兔病毒性出血症病毒2型及其在制备灭活疫苗中的应用

摘要

本发明公开了一种兔病毒性出血症病毒2型及其在制备灭活疫苗中的应用。该毒株保藏在中国普通微生物菌种保藏管理中心，其保藏名称为兔病毒性出血症病毒CD2020株，保藏编号为：CGMCC NO.21092。该毒株与目前国内分离兔病毒性出血症病毒序列比对差异较大，其中主要抗原氨基酸的同源性仅88.4％。当前的兔病毒性出血症疫苗对该毒株没有有效的保护作用。因此本发明提出用兔病毒性出血症病毒CD2020株制备油乳灭活疫苗，该疫苗具有良好的免疫效果，免疫兔子后副作用小，安全性高，对外界环境无任何不良影响。

说明书

技术领域

本发明涉及兽医传染病技术领域，具体而言，涉及一种兔病毒性出血症病毒2型及其在制备灭活疫苗中的应用。

背景技术

兔病毒性出血症2型病毒(Rabbit hemorrhagic disease virus 2，RHDV2)可导致兔群出现兔病毒性出血症。该病具有较高的发病率和病亡率。发病兔群主要呈现出肝脾肿大、肺脏出血等病理变化。

该病毒于2010年首次在法国的一家养殖场被检测到。相较于经典的兔病毒性出血症病毒(Rabbit hemorrhagic disease virus，RHDV)，其感染的宿主品种和日龄范围更广，甚至可以导致11日龄幼兔发病且死亡。由于近年来出现的RHDV2病毒能够突破经典RHDV灭活疫苗的免疫保护作用，免疫传统毒株RHDV的疫苗不能产生很好的交叉保护作用，该病毒已在意大利、英国、西班牙、德国、挪威、澳大利亚等国家形成广泛流行。

2020年5月21日，农村农业部畜牧兽医局发布疫情通告称，四川省成都市金堂县有兔场发生兔出血症疫情，造成1500只兔子死亡，经四川省动物疫病预防控制中心确诊为兔出血症2型。这意味着RHDV2型首次在我国发生。还没有疫苗可以用来预防RHDV2造成的兔出血症。目前，最好的预防措施就是采取组织灭活疫苗进行免疫。

发明内容

本发明要解决的技术问题是，提供一种引起的兔病毒性出血症的RHDV2及其在制备灭活疫苗中的应用。本发明利用该RHDV2型病毒CD2020制备了一种兔病毒性出血症油乳灭活疫苗(CD2020株)，以预防RHDV2型病毒感染造成的兔病毒性出血症的流行。该疫苗副作用小，且具有较好的安全性。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

本发明提供了一种兔病毒性出血症病毒毒株，名称为兔病毒性出血症病毒CD2020。本发明的兔病毒性出血症病毒CD2020是从四川省某养殖场疑似兔病毒性出血症的病死兔中分离的自然感染毒，从毒株的生物学特性、特异性、免疫原性等方面进行鉴定，筛选出的毒力强、免疫原性好的毒株。兔病毒性出血症病毒CD2020已于2020年11月16日保存于中国普通微生物菌种保藏管理中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所)，保藏编号为CGMCC No.21092。

本发明提供了一种兔病毒性出血症病毒的分离方法，包括以下步骤：

A.将病死兔的肝脏进行无菌采集，在合适的容器中一边加入无菌生理盐水一边进行研磨，冻融后离心，吸取上清，过滤得到滤液成分；

B.将步骤A中制备的组织滤液接种50-60日龄健康非免疫兔，采集接种后16-48h内发病死亡兔具有典型病理变化的肝脏组织，用含毒的肝脏组织悬液通过易感非免疫兔连续传代培育，筛选得到兔病毒性出血症病毒CD2020株。

优选地，步骤A中，所述研磨具体为采用加入10倍量的灭菌生理盐水进行研磨；所述离心条件为：4000rpm-8000rpm离心15-30min；所述过滤器的滤孔直径为0.45um。

