鼠在感染了冠状病毒后，相较正常组的试验小鼠来说，模型组的试验小鼠的血清和肺匀浆中的TNF-α和IL-6均显著提高，IFN-γ含量显著降低，在连续给药5天后，药物组中施加5mg/kg、15mg/kg剂量的试验小鼠的血清和肺匀浆中的TNF-α和IL-6相较模型组的显著下降，IFN-γ含量相对有所提高，且与正常组和奥司他韦组接近，说明施加药物后，药物一方面对炎性因子TNF-α和IL-6的分泌有抑制作用，另一方面可促进抗病毒因子IFN-γ分泌；整体上施加本发明的药物后，通过降低TNF-α和IL-6炎性因子的表达，减少了局部和全身的炎症损伤，可减轻冠状病毒感染导致的肺组织损伤，当受试药物的添加量不低于5mg/kg·d时，治疗效果较好。

整体上来说，本发明中的药物组合物，一方面抑制炎性因子TNF-α和IL-6的分泌，另一方面可促进抗病毒因子IFN-γ的分泌，最终减少炎症损伤，减轻病毒感染导致的肺组织损伤，当受试药物的添加量不低于5mg/kg·d时，治疗效果较好，为病毒性肺炎的治疗提供了一种新思路。

尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的实施例。