一个基因的甲基化水平在辅助诊断癌症中的应用

摘要

本发明公开了一个基因的甲基化水平在辅助诊断癌症中的应用。本发明提供了甲基化MGRN1基因作为标志物在制备产品中的应用；所述产品的用途为如下至少一种：辅助诊断癌症或预测癌症患病风险；辅助区分良性结节和癌症；辅助区分癌症不同亚型；辅助区分癌症不同分期；辅助区分不同癌症；确定待测物对癌症的发生是否存在阻碍或促进作用；所述癌症可为肺癌、胰腺癌或食管癌。本发明研究发现了肺癌、胰腺癌和食管癌患者血液中MGRN1基因的低甲基化现象，本发明对提高肺癌、胰腺癌和食管癌早期诊疗效果和降低死亡率均有重要的科学意义和临床应用价值。

说明书

技术领域

本发明涉及医学领域，特别涉及一个基因的甲基化水平在辅助诊断癌症中的应用。

背景技术

肺癌是一种发生于支气管粘膜上皮的恶性肿瘤，近几十年来，其发病率和死亡率一直呈上升趋势，为全世界发病率和死亡率最高的癌症。尽管最近几年在诊断方法、手术技术及化疗药物等方面均有新进展，但肺癌患者总的5年生存率仅为16％，主要是由于大部分肺癌患者就诊时己发生转移从而失去了手术根治机会。研究表明，肺癌的预后与分期直接相关，I期肺癌5年生存率为83％，II期为53％，III期为26％，IV期为6％。因此，降低肺癌患者死亡率的关键在于早诊断早治疗。

目前主要的肺癌诊断方法有如下几种：(1)影像学方法：例如胸部X射线和低剂量螺旋CT。但胸部X射线很难发现早期肺癌。低剂量螺旋CT虽然可以发现肺内小结节，但是假阳性率高达96.4％，给被检查者带来不必要的心理负担。同时，胸部X射线和低剂量螺旋CT由于辐射的原因不宜频繁使用。另外，影像学方法也往往受设备和医生看片经验，以及有效读片时间的影响。(2)细胞学方法：例如痰液细胞学检查、支气管镜下刷片或取活检、支气管肺泡灌洗液细胞学检查等。痰液细胞学检查和支气管镜下刷片或取活检对于周围性肺癌的灵敏度较低。同时支气管镜下刷片或取活检、支气管肺泡灌洗液细胞学检查操作比较繁琐，且体检者舒适度不佳。(3)目前常用的血清肿瘤标志物：癌胚抗原(CEA)、糖类抗原(CA125/153/199)、细胞角蛋白19片段抗原(CYFRA21-1)和神经元特异性烯醇化酶(NSE)等。这些血清肿瘤标志物对肺癌的灵敏度有限，一般为30％-40％，对于I期肿瘤甚至更低。而且肿瘤特异性也比较有限，受许多良性病变如良性肿瘤、炎症、退行性疾病等影响。目前，肿瘤标志物主要用于恶性肿瘤的筛查和肿瘤治疗效果复查。因此，需要进一步开发高效特异的肺癌早期诊断技术。

目前国际公认的肺部结节诊断的最有效方法是胸部低剂量螺旋CT筛查。但是低剂量螺旋CT的灵敏度高，能发现大量的小结节，却难以进行良恶性的判别。在发现的小结节中，恶性的比例还不到4％。目前，临床上对肺结节的良恶性鉴定需要长期随访、反复CT检查或者依赖肺部结节活组织取样(包括胸壁细针穿刺活检、支气管镜组织活检、胸腔镜或开胸手术肺活检)等创伤性检查方法。CT引导或超声引导经胸穿刺活检有较高的灵敏度，但对于<2cm的结节诊断率较低，有30～70％漏诊率，且气胸和出血发生率较高。气管镜针吸活检并发症发生率相对较低，但对周围型结节诊断率有限，对≤2cm的结节诊断率仅34％，大于2cm的结节诊断率为63％。手术切除诊断率高且可直接对结节进行处理，但会造成患者肺功能出现短暂减退，若结节为良性，则患者进行了不必要的手术，导致了过度医疗。因此，目前迫切需要新的体外诊断分子标志物来辅助进行肺部结节的鉴别，在降低漏诊率的同时也尽量减少不必要的穿刺或者手术。

