一种用于牛病毒性腹泻的RNA疫苗及其构建方法

摘要

本发明属于RNA疫苗的技术领域，具体涉及一种用于牛病毒性腹泻的RNA疫苗及其构建方法。所述RNA疫苗为采用包括5’UTR、牛病毒性腹泻病毒的E2蛋白、终止密码子、3’UTR以及polyA核酸的序列构成；采用脂质纳米颗粒包裹的RNA疫苗能够快速应对当前流行野毒株的BVDV新毒株，尤其是变异强毒株，所述纳米脂质颗粒包括BHEM‑Chol、PEG5k‑b‑PLGA11k、PLGA11k聚合物的混合物；本发明制备的牛病毒性腹泻病毒RNA疫苗减少了新疫苗开发的研发及生产周期，为防控BVDV的爆发提供有效的技术手段；所述RNA疫苗可做到无细胞生产、且生产时无需导入有毒化学品，RNA疫苗的安全性较高。

说明书

技术领域

本发明属于RNA疫苗的技术领域，具体涉及一种用于牛病毒性腹泻的RNA疫苗及其构建方法。

背景技术

牛病毒性腹泻粘膜病有牛病毒性腹泻黏膜病病毒(BVDV)引起，该病普遍存在于世界各地的牛群中，牛病毒性腹泻病毒主要侵害牛，尤其是犊牛，引起以腹泻(急性感染症状)和黏膜病(慢性持续性感染症状)为临床特征的疾病，给养牛业带来的主要影响有腹泻、黏膜病、持续感染、免疫抑制等，并伴随严重的经济损失。1968年，科学家正式将由BVDV引起的疾病被命名为牛病毒性腹泻-黏膜病(Bovine viral diarrhea-Mucosal disease，BVD/MD)。BVDV除感染牛外，还可感染牛、鹿、羊、骆驼及其他野生动物，宿主相当广泛。既能水平传播也能垂直传播，公牛精液也有病毒存在，感染病毒的怀孕母牛以消化道溃疡为特征。世界动物卫生组织将BVD/MD列为必须上报疫病之一，我国进出口检疫定为二类传染病。我国上个世纪80年代报道分离到该病毒，随着我国养牛数量的增加和饲养方式的转变，我国养牛业受该病威胁增大。

BVDV属于黄病毒科瘟病毒属，含有单股正链RNA。BVDV分为2个基因型，分别为BVDV1和BVDV2，在抗原性上BVDV1和BVDV2有所不同，BVDV1型疫苗可诱导针对BVDV2型病毒的抗体，但抗体滴度要比同源病毒抗体滴度平均低1个log值。BVDV基因组上的大开放阅读框编码所有的病毒蛋白，它本身翻译为一个包含所有病毒蛋白的蛋白多聚体，其蛋白顺序为：N

牛病毒性腹泻粘膜病是全球性传染病，具有较高的感染率，我国二十几个省市自治区均存在本病，且在各易感动物群中的感染已呈日益扩大趋势，结合BVDV的毒株有高度的变异性及流行毒株的多样性的情况，使得很多市场上的疫苗失去保护效果，加大了防控的难度。临床上急需能够快速应对当前流行野毒株的BVDV新毒株疫苗。

现有疫苗的制备技术主要为弱毒苗、灭活苗。我国学者制备BVD弱毒冻干苗，选用Oregon C24V标准毒株作为毒株，但其副作用较大及成本较高等因素均未能投入生产。BVDV致病机理复杂，目前国内批准了相应的疫苗和药物，农业部公告第2411号(2016.06.01)和第2422号(2016.07.14)分别批准了牛病毒性腹泻黏膜病(1型)灭活疫苗(NM01株)和牛病毒性腹泻黏膜病-传染性鼻气管炎二联灭活疫苗(NMG株+LY株)。

随着基因工程技术和分子生物学技术的发展，人们开始把注意力转移到亚单位疫苗(E2蛋白)、活载体疫苗(禽痘病毒、水疱性口炎病毒、牛3型腺病毒和牛疱疹病毒Ⅰ型中的一种新型疫苗)及核酸疫苗等新型基因工程疫苗上。核酸疫苗是目前疫苗研究的新趋势并且具有许多优点。近年来，BVDV-E2基因疫苗是BVDV疫苗的研究的一个热门。

发明内容

针对上述问题，本发明的目的在于提供一种用于牛病毒性腹泻的RNA疫苗及其构建方法，选取牛源的5’UTR、3’UTR与毒株的E2蛋白、终止密码子、polyA核酸序列串联，得到RNA疫苗，采用脂质纳米颗粒作为RNA疫苗的运送载体，所制备的脂质纳米颗粒包裹RNA疫苗能够快速应对当前流行野毒株的BVDV新毒株。

