一种高效的古代DNA提取方法

摘要

本发明提供一种高效的古代DNA提取方法，涉及生物DNA提取技术领域。所述古DNA的提取方法包括细胞裂解、DNA结合、DNA洗脱、DNA纯化、DNA保存等步骤。本发明克服了现有高度降解生物检材DNA提取技术的不足，通过优化DNA结合缓冲液的成分，使得DNA分子能高效的结合Chelex 100硅胶树脂，并大大减少抽提产物中的抑制剂，大大提高了DNA提取效率、纯度、DNA总产量以及聚合酶链式反应的成功率。特别适用于法医陈旧性或者高度降解检材的DNA提取。

说明书

技术领域

本发明涉及生物DNA提取技术领域，具体涉及一种高效的古代DNA提取方法。

背景技术

古DNA一般是指从古代生物遗体或遗迹中残存的DNA片段，包括动物、植物和人遗迹环境微生物中的DNA。古DNA由于长期埋葬地下，或者是暴露在地表，受到环境中氧化、水解等因素的影响，因此古代遗骸中的DNA通常都会被高度的降解，如他们细胞内的DNA降解为非常短的小片段(通常为50bp左右的长度)，并且目标DNA(内源性DNA)通常含量在1％左右，并且DNA提取之后相对现代DNA更容易降解。这些特点决定现有的DNA提取试剂盒不能有效的提取古代生物的DNA，造成极高的DNA抽提失败率。

现有的所有的商业化的试剂盒都是针对现代生物DNA提取的，目前还没有针对古DNA提取的商业化DNA提取试剂盒。现有DNA提取试剂盒之所以不适合古代DNA的提取，主要基于以下几点：1.现代生物组织中DNA含量非常高，DNA含量是古代DNA的成千上万倍；2.现有DNA提取试剂盒一般对短片段DNA提取效果不好，因此不适合古DNA高度降解DNA片段的提取；3.现代样本DNA提取之后，由于其DNA含量很高并且DNA片段很长，因此不容易降解。在应用领域，法医高度降解检材DNA提取失败率极高，经常有报道对案发现场人骨DNA抽提失败的案例。所以设计出一种针对古代生物，或者高度降解生物材料的DNA提取方法极其重要。

发明内容

针对现有DNA提取技术的不足，本发明提供一种古DNA的提取方法，提高了对小片段DNA提取的效果，同时提升DNA提取的总量，并且便于DNA的长期保存。

为实现以上目的，本发明的技术方案通过以下技术方案予以实现：

一种高效的古代DNA提取方法，所述高效的古代DNA的提取方法包括以下步骤：

(1)原料预处理：选取古生物样本打磨成粉后，加入缓冲液A，常温震荡孵育8min，后离心取沉淀继续加入磷酸钠缓冲液，重复上述步骤3次，得预处理样本备用；

(2)DNA的释放：取上述预处理样本，加入裂解液，其中裂解液的组成为：pH8.5Tris-HCl：10mM、EDTA：12-16mM、SDS：1.2-1.5wt％、NaCl：150mM、MgSO：1.2-2.0mM、蛋白酶K：0.3-0.5U/mg，后放入在37℃温度下孵育18小时，后将裂解产物在离心机上5000rpm离心3min，取上清液备用；

(3)DNA结合：将上述上清液加入离心管中，再加入缓冲液B和羟基磷石灰磁珠，调节pH至7.5，于水浴环境下震荡混合，结合吸附8-10h；

(4)洗涤：将上述离心管取出静置3-5min，再将其置于磁力架上，静置2min进行磁力分离，除去上清液，后加入洗涤液震荡1min，静置2min，置于磁力架上2min，继续除去上清液，保留磁珠；

(5)DNA洗脱：将上述步骤(4)中的磁珠加入缓冲液C，使磁珠悬浮，55℃水浴10min，将离心管置于磁力架1min，使磁珠被吸附，取上清液备用；再将磁珠中加入TE洗脱液，使磁珠悬浮，后置于磁力架1min，吸附磁珠，将洗脱液移除，合并洗脱液和上清液，即得古DNA提取溶液洗脱液。

优选的，所述步骤(1)中使用的缓冲液A为pH为7.0，0.5M的磷酸钠缓冲液。

优选的，所述步骤(1)中离心的转速为10000rpm，离心时间为3min。

优选的，所述步骤(2)中孵育过程中采用杂交炉使得裂解液与样本充分接触，且转速为20rpm/min。

优选的，所述步骤(3)中缓冲液B为4M的磷酸钠缓冲液，水浴环境的温度为45-50℃。

优选的，所述步骤(4)中洗涤液为75％的乙醇溶液。

优选的，所述步骤(5)中缓冲液C为10mM的氯化钙缓冲液。

本发明提供一种高效的古代DNA提取方法，与现有技术相比优点在于：

本发明DNA提取方法能够显著提升DNA提取总量，同时提升DNA提取的纯度，有效去除DNA提取过程中的抑制剂，大大提升后期PCA扩增反应的成功率。

附图说明：

图1：为实施例1所得DNA的Agilent 2100-H产生的质量检测图；

图2：为实施例2所得DNA的Agilent 2100-H产生的质量检测图.

