使用电化学分析确定活性白细胞存在的组合物和方法

摘要

一种用于白细胞酯酶的底物组合物，所述底物组合物包括单酯，所述单酯是α‑氨基酸酯或α‑羟基酸酯中的一种，对白细胞酯酶具有特异性，所述单酯具有用于参与氧化还原反应的第一部分，和包括氨阻断基团或醇阻断基团的第二部分。

说明书

相关申请的交叉引用

本申请要求2018年9月27日提交的美国专利申请序列号16/145,014的优先权。其公开的内容在此通过全文引用并入到本文。

技术领域

本公开涉及一种用于确定测试样本中白细胞活性的电化学分析的新型应用。更具体地，本公开涉及新型方法和试剂盒，所述方法和试剂盒用于在有发生感染风险的患者中确定活性白细胞释放的酶的活性，特别是白细胞酯酶和人中性粒细胞弹性蛋白酶。

背景技术

尿液中存在数量异常高的白细胞是感染过程中的常用指标。历史上，技术人员一直依赖显微镜下人工目测计数。这种目测技术很大程度上被用于检测泌尿生殖道感染的试纸分析所取代。在大多数此类商业性“试纸”分析中，白细胞酯酶(“LE”)的酶活性被用作为活性白细胞存在的代表。人中性粒细胞弹性蛋白酶(“HNE”)的分析也被报道对于男性尿路感染的诊断具有高的敏感性。

已知的LE分析是显色的，因为是以颜色变化为依据报告酶活性的存在的。通常，色彩检测条可以与颜色表相匹配以颜色强度增加3-4个增量(从无到2+/3+)，这表示LE浓度为30ng/mL到大于1500ng/mL。然而，比色法存在明显的缺点。仅有3-4个可用的颜色强度增量，分辨白细胞酯酶浓度的差异可能是相当困难的。此外，评估者之间甚至是评估者内部对此类颜色增量进行分类的可靠性可能很差。特别是试纸条结果不太明确(痕量或1+)的情况，尤其如此；在这种情况下，检测结果对于做出治疗决定可能太不可靠。因此，试纸条结果的应用仅限于白细胞酯酶活性极高的情况。任何能改变尿液颜色的物质(例如呋喃妥因、非那吡啶)也会影响试纸条的读数。

近年来，白细胞酯酶检测激起了医生对使用浆液的应用的兴趣，所述浆液例如来自关节、肺、腹部或甚至中耳积液。虽然结果对于关节假体周围感染(PJI)的诊断很有希望，但是由于血液或碎屑的存在，比色法在多达17-29％的样本的检测中是不切实际的。对于其他体腔也是如此，因为抽吸往往还不一定能产生清澈的液体。此外，不能对血清样本进行比色法白细胞酯酶检测。

最近，乳酸酯底物已经被证实在LE分析的敏感性和速度方面有所改善。醇部分以羟基吡咯化合物形式释放，然后与重氮盐反应生成紫色偶氮染料。然而，这种分析在血液或浑浊的液体的情况下应用有限，并且将需要昂贵的光学传感器来提供精确的定量测量。因此，改善底物和分析法以检测样本中的白细胞和白细胞酶是迫切所需的。

发明内容

为了提供对本发明的一些方面的基本理解，以下是本发明的简要概述。此概述并非本发明的详尽综述。其目的并不在于确定本发明的重要/关键元素，也不在于界定本发明的范围。其唯一目的是以简要的形式呈现本发明的一些概念，作为随后呈现的较详细描述的前序。

在一方面，本公开针对一种在有感染风险的患者或已经表现出感染相关症状的患者中筛查、检测和确认感染的方法。在一个实施例中，所述方法遵循以下步骤：从需要的受试者获得样本，检测样本中的白细胞标记物存在或不存在，并基于样本中白细胞标记物的程度和存在制定治疗方案。

在一些实施例中，白细胞标记物可以是以下标记物中的一个或任意组合：例如细胞因子、趋化因子、氧和氮自由基、白细胞弹性蛋白酶、白细胞酯酶、中性粒细胞弹性蛋白酶、明胶酶、IL-1β、金属蛋白酶(MMP)、组织蛋白酶(如组织蛋白酶A和组织蛋白酶B)、磷脂酶(如磷脂酶A和磷脂酶B)。

在一方面，本公开涉及一种包括白细胞酶或特别是中性粒细胞酶底物的组合物。在一些实施例中，所述白细胞酶包括白细胞酯酶(“LE”)。在一些实施例中，所述白细胞酶底物包括LE底物。在一些实施例中，所述白细胞酶包括人中性粒细胞弹性蛋白酶(“HNE”)。在一些实施例中，所述白细胞酶底物包括HNE底物。在替代实施例中，所述组合物既包括LE底物又包括HNE底物。在另一实施例中，所述组合物可包含对除LE和HNE以外的其他酶或生物标记物具有特异性的附加底物。

在一些实施例中，所述底物表现出对LE或HNE的特异性。在一个实施例中，所述底物包括单酯，所述单酯是α-氨基酸酯(如丙氨酸酯)、或α-羟基酸酯(如乳酸酯)中的一种，对白细胞酯酶具有特异性，所述单酯具有用于参与氧化还原反应的第一部分，和包括氨或醇阻断基团的第二部分，所述第二部分遮掩官能团(即胺或醇)以防止不良的化学反应。