本发明的技术内容如下：

本发明提供了一种用于牛病毒性腹泻的RNA疫苗，所述RNA疫苗为采用包括5’UTR、牛病毒性腹泻病毒的E2蛋白、终止密码子、3’UTR以及polyA核酸的序列构成；

所述疫苗还包括纳米脂质颗粒，所述纳米脂质颗粒包裹RNA疫苗，所述纳米脂质颗粒包括BHEM-Chol、PEG

所述5’UTR、3’UTR的序列选取自牛源的牛血红蛋白或牛白蛋白，所选序列的同源性在50％～100％。

所述5’UTR、3’UTR分别选自七组不同的牛血红蛋白或牛血清白蛋白，其核酸序列分别为序列表SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14所示的七组；

所述5’UTR、3’UTR的七组序列选自GenBank中NCBI参考序列NM_001077422.3、NM_173917.2、NM_001014902.4、NM_001083768.2、NM_001110507.1、XM_024975648.1、NM_180992.2；

所述牛病毒性腹泻病毒的E2蛋白，其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.15所示，其核酸序列如序列表SEQ ID NO.16所示；

所述RNA疫苗的核酸序列包括如序列表SEQ ID NO.17～23所示；

所述所述终止密码子，为TGA、TAA、TAG的自由组合，个数为1-10个；

所述polyA中的碱基A的个数为1-200个。

本发明还提供了一种用于牛病毒性腹泻的RNA疫苗的构建方法，包括如下步骤：

选取5’UTR、3’UTR、E2蛋白、终止密码子、polyA核酸序列合成RNA疫苗的核酸序列构建于载体上，转染到细菌得到重组菌，将重组菌进行质粒提取得到重组质粒，将重组质粒进行酶切、转录、纯化得到RNA疫苗核酸，所述RNA疫苗的核酸序列如序列表SEQ ID NO.17～23所示；

所述RNA疫苗包括由脂质纳米颗粒载体包裹，所述脂质纳米颗粒的制备原料包括聚合物PEG

所述脂质纳米颗粒包裹RNA疫苗的操作为：将RNA疫苗核酸溶液与BHEM-Chol、PEG

所述RNA疫苗核酸溶液为RNA疫苗核酸使用无核酸酶水溶解得到；

所述BHEM-Chol、PEG

本发明的有益效果如下：

本发明的用于牛病毒性腹泻的RNA疫苗，能够高效迅速地针对当下流行野毒株的BVDV新毒株，所得RNA疫苗成本低、生产效率高，且能同时诱导细胞免疫与体液免疫，所制备的脂质纳米颗粒包裹RNA疫苗能够快速应对当前流行野毒株的BVDV新毒株，尤其是变异强毒株，减少了新疫苗开发的研发及生产周期，为防控BVDV的爆发提供有效的技术手段；

本发明的用于牛病毒性腹泻的RNA疫苗的构建，选取牛源的5’UTR、3’UTR与毒株的E2蛋白、终止密码子、polyA核酸序列串联，得到RNA疫苗，采用脂质纳米颗粒作为RNA疫苗的运送载体，且脂质纳米颗粒包裹RNA疫苗的使用能够高效表达，利用了纳米脂质体作为载体进行递送，脂质纳米颗粒具有核酸包封率高，能够有效转染，组织穿透性增强，细胞毒性和免疫原性低等特点，所述RNA疫苗可做到无细胞生产、且生产时无需导入有毒化学品，受微生物污染的机会也相对较低，RNA疫苗的安全性相对较高。

附图说明

图1为转录纯化后的RNA疫苗的凝胶电泳图；

图2为脂质体颗粒包裹RNA疫苗的体外表达试验SDS-PAGE以及Western blot结果图；

图3为脂质体颗粒包裹RNA疫苗的抗体水平检测结果图；

图4为脂质体颗粒包裹RNA疫苗中和抗体滴度的测定结果图。

具体实施方式

以下通过具体的实施案例以及附图说明对本发明作进一步详细的描述，应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落于本申请所附权利要求所限定。

若无特殊说明，本发明的所有原料和试剂均为常规市场的原料、试剂。

实施例

一种用于牛病毒性腹泻的RNA疫苗及其构建：

1)重组菌构建：

选取5’UTR、3’UTR、E2蛋白(BVDV(1型)中的Oregon C24V经典毒株E2蛋白(GenBank：L07496.1))、终止密码子、polyA核酸序列进行人工合成RNA疫苗的DNA于pUC57载体上，无缝克隆于pUC57的EcoRV酶切位点，并转化大肠杆菌DH5α，获得BVDV-E2-pUC57-DH5α；

