一种调控药食两用真菌混合培养过程中均衡生长方法

摘要

本发明公开了一种调控药食两用真菌混合培养过程中均衡生长方法，涉及食用菌混合发酵技术领域，具体为一种调控药食两用真菌混合培养过程中均衡生长方法，包括以下步骤：(1)首先制备不同药食用真菌母种斜面，培养温度21～25℃，相对湿度50～70％；(2)待斜面菌丝成熟后，分别接种添加有机羧酸的改良PDA液体培养基，培养温度23～25℃，转速200～250rpm，培养时间48～96h；(3)按照5～10％的相同接种量，将不同的药食用真菌种子液接种至添加有机羧酸的发酵培养基中，培养温度23～25℃，转速200～250rpm，培养时间120～168h，发酵过程中进行光暗节律培养或暗培养或光照培养。该发明能够调控药食两用真菌混合培养过程中菌丝体均衡生长的方法，可以有效促进食用菌混合发酵产品的开发。

说明书

技术领域

本发明涉及食用菌混合发酵技术领域，具体为一种调控药食两用真菌混合培养过程中均衡生长方法。

背景技术

药用真菌是一类具有预防和治疗疾病功能的微生物，绝大多数属于蕈菌中的担子菌亚门，也有少数属于子囊菌亚门。其中有许多种类可以药食同用，例如香菇、猴头菇、木耳、银耳、茯苓、竹荪、羊肚菌和牛肝菌等。药食用真菌含有多种药理活性成分，主要有多糖、生物碱、萜类物质、甾醇类物质以及蛋白或蛋白糖等。药理学研究表明许多药食用真菌具有抗肿瘤、免疫调节、抗菌、抗病毒、预防心脑血管疾病、保肝护肝和抗氧化等药理作用。

目前食用菌或药食两用真菌单独培养和发酵的研究和应用已经很广泛，方法和技术也比较成熟。但是药食用真菌混合培养的研究并不多，主要原因是混合培养过程中不同菌株之间有影响、有竞争，不容易控制不同菌株的均衡生长。武忠伟等人先后研究了冬虫夏草与韩芝液体发酵混合培养特性和冬虫夏草与韩芝液体混合发酵条件，两篇文章内容基本相同，主要采用显微镜观察方法区别单核菌丝和双核菌丝来判断菌株的均衡生长情况，但并未对不同的真菌生物量进行定量分析(微生物学杂志，2007，27(006):60-63；食品科学，2008，29(005):307-310)。发明专利CN201410294324.0公开了一种保健口服液中含有虫草发酵液，香菇发酵液和灵芝发酵液，但这三种发酵液是分别培养完成后再进行混合，并不是混合培养。

发明内容

药食用真菌发酵产品在疾病预防治疗和身体保健方面发挥了重要的作用，但过往的产品和工艺大多是单一品种的药食用真菌发酵，产品生物活性物质和功效相对单一，将多种食药用真菌进行混合发酵培养，使产品中富含多种生物活性物质并能发挥多种药理功效，是未来食药用真菌研究和应用的方向之一；目前混合发酵研究中一个重要问题是如何实现不同菌株之间的均衡生长，只有解决这一关键问题，才能确保生物活性物质的多样性和功效的多重性。

为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：一种调控药食两用真菌混合培养过程中均衡生长方法，包括以下步骤：

(1)首先制备不同药食用真菌母种斜面，培养温度21～25℃，相对湿度50～70％；

(2)待斜面菌丝成熟后，分别接种添加有机羧酸的改良PDA液体培养基，培养温度23～25℃，转速200～250rpm，培养时间48～96h；

(3)按照5～10％的相同接种量，将不同的药食用真菌种子液接种至添加有机羧酸的发酵培养基中，培养温度23～25℃，转速200～250rpm，培养时间120～168h，发酵过程中进行光暗节律培养或暗培养或光照培养；

(4)发酵结束后分别测定不同培养方式下总生物量、稀释涂布法测定不同菌株的生物量以及生物活性物质核苷类、萜类和甾醇类的总含量。

可选的，所述步骤(1)中所涉及的药食用真菌包括灵芝、虫草、金耳、蜜环菌、猴头菇、香菇和灰树花中的任何两种或两种以上混合发酵。

可选的，所述步骤(2)中PDA培养基所添加的有机羧酸包括柠檬酸、抗坏血酸、苹果酸、草酸、酒石酸、苯甲酸、咖啡酸、儿茶酸、琥珀酸、熊果酸和丙酮酸中的一种或多种有机羧酸混合物。