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合本发明实施例对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1：

对古鸵鸟腿骨进行DNA提取：

(1)于国家动物博物馆中获取一小段距今1000年前的鸵鸟腿骨，钻取20mg骨粉，加入pH为7.0，0.5M的磷酸钠缓冲液，常温震荡孵育8min，后以10000rpm的转速离心时间为3min，后离心取沉淀继续加入pH为7.0，0.5M的磷酸钠缓冲液，重复上述步骤3次，得预处理样本备用；

(2)将上述预处理样本加入pH8.5Tris-HCl：10mM、EDTA：14mM、SDS：1.3wt％、NaCl：150mM、MgSO：1.6mM、蛋白酶K：0.4mg/ml混合制备的裂解液2ml，后放入37℃杂交炉中孵育18小时，且孵育过程中以20rpm的转速使裂解液与骨粉充分接触，得裂解产物，将裂解解产物在离心机上5000rpm/min离心5min；

(3)取离心后的所有上清液转移至新的离心管中，再加入300ul，4M的磷酸钠缓冲液和20ul的羟基磷石灰磁珠悬浮液，调节pH至7.5，在水浴温度为45-50℃的环境下震荡混合，结合吸附8-10h；

(4)将上述离心管取出静置3-5min，再将其置于磁力架上，静置2min进行磁力分离，除去上清液，后加入洗涤液震荡1min，静置2min，置于磁力架上2min，继续除去上清液，保留磁珠；

(5)将上述磁珠加入300ul，10mM的氯化钙缓冲液，使磁珠悬浮，55℃水浴10min，将离心管置于磁力架1min，使磁珠被吸附，取上清液备用；再将磁珠中加入200ulTE洗脱液，使磁珠悬浮，后置于磁力架1min，吸附磁珠，将洗脱液移除，合并洗脱液和上清液，即得古DNA提取溶液洗脱液

实施例2：

对古狼的牙齿进行DNA提取：

(1)于国家动物博物馆中获取约500年前狼的牙齿，用牙钻钻取牙粉20mg，加入pH为7.0，0.5M的磷酸钠缓冲液，常温震荡孵育8min，后以10000rpm的转速离心时间为3min，后离心取沉淀继续加入pH为7.0，0.5M的磷酸钠缓冲液，重复上述步骤3次，得预处理样本备用；

(2)将上述预处理样本加入pH8.5Tris-HCl：10mM、EDTA：14mM、SDS：1.3wt％、NaCl：150mM、MgSO：1.6mM、蛋白酶K：0.4mg/ml混合制备的裂解液2ml，后放入37℃杂交炉中孵育18小时，且孵育过程中以20rpm的转速使裂解液与骨粉充分接触，得裂解产物，将裂解解产物在离心机上5000rpm/min离心5min；

(3)取离心后的所有上清液新的转移至离心管中，再加入300ul，4M的磷酸钠缓冲液和20ul的羟基磷石灰磁珠悬浮液，调节pH至7.5，在水浴温度为45-50℃的环境下震荡混合，结合吸附8-10h；

(4)将上述离心管取出静置3-5min，再将其置于磁力架上，静置2min进行磁力分离，除去上清液，后加入洗涤液震荡1min，静置2min，置于磁力架上2min，继续除去上清液，保留磁珠；

(5)将上述磁珠加入300ul，10mM的氯化钙缓冲液，使磁珠悬浮，55℃水浴10min，将离心管置于磁力架1min，使磁珠被吸附，取上清液备用；再将磁珠中加入200ulTE洗脱液，使磁珠悬浮，后置于磁力架1min，吸附磁珠，将洗脱液移除，合并洗脱液和上清液，即得古DNA提取溶液洗脱液

实施例3：

1、对上述实施例1-2所获取的DNA应用Agilent 2100-H进行抽提DNA片段长度进行检测，分别获取实施例1-2所提取DNA的Agilent2100-H产生的质量检测图(如图1和图2所示)。

2、分别对上述实施例1-2所获取的1000年前鸵鸟腿骨和500年前古狼牙齿采用Qiagen试剂盒进行样品DNA提取，且提取的各组分为对照组1和对照组2，对上述实施例1和实施例2提取的DNA和对照组1和对照组2提取的DNA的含量进行检测，结果如下表所示：

由上表可知，本申请所采用的DNA检测方法能够有效提取古生物中的DNA，且提取效果较优。

需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。