优选地，步骤B中，所述滤液接种健康非免疫兔为1ml，腿部肌肉注射。

本发明提供了一种所述的兔病毒性出血症病毒在制备兔病毒性出血症油乳灭活疫苗中的应用。

本发明提供了一种兔病毒性出血症2型油乳灭活疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

以所述兔病毒性出血症病毒CD2020株作为种毒，接种50-60日龄健康非免疫兔，无菌采集接种后16-48h内病亡兔肝脏组织，剔除脏器结缔组织；

将肝脏组织加入无菌生理盐水，充分研磨，制备成匀浆；匀浆冻融，加入双抗，离心，取上清，加入甲醛后摇床灭活，得到灭活组织悬液；

将步骤(2)中得到的灭活组织悬液与白油佐剂混合，4摄氏度保存备用。

优选地，步骤(2)中，所述具体为采用加入10倍体积的灭菌生理盐水进行研磨；所述冻融次数为3次。

优选地，步骤(2)中，所述双抗为青霉素和链霉素，青霉素和链霉素的加入量为1000IU/ml；所述离心条件为4000rpm，30min。

优选地，步骤(2)中，所述甲醛的终浓度为0.4％；所述摇床灭活的温度为37摄氏度、灭活时间为48h-72h。

本发明提供了一种根据前述方法制备的兔病毒性出血症病毒2型油乳灭活疫苗。

与现有技术相比，本发明具有如下优点：

本发明所获得的兔病毒性出血症病毒CD2020株，与目前国内分离的兔病毒性出血症病毒序列比对差异较大，其中主要抗原蛋白的同源性仅88.4％，且该毒株对幼龄兔感染造成的危害较大，当前的兔病毒性出血症灭活疫苗对该毒株的感染不能提供有效保护。

本发明所获得的兔病毒性出血症病毒CD2020株能够在兔体内稳定传代，根据该毒株制备的油乳灭活疫苗针对该兔病毒性出血症病毒能够提供良好的保护性。本发明所制备的兔病毒性出血症油乳灭活采用成熟稳定的制作方法，工艺简单，操作简便，且制备出的疫苗抗原性好，安全性高。

附图说明

图1为本发明所述CD2020株与RHDV的遗传进化树分析；

图2为实施例1的CD2020病料RT-PCR扩增结果；其中：M为DL2000Marker；1、2、3、4为病料组织；5为阴性对照；

图3为实施例3中疫苗免疫效力试验的的剖检观察结果；其中：图3A为试验组的肺脏；图3B为试验组的肝脏；图3C为对照组的肺脏；图3D为对照组的肝脏；

图4为实施例3中疫苗免疫效力试验的剖检观察结果；其中：图4A为第一组的肺脏；图4B为第一组的肝脏；图4C为第二组的肺脏；图4D为第二组的肝脏。

图5为CD2020株与传统RHDV株衣壳蛋白的氨基酸同源性比对结果

具体实施方式

下述实施例中的方法，如无特别说明，均为常规方法。

下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变化和改进。这些都属于本发明的保护范围。

实施例1、兔病毒性出血症病毒CD2020株的分离鉴定

1、兔病毒性出血症病毒CD2020株的分离鉴定

采集病死兔肝脏，用10倍量的灭菌生理盐水进行研磨，8000rpm离心15min，取上清，使用0.45μm滤器过滤，收集滤液，置于-20摄氏度备用。

根据GenBank上公布的RHDV的VP60核酸序列设计特异性引物，上游引物P1：ATTGGGCCGGGTTTGGAAGTCAGAC，下游引物P2：GCTCCAGTGGCAAAGCCCAACTCATAAG，扩增VP60基因部分序列片段722bp，序列如SEQ ID NO.1。用Trizol法提取前述采集的发病兔肝组织的RNA，并用M-MLV反转录成cDNA，并用其作为模板进行RT-PCR扩增，反应条件为95摄氏度预变性3min，94摄氏度变性30s，55摄氏度退火30s，72摄氏度延伸1min45s；30个循环，最后延伸10min。PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳。结果显示在722bp处出现一条特异性条带。经Blast比对，扩增产物片段与国内分离经典RHDV的VP60的基因同源性为79.8％，同GenBank上公布的RHDV2的VP60的基因同源性为96.7％，因此初步判断该毒株是兔病毒性出血症2型。

