一种立克次体胞内菌菌株分离方法

摘要

本发明属于医学微生物学技术领域，尤其是一种立克次体胞内菌菌株分离方法，解决了现有技术中立克次体胞内菌菌株分离比较困难，分离得到的菌株纯度低，在细胞中培养比较困难的的问题，所述立克次体胞内菌菌株分离方法的制备方法，包括以下步骤：将带有立克次体感染的贴壁细胞进行离心，破碎，离心处理获得初纯菌株，加泛影葡胺超速离心获得层内菌悬液，最后离心、定容即得立克次体胞内菌菌株。本发明提出的克次体胞内菌菌株分离方法简单易操作，将立克次体胞内菌从细胞中分离出来，得到纯度较高的立克次体胞内菌菌株，可用于后续立克次体的致病机制及特异性临床表现的研究，意义深远。

说明书

技术领域

本发明涉及医学微生物学技术领域，尤其涉及一种立克次体胞内菌菌株分离方法。

背景技术

立克次体一般指立克次氏体，为革兰氏阴性菌，是一类专性寄生于真核细胞内的G-原核生物。是介于细菌与病毒之间，而接近于细菌的一类原核生物，没有核仁及核膜。一般呈球状或杆状，主要寄生于节肢动物，有的会通过蚤、虱、蜱、螨传入人体、引起斑疹伤寒、战壕热等疾病。立克次体在1906年由青年医生Howard Taylor ricketts首先发现并报道，但他在研究立克次体的过程中不幸感染献出生命，为纪念他在研究中献身以及对于立克次体的发现作出的卓越贡献，故以他的名字命名这一类微生物。

随着新发和再现传染病(Emerging and reemerging infectious diseases)的流行，立克次体感染日益受到医学界重视。世界历史上由立克次体感染引发的疾病曾严重威胁人类的健康，随着全球气候的改变，新发传染病的增多，立克次体及立克次体感染导致的疾病日趋增多，以至当今立克次体病仍是造成人类发病和死亡的重要病因之一。立克次体感染存在不同种属的病原体，并且各种病原体感染的流行病学分布、临床表现、发病机制均有差异，不同种属立克次体的感染的发病机制和诊断治疗目前在我国乃至在全世界仍在继续探索。同样，不同病原体的临床表现也存在差异性，更需要引起临床医生和科研人员的重视，因此，世界各地的学者始终在探寻立克次体的致病机制及特异性临床表现。

立克次体胞内菌菌株是用于研究、分析、明确立克次体的致病机制及特异性临床表现的重要部分。然而，现有技术中，立克次体胞内菌菌株分离比较困难，分离得到的菌株纯度低，在细胞中培养比较困难。基于上述陈述，本发明提出了一种立克次体胞内菌菌株分离方法。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有技术中立克次体胞内菌菌株分离比较困难，分离得到的菌株纯度低，在细胞中培养比较困难的问题，而提出的一种立克次体胞内菌菌株分离方法。

一种立克次体胞内菌菌株分离方法，包括以下步骤：

(1)将显微镜观察后的生长状态良好的带有立克次体感染的贴壁细胞刮下来；

(2)将步骤(1)中刮下来的带有立克次体感染的贴壁细胞以及细胞培养液共同加入50ml离心管A中，在4℃的温度下离心，离心转速为13000rpm，离心时间为15min；

(3)将步骤(2)离心后的上清液体吸出弃掉，保留离心后的沉淀；

(4)取50ml无菌一次性离心管B，倒入灭菌玻璃珠至5ml刻度线处；

(5)用10ml无菌SPG缓冲液将步骤(3)中的沉淀混匀，加入到步骤(4)的离心管B中；

(6)在震荡器上破碎步骤(5)中离心管B中的细胞，震荡时间为1min，冰浴1min，重复上述操作3-4次后结束，将震荡后的液体涂片，观察细胞破碎情况，如显微镜下观察视野内无完整的细胞核，则进行下一步，如果细胞破碎效果不好，则继续震荡1-2次；

(7)将步骤(6)中破碎得到的液体转入50ml灭菌离心管C中，在4℃的温度下离心，离心转速为500g或1000rpm，离心时间为20min，将离心后的上清液转入离心管D中，离心后的沉淀弃掉；