在某些实施例中，底物可以遵循如下所示的式I：

其中A包括醚基(即-O-)或胺基(即NR

在某些实施例中，LE底物包括如下式II所述的化合物：

X

Y

R

R

环上的每个R

在某些实施例中，LE底物包括4-((甲苯磺酰基-L-丙氨酰)氧)苯基甲苯磺酰基-L-丙氨酸酯。在某些实施例中，LE底物包括4-(((S)-2-(甲苯磺酰氧基)丙酰基)氧)苯基(S)-2-(甲苯磺酰氧基)丙酸酯。在某些实施例中，LE底物包括以下苯二胺变体之一：4-((甲苯磺酰基-L-丙氨酰)氧)苯基甲苯磺酰基-L-丙氨酸酯和4-(((S)-2-(甲苯磺酰氧基)丙酰基)氧)苯基(S)-2-(甲苯磺酰氧基)丙酸酯。

在某些实施例中，HNE底物包括如下式III所述的化合物：

其中A

在某些实施例中，HNE底物包括3-{[(lS)-1-{[(2S)-1-(5-{[(1S)-l-({4-[(2S)-2-({1-[(2S)-2-[(2S)-2-(3-羧基丙酰胺基)丙酰胺基]丙酰基]吡咯烷-2-基}甲酰胺)-3-甲基丁酰氨基]苯基}氨基甲酰基)-2-甲基丙基]氨基甲酰基}咪唑烷-1-基)-1-氧代丙烷-2-基]氨基甲酰基}乙基]氨基甲酰基}丙酸。

在某些实施例中，所述白细胞酶底物被包含在分析中。在某些实施例中，所述分析包括电化学分析。在一个替代实施例中，所述分析可能包含比色法步骤与所述电化学分析的结合。在某些实施例中，所述电化学分析包括一种内部校准的电化学连续酶分析(“ICECEA”)。在某些实施例中，所述电化学分析包括本公开的白细胞底物和电化学测量装置。在某些实施例中，所述电化学测量装置包含工作电极、参比电极和辅助电极。

在某些实施例中，本公开涉及一种检测样本中的白细胞酶的存在并制定治疗方案的方法。在某些实施例中，样本中白细胞酶的存在表明样本中存在白细胞。在某些实施例中，所述白细胞酶包括LE。在某些实施例中，所述白细胞酶包括人中性粒细胞弹性蛋白酶HNE。在某些实施例中，通过将酶与酶的底物接触来检测白细胞酶。在某些实施例中，所述底物是本公开任意的LE底物。在某些实施例中，所述底物是本公开任意的HNE底物。

在某些实施例中，对样本中存在的白细胞酶的数量进行定量。在某些实施例中，样本中白细胞的存在表明感染。在某些实施例中，所述感染包括尿路感染(“UTI”)。在某些实施例中，所述感染包括关节假体周围感染(“PJI”)。在某些实施例中，所述感染包括自发性细菌性腹膜炎(“SBP”)。在某些实施例中，所述样本包括生物样本。在某些实施例中，所述生物样本包括以下之一：尿液、痰、滑液、胸膜液、心包液、腹膜液、脑脊液(“CSF”)和中耳液。

在某些实施例中，筛查有发生感染风险的患者方法遵循以下步骤：在分析中，通过白细胞酶与底物接触来测定样本中白细胞酶的存在。在某些实施例中，所述分析包括电化学分析。在某些实施例中，所述电化学分析包括一种内部校准的电化学连续酶分析(“ICECEA”)。

在某些实施例中，在电化学分析中，检测白细胞酶的存在方法包括以下步骤：将白细胞酶反应物或生成物的第一等份试样加入到白细胞酶底物中。在某些实施例中，所述白细胞酶底物在电解质溶液中。在某些实施例中，所述方法包括以下步骤：测量流过电化学分析电极的电流。在某些实施例中，所述方法包括以下步骤：将白细胞酶反应物或生成物的至少额外的一等份试样加入到白细胞酶底物中。在某些实施例中，所述方法包括以下步骤：第二次测量流过电化学分析电极的电流。在某些实施例中，所述方法包括以下步骤：将白细胞酶加入到白细胞酶底物中。在某些实施例中，所述方法包括以下步骤：第三次测量流过电化学分析电极的电流。

在某些实施例中，筛查感染患者的方法通过在电化学分析中检测白细胞酶的存在，然后包含将白细胞酶的第一等份试样加入到白细胞酶底物中的过程。在某些实施例中，所述白细胞酶底物是电解质溶液。在某些实施例中，所述方法包括测量流过电化学分析电极的电流的步骤。在某些实施例中，所述方法包括将至少额外的一等份白细胞酶加入到白细胞酶底物中的步骤。在某些实施例中，所述方法包括第二次测量流过电化学分析电极的电流的步骤。在某些实施例中，所述方法包括将白细胞酶的反应物或生成物加入到白细胞酶底物中的步骤。在某些实施例中，所述方法包括第三次测量流过电化学分析电极的电流的步骤。

