以CD180阴性B细胞指示重症肌无力病情的试剂盒及应用

摘要

本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种以CD180阴性B细胞指示重症肌无力病情的试剂盒及应用，该试剂盒包括如下抗体：明亮蓝色515标记的抗人CD19抗体、藻红蛋白标记的抗人CD180抗体和藻红蛋白‑花青素7标记的抗人IgG抗体；该试剂盒用于抗AChR抗体分泌活动的检测。

说明书

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种以CD180阴性B细胞指示重症肌无力病情的试剂盒及应用。

背景技术

重症肌无力是由抗体介导的，T细胞、B细胞过度激活导致神经肌肉接头障碍，而出现的一类自身免疫性疾病，表现为波动性骨骼肌肌肉无力，易疲劳。在目前临床实践中，重症肌无力的诊断主要依靠临床医师对症状、体征的判断、肌电图、新斯的明实验以及自身抗体的检查。研究表明抗AChR抗体是导致重症肌无力的主要自身抗体之一，但是外周血清中抗AChR抗体的滴度往往与患者的临床严重程度不相关。目前仍缺乏反映重症肌无力自身抗体分泌活动及疾病严重程度的生物学标志物。B细胞在重症肌无力的发病中起着关键作用，B细胞最终生成了攻击神经肌肉接头的自身抗体。因此，B细胞相关的标志物可能可以反映自身抗体的分泌活动及疾病的严重程度。

流式细胞术可以高速分析上万个细胞，并从同一个细胞测得多个参数，具有速度快、精度高、准确性好等优点。流式细胞术在常规临床实验室中越来越多地用于疾病的诊断、预后和监测。如流式细胞术用于血液肿瘤患者诊断和分期，用于检测白细胞的功能异常等等。因此，进行流式细胞术分析，寻找重症肌无力的生物学标志物，具有重要的临床意义。

CD180是一种Toll样蛋白，通常与MD-1结合成二聚体，CD180/MD-1二聚体主要表达与B细胞、DC细胞和巨噬细胞表面。CD180的胞外部分含有Toll样蛋白典型的富亮氨酸重复域LRR，却没有Toll样蛋白通常的胞内结构。

研究表明，在不同的细胞上，CD180功能不同，巨噬细胞或DC细胞中，CD180能抑制TLR4通路活化，CD180敲除小鼠对LPS的炎症反应更强，产生更多的炎性因子。而在B细胞中，CD180的作用似乎是相反的，敲除CD180明显抑制TLR4通路活化对B细胞增殖及活化的促进作用。除了与TLR4关系密切，激活CD180通路本身能促进B细胞增殖及CD86的表达。此外，动物实验表明，敲除CD180后，老鼠的抗体分泌减少，因此，CD180与B细胞的激活和抗体分泌有关，其异常表达可能参与了免疫性疾病的发生与发展。然而，CD180在重症肌无力疾病中的表达情况目前还没有研究报道，其与自身抗体的关系仍旧未知。

发明内容

本发明的目的在于提供一种以CD180阴性B细胞指示重症肌无力病情的试剂盒及应用，以弥补现有生物标志物的不足，通过检测生物标志物的水平，可以判断患者重症肌无力病情的严重程度及抗体分泌活动，从而为指示重症肌无力病情和抗体分泌活动的提供一种新的手段。

为解决上述的技术问题，本发明采用的第一种技术方案是：

一种试剂盒，包括如下抗体：明亮蓝色515标记的抗人CD19抗体、藻红蛋白标记的抗人CD180抗体和藻红蛋白-花青素7标记的抗人IgG抗体。

进一步的技术方案是，还包括用于处理样本的试剂，所述试剂包括PBS、固定液和透化液。

本发明采用的第二种技术方案是：

一种试剂盒的应用，包括上述试剂盒，将所述试剂盒用于抗AChR抗体分泌活动的检测。

本发明采用的第三种技术方案是：

一种检测CD180阴性B细胞抗体分泌功能的方法，包括如下步骤：

S201、利用EDTA紫管抽取新鲜外周血5ml，在600g下离心10min后取上层血浆，分装于-80℃的环境中暂存；

S202、向分装的血浆中加入等体积的1×PBS，用巴氏管吹打混合均匀，形成PBS稀释的血液标本；

S203、取第三离心管向其中加入2.5ml人淋巴细胞分离液，然后倾斜第三离心管，向其中加入前述PBS稀释的血液标本；

S204、将第三离心管放置于离心机上，以快升慢降的方式在800g下离心20min；

S205、吸取第三离心管中离心后的白雾层PBMC，并将其转移至第四离心管中，然后用10ml 1×PBS洗涤2次；

S206、将第四离心管中的PBMC重悬于100μl的PBS中，然后向第四离心管中加入anti-CD180抗体和anti-CD19抗体在4℃避光的条件下孵育30min；

S207、将孵育30min后的溶液用PBS洗两遍后加入250μl固定液的试剂固定细胞，在4℃下孵育20min，然后用1ml的透化液洗2次，再在室温下以350g的条件离心5min；