胰腺癌是一种常见的消化道恶性肿瘤，其中约90％为胰腺导管腺癌，是目前世界上第四大致死性恶性肿瘤。由于发病隐匿、临床症状特异性差和早期浸润性特点，大部分胰腺癌患者发现时已处于晚期，失去手术治疗机会，导致5年生存率只有7％。如果病人可以在早期(I期)发现，胰腺癌患者5年生存率可达到60％。目前临床上关于胰腺癌的常用诊断方法有：(1)超声、增强CT和核磁共振(MRI)等影像学方法，超声波诊断的准确性受医生看片经验、病人肥大的体形和胃肠道气体的限制；通常，超声这种诊断胰腺癌的方法可作为CT的补充检查来运用，但增强CT对人体辐射较大，不易频繁使用；MRI没有辐射的影响，但它对于一些人并不适用(体内有金属物品及心脏起搏器等)，检查所需时间较长，由于设备比较昂贵，一些中小医院尚未普及。(2)临床上会结合一些血清肿瘤标志物如CA19-9、CA242、CA50等进一步检测，以上肿瘤标志物敏感度较高，但特异性较低，容易受肝功能及胆汁郁积的影响。(3)病理学检查：经皮穿刺活检、超声胃镜引导下的活检、腹水脱落细胞学检查及腹腔镜或开腹手术下探查活检，但该方法为创伤性检查，并不适用于早期患者。因此，更为敏感、特异的早期胰腺癌分子标记亟待发掘。

食管癌为一种起源于食管黏膜上皮的恶性肿瘤，其中约80％为鳞状细胞癌，是临床常见的恶性肿瘤之一。在全球范围内，食管癌的发病率在恶性肿瘤中居第8位，死亡率居第6位。我国是食管癌高发国家，且其发病率有逐渐增加的趋势。目前，90％以上的食管癌患者确诊时已进展至中晚期，总体5年生存率不足20％。目前临床上食管癌检测主要有以下几种方法。内镜超声检查：因高频探头穿透力低，仅

DNA甲基化是基因上重要的一种化学修饰，影响着基因转录的调控过程和细胞核结构。DNA甲基化的改变是癌症发展的早期事件和伴随事件，主要体现在肿瘤组织上抑癌基因的高甲基化和原癌基因的低甲基化等。但是血液中的DNA甲基化跟肿瘤发生发展的相关性则报道得较少。此外血液容易收集，DNA甲基化较稳定，如果可以发现肿瘤特异的血液DNA甲基化分子标志物则有巨大的临床应用价值。因此，探索和开发适用于临床检测需要的血液DNA甲基化诊断技术对提高肺癌早期诊疗效果和降低死亡率均有重要的临床应用价值和社会意义。

发明内容

本发明的目的是提供一个基因的甲基化水平在辅助诊断癌症中的应用。

第一方面，本发明要求保护甲基化MGRN1基因作为标志物在制备产品中的应用。所述产品的用途可为如下中的至少一种：

(1)辅助诊断癌症或预测癌症患病风险；

(2)辅助区分良性结节和癌症；

(3)辅助区分癌症不同亚型；

(4)辅助区分癌症不同分期；

(5)辅助诊断肺癌或预测肺癌患病风险；

(6)辅助区分肺部良性结节和肺癌；

(7)辅助区分肺癌不同亚型；

(8)辅助区分肺癌不同分期；

(9)辅助诊断胰腺癌或预测胰腺癌患病风险；

(10)辅助诊断食管癌或预测食管癌患病风险；

(11)辅助区分肺癌和胰腺癌；

(12)辅助区分肺癌和食管癌；

(13)辅助区分胰腺癌和食管癌；

(14)确定待测物对癌症的发生是否存在阻碍或促进作用。

进一步地，(1)中所述辅助诊断癌症具体可体现为如下中的至少一种：辅助区分癌症患者和无癌对照(可理解为现在及曾经均没有患过癌症且没有报告肺部良性结节且血常规指标都在参考范围内)；辅助区分不同癌症。

