用于体外检测血清中金黄色葡萄球菌溶血素的溶血中和活性的溶血素抗原表位肽及其应用

摘要

本发明公开了本发明提供了一种用于体外检测血清中金黄色葡萄球菌溶血素的溶血中和活性的α溶血素抗原表位肽，包含氨基酸序列为SEQ ID NO:10的多肽。本发明还提供了其在制备用于体外检测血清中金黄色葡萄球菌溶血素的溶血中和活性的试剂及方法中的用途。本发明提供的α溶血素抗原表位肽可用于快速、直接评价疫苗接种后人体血清内中和Hla毒素溶血活性的水平。

说明书

技术领域

本发明属于免疫学技术领域，具体地说，涉及一种基于金黄色葡萄球菌溶血素中和表位的体外溶血中和活性检测方法。

背景技术

金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，SA)属于革兰氏阳性球菌，广泛存在于自然界中，是引起人类皮肤和软组织感染、重症肺炎、脓毒血症等疾病的重要病原菌。且致病性较强，其高度的耐药性使得临床上常规抗生素治疗有限。其典型耐药菌代表MRSA,被列为“12类最危险的‘超级细菌’”之一。我国MRSA感染发病率较高，“全国细菌耐药检测网”调查显示，内地医院革兰氏阳性菌中金葡菌的临床分离率占首位，不仅严重威胁人类生命健康，其感染、预防和治疗已经成为目前临床医学难题之一。

α-溶血素(alpha-hemolysin，Hla)是SA分泌的一种分子量为33KD的外毒素孔道蛋白，其单体在哺乳动物细胞膜上自组装形成一个七聚体的跨膜区，再细胞膜上形成流通通道，从而导致机体细胞结构破坏。Hla对哺乳动物红细胞具有普遍溶血作用，对人类和动物机体尤其是肺脏的破坏作用较为严重。

Hla具有良好的抗原性，已成为预防SA感染的疫苗靶标，其中有两个靶向Hla的疫苗已经进入临床试验阶段。疫苗诱导的特异性抗体是其发挥保护性作用的主要物质。基于Hla脱毒或亚单位Hla疫苗具有良好的免疫原性，可诱导高水平的抗Hla抗体。更重要的是这些抗Hla抗体不仅能结合天然的Hla毒素，还能阻断其导致的细胞溶血作用。因此，对血清的体外中和Hla毒素的能力的检测成为疫苗有效性评价的重要指标之一。

该领域的技术难题在于：目前检测Hla毒素中和能力的方法主要依赖于细胞试验。其主要过程包括细胞的培养或获取(红细胞)、毒素与细胞的孵育、裂解细胞数量(比例)的检测、溶血中和活性的计算。从这个流程可以看到，目前Hla毒素中和活性检测存在操作复杂、周期长、实验室之间难以对比等缺点，严重限制了基于Hla毒素的研发进度。

发明内容

疫苗抗原刺激机体产生特异性应答的本质是其表位特异性应答的集合，其中只有部分表位的免疫应答能够发挥保护作用，且某些特定表位与血清的毒素中和活性密切相关，因此，本发明针对上述现有技术在Hla毒素中和活性检测的操作复杂、周期长等问题，筛选出Hla毒素的免疫优势表位，确定了与血清Hla毒素中和活性密切相关的免疫优势表位，并基于该免疫优势表位建立评价方法，通过检测血清种针对特异性表位的抗体水平，作为评价血清中和活性的替代指标。

本发明提供提供一种基于金黄色葡萄球菌溶血素表位多肽的体外溶血中和活性检测方法，可用于快速、直接评价疫苗接种后人体血清中和Hla毒素的水平。具体地，本发明通过检测血清中针对特异性表位区域：Hla的121-138表位多肽(SEQ ID NO:10:FNGNVTGDDSGKIGGLIG)的应答强度，以此评价血清的Hla毒素中和活性。

本发明提供了一种用于体外检测血清中金黄色葡萄球菌溶血素的溶血中和活性的溶血素抗原表位肽，包含氨基酸序列为SEQ ID NO:.10FNGNVTGDDSGKIGGLIG的多肽。

根据本发明的一个实施方案中，还包含偶联在所述多肽N端或C端的多肽标记；优选地，所述多肽标记为生物素标记或荧光标记。

本发明还提供了上述的溶血素抗原表位肽在制备用于体外检测血清中金黄色葡萄球菌溶血素的溶血中和活性试剂中的应用。

本发明进一步提供了一种用于体外检测血清中金黄色葡萄球菌溶血素的溶血中和活性的试剂，其特征在于，包含上述的溶血素抗原表位肽。根据本发明的一个实施方案中，所述溶血素抗原表位肽包被于检测载体上，所述检测载体选自聚苯乙烯微量反应板、胶体金试剂条、磁珠和微流控芯片中的任一种。