2、稳定性试验及毒力鉴定

选取5只健康易感非免疫试验兔，将前述处理好的滤液经兔腿部肌肉注射，每只1.0mL，采集死亡接种兔的肝脏病料；重复以上试验步骤，连续3次。结果表明：攻毒的兔100％死亡，且死亡时间在18～48h，说明获得了稳定的兔病毒性出血症病毒2型，并命名为CD2020株，将其保藏在中国普通微生物菌种保藏管理中心，其保藏名称为兔病毒性出血症病毒2型SC株，保藏编号为CGMCC No.21092(保藏日期：2020年11月16日，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所)。死亡兔鼻孔出血，解剖观察可见气管环状出血，潮红，肺脏出血严重，肝脏肿大，说明该分离株具有很强的致病力，是强毒株。

3、兔病毒性出血症病毒CD2020的传代培养

将兔病毒性出血症病毒CD2020用灭菌生理盐水作10倍稀释，接种于50～60日龄的健康易感非免疫兔。每只腿部肌肉注射1mL。无菌采集接种后24～48h内死亡的兔，无菌采集具有典型病理变化的肝脏组织，剔除结缔组织作为毒种备用。

采用传3～8代的毒株CD2020株接种，将剔除结缔组织的死亡兔的肝脏病理组织加生理盐水研磨过滤,肝脏组织和生理盐水比例为1比10(W/V)。加入青霉素、链霉素1000IU/ml,4000rpm离心30min，吸取上清液，-20摄氏度保存。

将保存的兔肝组织做10倍倍比稀释，稀释梯度为10

实施例2、兔病毒性出血症组织悬液制备

将兔病毒性出血症病毒CD2020株用生理盐水作10倍稀释，接种于50-60日龄的健康易感非免疫兔。每只腿部肌肉注射1ml，选取接种后24-48h内死亡的兔子，无菌采集具有典型病变的肝脏组织，剔除结缔组织作为毒种。

将前述的毒种传3-8代后接种至健康易感非免疫兔中，无菌采集接种后24-48h内死亡的兔的肝脏，剔除结缔组织后加生理盐水研磨过滤，肝脏组织和灭菌生理盐水的比例为1:10(W/V),制备成匀浆。冻融3次，加入青、链霉素各1000IU/ml,4000rpm离心30min，吸取上清即得组织悬液。往悬液里的加入甲醛溶液进行灭活，终浓度为0.4％，灭活条件为：置于37摄氏度摇床内灭活48-72h。灭活结束后进行无菌检验和灭活检验。无菌检验和灭活检验合格后，由此获得灭活组织悬液。

实施例3、疫苗评价试验

本发明中的兔病毒出血症病毒CD2020株是发明人自四川某兔场疑似兔病毒性出血症的病死兔体内分离的自然感染株。本次分离的变异株与经典毒株的抗原性变异较大，这可能是传统兔病毒性出血症灭活疫苗不能完全保护兔群抵抗兔病毒性出血症2型病毒感染的原因。

本发明中涉及的兔病毒性出血症病毒CD2020株与国内之前报道的传统RHDV相比，其序列差异性较大，其主要抗原基因的氨基酸同源性也存在较大差异。进化树分析显示，它同传统的RHDV流行株遗传距离较远，且位于不同的进化分支(图5)。说明CD2020株与我国的一些经典RHDV处于不同拓扑群，证明CD2020株是一株变异的RHDV分离株。CD2020株与目前国内分离的兔病毒性出血症病毒序列比对差异较大，其中主要抗原蛋白的同源性仅88.4％，且该毒株对幼龄兔感染造成的危害较大，试验结果进一步证明，现有商品化兔病毒性出血症疫苗不能完全保护被CD2020株感染的兔子。因此，本发明以CD2020株做疫苗种毒，制备了一种可用于预防RHDV2感染的灭活疫苗。