进一步地，(2)中所述良性结节为(2)中所述癌症对应的良性结节，如肺部良性结节和肺癌。

进一步地，(3)中所述癌症不同亚型可为病理分型，如组织学分型。

进一步地，(4)中所述癌症不同分期可为临床分期或TNM分期。

在本发明的具体实施方式中，(5)中所述辅助诊断肺癌具体体现为如下中的至少一种：可辅助区分肺癌患者和无癌对照、可辅助区分肺腺癌患者和无癌对照、可辅助区分肺鳞癌患者和无癌对照、可辅助区分小细胞肺癌患者和无癌对照、可辅助区分I期肺癌患者和无癌对照、可辅助区分II-III期肺癌患者和无癌对照、可辅助区分无淋巴结浸润的肺癌患者和无癌对照、可辅助区分有淋巴结浸润的肺癌患者和无癌对照。其中，所述无癌对照可理解为现在及曾经均没有患过癌症且没有报告肺部良性结节且血常规指标都在参考范围内。

在本发明的具体实施方式中，(6)中所述辅助区分肺部良性结节和肺癌具体体现为如下中的至少一种：可辅助区分肺癌和肺部良性结节、可辅助区分肺腺癌和肺部良性结节、可辅助区分肺鳞癌和肺部良性结节、可辅助区分小细胞肺癌和肺部良性结节、可辅助区分I期肺癌和肺部良性结节、可辅助区分II-III期肺癌和肺部良性结节、可辅助区分无淋巴结浸润的肺癌和肺部良性结节、可辅助区分有淋巴结浸润的肺癌和肺部良性结节。

在本发明的具体实施方式中，(7)中所述辅助区分肺癌不同亚型具体体现为：可辅助区分肺腺癌、肺鳞癌和小细胞肺癌中的任意两种。

在本发明的具体实施方式中，(8)中所述辅助区分肺癌不同分期具体体现为如下中的至少一种：可辅助区分T1期肺癌、T2期肺癌和T3肺癌中的任意两种；可辅助区分无淋巴结浸润的肺癌和有淋巴结浸润的肺癌；可辅助区分临床I期肺癌、临床II肺癌和临床III期肺癌中的任意两种。

在本发明的具体实施方式中，(9)中所述辅助诊断胰腺癌具体体现为如下中的至少一种：可辅助区分胰腺癌患者和无癌对照、可辅助区分胰腺导管癌和无癌对照。其中，所述无癌对照可理解为现在及曾经均没有患过癌症且没有报告肺部良性结节且血常规指标都在参考范围内。

在本发明的具体实施方式中，(10)中所述辅助诊断食管癌具体体现为如下中的至少一种：可辅助区分食管癌患者和无癌对照、可辅助区分食管鳞状细胞癌和无癌对照。其中，所述无癌对照可理解为现在及曾经均没有患过癌症且没有报告肺部良性结节且血常规指标都在参考范围内。

在上述(1)-(14)中，所述癌症可为能够引起机体内MGRN1基因甲基化水平降低的癌症，如肺癌、胰腺癌、食管癌等。

第二方面，本发明要求保护用于检测MGRN1基因甲基化水平的物质在制备产品中的应用。所述产品的用途可为前文(1)-(14)中的至少一种。

第三方面，本发明要求保护用于检测MGRN1基因甲基化水平的物质和储存有数学模型建立方法和/或使用方法的介质在制备产品中的应用。所述产品的用途可为前文(1)-(14)中的至少一种。

所述数学模型可按照包括如下步骤的方法获得：

(A1)分别检测n1个A类型样本和n2个B类型样本的MGRN1基因甲基化水平(训练集)；

(A2)取步骤(A1)获得的所有样本的MGRN1基因甲基化水平数据，按照A类型和B类型的分类方式，通过二分类逻辑回归法建立数学模型。

其中，(A1)中的n1和n2均为50以上的正整数。

所述数学模型的使用方法包括如下步骤：

(B1)检测待测样本的MGRN1基因甲基化水平；

(B2)将步骤(B1)获得的所述待测样本的MGRN1基因甲基化水平数据代入所述数学模型，得到检测指数；然后比较检测指数和阈值的大小，根据比较结果确定所述待测样本的类型是A类型还是B类型。

