一种抗丝状菌污染螺旋藻藻种的筛选方法

摘要

本发明涉及一种抗丝状菌污染螺旋藻藻种的筛选方法，包括如下过程：(1)采用连续感染继代培养的方法获得污染源丝状菌菌种并保存；(2)将各候选螺旋藻藻种分别接种至通用螺旋藻培养基中获得藻液，然后接种所述污染源丝状菌菌种，进行摇床连续培养；将培养后的各候选螺旋藻藻种进行放大培养并多次采收，对每次采收后的螺旋藻培养液补充营养源；(3)对各候选螺旋藻藻种进行抗丝状菌污染的综合评价，评价项目包括生长速率比较以及宏观污染程度表现比较；对以上比较项目进行量化评分，以此比较候选螺旋藻藻种抗丝状菌污染的能力，量化评分的总分越高，则该候选螺旋藻藻种的抗丝状菌污染能力越强。

说明书

技术领域

本发明涉及水产养殖技术领域，具体涉及一种抗丝状菌污染螺旋藻藻种的筛选方法。

背景技术

螺旋藻(Spirulina)系蓝藻门(Cyanophyta)颤藻目(Oscillatoriales)颤藻科(Oscillatoriaceae)螺旋藻属(Spirulina)，目前国内外人工养殖的螺旋藻主要有两种：钝顶螺旋藻(S.platensis)和极大螺旋藻(S.maxima)。因螺旋藻长期培养于自然环境中，易受到杂菌，特别是丝状菌的污染，从而导致养殖螺旋藻大面积死亡，造成减产。且养殖过程中丝状菌大面积污染一般发生在螺旋藻丰产的黄金时段(5月～9月)，一旦发生损失巨大。

大规模养殖表明，丝状菌污染的发生与藻种本身有关。有的藻种容易被污染，而有的藻种则不容易被污染。因此，不断的分离、培养、筛选适合于大规模养殖抗丝状菌污染的螺旋藻藻种，是实现螺旋藻产业化可持续生产的重要条件。

丝状菌是一大类细胞连成丝状的多种微生物的统称，包括丝状细菌、丝状蓝细菌和丝状真菌等。大体可分7群：①能形成衣鞘的G–细菌，如浮游球衣菌(Sphaerotilusnatans)和水束缚杆菌(Halicomenobacterhydrossis)；②有衣鞘G+细菌；③无衣鞘，丝体卷曲，多细胞无色丝状体细菌，如泥生念珠状细菌(Nostocoidalimicola)；④丝状体细长、蟠曲、不分枝，菌丝伸出污泥，可围绕凝絮体生长，细胞分隔不明显，如细小微丝菌(Microthrixparvicella)；⑤菌丝体直而短、不分枝，由多个细胞连成的G–细菌，无衣鞘；⑥滑行运动的丝状细菌，如贝日阿托氏菌(Beggiatoaspp)等；⑦其他群，如丝状真菌，部分诺卡氏菌(Nocardiaspp)和链球菌(Streptococcusspp)等。因此要分离得到一种或多种丝状菌，并纯化、储存非常困难，且单一的丝状菌也不能模拟实际养殖情况。抗丝状菌污染螺旋藻藻种的选育及藻种耐丝状菌污染特性测试技术体系的成功建立是较为经济有效的方法，这样可以避免藻种的盲目投入并减少生产过程中的损失。

目前，螺旋藻大规模养殖中防止丝状菌污染的方法有以下几类：(1)加强对养殖情况的监测，一旦镜检发现藻体被易感杂菌污染，即在培养液中添加NaHCO

现有技术中如中国专利201210082738.8公开了适合大规模生产应用螺旋藻品系的筛选方法，该方法是将候选品系的基因组DNA经过特定引物HIPS-TG扩增，并在电泳分析后采用软件构建藻株间的聚类图；若候选品系具有1050bp和760bp的特异DNA电泳条带，且能与已知生产性状好的品系聚到一起，则候选品系生产性状好，适用于大规模培植生产。再如中国专利200610052234.6公开了一种筛选适合大规模生产的优质螺旋藻品系的方法，通过设计16S-23SrRNA转录间隔区的引物，应用PCR技术克隆并测定7种待测品系的基因序列，依据各序列的相似程度将7种待测品系分为两类，一类环境适应能力强、一类环境适应能力差(这7中品系环境适应能力已知)，再将候选品系的16S-23SrRNA序列进行比对，若能与环境适应能力强的一类聚成一类，则该候选品系性能优良，能适合大规模生产。由此可见，现有技术中常采用基因扩增、转录及克隆的方法与聚类的构建来进行螺旋藻种的筛选。以上现有技术公开的方法适用实验室中小规模进行且方法复杂，未涉及如何筛选抗丝状菌污染藻种。

发明内容

为了解决如何进行抗丝状菌污染螺旋藻藻种筛选的技术问题，而提供一种抗丝状菌污染螺旋藻藻种的筛选方法。本发明方法能够精确、有效地筛选出具有较好地抗丝状菌污染能力的螺旋藻藻种，且筛选结果可靠，与实际生产表现相符。