根据本发明的一个实施方案中，还包含特异性识别人IgG抗体的第二抗体；

优选地，所述第二抗体选自兔抗人单克隆抗体、兔抗人多克隆抗体、鼠抗人单克隆抗体、鼠抗人多克隆抗体、羊抗人多克隆抗体或羊抗人多克隆抗体中的一种；

优选地，所述第二抗体偶联有激活或猝灭所述特异性荧光基团的配合基团。

本发明进一步提供了一种体外检测血清中金黄色葡萄球菌溶血素的溶血中和活性的方法，包括：

1)将上述的溶血素抗原表位肽包被于检测载体上；

2)将待测血清加入到所述检测载体；

3)测定待测血清中与所述溶血素抗原表位肽结合的抗体反应强度；

4)基于所述抗体反应强度计算所述待测血清中金黄色葡萄球菌溶血素溶血中和活性。

根据本发明的一个实施方案中，步骤3)中所述测定抗体数量是通过显色剂、吸光度或荧光数值的变化实现的。

根据本发明的一个实施方案中，步骤4)中所述计算可通过公式Y＝4.419X-14.04，P＝0.0085实现的，其中，Y为中和50％毒素溶血效应时的血清稀释度的以2为底对数值(Log2)，X为针对SEQ ID NO:.10的荧光中位数值的以为2为底的对数值(Log2)。

本发明的有益效果是：

本发明利用合成的Hla

附图说明

图1为Hla肽库的反应性检测结果。A：热图；B柱状图。

图2为Hla表位肽反应强度与中和活性的相关性分析结果图谱，其中，A-F分别对应于肽段：Hla

图3为血清Hla毒素中和活性与Hla

具体实施方式

下面对本发明的较佳实施例进行详细阐述，以使本发明的优点和特征能更易被本领域人员理解，从而对本发明的保护范围做出更为清楚明确的界定。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1实验材料

1.血清准备：

收集金黄色葡萄球疫苗Ib期临床试验24名受试者疫苗接种后的血清(批号：NCT03966040)。

2.磁珠准备：

将购买的luminex磁珠(Luminex，货号MC10012-ID)按照说明书，利用抗体偶联试剂盒(Luminex，货号40-50016)进行偶联，PBST清洗干净后将链霉亲和素(上海生工)以30μg/250万个磁珠的比例加入，37℃，200rpm避光反应2h，PBST(北京中杉金桥)清洗3次后配置成母液，4℃保存。

3.表位肽的准备：

根据Hla蛋白氨基酸序列信息，合成了一个生物素标记的Hla全长的肽库，从第1个氨基酸开始，每条Hla重叠肽段含18个氨基酸以6个氨基酸步移，相邻的两条肽有12个相同的氨基酸重复，且合成纯度均大于90％，其氨基酸序列的基本信息如(表1)所示：

表1步移重叠肽

实施例2磁珠检测

1.实验步骤

1)将偶联生物素的短肽按2μg/2500个磁珠的比例分别加入6种不同编号的磁珠中，37℃，200rpm避光反应1h，PBST清洗3次后合并6种磁珠，加入PBST，使其理论值为50个/ul。

2)将磁珠按50μl/孔分装至96孔板中，弃上清，将血清按1:200的比例稀释后，加入装有磁珠的96孔板中，每个反应设双复孔，设计不偶联多肽的磁珠为空白对照，37℃，200rpm避光反应1h，PBST清洗3次，弃上清。

3)Goat F(ab')2Anti-Human IgG-Fc(PE)(Abcam)以1:2500稀释后加入到96孔板中，50μl/孔，37℃，200rpm避光反应40min，PBST清洗3次，弃上清，加入PBST 100μl/孔，振荡备用。

4)将96孔板放至Luminex 200(Luminex公司)仪器上进行检测，每种磁珠最少检测50个，测定各孔中6种磁珠的荧光中位数值(MFI：mean fluorescence intensity)。

2.试验结果

基于Hla蛋白的24条18个氨基酸的重叠短肽，并将它们非共价耦合到磁珠上。然后，基于Luminex的方法评估这些潜在表位的免疫反应性，结果如图1中A所示，选取的24份血清对Hla肽库的反应强度做热图，结果如图1中B所示，排名前3位的高活性肽分别为Hla

实施例3血清hla毒素中和活性检测及中和活性相关表位鉴定

1.试验方法

血清准备：

收集金黄色葡萄球疫苗Ib期临床试验24名受试者疫苗接种后的血清。

Hla毒素准备：按照参考文献(Sugawara,T等,2015,Toxicon)进行。

2.试验步骤

1)将人血清按1：100开始2倍倍比稀释8个梯度后，取50μl稀释后的血清与50μlHla(EC50，0.75μg/ml)混合后，在37℃恒温孵育30min，再与100μl 4％兔红细胞孵育1h，离心取上清液，在OD＝540nm处测定其吸光度值，计算其中和50％毒素溶血效应时的血清稀释度(IC50)，作为中和活性的参数。