在本发明的具体实施方式种，所述阈值设为0.5。大于0.5归为一类，小于0.5归为另外一类，等于0.5作为不确定的灰区。其中A类型和B类型为相对应的两分类，二分类的分组，哪一组是A类型，哪一组是B类型，要根据具体的数学模型来确定，无需约定。

在实际应用中，所述阈值也可根据最大约登指数确定(具体可为最大约登指数对应的数值)。大于阈值归为一类，小于阈值归为另外一类，等于阈值作为不确定的灰区。其中A类型和B类型为相对应的两分类，二分类的分组，哪一组A类型，哪一组是B类型，要根据具体的数学模型来确定，无需约定。

所述A类型样本和所述B类型样本可为如下中的任一种：

(C1)肺癌样本和无癌对照；

(C2)肺癌样本和肺良性结节样本；

(C3)肺癌不同亚型样本；

(C4)肺癌不同分期样本；

(C5)肺癌样本和食管癌样本；

(C6)肺癌样本和胰腺癌样本；

(C7)胰腺癌样本和食管癌样本；

(C8)胰腺癌样本和无癌对照；

(C9)食管癌样本和无癌对照。

第四方面，本发明要求保护前文第三方面中所述的“储存有数学模型建立方法和/或使用方法的介质”在制备产品中的应用。所述产品的用途可为前文(1)-(14)中的至少一种。

第五方面，本发明要求保护一种试剂盒。

本发明所要求保护的试剂盒包括用于检测MGRN1基因甲基化水平的物质。所述试剂盒的用途可为前文(1)-(14)中的至少一种。

进一步地，所述试剂盒中还可含有前文第三方面或第四方面中所述的“储存有数学模型建立方法和/或使用方法的介质”。

第六方面，本发明要求保护一种系统。

本发明所要求保护的系统，包括：

(D1)用于检测MGRN1基因甲基化水平的试剂和/或仪器；

(D2)装置，所述装置包括单元A和单元B；

所述单元A用于建立数学模型，包括数据采集模块、数据分析处理模块和模型输出模块；

所述数据采集模块用于采集(D1)检测得到的n1个A类型样本和n2个B类型样本的MGRN1基因甲基化水平数据；

所述数据分析处理模块能够基于所述数据采集模块采集的n1个A类型样本和n2个B类型样本的MGRN1基因甲基化水平数据，按照A类型和B类型的分类方式，通过二分类逻辑回归法建立数学模型，确定分类判定的阈值；

所述模型输出模块用于输出所述数据分析处理模块建立的数学模型；

所述单元B用于确定待测样本类型，包括数据输入模块、数据运算模块、数据比较模块和结论输出模块；

所述数据输入模块用于输入(D1)检测得到的待测者的MGRN1基因甲基化水平数据；

所述数据运算模块用于将所述待测者的MGRN1基因甲基化水平数据代入所述数学模型，计算得到检测指数；

所述数据比较模块用于将所述检测指数与阈值进行比较；

所述结论输出模块用于根据所述数据比较模块的比较结果输出所述待测样本的类型是A类型还是B类型的结论；所述A类型样本和所述B类型样本可为如下中的任一种：

(C1)肺癌样本和无癌对照；

(C2)肺癌样本和肺良性结节样本；

(C3)肺癌不同亚型样本；

(C4)肺癌不同分期样本；

(C5)肺癌样本和食管癌样本；

(C6)肺癌样本和胰腺癌样本；

(C7)胰腺癌样本和食管癌样本；

(C8)胰腺癌样本和无癌对照；

(C9)食管癌样本和无癌对照。

其中，n1和n2均可为50以上正整数。

在本发明的具体实施方式中，所述阈值设为0.5。大于0.5归为一类，小于0.5归为另外一类，等于0.5作为不确定的灰区。其中A类型和B类型为相对应的两分类，二分类的分组，哪一组是A类型，哪一组是B类型，要根据具体的数学模型来确定，无需约定。

在实际应用中，所述阈值也可根据最大约登指数确定(具体可为最大约登指数对应的数值)。大于阈值归为一类，小于阈值归为另外一类，等于阈值作为不确定的灰区。其中A类型和B类型为相对应的两分类，二分类的分组，哪一组是A类型，哪一组是B类型，要根据具体的数学模型来确定，无需约定。