为了达到以上目的，本发明通过以下技术方案实现：

一种抗丝状菌污染螺旋藻藻种的筛选方法，包括如下过程：

(1)污染源丝状菌菌种获得：从被丝状菌污染的螺旋藻培养池中取培养液，采用连续感染继代培养的方法获得污染源丝状菌菌种，并保存；

(2)各候选螺旋藻培养：模拟实际大生产环境配制通用螺旋藻培养基，将各候选螺旋藻的藻种分别接种至所述培养基中获得藻液，再接种所述污染源丝状菌菌种至所述藻液中进行摇床连续培养；然后将培养后的各候选螺旋藻种接种至培养装置中进行放大培养并多次采收，对每次采收后的螺旋藻培养液补充营养源；

(3)对各候选螺旋藻种进行抗丝状菌污染的综合评价，评价项目包括生长速率的比较以及宏观污染程度表现的比较，对各候选螺旋藻按比较的结果进行排序；

对以上所述评价项目的排序结果进行量化评分，以此比较各候选螺旋藻藻种抗丝状菌污染的能力，量化评分的总分越高，则该候选螺旋藻的藻种抗丝状菌污染能力越强。

进一步地，所述生长速率的比较方法为：记录采收前后藻液的OD变化值，记为△OD，用以表示各采收期螺旋藻的生长速率，并以各采收期螺旋藻生长速率的平均值表示平均生长速率；按照平均生长速率的大小对各候选螺旋藻进行比较排序；

所述宏观污染程度表现的比较方法为：采用显微镜观察培养期间藻液中各候选螺旋藻的藻体被丝状菌菌群污染情况以及藻液外观变化情况，按宏观污染程度表现对各候选螺旋藻进行比较排序。

进一步地，所述候选螺旋藻种包括GFJ①、TFJ①、FJ、FJⅡ、TFJ②、FJD

进一步地，步骤(1)中所述连续感染继代培养的方法是：从被丝状菌污染的螺旋藻培养池中取培养液进行镜检，确认丝状结构，然后进行过滤并得到滤渣即为丝状菌群体菌种；按照1g/20mL的接种量将所述丝状菌群体菌种接种到通用螺旋藻培养基进行培养，培养条件：在4000Lux光照强度、12h/d的光照时间下置于摇床培养，摇床转速100转/分，暗周期时静止，光照时温度为28±2℃，暗周期时20～26℃；培养3天后，再进行镜检，然后过滤，得到的滤渣部分再加入到螺旋藻通用培养基中进行培养，重复3-4次，最后获得污染源丝状菌菌种，保存丝状菌群体菌种，OD值＝0.8，即可使用。

再进一步地，所述镜检是在光学显微镜目镜10倍、物镜10倍下进行的检查；所述过滤采用孔径为30～50微米的滤纸。

进一步地，步骤(2)中所述培养装置的容量为30L～100L。

进一步地，步骤(2)中所述放大培养并多次采收的过程是：在培养过程中需监测水温、水位、OD值和pH，对各候选螺旋藻每3天采收一次，采收后培养液保留浓度OD值为0.2，对每次采收后的螺旋藻培养液补充营养源再培养并进行5-10次采收。

进一步地，步骤(2)中，放大培养前：所述各候选螺旋藻藻种在所述通用螺旋藻培养基中的接种量为使获得所述藻液的初始OD值等于0.3，所述藻液为100mL/瓶；

所述丝状菌群体菌种在所述藻液中的接种量为10mL/100mL，所述摇床连续培养的条件为：在4000Lux光照强度、12h/d的光照时间下置于摇床培养，摇床转速100转/分，暗周期时静止，光照时温度为28±2℃，暗周期时20～26℃；所述摇床连续培养的时间为8～15天。

进一步地，步骤(2)中所述营养源，按下式补充添加：NaHCO

进一步地，步骤(3)中所述抗丝状菌污染的综合评价项目还包括螺旋藻采收时的难易程度、采收得到的螺旋藻卫生状况及形态稳定性。综合评价的量化评分自行制定可量化的标准内容。

有益技术效果：本发明方法建立了有效的丝状菌群体菌种的继代培养方法，得到的污染菌群可以完全模拟实际生产中污染环境。本发明方法建立了有效的抗丝状菌污染螺旋藻藻种的筛选方法，由于采用了与生产实际紧密结合的综合评价指标，能够有效筛选出抗丝状菌污染能力强、生长快、品质好等综合优点的藻种，能够为大规模生产提供优良的抗丝状菌污染的螺旋藻藻种。

附图说明

图1为螺旋藻感染丝状菌四个过程种的显微镜图，放大倍数为100倍，其中a表示螺旋藻刚开始感染丝状菌，b表示螺旋藻感染后藻团扩大，c表示螺旋藻感染严重，d表示螺旋在严重感染至藻体破碎。

具体实施方式

下面将结合本发明的实施例和附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。以下对至少一个示例性实施例的描述实际上仅仅是说明性的，决不作为对本发明及其应用或使用的任何限制。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