在另一方面，本发明涉及包含合适底物的试剂盒，用于优化结果、以及可选地基于观察到的结果提供患者具体的治疗方案的指示。

附图说明

图1表示初始对苯二酚底物和第一酯水解步骤。

图2表示半醌中间体和第二酯水解步骤。

图3表示最终的苯醌氧化产物。

图4表示在内部校准的电化学连续酶分析(ICECEA)中，使用4-((甲苯磺酰基-L-丙氨酰)氧)苯基甲苯磺酰基-L-丙氨酸酯(“TAPTA”)的结果。

图5表示4-((甲苯磺酰基-L-丙氨酰)氧)苯基甲苯磺酰基-L-丙氨酸酯(“TAPTA”)的核磁共振(NMR)。

图6是本发明的单酯实施例的裂解机理示意图。

图7是用本发明底物的一个实施例的丝网印刷的电极的伏安图，示出了随着LE浓度的增高，还原峰不断增加。

具体实施方式

如本文和所附权利要求中所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式“一个(a)”、“和(and)”和“该(the)”包含复数引用。

如本文所用，“白细胞(leukocyte)”可以指任何白血细胞(“WBC”)。白细胞是免疫系统的细胞，参与保护人体免受传染病和入侵病原体的侵害。根据其自身区别于其他的形态特征，所有的白细胞/WBC可以分为五类。它们包含中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、单核细胞和淋巴细胞。中性粒细胞约占白细胞的40-75％，嗜酸性粒细胞约占白细胞的1-6％，嗜碱性粒细胞占白细胞的不到1％，单核细胞约占白细胞的2-10％，以及淋巴细胞(例如淋巴B细胞和淋巴T细胞)约占白细胞的20-45％。

如本文所用的术语“患者(patient)”可以指对其进行治疗的生物系统。生物系统可以包含例如单个细胞、一组细胞(如细胞培养)、器官、组织或多细胞生物体。“患者(patient)”可以指人类患者或非人类患者。在优选的实施例中，患者是人类患者。

如本文所用的术语“有效量(effective amount)”或“治疗有效量(therapeutically effective amount)”可以指能够在治疗受试者中产生医学上期望结果的化合物或药剂的量。治疗方法可以在体内或体外，单独或与其他药物或治疗结合进行。治疗有效量可以以一种或多种给药、应用或剂量施用，并不旨在局限于特定的配方或给药途径。

疾病的术语“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”指执行方案，所述方案可能包含向患者(人类或其他)施用一种或多种药物，以缓解疾病的症状或体征。缓解可以发生在症状或体征出现之前，也可以发生在其出现之后。因此，“医治(treating)”或“治疗(treatment)”包含疾病的“防止(preventing)”或“预防(prevention)”。术语“防止(prevent)”或“防止(preventing)”指预防性药物和/或预防措施，其中目的是预防或减缓目标病理状态或病症。

本公开涉及用于快速检测(包含测定相对活性)由活性白细胞释放的酶的组合物和方法，例如由活性白细胞释放的白细胞酶，特别是白细胞酯酶(“LE”)和人中性粒细胞弹性蛋白酶(“HNE”)。

在本公开的至少一个方面，描述了筛查感染的受试者的方法，所述方法包括以下步骤：(a)从有发生感染风险的患者获得组织或体液样本；(b)将样本应用于检测装置，其中所述检测装置包括至少一个底物，所述底物对LE和/或HNE中至少之一有特异性，其中所述至少一个底物用于检测LE和/或HNE中至少之一的阈值水平，所述阈值水平与感染的存在相关；(c)确定样本中存在LE和/或HNE的阈值水平，其中如果LE和/或HNE各自的浓度超过阈值水平，并且进一步其中这类测量是感染的阳性筛查。

本发明提供了一种方法，其中所述感染是关节假体周围感染(PJI)。在某些实施例中，用于检测PJI的白细胞酯酶(LE)的阈值水平为滑膜液样本中至少约20pg/ml白细胞酯酶。

用于快速检测的组合物和方法利用用于检测诸如LE和HNE的白细胞酶)的特定底物，分别称为LE底物和HNE底物。用于快速检测的组合物和方法可利用电化学分析来检测白细胞酶，特别是，内部校准的电化学连续酶分析(“ICECEA”)，但不一定局限于此。

在某些实施例中，所述底物能够检测LE。这类底物易于被LE水解以生成氧化还原中间体，所述氧化还原中间体可以提供可检测的电化学响应。在某些实施例中，用于检测LE的底物(即“LE底物”)可以遵循如下所述的式I：

在对白细胞酯酶具有酶特异性的酯裂解位点处，A决定了酰基的同一性，例如丙氨酸酯或乳酸酯，并且B是能参与氧化还原反应的部分，所述部分可以通过电化学分析(如通过使用ICECEA或丝网印刷电化学传感器)检测。

在某些实施例中，A包括胺基(即-NR

使用任何有效的氨或醇的阻断基团C(如甲苯磺酰基)保护由A定义的酰基。酯的醇中间体即B部分在酯酶水解时被释放，其是氧化还原底物并参与氧化还原反应。另外，式I中连接B的氧可以被-NH连接部分取代(即式I中提到的酯基可以被氨基取代)，并且仍然在本公开的范围内。

氨或醇阻断基团C可包括以下中的任何：乙酰基(Ac)、苯甲酰基(Bz)、苄基(Bn)、β-甲氧基乙氧甲基(MEM)、二甲氧基三苯甲基(DMT)、甲氧甲基(MOM)、甲氧基三苯甲基[(4-甲氧基苯基)二苯甲基](MMT)、对甲氧基苄基(PMB)、甲硫基甲基、特戊酰基(Piv)、四氢吡喃(THP)、四氢呋喃(THF)、三苯基(Tr)、甲硅烷基(如TMS、TBDMS、TOM、TIPS)、甲基、和乙氧基乙基(EE)、苄氧羰基(Cbz)；对甲氧基苄基羰基(Moz或MeOZ)、叔丁氧羰基(BOC)、9-芴基甲氧羰基(FMOC)、3,4-二甲氧基苄基(DMPM)、对甲氧基苯基(PMP)、甲苯磺酰基(Ts)、三氯乙氧基羰基(Troc)、芳磺酰基或烷基磺酰基(如硝基苯磺酰基(Nosyl)和)。