在前文各方面中，所述MGRN1基因甲基化水平可为MGRN1基因中如下(e1)-(e8)所示片段中全部或部分CpG位点的甲基化水平。所述甲基化MGRN1基因可为MGRN1基因中如下(e1)-(e8)所示片段中全部或部分CpG位点甲基化。

(e1)SEQ ID No.1所示的DNA片段或与其具有80％以上同一性的DNA片段；

(e2)SEQ ID No.2所示的DNA片段或与其具有80％以上同一性的DNA片段；

(e3)SEQ ID No.3所示的DNA片段或与其具有80％以上同一性的DNA片段；

(e4)SEQ ID No.4所示的DNA片段或与其具有80％以上同一性的DNA片段；

(e5)SEQ ID No.5所示的DNA片段或与其具有80％以上同一性的DNA片段；

(e6)SEQ ID No.6所示的DNA片段或与其具有80％以上同一性的DNA片段；

(e7)SEQ ID No.7所示的DNA片段或与其具有80％以上同一性的DNA片段；

(e8)SEQ ID No.8所示的DNA片段或与其具有80％以上同一性的DNA片段。

进一步地，所述“全部或部分CpG位点”可为MGRN1基因中SEQ ID No.1至SEQ IDNo.8所示8个DNA片段中的任意一个或多个CpG位点。此处所述“多个CpG位点”的上限为MGRN1基因中SEQ ID No.1至SEQ ID No.8所示8个DNA片段中所有CpG位点。SEQ ID No.1所示的DNA片段中所有CpG位点见表1，SEQ ID No.2所示的DNA片段中所有CpG位点见表2，SEQID No.3所示的DNA片段中所有CpG位点见表3，SEQ ID No.4所示的DNA片段中所有CpG位点见表4，SEQ ID No.5所示的DNA片段中所有CpG位点见表5，SEQ ID No.6所示的DNA片段中所有CpG位点见表6，SEQ ID No.7所示的DNA片段中所有CpG位点见表7，SEQ ID No.8所示的DNA片段中所有CpG位点见表8。在本发明的具体实施方式中，所示“全部或部分CpG位点”用于区分肺癌样本和无癌对照、肺癌样本和肺良性结节样本、肺癌不同亚型样本或肺癌不同分期样本(见表11-13)。

或，所述“全部或部分CpG位点”可为MGRN1基因中SEQ ID No.3、SEQ ID No.4和SEQID No.6所示3个DNA片段中的任意一个或多个CpG位点。此处所述“多个CpG位点”的上限为MGRN1基因中SEQ ID No.3、SEQ ID No.4和SEQ ID No.6所示3个DNA片段中所有CpG位点。SEQ ID No.3所示的DNA片段中所有CpG位点见表3，SEQ ID No.4所示的DNA片段中所有CpG位点见表4，SEQ ID No.6所示的DNA片段中所有CpG位点见表6。在本发明的具体实施方式中，此处所示“全部或部分CpG位点”用于区分肺癌样本和食管癌样本、肺癌样本和胰腺癌样本、胰腺癌样本和食管癌样本、胰腺癌样本和无癌对照或食管癌样本和无癌对照(见表14-16)。

或，所述“全部或部分CpG位点”可为MGRN1基因中SEQ ID No.4所示的DNA片段中如下35项所示CpG位点的全部或任意34项或任意33项或任意32项或任意31项或任意30项或任意29项或任意28项或任意27项或任意26项或任意25项或任意24项或任意23项或任意22项或任意21项或任意20项或任意19项或任意18项或任意17项或任意16项或任意15项或任意14项或任意13项或任意12项或任意11项或任意10项或任意9项或任意8项或任意7项或任意6项或任意5项或任意4项或任意3项或任意2项或任意1项：