所述E2蛋白可选用来自BVDV(2型)的，也可以是E2蛋白中的一段氨基酸序列或具有50-100％同源性的氨基酸序列，操作与上相同，在此不作重复赘述；

2)重组质粒

将获得的重组菌进行摇菌，按照常规方法提取质粒，参照质粒抽提试剂盒(

取菌液于1.5mL Ep管中12000r/min离心30s，弃上清；

加250μL溶液Ⅰ/RNase A，充分重悬菌泥；

加250μL溶液Ⅱ，颠倒4～6次混匀，室温作用2min至溶液变成澄清；

加350μL溶液Ⅲ，颠倒4～6次混匀以形成白色沉淀，12000r/min离心10min；

转移上清至DNA吸附柱中，室温静置2min，12000r/min离心1min，弃液；

加入500μL的Buffer HB，12000r/min离心1min，弃液；

加入750μL的DNA Wash Buffer，12000r/min离心1min，弃液；

重复该步骤一次，再空管12000r/min离心1min；

移至新的1.5mLEp管中，加入50～100μL的TE室温下放置2min，12000r/min离心1min，洗脱的质粒于-20℃保存备用，取少量于1.0％琼脂糖凝胶中低压电泳检测质粒效果。

3)酶切线性化、纯化

对重组质粒进行QuickCut MluI酶切，酶切反应体系见表1，如下：

表1酶切反应体系

将上述成分加入0.5mL的EP管中，混匀，37℃酶切15min。纯化试剂盒进行纯化回收线性化重组质粒。

根据OMEGA公司的Cycle-pure纯化试剂盒使用说明书，线性化质粒进行纯化回收，方法如下：

(1)将线性化质粒收集在一个1.5ml的EP管中；

(2)加入6倍体积的Buffer CP于装有PCR产物的EP管中，小心混匀；

(3)将上述混合液全部加至试剂盒配的有滤膜的管HiBind spin-column中，10000r/min离心1min，弃去离心出来的溶液；

(4)加入700μLSPW Buffer，等待2～3min，10000r/min离心1min，弃去离心出来的溶液；

(5)重复步骤(4)；

(6)空管10000r/min离心1min；

(8)弃去下面的离心管，将柱子放入新的干净的1.5mL离心管中，在柱子中央加入50μL DNA Elution Buffer，室温下放置2min，10000r/min离心1min，收集离心管中的液体即为回收的DNA片段，经琼脂糖凝胶电泳检测后即用或-20℃冰箱保存备用。提高洗脱液的温度至55℃～80℃，有利于提高DNA的洗脱效率。

4)体外转录

采用体外转录试剂盒(mMESSAGE mMACHINE

5)纯化

采用纯化试剂盒(MEGA clear

取来自牛血红蛋白或牛血清白蛋白的参考序列NM_001077422.3、NM_173917.2、NM_001014902.4、NM_001083768.2、NM_001110507.1、XM_024975648.1、NM_180992.2序列的非翻译区的七组5’UTR、3’UTR，按照以上5个步骤制备成RNA疫苗核酸，纯化之后的RNA疫苗核酸进行1％琼脂凝胶电泳鉴定，如图1所示。

6)脂质纳米颗粒的制备

6.1)将-80℃冰箱保存的聚合物PEG

6.2)将-80℃冰箱保存的mRNA溶液在冰上融化，使用无核酸酶水(DEPC水)调整其浓度为4mg/mL，在50mL无菌离心管中，依次加入25μL mRNA(0.1mg)，100μL BHEM-Chol(2mg)，350μL PEG

6.3)将该离心管置于冰水中，超声探头用DEPC水冲洗后放入离心管的溶液中，在80W功率和冰水浴条件下，以超声5s停2s的方式超声乳化溶液60s，得到油相-水相的初乳液。随后，将5mLDEPC水沿管壁加入到初乳液中，并在同样条件下，以超声10s停2s的方式再次乳化60s，形成水相-油相-水相的复乳液；

6.4)将复乳液转移到DEPC处理并高压过的无菌无核酸酶100mL圆底烧瓶中，使用旋转蒸发仪在低温条件下缓慢地减压旋蒸以除去乳液中的三氯甲烷，并浓缩其水溶液体积到1mL左右，制备好的脂质纳米颗粒包裹的mRNA转移到1.5mL EP管中保存于4C冰箱中待用。

7)检测细胞转染后的BVDV-E2-mRNA脂质体表达情况：

1、取24孔板，接种PK-15细胞(200000个细胞/孔)，采用含10％血清无抗培养基培养18小时；

2、当细胞贴壁融合度约达60％时，在转染前一小时更换为无血清的Opti-MEM培养基，转染脂质纳米颗粒BVDV-E2-mRNA(1μg RNA/孔)，培养6小时；