在某些实施例中，氧化还原部分B是苯酚的衍生物，可通过其羟基形成酯。这种中间体可被氧化以释放电子。例如，但不一定局限于，一种苯酚衍生物即对苯二酚，在对位构象中含有两个羟基。每个羟基可被结合以形成独特的乳酸酯，所述乳酸酯独立地是白细胞酯酶的底物(图1)。生成的双重底物具有两个白细胞酯酶活性的潜在靶点，并且底物的分解是逐步进行的。由于活性位点的分子阻碍，白细胞酯酶在第一靶点处进行酯水解会发生得相对缓慢；然而，随后的第二个活性位点处的水解将发生得更快。这可能有效地提高电化学分析的特异性，因为非特异性水解不太可能开始级联。在第一个酯水解步骤之后，氧化反应可以去除氢原子以释放电子，从而形成半醌乳酸酯中间体(图2)。在剩余的酯随后水解后，基于醌的中间体被释放，并进一步被氧化形成对苯醌。对苯醌会在低电位下被还原，这最大限度地减少样本内的其他氧化还原活性物质的干扰，并且可以提高分析的选择性。最终产物如图3所示。

在其他方面，描述了具有LE和HNE阳性指征的患者的治疗方法。在一个实施例中，目前难以治疗由革兰氏阳性细菌引起的严重感染，因为这些病原体的多数现在对标准抗菌剂有抵抗力。为此，本公开的至少一个方面是在任何侵入性手术前对患者进行预防性治疗，以使感染风险最小化。在至少一个实施例中，可对被确认有感染的患者启动全面的治疗计划，该治疗计划包含使用抗菌剂，如青霉素、头孢菌素、四环素、达托霉素、替加环素、利奈唑胺、奎奴普丁/达福普汀和达巴万星，以及诸如此类的可用于抗活动性感染。在其他实施例中，通过开发对由于革兰氏阳性和革兰氏阴性耐药性感染的有效治疗，以筛查或检测PJI风险的方法。

在某些实施例中，B包括醌。在某些实施例中，B包括苯酚。在某些实施例中，B包括取代的醌或取代的苯酚。在某些实施例中，C包括甲苯磺酰基保护基。在某些实施例中，式II中连接B的氧被氨基取代。在进一步的实施例中，B包括氨基苯基。在某些实施例中，B包括取代的氨基苯基。

在式I范围内的用于检测白细胞酯酶(“LE”)的底物的两个具体的、明确的非限制性实例包括4-((甲苯磺酰基-L-丙氨酰)氧)苯基甲苯磺酰基-L-丙氨酸酯(下文中的化合物A)和4-(((S)-2-(甲苯磺酰氧基)丙酰基)氧)苯基(S)-2-(甲苯磺酰氧基)丙酸酯(下文中的化合物B)。化合物A在此也被称为“TAPTA”。化合物A的NMR如图5所示，其示出了甲苯磺酰基部分结构及其附着物。化合物A和化合物B的苯基乙二胺变体(即对位氧被NH连接基取代)也被认为是在本公开的范围内，并且同样适用于包含在本公开的电化学分析中(如在ICECEA中)。

在某些实施例中，LE底物包括如下所述式II的组合物：

X

Y

R

R

R

环上的每个R

在某些实施例中，所述底物检测人中性粒细胞弹性蛋白酶(“HNE”)。在某些实施例中，用于检测HNE的底物(即“HNE底物”)可以遵循如下所述的式III：

A

式III中的B代表氧化还原部分，与上述式I中的LE底物相似。例如，B可包括苯酚的衍生物，可通过其羟基形成酯，如氧化还原活性醇中间体。这可包括，例如对苯二酚中间体或基于对苯二酚的氧化还原基团。式III中的C代表酰基，例如N-甲氧基琥珀酰基。酰基可有助于提高底物对HNE的敏感性，并且一些酰基，如N-甲氧基琥珀酰基，也可以增大底物的溶解度。

在式III范围内的用于检测HNE的底物的一个具体的、明确的非限制性实例包括3-{[(lS)-1-{[(2S)-1-(5-{[(1S)-l-({4-[(2S)-2-({1-[(2S)-2-[(2S)-2-(3-羧基丙酰胺基)丙酰胺基]丙酰基]吡咯烷-2-基}甲酰胺)-3-甲基丁酰氨基]苯基}氨基甲酰基)-2-甲基丙基]氨基甲酰基}咪唑烷-1-基)-1-氧代丙烷-2-基]氨基甲酰基}乙基]氨基甲酰基}丙酸、以下的化合物C。