可选的，所述步骤(2)中PDA培养基所添加的有机羧酸含量为0.05～0.6％。

可选的，所述步骤(2)中改良PDA培养基中添加慢效氮源，并且碳氮比控制在1:1～3:1。

可选的，所述步骤(3)中发酵培养基中慢效碳源可以是麦芽糊精、玉米淀粉、土豆浸出物、土豆淀粉中的一种或多种；慢效氮源可以是豆粉、鱼胨粉、花生饼粉、棉籽饼粉中的一种或多种，并且碳氮比控制在1:1～4:1。

可选的，所述步骤(3)中混合发酵过程中光暗时间比例为3:1～1:2。

本发明提供了一种调控药食两用真菌混合培养过程中均衡生长方法，具备以下有益效果：

本发明的有益效果是实现了多种药食用真菌混合培养的均衡生长，实验数据显示在添加有有机羧酸和光暗交替培养组合中不同菌株两两之间的生物量比例范围在0.89～1.06之间，达到了均衡生长的目的。另外，以多糖、腺苷和甾醇为代表的生物活性物质的含量比单一培养分别提高了18.3～42.1％、12.6～18.5％和7.4～15.6％。

具体实施方式

下面，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。

实施案例一

本发明提供一种技术方案：一种调控药食两用真菌混合培养过程中均衡生长方法中，药食用真菌母种的制备：首先从保存的不同药食用真菌灵芝、虫草、蜜环菌和灰树花工作库甘油管中各取100μL接种PDA斜面，23℃培养，湿度55％左右，培养7天，待菌丝布满斜面后准备接种种子瓶；

种子液培养：分别用250mL大小的三角瓶配制种子培养液50mL，培养基成分为PDA培养基加入2％麦芽糊精，3％大豆粉，0.12％苹果酸，按照接种量为5平方厘米斜面，分别接种4种真菌，然后在25℃，220rpm条件下培养72h；

混合发酵培养：按照6％的接种量，分别从不同的药食用真菌种子液中取6ml接种到一个发酵瓶中，发酵瓶大小为500mL，装液量100mL，发酵培养基成分中含有葡萄糖2％，麦芽糊精2％，玉米淀粉3％，酵母浸粉1％，大豆粉3％，草酸0.25％，磷酸氢二钾0.25％，七水硫酸镁0.2％，pH6.5，培养条件25℃，转速230rpm，培养时间168h，其中光照总时间为84h。

分析检测：分别采用干重法、分光光度法、稀释涂布法和高效液相色谱法测定总生物量、单品种生物量比例、多糖、腺苷、麦角甾醇、灵芝酸A、虫草素，结果显示总生物量为65.3g/L，单品种生物量比例为1:1.15：1.2：1.08，多糖含量为9.2％，腺苷含量为2.1mg/g，麦角甾醇为6.9mg/g，灵芝酸A为1.5mg/L，虫草素为1.1mg/L。

实施案例二

一种调控药食两用真菌混合培养过程中均衡生长方法中，药食用真菌母种的制备：首先从保存的不同药食用真菌灵芝和虫草工作库甘油管中各取100μL接种PDA斜面，23℃培养，湿度55％左右，培养7天，待菌丝布满斜面后准备接种种子瓶；

种子液培养：分别用250mL大小的三角瓶配制种子培养液50mL，培养基成分为PDA培养基加入2％麦芽糊精，3％大豆粉，0.12％苹果酸，按照接种量为5平方厘米斜面，分别接种2种真菌，然后在25℃，220rpm条件下培养72h；

混合发酵培养：按照6％的接种量，分别从不同的药食用真菌种子液中取6ml接种到一个发酵瓶中，发酵瓶大小为500mL，装液量100mL，发酵培养基成分中含有葡萄糖2％，麦芽糊精2％，玉米淀粉3％，酵母浸粉1％，大豆粉3％，柠檬酸0.25％，磷酸氢二钾0.25％，七水硫酸镁0.2％，pH6.5，培养条件25℃，转速230rpm，培养时间168h，其中光照总时间为84h。

分析检测：分别采用干重法、分光光度法、稀释涂布法和高效液相色谱法测定总生物量、单品种生物量比例、多糖、腺苷、麦角甾醇、灵芝酸A、虫草素，结果显示总生物量为45.8g/L，单品种生物量比例为1:1.2，多糖含量为5.7％，腺苷含量为1.6mg/L，麦角甾醇为4.8mg/L，灵芝酸A为2.6mg/L，虫草素为1.2mg/L。