(8)将离心管D中的上清液在4℃的温度下离心，离心转速为13000rpm，离心时间为15min，将离心后的上清液丢弃，保留离心后的沉淀；

(9)取约2-4ml无菌SPG缓冲液将步骤(8)中离心后的沉淀定容分装于冻存管中，获得初纯菌株；

(10)配置浓度分别为36％，32％，25％，18％的泛影葡胺，并分开存放于不同的50ml一次性离心管中；

(11)取6只超速离心管，分别将步骤(10)配制的不同浓度的泛影葡胺，按照36％泛影葡胺10ml，32％泛影葡胺7.5ml，25％泛影葡胺10ml，18％泛影葡胺7.5ml的顺序依次加入6只超速离心管中，加样需缓慢，不可晃动混匀，以免影响分层；

(12)取步骤(9)中定容获得的初纯菌株，将其加入到步骤(11)中获得的6只超速离心管中的1只，其余5只超速离心管加入SPG缓冲液配平；在4℃的温度下进行超速离心，离心转速为90000g，离心时间为90min；

(13)离心结束后取含有初纯菌株的超速离心管中介于分层内32-36％段的分层物质即得层内菌悬液，将层内菌悬液转入50ml灭菌离心管内，加入10-20倍体积的SPG缓冲液，在4℃的温度下进行离心，离心转速为13000rpm，离心时间为15min，离心后的上清液丢弃，保留离心后的沉淀，加入SPG缓冲液定容定容至0.5ml，即得所需的立克次体胞内菌菌株。

优选的，所述步骤(1)的具体操作如下：将含有立克次体的菌液或者血清感染至L929细胞中，感染3天后，每天对细胞进行涂片，并进行吉姆萨染色，在显微镜下观察细胞质内菌体数量，直到胞质内充满菌体即可将带有立克次体感染的贴壁细胞全部刮下备用；通过前期预实验发现，立克次体在小鼠成纤维细胞(L929细胞)中生长状态良好，立克次体为胞内寄生菌，生长在其所感染的L929细胞的胞质内，吉姆萨染色呈紫色短杆状。

优选的，所述步骤(2)中的细胞培养液由DMEM培养基、HEPEs缓冲液和谷氨酰胺复配而得。

优选的，所述步骤(4)中的灭菌玻璃珠为直径2-3mm的氧化锆珠。

本发明提出的一种立克次体胞内菌菌株分离方法，具有以下有益效果：

本发明提出的克次体胞内菌菌株分离方法简单易操作，将立克次体胞内菌从细胞中分离出来，能够得到纯度较高的立克次体胞内菌菌株，可用于后续立克次体的致病机制及特异性临床表现的研究，意义深远。

附图说明

图1为本发明提出的一种立克次体胞内菌菌株分离方法中实施例一中的L929细胞培养后菌株纯化吉姆萨染色后1000×油镜图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步解说。

实施例一

本发明提出的一种立克次体胞内菌菌株分离方法，包括以下步骤：

(1)通过前期预实验发现，立克次体在小鼠成纤维细胞(L929细胞)中生长状态良好，因此将含有立克次体的菌液或者血清感染至L929细胞中，感染3天后，每天对细胞进行涂片，并进行吉姆萨染色，在显微镜下观察细胞质内菌体数量，直到胞质内充满菌体即可将带有立克次体感染的贴壁细胞全部刮下备用；立克次体为胞内寄生菌，生长在其所感染的L929细胞的胞质内，吉姆萨染色呈紫色短杆状；

(2)将步骤(1)中刮下来的带有立克次体感染的贴壁细胞以及由DMEM培养基、HEPEs缓冲液和谷氨酰胺复配得到的细胞培养液共同加入50ml离心管A中，在4℃的温度下离心，离心转速为13000rpm，离心时间为15min；

(3)将步骤(2)离心后的上清液体吸出弃掉，保留离心后的沉淀；

(4)取50ml无菌一次性离心管B，倒入直径2mm的氧化锆灭菌玻璃珠至5ml刻度线处；

(5)用10ml无菌SPG缓冲液将步骤(3)中的沉淀混匀，加入到步骤(4)的离心管B中；

(6)在震荡器上破碎步骤(5)中离心管B中的细胞，震荡时间为1min，冰浴1min，重复上述操作3次后结束，将震荡后的液体涂片，观察细胞破碎情况，如显微镜下观察视野内无完整的细胞核，则进行下一步，如果细胞破碎效果不好，则继续震荡1次；

(7)将步骤(6)中破碎得到的液体转入50ml灭菌离心管C中，在4℃的温度下离心，离心转速为1000rpm，离心时间为20min，将离心后的上清液转入离心管D中，离心后的沉淀弃掉；