如上结合图1和图2的实施例以及式II和式III所述，有理由相信二酯(由两个对称或不对称的α-氨基或α-羟基酸酯组成)将会是更有效的底物，因为生成的双重底物具有两个由白细胞酯酶裂解的潜在靶点。进一步地，底物的分解可能是逐步进行的，由于双底物产生的空间位阻，使得在第一个活性位点的白细胞酯酶的酯水解会较缓慢、或更谨慎。初步的想法是这可能有效地提高电化学分析的特异性，因为非特异性水解不太可能开始逐步水解的级联。然而，申请人惊奇地发现，二酯的效果比单酯差。即使在二酯和单酯的混合物中单酯以极低的浓度(例如约1％)存在，单酯的有效性是占主导的，并决定了整个组合物的有效性。实际上，直到二酯组合物被纯化到单酯的浓度低于1％时，才发现单酯的有效性。在这时，二酯组合物的有效性急剧下降，从而表明单酯是与白细胞酯酶反应的更有效的底物

因此，在一个实施例中，本发明的底物包括单酯，所述单酯是α-氨基酸酯(如丙氨酸酯)或α-羟基酸酯(如乳酸酯)中的一种，对白细胞酯酶具有特异性。所述单酯具有用于参与氧化还原反应的第一部分，和包括氨或醇阻断基团的第二部分。

在一个实施例中，所述组合物包括如公式I所示的单酯，其中A包括氧(O)或NR

在一个实施例中，连接第一和/或第二部分的任何氧连接基团可以被氮连接基团取代，并且氮连接基团可以被氧连接基团取代。

在一个实施例中，第一部分(B)包括取代的或未取代的苯酚衍生物、取代的或未取代的羟基蒽醌、取代的或未取代的氨基酚、或取代的或未取代的羟基菲咯啉中的一种。

在一个实施例中，第二部分(C)包括以下之一：乙酰基(Ac)、苯甲酰基(Bz)、苄基(Bn)、β-甲氧基乙氧甲基(MEM)、二甲氧基三苯甲基(DMT)、甲氧甲基(MOM)、甲氧基三苯甲基[(4-甲氧基苯基)二苯甲基](MMT)、对甲氧基苄基(PMB)、甲硫基甲基、特戊酰基(Piv)、四氢吡喃(THP)、四氢呋喃(THF)、三苯基(Tr)、甲硅烷基(如TMS、TBDMS、TOM、TIPS)、甲基、以及乙氧基乙基(EE)、苄氧羰基(Cbz)；对甲氧基苄基羰基(Moz或MeOZ)、叔丁氧羰基(BOC)、9-芴基甲氧羰基(FMOC)、3,4-二甲氧基苄基(DMPM)、对甲氧基苯基(PMP)、甲苯磺酰基(Ts)、三氯乙氧基羰基(Troc)、芳磺酰基或烷基磺酰基(如硝基苯磺酰基和Nps)。

在一个实施例中，第二部分是具有取代的或未取代的杂环或杂芳基环的磺酰基。

在一个实施例中，将式I进一步细化为如式IV所示的一般结构：

其中第一部分B包括4-羟基苯基

在一个实施例中，R

在一个实施例中，R

在一个实施例中，R

在一个特别的实施例中，R

在一个特别的实施例中，单酯底物的组合物是4-羟基苯基(N-(3-(甲氧基羰基)吡啶-5-磺酰基)-L-丙氨酸酯。

在另一个特别的实施例中，单酯的组合物如式V所示：

参照图6，示出了式V的裂解机理。特别地，白细胞酯酶(LE)在酯水解时，在氧位点上裂解单酯底物。

在一个实施例中，使用已知的和市场上可得的技术和材料，将白细胞酯酶底物丝网印刷到电极传感器条的表面上。

如本文所述，白细胞能够产生白细胞酶，所述白细胞酶能够通过本公开的电化学分析(即ICECEA)来检测和/或定量。

白细胞酶可包含，例如，WO 2010/036930中所述的，在此通过全文引用并入到本文，例如IL-lβ、白细胞弹性蛋白酶、白细胞酯酶和/或明胶酶B，以及人中性粒细胞弹性蛋白酶。白细胞酯酶(“LE”)是白细胞(白血细胞)产生的酯酶。例如，LE是尿检的对象，所述尿检用于检查白细胞/WBC存在和其他与感染有关的异常。人中性粒细胞弹性蛋白酶(“HNE”)也被称为人白细胞弹性蛋白酶(“HLE”)，是一种丝氨酸蛋白酶。它与糜蛋白酶同属一个家族，并具有广泛的底物活性。HNE由中性粒细胞和巨噬细胞分泌，所述中性粒细胞和巨噬细胞是本文所述的五种白细胞中的两种。HNE具有218个氨基酸的长度，并且具有两条天冬酰胺连接的糖链。HNE具有两种形式，被认为是IIa和IIb。

如本文所用的术语“样本(sample)”可以指生物样本，包括在体内或在体外获得的生物组织或液体样本。生物样本可以是，但不限于，分离自包括例如人在内的哺乳动物的体液(如浆液、血液、血浆、血清或尿液)、器官、组织、部分和细胞。生物样本也可包括生物样本(包括组织)的部分。生物样本也可包括来自生物样本的提取物，例如生物流体(如血液、血清、腹膜液和或尿液)。特别感兴趣但明确非限制性的是尿液、痰(例如在被诊断为囊性纤维化的患者中)、腹膜液(例如在被诊断为肝硬化伴腹水的患者中)和其它浆液，所述浆液包含但不限于滑液、胸膜液、心包液、脑脊液(“CSF”)和中耳液。