实施案例三

一种调控药食两用真菌混合培养过程中均衡生长方法中，药食用真菌母种的制备：首先从保存的不同药食用真菌香菇、金耳和灰树花工作库甘油管中各取100μL接种PDA斜面，23℃培养，湿度55％左右，培养7天，待菌丝布满斜面后准备接种种子瓶；

种子液培养：分别用250mL大小的三角瓶配制种子培养液50mL，培养基成分为PDA培养基加入2％麦芽糊精，3％大豆粉，0.25％酒石酸，按照接种量为5平方厘米斜面，分别接种3种真菌，然后在25℃，220rpm条件下培养72h；

混合发酵培养：按照6％的接种量，分别从不同的药食用真菌种子液中取6ml接种到一个发酵瓶中，发酵瓶大小为500mL，装液量100mL，发酵培养基成分中含有葡萄糖2％，麦芽糊精2％，玉米淀粉3％，酵母浸粉1％，大豆粉3％，酒石酸0.25％，磷酸氢二钾0.25％，七水硫酸镁0.2％，pH6.5，培养条件25℃，转速230rpm，培养时间168h，其中光照总时间为100h。

分析检测：分别采用干重法、分光光度法、稀释涂布法和高效液相色谱法测定总生物量、单品种生物量比例、多糖、腺苷、麦角甾醇，结果显示总生物量为71.3g/L，单品种生物量比例为1:0.89:1.17，多糖含量为11.5％，腺苷含量为0.7mg/L，麦角甾醇为3.5mg/L。

实施案例四

一种调控药食两用真菌混合培养过程中均衡生长方法中，药食用真菌母种的制备：首先从保存的不同药食用真菌灵芝、虫草、蜜环菌和灰树花工作库甘油管中各取100μL接种PDA斜面，23℃培养，湿度55％左右，培养7天，待菌丝布满斜面后准备接种种子瓶；

种子液培养：分别用250mL大小的三角瓶配制种子培养液50mL，培养基成分为PDA培养基加入2％麦芽糊精，3％大豆粉，0.15％草酸，按照接种量为5平方厘米斜面，分别接种4种真菌，然后在25℃，220rpm条件下培养72h；

混合发酵培养：按照6％的接种量，分别从不同的药食用真菌种子液中取6ml接种到一个发酵瓶中，发酵瓶大小为500mL，装液量100mL，发酵培养基成分中含有葡萄糖2％，麦芽糊精3％，玉米淀粉3.5％，酵母浸粉2％，大豆粉3％，草酸0.5％，磷酸氢二钾0.25％，七水硫酸镁0.2％，pH6.5，培养条件25℃，转速230rpm，培养时间168h，其中光照总时间为72h。

分析检测：分别采用干重法、分光光度法、稀释涂布法和高效液相色谱法测定总生物量、单品种生物量比例、多糖、腺苷、麦角甾醇、灵芝酸A、虫草素，结果显示总生物量为75.5g/L，单品种生物量比例为1:1.08:1.19：0.98，多糖含量为10.7mg/L，腺苷含量为2.3mg/L，麦角甾醇为5.4mg/L，灵芝酸A为1.7mg/L，虫草素为0.9mg/L。

实施案例五

一种调控药食两用真菌混合培养过程中均衡生长方法中，药食用真菌母种的制备：首先从保存的不同药食用真菌香菇、猴头菇、金耳和虫草工作库甘油管中各取100μL接种PDA斜面，23℃培养，湿度55％左右，培养7天，待菌丝布满斜面后准备接种种子瓶；

种子液培养：分别用250mL大小的三角瓶配制种子培养液50mL，培养基成分为PDA培养基加入2％麦芽糊精，3％大豆粉，0.15％咖啡酸，按照接种量为5平方厘米斜面，分别接种4种真菌，然后在25℃，220rpm条件下培养72h；

混合发酵培养：按照6％的接种量，分别从不同的药食用真菌种子液中取6ml接种到一个发酵瓶中，发酵瓶大小为500mL，装液量100mL，发酵培养基成分中含有葡萄糖2％，麦芽糊精2％，玉米淀粉3％，酵母浸粉1％，大豆粉3％，柠檬酸0.25％，磷酸氢二钾0.25％，七水硫酸镁0.2％，pH6.5，培养条件25℃，转速230rpm，培养时间168h，其中光照总时间为84h。

分析检测：分别采用干重法、分光光度法、稀释涂布法和高效液相色谱法测定总生物量、单品种生物量比例、多糖、腺苷、麦角甾醇、虫草素，结果显示总生物量为83.4g/L，单品种生物量比例为1:0.95:0.82:1.1，多糖含量为11.5％，腺苷含量为1.9mg/L，麦角甾醇为5.8mg/L，虫草素为1.3mg/L。