(8)将离心管D中的上清液在4℃的温度下离心，离心转速为13000rpm，离心时间为15min，将离心后的上清液丢弃，保留离心后的沉淀；

(9)取约2-4ml无菌SPG缓冲液将步骤(8)中离心后的沉淀定容分装于冻存管中，获得初纯菌株；

(10)配置浓度分别为36％，32％，25％，18％的泛影葡胺，并分开存放于不同的50ml一次性离心管中；

(11)取6只超速离心管，分别将步骤(10)配制的不同浓度的泛影葡胺，按照36％泛影葡胺10ml，32％泛影葡胺7.5ml，25％泛影葡胺10ml，18％泛影葡胺7.5ml的顺序依次加入6只超速离心管中，加样需缓慢，不可晃动混匀，以免影响分层；

(12)取步骤(9)中定容获得的初纯菌株，将其加入到步骤(11)中获得的6只超速离心管中的1只，其余5只超速离心管加入SPG缓冲液配平；在4℃的温度下进行超速离心，离心转速为90000g，离心时间为90min；

(13)离心结束后取含有初纯菌株的超速离心管中介于分层内32-36％段的分层物质即得层内菌悬液，将层内菌悬液转入50ml灭菌离心管内，加入10倍体积的SPG缓冲液，在4℃的温度下进行离心，离心转速为13000rpm，离心时间为15min，离心后的上清液丢弃，保留离心后的沉淀，加入SPG缓冲液定容定容至0.5ml，即得所需的立克次体胞内菌菌株。

实施例二

本发明提出的一种立克次体胞内菌菌株分离方法，包括以下步骤：

(1)通过前期预实验发现，立克次体在小鼠成纤维细胞(L929细胞)中生长状态良好，因此将含有立克次体的菌液或者血清感染至L929细胞中，感染3天后，每天对细胞进行涂片，并进行吉姆萨染色，在显微镜下观察细胞质内菌体数量，直到胞质内充满菌体即可将带有立克次体感染的贴壁细胞全部刮下备用；立克次体为胞内寄生菌，生长在其所感染的L929细胞的胞质内，吉姆萨染色呈紫色短杆状；

(2)将步骤(1)中刮下来的带有立克次体感染的贴壁细胞以及由DMEM培养基、HEPEs缓冲液和谷氨酰胺复配得到的细胞培养液共同加入50ml离心管A中，在4℃的温度下离心，离心转速为13000rpm，离心时间为15min；

(3)将步骤(2)离心后的上清液体吸出弃掉，保留离心后的沉淀；

(4)取50ml无菌一次性离心管B，倒入直径3mm的氧化锆灭菌玻璃珠至5ml刻度线处；

(5)用10ml无菌SPG缓冲液将步骤(3)中的沉淀混匀，加入到步骤(4)的离心管B中；

(6)在震荡器上破碎步骤(5)中离心管B中的细胞，震荡时间为1min，冰浴1min，重复上述操作4次后结束，将震荡后的液体涂片，观察细胞破碎情况，如显微镜下观察视野内无完整的细胞核，则进行下一步，如果细胞破碎效果不好，则继续震荡2次；

(7)将步骤(6)中破碎得到的液体转入50ml灭菌离心管C中，在4℃的温度下离心，离心转速为500g，离心时间为20min，将离心后的上清液转入离心管D中，离心后的沉淀弃掉；

(8)将离心管D中的上清液在4℃的温度下离心，离心转速为13000rpm，离心时间为15min，将离心后的上清液丢弃，保留离心后的沉淀；

(9)取约2-4ml无菌SPG缓冲液将步骤(8)中离心后的沉淀定容分装于冻存管中，获得初纯菌株；

(10)配置浓度分别为36％，32％，25％，18％的泛影葡胺，并分开存放于不同的50ml一次性离心管中；

(11)取6只超速离心管，分别将步骤(10)配制的不同浓度的泛影葡胺，按照36％泛影葡胺10ml，32％泛影葡胺7.5ml，25％泛影葡胺10ml，18％泛影葡胺7.5ml的顺序依次加入6只超速离心管中，加样需缓慢，不可晃动混匀，以免影响分层；

(12)取步骤(9)中定容获得的初纯菌株，将其加入到步骤(11)中获得的6只超速离心管中的1只，其余5只超速离心管加入SPG缓冲液配平；在4℃的温度下进行超速离心，离心转速为90000g，离心时间为90min；

(13)离心结束后取含有初纯菌株的超速离心管中介于分层内32-36％段的分层物质即得层内菌悬液，将层内菌悬液转入50ml灭菌离心管内，加入20倍体积的SPG缓冲液，在4℃的温度下进行离心，离心转速为13000rpm，离心时间为15min，离心后的上清液丢弃，保留离心后的沉淀，加入SPG缓冲液定容定容至0.5ml，即得所需的立克次体胞内菌菌株。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。