在某些实施例中，白细胞的存在，即通过检测和/或定量存在于生物样本中的白细胞酶(如LE和/或HNE)的数量来确定，可指示受试者存在感染。这类实施例可在电化学分析中利用本公开的LE和/或HNE底物，特别是本文所述的ICECEA。例如，尿液中LE和/或HNE的存在可指示受试者患有尿路感染(“UTI”)。类似地，滑液中LE和/或HNE的存在可指示受试者患有关节感染，例如但不一定局限于关节假体周围感染(“PJI”)。指示感染存在的这些实例不限于此，因为这仅仅是本公开底物的示例性用途，并且它们可以用于或不用于电化学分析中，例如在ICECEA中。

在某些实施例中。本公开的底物用于指示受试者患有关节假体周围感染(PJI)。PJI是一种全关节置换术后的严重并发症，诊断和治疗对于外科医生而言仍然是一个挑战。建立准确和及时的PJI诊断对于制定治疗决策至关重要。对于出现假体疼痛的的患者，完成检查以排除或诊断感染的存在是很重要的。在大多数情况下，血清学检查是初步筛查测试的选择，其包含红细胞沉降率(ESR)和C-反应蛋白(CRP)。对于血清学标记物升高甚至是高度怀疑感染的患者，下一步是进行关节抽吸以检测滑液。传统上，滑液的细菌培养已被用于PJI诊断。由于细菌培养本身不够敏感，多达30％的感染是培养阴性的，骨科医生还考虑血清学检查、滑液白血细胞计数和多形核的百分比、以及组织学分析的结果来作出诊断。不幸的是，细菌培养和传统的滑液测试可能需要几天到超过一周的时间才能得出结果。

因此，在某些实施例中，将使用本公开的酶底物来检测从疼痛的关节吸出的滑液的LE和/或HNE活性。例如，这可以通过使用本文所述的ICECEA分析来完成。在这类实施例中，LE和/或HNE的活性将被报道为绝对浓度的连续测量。这可以在办公室或手术室进行，在几分钟内就能做出即时检验(point-of-care)决策。

基于人群数据的积累，可以将LE和/或HNE的活性的水平与额外的指标结合以预测存在感染的可能性。额外的指标可包含关节类型、既往感染史和血清学检查结果(ESR和CRP)。外科医生可考虑存在感染的可能性以确定对其患者最合适的治疗算法。存在感染的可能性高的情况下，对PJI的治疗(如假体取出和抗生素垫片放置、切口和清创、或长期抗生素抑制)可根据感染的严重程度等因素考虑。存在感染的可能性是中等的情况下，外科医生可考虑开始治疗或等待额外的诊断结果。最后，存在感染的可能性低或在很大程度上排除感染的情况下，可考虑假体疼痛的其他原因。

除了对感染进行初步诊断外，当前公开的底物，如用于分析(如ICECEA)中，可以用来建立PJI的解决方案，以确定重新植入新假体的正确时机。除血清学标记物和其他滑液检查外，例如上文所述的，LE和/或HNE活性水平可用来确定治疗的成功性。对于LE和/或HNE持续升高的患者，外科医生可选择持续静脉注射抗生素或尝试更换抗生素垫片，以改善彻底解决感染的前景。

在某些实施例中。本公开的底物用于指示受试者患有自发性细菌性腹膜炎(SBP)。SBP是一种严重且危及生命的并发症，其在肝硬化伴腹水患者中相对常见。对于患有这种并发症的患者，快速诊断和早期施用抗生素对生存至关重要，以及住院死亡率可高达20％。对于腹水的患者，出现发烧、精神状态改变和腹部压痛的症状，是SBP的常见征兆。在这种情况下，进行诊断性穿刺，并根据中性粒细胞绝对计数高于250个细胞/mm

因此，在某些实施例中，使用本公开的酶底物，将对从诊断性穿刺获得的腹水检测LE和/或HNE活性。例如，这可以通过使用本文所述的ICECEA分析来完成。使用ICECEA分析，LE和/或HNE的活性将被报道为绝对浓度的连续测量。基于从许多患者中收集到的人群数据积累，将LE和/或HNE的绝对浓度与金标准诊断标准进行比较，以提供SBP存在概率的计算。感染的可能性可用于告知治疗医师最合适的治疗算法。测得的LE和/或HNE水平也可提供重要的预后信息，水平越高表明预后越差。

在某些实施例中，本公开的底物用于指示受试者患有尿路感染(UTI)，其也被称为泌尿生殖道感染。对于具有典型的尿路感染症状(如排尿困难和尿频)并且无阴道分泌物或刺激的健康女性，通常可以仅凭临床症状作出UTI诊断。相反，症状不明确的女性、无症状的孕妇、老年患者和儿童的UTI预测(pre-test)概率要低得多。本公开不限于测试女性的UTI。UTI诊断的金标准是中段尿培养(＞10

因此，在某些实施例中，使用本公开的酶底物，检测有症状患者的中段尿的白细胞酯酶(“LE”)和/或人中性粒细胞弹性蛋白酶(“HNE”)的活性。例如，这可以通过本文所述的ICECEA化分析的使用来完成。基于人群数据，根据LE和/或HNE活性的测量值和额外的因素两者，如出现特定的症状和病人的特征(即年龄、性别、妊娠)，可确定感染的可能性。根据感染的可能性，医生可以决定是否施用口服抗生素。