2)通过SPSS统计学软件将逐个Hla表位肽的MFI值与24个志愿者血清IC50值进行相关性分析，筛选与血清Hla毒素中和活性相关的表位多肽。

3.试验结果

结果如图2中A、B、C、D、E、F分别所示，通过SPSS软件分析Hla肽库的反应强度与血清中和活性的相关性分析表明，其中Hla

实施例4血清hla毒素中和活性相关表位肽Hla121-138的验证

1.试验方法

血清准备：收集Ib期临床288名受试者疫苗接种后14天血清。

Hla毒素准备：参考文献(Sugawara,T等,2015,Toxicon)进行。

2.试验步骤

1)按照上述方法检测血清针对表位肽Hla

2)按照上述方法检测血清的体外Hla毒素中和活性，即IC50。

3)通过SPSS软件分析表位肽Hla

试验结果:

结果如图3所示，二者线性回归方程为Y＝0.5278X+6.842(P<0.0001)，其中，Y为中和50％毒素溶血效应时的血清稀释度的以2为底对数值

(Log2)，X为针对SEQ ID NO:.1的荧光中位数值的以为2为底的对数值(Log2)。因此，可以确定Hla

上述发明内容及具体实施方式意在证明本发明所提供技术方案的实际应用，不应解释为对本发明保护范围的限定。本领域技术人员在本发明的精神和原理内，当可作各种修改、等同替换、或改进。本发明的保护范围以所附权利要求书为准。

序列表

<110> 中国人民解放军陆军军医大学

成都欧林生物科技股份有限公司

<120> 用于体外检测血清中金黄色葡萄球菌溶血素的溶血中和活性的溶血素抗原表位肽及其应用

<141> 2021-04-14

<160> 23

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Ala Asp Ser Asp Ile Asn Ile Lys Thr Gly Thr Thr Asp Ile Gly

1 5 10 15

Ser Asn

<210> 2

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Thr Asp Ile Gly Ser Asn Thr Thr Val Lys Thr Gly Asp Leu Val Thr

1 5 10 15

Tyr Asp

<210> 3

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Asp Leu Val Thr Tyr Asp Lys Glu Asn Gly Met His Lys Lys Val Phe

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Tyr Ser

<210> 4

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Lys Lys Val Phe Tyr Ser Phe Ile Asp Asp Lys Asn His Asn Lys Lys

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Ile Leu

<210> 5

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

His Asn Lys Lys Ile Leu Val Ile Arg Thr Lys Gly Thr Ile Ala Gly

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Gln Tyr

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<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

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<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

Gly Ala Asn Lys Ser Gly Leu Ala Trp Pro Ser Ala Phe Lys Val Gln

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Leu Gln

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<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

Phe Lys Val Gln Leu Gln Leu Pro Asp Asn Glu Val Ala Gln Ile Ser

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<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

Asp Thr Lys Glu Tyr Met Ser Thr Leu Thr Tyr Gly Phe Asn Gly Asn

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Val Thr

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

Phe Asn Gly Asn Val Thr Gly Asp Asp Ser Gly Lys Ile Gly Gly Leu

1 5 10 15

Ile Gly

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<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

Ile Gly Gly Leu Ile Gly Ala Asn Val Ser Ile Gly His Thr Leu Lys

1 5 10 15

Tyr Val

<210> 12

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

His Thr Leu Lys Tyr Val Gln Pro Asp Phe Lys Thr Ile Leu Glu Ser

1 5 10 15

Pro Thr

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<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

Ile Leu Glu Ser Pro Thr Asp Lys Lys Val Gly Trp Lys Val Ile Phe

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Asn Asn

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

Lys Val Ile Phe Asn Asn Met Val Asn Gln Asn Trp Gly Pro Tyr Asp

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

Pro Tyr Asp Arg Asp Ser Trp Asn Pro Val Tyr Gly Asn Gln Leu Phe

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Met

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

Gly Asn Gln Leu Phe Met Lys Thr Arg Asn Gly Ser Met Lys Ala Ala

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Glu Asn

<210> 17

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

Met Lys Ala Ala Glu Asn Phe Leu Asp Pro Asn Lys Ala Ser Ser Leu

1 5 10 15

Leu Ser

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<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

Ala Ser Ser Leu Leu Ser Ser Gly Phe Ser Pro Asp Phe Ala Thr Val

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<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

Phe Ala Thr Val Ile Thr Met Asp Arg Lys Ala Thr Lys Gln Gln Thr

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

Lys Gln Gln Thr Asn Ile Asp Val Ile Tyr Glu Arg Val Arg Asp Asp

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

Val Arg Asp Asp Tyr Gln Leu His Trp Thr Ser Thr Asn Trp Lys Gly

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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Asp Arg Ser Ser Glu Arg Tyr Lys Ile Asp Trp Glu Lys Glu Glu Met

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Thr Asn