实施案例六

一种调控药食两用真菌混合培养过程中均衡生长方法中，药食用真菌母种的制备：首先从保存的不同药食用真菌香菇、猴头菇、金耳和虫草工作库甘油管中各取100μL接种PDA斜面，23℃培养，湿度55％左右，培养7天，待菌丝布满斜面后准备接种种子瓶；

种子液培养：分别用250mL大小的三角瓶配制种子培养液50mL，培养基成分为PDA培养基加入2％麦芽糊精，3％大豆粉，0.12％草酸，按照接种量为5平方厘米斜面，分别接种4种真菌，然后在25℃，220rpm条件下培养72h；

混合发酵培养：按照6％的接种量，分别从不同的药食用真菌种子液中取6ml接种到一个发酵瓶中，发酵瓶大小为500mL，装液量100mL，发酵培养基成分中含有葡萄糖2％，麦芽糊精2.5％，玉米淀粉3％，酵母浸粉2％，大豆粉3.5％，柠檬酸0.35％，磷酸氢二钾0.25％，七水硫酸镁0.2％，pH6.5，培养条件25℃，转速230rpm，培养时间168h，其中光照总时间为72h。

分析检测：分别采用干重法、分光光度法、稀释涂布法和高效液相色谱法测定总生物量、单品种生物量比例、多糖、腺苷、麦角甾醇、虫草素，结果显示总生物量为80.4g/L，单品种生物量比例为1:1.05:1.08:1.15，多糖含量为9.5％，腺苷含量为2.4mg/L，麦角甾醇为7.8mg/L，虫草素为1.5mg/L。

对比实施例1

药食用真菌母种的制备：首先从保存的不同药食用真菌灵芝、虫草、蜜环菌和灰树花工作库甘油管中各取100μL接种PDA斜面，23℃培养，湿度55％左右，培养7天，待菌丝布满斜面后准备接种种子瓶；

种子液培养：分别用250mL大小的三角瓶配制种子培养液50mL，培养基成分为PDA培养基加入2％麦芽糊精，3％大豆粉，按照接种量为5平方厘米斜面，分别接种4种真菌，然后在25℃，220rpm条件下培养72h；

混合发酵培养：按照6％的接种量，分别从不同的药食用真菌种子液中取6ml接种到一个发酵瓶中，发酵瓶大小为500mL，装液量100mL，发酵培养基成分中含有葡萄糖2％，麦芽糊精2％，酵母浸粉1％，大豆粉3％，磷酸氢二钾0.25％，七水硫酸镁0.2％，pH6.5，培养条件25℃，转速230rpm，培养时间168h。

分析检测：分别采用干重法、分光光度法、稀释涂布法和高效液相色谱法测定总生物量、单品种生物量比例、多糖、腺苷、麦角甾醇、灵芝酸A、虫草素，结果显示总生物量为38.9g/L，单品种生物量比例为1:2.5：3.21：3.5，多糖含量为4.3％，腺苷含量为1.5mg/g，麦角甾醇为3.9mg/g，灵芝酸A为0.5mg/L，虫草素为0.7mg/L。

对比实施例2

药食用真菌母种的制备：首先从保存的不同药食用真菌灵芝、虫草、蜜环菌和灰树花工作库甘油管中各取100μL接种PDA斜面，23℃培养，湿度55％左右，培养7天，待菌丝布满斜面后准备接种种子瓶；

种子液培养：分别用250mL大小的三角瓶配制种子培养液50mL，培养基成分为PDA培养基，按照接种量为5平方厘米斜面，分别接种4种真菌，然后在25℃，220rpm条件下培养72h；

混合发酵培养：按照6％的接种量，分别从不同的药食用真菌种子液中取6ml接种到一个发酵瓶中，发酵瓶大小为500mL，装液量100mL，发酵培养基成分中含有葡萄糖2％，土豆浸出物5％，酵母浸粉1％，蛋白胨2％，磷酸氢二钾0.25％，七水硫酸镁0.2％，pH6.5，培养条件25℃，转速230rpm，培养时间168h。

分析检测：分别采用干重法、分光光度法、稀释涂布法和高效液相色谱法测定总生物量、单品种生物量比例、多糖、腺苷、麦角甾醇、灵芝酸A、虫草素，结果显示总生物量为32.9g/L，单品种生物量比例为1:2.3：2.15：1.84，多糖含量为3.9％，腺苷含量为1.6mg/g，麦角甾醇为3.5mg/g，灵芝酸A为0.4mg/L，虫草素为0.8mg/L。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。