除非另外具体说明，否则在这些实施例中阐述的数值不限制本发明的范围。对于相关领域普通技术人员已知的技术、方法可能不作详细讨论，但在适当情况下，所述技术、方法应当被视为说明书的一部分。在这里示出和讨论的所有示例中，任何具体值应被解释为仅仅是示例性的，而不是作为限制。因此，示例性实施例的其它示例可以具有不同的值。

实施例1

一种抗丝状菌污染螺旋藻藻种的筛选方法，包括如下过程：

(1)污染源群体菌种获得：

从被丝状菌污染的螺旋藻培养池中取培养液，光学显微镜目镜10倍、物镜10倍下镜检，确认丝状结构，用孔径为30～50微米的滤纸过滤，过滤得到的滤渣即“丝状菌群体菌种”，将5g丝状菌群体菌种加入到100mL螺旋藻通用培养基进行培养，培养条件：在4000Lux光照强度、12h/d的光照时间下置于摇床培养，摇床转速100转/分，暗周期时静止，光照时温度为28±2℃，暗周期时20～26℃；培养3天后，再进行镜检，过滤，得到的滤渣再加入到100mL螺旋藻通用培养基进行培养，重复3次，保存丝状菌群体菌种，OD值＝0.8，即可使用。

(2)螺旋藻培养：

候选螺旋藻藻种：GFJ①、TFJ①、FJ、FJⅡ、TFJ②、FJD

取未经任何处理的螺旋藻养殖地区水域(程海水)的水配制成通用螺旋藻培养基(Zarrouk培养基，模拟实际大生产环境)，将各候选螺旋藻种分别接种至所述培养基中获得藻液(接种量为使藻液的初始OD值＝0.3，藻液100mL/瓶)；再接种步骤(1)中所述污染源群体菌种10mL至所述藻液中进行摇床连续培养10天，摇床连续培养的条件为：在4000Lux光照强度、12h/d的光照时间下置于摇床培养，摇床转速100转/分，暗周期时静止，光照时温度为28±2℃，暗周期时20～26℃；

然后将各候选螺旋藻种培养10天后得到的藻液放入40L的培养箱中进行放大培养，接种量为使初始OD值＝0.3、水位控制在20.5cm，放大培养的过程中监测水温、水位、OD和pH；每天8:30、15:00、17:00测定水温；每天上午测定水位，若不足补水至刻度20.5cm，每天下午测定OD和pH；

每3天分别对放大培养的各候选螺旋藻采收一次，采收后保留螺旋藻培养液OD值为0.2，记录采收前藻液OD值记为OD

对采收后的剩余螺旋藻培养液中补入营养源，所加入的营养源按下式添加：NaHCO

(3)对各候选螺旋藻种进行抗污性的综合评价，评价项目包括如下：

①生长速率的比较：用△OD表示该采收期的生长速率，并以各采收期的平均生长速率的平均值表示各候选螺旋藻藻种的平均生长速率；

实验期间共采收9次，各采收期间的生长速率(△OD)的结果见表1；

表1各候选螺旋藻藻种的各采收期间的生长速率(△OD)的值

表2各候选螺旋藻藻种的平均生长速率

由表1和表2可知，生长速率方面表现由好及差依次为CH＞FJ＞FJⅡ＞JXⅡ＞FJXY＞TFJ①＞TFJ②＞GFJ①＞FJD

②宏观污染程度表现的比较：采用显微镜观察采收得到的螺旋藻并按污染程度表现进行分类比较；可参照表3进行分类比较：

表3宏观污染程度表现

③其他项目比较：包括采收难易度、采收得到的螺旋藻形态稳定性、及藻液卫生状况的比较；

采收难易度方面：6310XY、CH-5表现较差，JXⅡ表现一般，其他表现较好；

稳定性形态方面：各藻种基本保持稳定，实验过程经历了20多天，体长有些变化，但并未小到难以采收的程度，其中FJ、FJⅡ、TFJ②、FJD

卫生状况方面：TFJ②、FJ⑦、CH表现较差，其表现是藻泥较脏，有红褐色沉淀夹杂其中，其他藻种表现尚可。

对以上比较项目进行量化评分以此比较综合抗污染能力，自行制定量化标准，可参照如下方式进行量化评分：

生长速率，分为6个级别(两个藻种评为同一级)，表现最好者得5分，表现次之者得4分，以此类推，表现最差者不得分；

宏观污染程度，严重污染者扣3分，轻微污染者扣1分，不污染者不扣分；

采收难易度，表现好者得2分，一般者得1分，不好者不得分；

卫生状况，表现好者得2分，一般者得1分，不好者不得分；

形态稳定性，表现好者得3分，一般者得1分，表现不好者不得分；

评分表见表4：

表4综合抗污染能力的量化评分

由表7可以看出，量化评分的总分越高，则该候选螺旋藻种的抗污染能力越强。综合抗污染能力方面FJ、FJⅡ、JXⅡ、FJXY表现较好，CH、TFJ②、GFJ①、FJD

整个实验过程，实验条件基本模拟了生产环境，实验结果与生产表现基本相符，这说明本发明方法对藻种的选育有一定的意义，可以作为筛选抗污染藻种的依据。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。