3、将培养基替换为新鲜的培养基，培养42小时。

4、1000g离心10min，收集上清液。

取上清液，进行非还原型SDS-PAGE，然后进行Western blot。Western blot采用的一抗为抗E2蛋白的鼠源单克隆抗体，二抗为抗鼠源抗体。

如图2所示，表明脂质纳米颗粒BVDV-E2-mRNA能够在PK-15细胞上高效表达，本发明所制备的用于牛病毒性腹泻的RNA疫苗具有良好的应用前景。

8)BVDV-S-mRNA疫苗免疫小鼠及其抗体的测定

将6-8周龄雄性BALB/c小鼠随机分为5组(每组5只)：BVDV-E2-mRNA1组、BVDV-E2-mRNA2组、BVDV-E2-mRNA3组、BVDV-E2-mRNA4组、BVDV-E2-mRNA5组、BVDV-E2-mRNA6组、BVDV-E2-mRNA7组、商品灭活疫苗组及PBS空白对照组。采用肌内免疫，试验第1天进行初次免疫，试验第28天进行加强免疫，BVDV-E2-mRNA中的各组组每次免疫剂量相同，均为20g，体积为200L，商品灭活疫苗组注射剂量也为200L、PBS空白注射组注射等体积的PBS(pH7.2，0.01M)。分别在二免14天后进行尾部采血，收集血清，用间接ELISA法测定抗体水平。如图3所示，结果显示BVDV-E2-mRNA1、BVDV-E2-mRNA2、BVDV-E2-mRNA3、BVDV-E2-mRNA4、BVDV-E2-mRNA5、BVDV-E2-mRNA6、BVDV-E2-mRNA7实验组产生的抗体水平高于商品化的灭活疫苗。

9)5、血清中和试验中中和效价及抗体滴度的测定

对第42d的血清进行血清中和试验，结果显示BVDV-E2-mRNA1、BVDV-E2-mRNA2、BVDV-E2-mRNA3、BVDV-E2-mRNA4、BVDV-E2-mRNA5、BVDV-E2-mRNA6、BVDV-E2-mRNA7实验组及商品化灭活疫苗组的中和抗体效价均显著高于PBS对照组。其中BVDV-E2-mRNA1组、BVDV-E2-mRNA2组、BVDV-E2-mRNA3组、BVDV-E2-mRNA4、BVDV-E2-mRNA5、BVDV-E2-mRNA6、BVDV-E2-mRNA7实验组中的中和抗体效价与灭活疫苗组相当，如下表所示：

表2疫苗的中和效价表

如图4可见，抗体滴度测定试验中BVDV-E2-mRNA1、BVDV-E2-mRNA2、BVDV-E2-mRNA3、BVDV-E2-mRNA4、BVDV-E2-mRNA5、BVDV-E2-mRNA6、BVDV-E2-mRNA7实验组及商品化灭活疫苗组中和抗体滴度均高于2

序列表

<110> 广州源博医药科技有限公司

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<170> SIPOSequenceListing 1.0

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<212> DNA

<213> Sequence Artificial

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1 5 10 15

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20 25 30

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35 40 45

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50 55 60

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65 70 75 80

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85 90 95

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100 105 110

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115 120 125

Arg Gly Thr Tyr Asn Thr Thr Leu Leu Asn Gly Pro Ala Phe Gln Met

130 135 140

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145 150 155 160

Arg Asp Thr Leu Asp Thr Ala Val Val Arg Thr Tyr Arg Arg Ser Arg

165 170 175

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180 185 190

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195 200 205

Asp Gln Leu Gln Tyr Thr Gly Gly Ser Val Glu Ser Cys Lys Trp Cys

210 215 220

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225 230 235 240

Lys Cys Arg Leu Lys Asn Glu Thr Gly Tyr Arg Phe Val Asp Gly Thr

245 250 255

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260 265 270

Cys Lys Ile Gly Asp Thr Ile Val Gln Val Ile Ala Leu Asp Thr Lys

275 280 285

Leu Gly Pro Met Pro Cys Lys Pro Tyr Glu Ile Ile Pro Ser Glu Gly

290 295 300

Pro Val Glu Lys Thr Ala Cys Thr Phe Asn Tyr Thr Arg Thr Leu Lys

305 310 315 320

Asn Lys Tyr Phe Glu Pro Arg Asp Ser Tyr Phe Gln Gln Tyr Met Leu

325 330 335

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340 345 350

<210> 16

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<212> DNA

<213> Sequence Artificial

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gtagtacgga cgtatagaag gtccagacca ttcccttata ggcaaggctg tattacccaa 600

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aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1260

aaaaaa 1266

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<211> 1305

<212> DNA

<213> Sequence Artificial

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<212> DNA

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