用于本公开临床应用的人群数据(即，在指示患者受到感染，例如，但不限于PJI、SBP和/或UTI)，可以将LE和/或HNE活性的测量值转换为存在感染的预测概率。检测装置本身可以作为收集和分发此类基于人群数据的媒介。例如，连接电化学生物传感器的智能手机(或类似设备)可以让医生向集中式数据库提供选定的信息，然后所述集中式数据库被用于不断改进感染可能性的计算。生物传感器还可以根据LE和/或HNE活性和额外的指标向外科医生反馈他们各个患者的感染可能性，可用于完善其治疗算法。

在某些实施例中，用于检测白细胞酶的底物(例如LE和/或HNE底物)被纳入分析中。这类分析可包括，例如电化学分析。电化学分析具有成本效益、灵敏度高和简化校准过程。此外，此类方法在血液或浑浊的液体中同样有效。优选的电化学分析包括内部校准的电化学连续酶分析(“ICECEA”)。本公开的LE底物(“TAPTA”)在ICECEA中的使用描述于下文实例1中。ICECEA一般公开在PCT/US2014/03713和U.S.2016/0040209中，其公开的内容在此全部并入到本文。ICECEA在连续实验中利用了无菌预化验校准和电化学酶分析的整合。相信这会产生一个独特形状的安培迹线，其允许有选择性和灵敏性地检测存在于样本中的酶，如LE和HNE。

ICECEA一般遵循U.S.2016/0040209所述的方法。首先，将酶底物(如本公开的LE和/或HNE底物)放置在背景电解质中。接下来，将酶的酶促反应的反应物或生成物加入到第一酶底物/背景电解质中，这就产生了所谓的“第一分析混合物”。接下来，在形成所述第一分析混合物后，测量流过电化学分析电极的电流。接下来，将酶(如LE和/或HNE)加入到所述“第一分析混合物”中以形成“第二分析混合物”，并且在预定的时间段内再次测量电流。酶活性是基于加入酶后所引起的电流随时间的变化决定的。最佳地，在将反应物/生成物加入到酶底物之后加入酶，顺序可以调换，即首先把酶加入到底物中，然后加入反应物/生成物。

所述ICECEA包含电化学测量装置。所述电化学测量装置包含工作电极、参比电极和辅助电极。电流是通过工作电极测量的。所述工作电极可能是贵金属电极、金属氧化物电极、由碳同素异形体组成的电极或修饰电极。所述辅助电极可能是铂丝。所述参比电极可能是Ag/AgCl/NaCl或任何其他参比电极。电化学分析系统还可以仅由工作电极和参比电极制成。测量电流的变化可以通过收集电流的安培迹线来完成。

一般地，在ICECEA中，在电化学分析系统中将反应物/生成物加入到酶底物(在电解质中)包含以下步骤：首先，将反应物/生成物的第一等份试样加入到酶底物(在电解质中)。在所述第一等份试样加入后，测量流过电化学分析系统电极的电流。将反应物/生成物的一个或多个额外的等份试样加入到混合物中，并再次测量流过电化学分析系统电极的电流。优选地，在将酶添加到混合物之前，将反应物/生成物的至少三个等份试样加入到酶底物(在电解质中)。可替换地，在将酶加入到混合物之后，将反应物/生成物等份试样加入到底物(在电解质中)。

酶的酶促活性可以根据在预定时间段内以预定的时间间隔，将反应物/生成物加入到底物之后(在添加酶之前，如本文所述反之亦然)，由测量流过电化学分析系统工作电极的电流而产生的线的斜率来确定。这个方法的优点是，将反应物/生成物加入到底物(在电解质中)、以及加入酶是在相同的容器中并且使用相同的电极。

在至少一个实施例中，描述了一种定制的试剂盒，所述试剂盒包括酶底物和其它在背景电解质中的必要反应物的溶液；酶促反应的氧化还原活性组分的溶液；和被分析的酶的溶液。因此，通过使用任意电化学测量装置和常规电化学电池可以完成安培测量，所述电化学测量装置带有安培测量法，所述常规电化学电池带有浸入含有酶底物的溶液中的工作、参比和对电极。工作电极保持在与参比电极的电势相对的电势E。电势E对于物质的氧化或还原都是足够的，所述物质存在于含有酶促反应的氧化还原活性组分的溶液中。实验通过以下进行：把含有氧化还原活性的溶液的一个或多个已知等份试样加入到搅拌溶液内后，将含有被分析的酶的溶液的一等份试样加入，所述搅拌溶液含有酶底物和其他必要反应物，并且测量流过工作电极的电流。

除非本文另作定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员的通常理解的相同意义。虽然类似或等同于本文所述的任何方法和材料可用于本发明的实践或测试，现对优选的方法和材料进行描述。本文提及的所有公开文本通过全文引用并入到本文。

在本发明的申请日期之前，本文公开的公开文本仅用于提供其公开内容。此外，提供的公开文本的日期可能不同于实际的公开日期，这些日期可能需要单独确认。

本文引用的每项申请和专利，以及每一项申请和专利中引用的每份文件或参考文献、专利或非专利文献(包括在每项已发布专利的公诉期间；“申请引用文件”)，以及与这些申请和专利中的任何一项相对应和/或要求其优先权的每项PCT和外国申请或专利，以及在每份申请引用文件中引用或参考的每份文件，在此均明确地通过全文引用并入本文。更普遍地，本文引用的文件或参考文献，以及每份本文引用的参考文献(包含任何制造商的说明书、用法等)中引用的每份文件或参考文献，在此均明确地通过引用全文并入本文。