S208、向离心5min的溶液中加入anti-IgG抗体，并在4℃避光孵育30min，然后用1ml透化液洗2次，再在室温下以350g的条件离心5min，最后重悬于300μl的PBS再流式上机。

更进一步的技术方案是，S101中-80℃的环境由冰箱提供，用于存储血浆样本。

更进一步的技术方案是，所述第一离心管和第二离心管的容积均为15ml。

本发明采用的第四种技术方案是：

一种用于评估重症肌无力免疫抑制剂药物治疗效果的方法，包括如下步骤：

S301、收集患有重症肌无力的受试者提供第一样本，同时收集患者重症肌无力的定量评分信息；

S302、使用梯度离心法从第一样本中获取外周血单个核细胞，并进行流式染色，得到第一CD180阴性群；

S303、收集服用免疫抑制剂药物的受试者的第二样本，使用梯度离心法从第二样本中获取外周血单个核细胞，并进行流式染色，得到第二CD180阴性群；

S304、将第一CD180阴性群、第二CD180阴性群结合重症肌无力的定量评分信息进行比较，评估此重症肌无力患者的治疗效果。

与现有技术相比，本发明至少具有以下的有益效果之一：

1、采用本试剂盒可以对CD180阴性B细胞进行筛查，重症肌无力患者病情的病情严重程度进行判断以及对抗AChR抗体分泌活动的检测；

2、将CD180阴性B细胞作为重症肌无力的生物标志物，可以对重症肌无力的判断、评估重症肌无力的严重程度、对重症肌无力的疗效以及抗体分泌活动提供重要指标。

附图说明

图1为本发明中CD180阴性B细胞在60例重症肌无力患者及15例健康对照示意图。

图2（a）为本发明中重症肌无力患者CD180阴性B细胞与QMG评分相关性的示意图。

图2（b）为本发明中重症肌无力患者CD180阴性B细胞与分泌的抗AChR抗体相关性的示意图。

图3（a）为本发明中正常人的CD180阴性B细胞与CD180阳性B细胞分泌IgG的示意图。

图3（b）为本发明中重症肌无力患者的CD180阴性B细胞与CD180阳性B细胞分泌IgG的示意图。

图4（a）为本发明中重症肌无力患者经过治疗前后CD180阴性B细胞的比例变化示意图。

图4（b）为本发明中重症肌无力患者经过治疗前后CD180阴性B细胞QMG评分变化示意图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

图1-4示出了本发明以CD180阴性B细胞指示重症肌无力病情的试剂盒及应用的实施例。

实施例1：

本实施例提供一种试剂盒，包括如下抗体：明亮蓝色515标记的抗人CD19抗体、藻红蛋白标记的抗人CD180抗体和藻红蛋白-花青素7标记的抗人IgG抗体。后续染色推荐各加入2ul与细胞孵育。其中CD19抗体用于确定B细胞群，CD180抗体为此试剂盒的核心生物学标志物，IgG抗体用于观察细胞内的免疫球蛋白的分泌状态。

还包括用于处理样本的试剂，所述试剂包括PBS、固定液和透化液。

其中试剂盒配套有使用说明书，以便于医护人员知晓如何使用。

实施例2：

在前述实施例1的基础上，本实施例提供一种试剂盒的应用，将所述试剂盒用于CD180阴性B细胞的筛查，和/或，重症肌无力患者病情的指示，和/或，抗AChR抗体分泌活动的检测。

其中，重症肌无力患者病情的指示为利用试剂盒评估受试者重症肌无力的病情严重程度。

实施例3：

本实施例提供一种检测CD180阴性B细胞的方法，包括如下步骤：

S101、利用EDTA紫管抽取新鲜外周血5ml ，在600g下离心10min后取上层血浆，分装于-80℃的环境中暂存；

S102、向分装的血浆中加入等体积的1×PBS，用巴氏管吹打混合均匀，形成PBS稀释的血液标本；

S103、取第一离心管向其中加入2.5ml人淋巴细胞分离液，然后倾斜第一离心管，向其中加入前述PBS稀释的血液标本；

S104、将第一离心管放置于离心机上，以快升慢降的方式在800g下离心20min；

S105、吸取第一离心管中离心后的白雾层PBMC，并将其转移至第二离心管中，然后用10ml 1×PBS洗涤2次；

S106、将第二离心管中的PBMC重悬于100μl的PBS中，然后向第二离心管中加入anti-CD180抗体和anti-CD19抗体在4℃避光的条件下孵育30min；

S107、将孵育30min后的溶液用PBS洗两遍后重悬于300μl的PBS中，最后进行流式上机。

流式细胞术具有每秒测量数百至数千个细胞的优势，所获得的信息既是定性的，也是定量的。流式细胞术用于对各种标本进行免疫表型分析，包括全血、骨髓、浆液、脑脊液、尿液和实体组织等等。可以测量的特征包括细胞大小（由前向角光散射表示）、细胞质复杂性（由直角散射表示）、 DNA 或 RNA 含量，以及大范围的膜结合和细胞内蛋白质。过去流式细胞仪只能在大型学术中心使用，流式细胞术在常规临床实验室中越来越多地用于疾病的诊断、预后和监测。该方法允许快速对每个外周血的单个核细胞包括B细胞的CD180表达水平进行可视化，对同一样本的测量具有高重复性和高准确的特点。