1、灭活疫苗的制备

将实施例2中采用毒种传3代CD2020株制备灭活组织悬液与白油佐剂按1:1的比例进行混合，获得灭活疫苗，于4摄氏度保存备用。

2、疫苗安全性试验

选取15只SPF新西兰兔，随机分三组，每组5只。第一组皮下接种1mL前述的灭活疫苗；第二组皮下超剂量接种2mL前述的灭活疫苗；第三组为对照组，皮下注射1mL灭菌生理盐水。每组试验兔均在隔离器中饲养，连续观察10日。结果均未见不良反应，表明该灭活苗安全性好。

3、疫苗免疫效力实验

购买10只SPF新西兰兔，随机分成两组，每组5只。实验组每只皮下注射1.0ml前述灭活疫苗，另5只健康新西兰兔作为对照。免疫后14天，对两组新西兰兔进行攻毒，每只腿部肌肉注射实施例1中制备的致死量毒液。每组实验兔均在隔离器中饲养，观察10日，免疫组新西兰兔全部存活，对照组全部死亡。疫苗对兔病毒性出血症2型的保护率为100％，对照组死亡率100％(表1)。将所有实验兔进行剖检，免疫组兔脏器未见明显病变(图3A和B)；对照组肺脏出血严重，肝脏呈土黄色(图3C和D)。由此可见本发明兔病毒性出血症2型油乳灭活疫苗(CD2020株)具有良好的免疫保护性。

选取15只SPF级别的新西兰兔，随机分成3组，每组5只。第一组每只皮下注射前述灭活疫苗1ml，第二组每只接种市售兔病毒性出血症病毒组织灭活苗1ml，第三组作为空白对照。免疫后14天，对第一组和第二组进行攻毒，每只腿部肌肉注射致死剂量毒液。将实验兔置于隔离区中饲养，观察10日，第一组兔全部存活，第二组全部发病。将实验兔剖检观察，第一组兔子脏器无明显病变；第二组肺脏出血，肝脏呈土黄色，见图4。由此可见，本发明兔病毒性出血症油乳灭活疫苗(CD2020株)较市售兔病毒性出血症病毒组织灭活苗更能保护兔群抵抗兔病毒性出血症病毒2型的侵袭。

表1CD2020株灭活疫苗与市售疫苗攻毒保护情况

虽然，上文中用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 中牧实业股份有限公司

<120> 兔病毒性出血症病毒2型及其在制备灭活疫苗中的应用

<130> WHOI210025

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 722

<212> DNA

<213> 兔病毒性出血症病毒(Rabbit hemorrhagic disease virus)

<400> 1

attgggccag gtttggaagt tagacaattc cctcatgttg tcattgacgc tcgttcactc 60

gaaccagtca ccatcaccat gccggacttg cgccccaaca tgtaccaccc aacaggcaac 120

cctggcctcg ttcccacgtt ggtcctgagc gtttacaaca acctcatcaa cccatttggt 180

ggatccacga gcgcaatcca ggtcacggtg gaaacaaggc ccagtgagga ctttgagttt 240

gtgatgatcc gtgccccctc cagtaagacc gttgattcga tctcgcccgc agatctcctc 300

acaaccccag ttctcactgg ggttggcacc gataacagat ggaatggtga gatagttggg 360

ctgcaaccag tccccggtgg gttttctacg tgcaacagac actggaactt aaacggcagc 420

acatatggat ggtcaagccc gcggtttgcc gccattgacc acgacagagg caacgcaagt 480

ttccctggaa gcagttcgtc aaacgtgctt gagctttggt atgctagtgc cgggtctgca 540

gctgacaacc ccatctccca aattgctcca gatggtttcc ctgacatgtc atttgtaccc 600

ttcagcggta ccaccatccc taccgcaggg tgggtcgggt tcggtgggat ctggaacagc 660

agtaatggtg ccccctacgt cacgaccatg caggcttatg agttgggttt tgccactgga 720

gt 722