以下非限制性的实例用于进一步说明了本公开。

1. 4-((甲苯磺酰基-L-丙氨酰)氧)苯基甲苯磺酰基-L-丙氨酸酯在内部校准的电化学连续酶分析(ICECEA)中的应用

底物4-((甲苯磺酰基-L-丙氨酰)氧)苯基甲苯磺酰基-L-丙氨酸酯如下化合物A(也被称为“TAPTA”)被用作在内部校准的电化学连续酶分析(ICECEA)中测量白细胞酯酶(LE)活性的底物。结果如图4所示。

ICECEA是按照U.S.2016/0040209的一般描述以及上文详细描述进行的。简要地，在预分析(pre-assay)阶段，三(3)个不同的校准步骤是通过将酶底物(“TAPTA”)与必要的反应物加入到具有酶促反应的氧化还原活性组分的溶液中进行。这三个不同的校准步骤在图4中用粗体“a”表示。校准之后，通过将被分析的酶(LE)的一等份试样加入到酶底物溶液中开始分析阶段。这个步骤在图4中用粗体“b”表示。酶促反应之后，测量流过工作电极的电流。在LE浓度范围为0-250μg/L内对酶分析进行校准。LE的酶活性表现出对LE浓度的线性响应和预示感染。

2.式V的单酯的合成

实例2a.4-羟基苯基(N-(3-(甲氧基羰基)吡啶-5-磺酰基)-L-丙氨酸酯(单酯)可由1,4-亚苯基双(N-(3-(甲氧基羰基)吡啶-5-磺酰基)-L-丙氨酸酯部分水解制备(通过修改Hanson等人描述的化合物III的过程合成(Hanson et a1.,Chembiochem2018,19,https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/29679431))。合适的碱包含碱金属氢氧化物、碱土金属氢氧化物、氨、胺等。

实例2b.用氢氧化钠水解。将1,4-亚苯基双(N-(3-(甲氧基羰基)吡啶-5-磺酰基)-L-丙氨酸酯(21mg，0.032mmol)溶解于THF中，并用1M NaOH(0.045mL，139mol％)在30℃下处理4天。蒸发溶剂，将残渣溶于二氯甲烷，用1M HCl润洗，并通过MgSO

实例2c.用三乙胺水解。将1,4-亚苯基双(N-(3-(甲氧基羰基)吡啶-5-磺酰基)-L-丙氨酸酯(98mg，0.151mmol)溶解于二氯甲烷(2mL)和三乙胺(28mg，0.277mmol，184mol％)。加入水(62mg)并将非均质混合物在30℃下搅拌3天。加入1M HCl至PH为1。分离层，用二氯甲烷提取萃取水层两次。将合并的有机萃取物通过MgSO

实例2d.由L-丙氨酸叔丁酯或L-丙氨酸苄酯合成4-羟基苯基(N-(3-(甲氧基羰基)吡啶-5-磺酰基)-L-丙氨酸酯。L-丙氨酸叔丁酯与5-(氯磺酰基)吡啶-3-羧酸甲酯在三乙胺的存在下缩合。在二氯甲烷中用HCl(g)去除叔丁基以得到N-(3-(甲氧羰基)吡啶-5-磺酰基)-L-丙氨酸。该中间体也是由L-丙氨酸苄酯与5-(氯磺酰基)吡啶-3-羧酸甲酯缩合，然后在Pd/C上在EtOAc中加氢制备的。

N-(3-(甲氧羰基)吡啶-5-磺酰基)-L-丙氨酸与过量的对苯二酚在乙腈中在DCC和DMAP的存在下缩合，以得到羟基苯基N-(3-(甲氧羰基)吡啶-5-磺酰基)-L-丙氨酸。可替换地，N-(3-(甲氧羰基)吡啶-5-磺酰基)-L-丙氨酸与对苯二酚单苄醚或单-叔丁氧羰基-对苯二酚[叔丁基4-(羟基苯基)碳酸酯]缩合，然后在钯上在醋酸中加氢或用HCl(g)水解分别都得到4-羟基苯基(N-(3-(甲氧基羰基)吡啶-5-磺酰基)-L-丙氨酸酯。

3. 4-羟基苯基(N-(3-(甲氧基羰基)吡啶-5-磺酰基)-L-丙氨酸酯在丝网印刷电极的应用。

参照图7，说明了在丝网印刷电极条上使用本发明的底物的有效性。特别地，用具有如式V所述结构的底物的丝网印刷电极条。所述电极条与不同浓度的LE(即0.125U/ml-0.35U/ml的LE)接触。

图表清晰地指出在约-0.17V处有明显的还原峰，对应于对苯二酚分子的氧化还原反应，其在酯活性位点处白细胞酯酶裂解单酯时释放。此外，因为还原峰被视为与样本中LE活性以剂量依赖性的方式相关联，丝网印刷电极条不仅被证实能检测LE的存在，还能提供对样本中LE的活性水平或浓度的定量测量，所述定量测量直接对应于酶对单酯的裂解。基于该测量水平，可以确定患者的LE水平是否足够高以指示感染。

上述实例和优选实施例的说明应被视为图解，而不是如权利要求书限定一样限制本发明。易于理解的是，在不背离权利要求书所阐述的本公开的情况下，可以利用前述特征的各种变化和组合。这种变化不被认为是偏离本公开的范围，并且所有的这种变化旨在包括在以下范围内。