其中，S101中-80℃的环境由冰箱提供。第一离心管和第二离心管的容积均为15ml。

实施例4：

本实施例提供一种检测CD180阴性B细胞抗体分泌功能的方法，包括如下步骤：

S201、利用EDTA紫管抽取新鲜外周血5ml ，在600g下离心10min后取上层血浆，分装于-80℃的环境中暂存；

S202、向分装的血浆中加入等体积的1×PBS，用巴氏管吹打混合均匀，形成PBS稀释的血液标本；

S203、取第三离心管向其中加入2.5ml人淋巴细胞分离液，然后倾斜第三离心管，向其中加入前述PBS稀释的血液标本；

S204、将第三离心管放置于离心机上，以快升慢降的方式在800g下离心20min；

S205、吸取第三离心管中离心后的白雾层PBMC，并将其转移至第四离心管中，然后用10ml 1×PBS洗涤2次；

S206、将第四离心管中的PBMC重悬于100μl的PBS中，然后向第四离心管中加入anti-CD180抗体和anti-CD19抗体在4℃避光的条件下孵育30min；

S207、将孵育30min后的溶液用PBS洗两遍后加入250μl固定液的试剂固定细胞，在4℃下孵育20min，然后用1ml的透化液洗2次，再在室温下以350g的条件离心5min；

S208、向离心5min的溶液中加入anti-IgG抗体，并在4℃避光孵育30min，然后用1ml透化液洗2次，再在室温下以350g的条件离心5min，最后重悬与300μl的PBS再流式上机。

该方法的优势在于它可以通过同时表征CD180阳性B细胞和CD180阴性B细胞中IgG的表达来评估免疫球蛋白的分泌情况。

其中，S201中-80℃的环境由冰箱提供。第三离心管和第四离心管的容积均为15ml。

实施例5：

本实施例提供一种CD180阴性B细胞的应用，将其作为重症肌无力的生物标志物。

实施例6：

本实施例提供一种用于评估重症肌无力免疫抑制剂药物治疗效果的方法，包括如下步骤：

S301、收集患有重症肌无力的受试者提供第一样本，同时收集患者重症肌无力的定量评分信息；

S302、使用梯度离心法从第一样本中获取外周血单个核细胞，并进行流式染色，得到第一CD180阴性群；

S303、收集服用免疫抑制剂药物的受试者的第二样本，使用梯度离心法从第二样本中获取外周血单个核细胞，并进行流式染色，得到第二CD180阴性群；

S304、将第一CD180阴性群、第二CD180阴性群结合重症肌无力的定量评分信息进行比较，评估此重症肌无力患者的治疗效果。

该方法的优势在于可以获得疗效相关的生物学指标，指导临床用药。

本发明中，已检测了CD180阴性B细胞在60例重症肌无力患者及15例健康对照中的表达，如图1，CD180阴性B细胞在重症肌无力中表达升高，与对照组相比，p=0.0041，具有明显统计学意义。

同时CD180阴性B细胞群也与重症肌无力患者分泌的抗AChR抗体及患者病情程度呈正向相关性（如图2（a）和图2（b）所示）。说明CD180阴性B细胞可以反映重症肌无力患者抗AChR抗体的分泌情况和疾病的严重程度。图2（a）说明重症肌无力患者的CD180阴性B细胞与QMG评分是相关的，具有统计学意义。即说明CD180阴性B细胞与重症肌无力患者严重程度相关。图2（b）说明重症肌无力患者的CD180阴性B细胞与抗AChR抗体是相关的，具有统计学意义。即说明CD180阴性B细胞与重症肌无力患者分泌的致病抗AChR抗体相关。

进一步检测CD180阴性B细胞抗体分泌发现，重症肌无力患者的CD180阴性B细胞与CD180阳性B细胞分泌抗体存在明显差异，并且是CD180阴性B细胞主要的分泌IgG抗体的细胞（如图3（a）和图3（b）所示）。说明CD180阴性B细胞可以反映IgG抗体的分泌活动。

此外，重症肌无力患者经过治疗后，CD180阴性B细胞比例下降。说明CD180阴性B细胞可以反映重症肌无力患者治疗疗效（如图4（a）和图4（b）所示）。

综上所述，本发明的试剂盒通过流式细胞术，表明CD180阴性B细胞可以作为重症肌无力诊断、评估疾病的严重程度、评估疗效、抗体分泌活动的重要指标。

尽管这里参照本发明的多个解释性实施例对本发明进行了描述，但是，应该理解，本领域技术人员可以设计出很多其他的修改和实施方式，这些修改和实施方式将落在本申请公开的原则范围和精神之内。更具体地说，在本申请公开、附图和权利要求的范围内，可以对主题组合布局的组成部件和/或布局进行多种变型和改进。除了对组成部件和/或布局进行的变形和改进外，对于本领域技术人员来说，其他的用途也将是明显的。