(f1)SEQ ID No.4所示的DNA片段自5’端第219-220和224-225位所示CpG位点(MGRN1_D_11,12)；

(f2)SEQ ID No.4所示的DNA片段自5’端第237-238位所示CpG位点(MGRN1_D_13)；

(f3)SEQ ID No.4所示的DNA片段自5’端第347-348位、352-353位和362-363位所示CpG位点(MGRN1_D_14,15,16)；

(f4)SEQ ID No.4所示的DNA片段自5’端第389-390位所示CpG位点(MGRN1_D_17)；

(f5)SEQ ID No.4所示的DNA片段自5’端第403-404位所示CpG位点(MGRN1_D_18)；

(f6)SEQ ID No.4所示的DNA片段自5’端第424-425位所示CpG位点(MGRN1_D_19)；

(f7)SEQ ID No.4所示的DNA片段自5’端第518-519位所示CpG位点(MGRN1_D_20)；

(f8)SEQ ID No.4所示的DNA片段自5’端第524-525位所示CpG位点(MGRN1_D_21)；

(f9)SEQ ID No.4所示的DNA片段自5’端第539-540位所示CpG位点(MGRN1_D_22)；

(f10)SEQ ID No.4所示的DNA片段自5’端第546-547位所示CpG位(MGRN1_D_23)；

(f11)SEQ ID No.4所示的DNA片段自5’端第563-564位、565-566位、570-571位和572-573位所示CpG位点(MGRN1_D_24,25,26,27)；

(f12)SEQ ID No.4所示的DNA片段自5’端第583-584位所示CpG位点(MGRN1_D_28)；

(f13)SEQ ID No4所示的DNA片段自5’端第591-592位所示CpG位点(MGRN1_D_29)；

(f14)SEQ ID No.4所示的DNA片段自5’端第594-595位所示CpG位点(MGRN1_D_30)；

(f15)SEQ ID No.4所示的DNA片段自5’端第603-604位所示CpG位点(MGRN1_D_31)；

(f16)SEQ ID No.4所示的DNA片段自5’端第612-613位所示CpG位点(MGRN1_D_32)；

(f17)SEQ ID No.4所示的DNA片段自5’端第648-649位所示CpG位点(MGRN1_D_33)；

(f18)SEQ ID No.4所示的DNA片段自5’端第653-654位所示CpG位点(MGRN1_D_34)；

(f19)SEQ ID No.4所示的DNA片段自5’端第662-663位、664-665和669-670位所示CpG位点(MGRN1_D_35,36,37)；

(f20)SEQ ID No.4所示的DNA片段自5’端第692-693和695-696位所示CpG位点(MGRN1_D_38,39)；

(f21)SEQ ID No.4所示的DNA片段自5’端第704-705位所示CpG位点(MGRN1_D_40)；

(f22)SEQ ID No.4所示的DNA片段自5’端第713-714位和718-719位所示CpG位点(MGRN1_D_41,42)；

(f23)SEQ ID No.4所示的DNA片段自5’端第724-725位所示CpG位点(MGRN1_D_43)；

(f24)SEQ ID No4所示的DNA片段自5’端第729-730位所示CpG位点(MGRN1_D_44)；

(f25)SEQ ID No.4所示的DNA片段自5’端第741-742位所示CpG位点(MGRN1_D_45)；

(f26)SEQ ID No.4所示的DNA片段自5’端第771-772位所示CpG位点(MGRN1_D_46)；

(f27)SEQ ID No.4所示的DNA片段自5’端第794-795位所示CpG位点(MGRN1_D_47)；

(f28)SEQ ID No.4所示的DNA片段自5’端第825-826位所示CpG位点(MGRN1_D_48)；

(f29)SEQ ID No.4所示的DNA片段自5’端第831-832位所示CpG位点(MGRN1_D_49)；

(f30)SEQ ID No.4所示的DNA片段自5’端第848-849位所示CpG位点(MGRN1_D_50)；

(f31)SEQ ID No.4所示的DNA片段自5’端第868-869位所示CpG位点(MGRN1_D_51)；

(f32)SEQ ID No.4所示的DNA片段自5’端第882-883位所示CpG位点(MGRN1_D_52)；

(f33)SEQ ID No.4所示的DNA片段自5’端第888-889位所示CpG位点(MGRN1_D_53)；

(f34)SEQ ID No.4所示的DNA片段自5’端第942-943位和949-950位所示CpG位点(MGRN1_D_54,55)；

(f35)SEQ ID No.4所示的DNA片段自5’端第1015-1016位和1017-1018位所示CpG位点(MGRN1_D_56,57)。

在本发明的具体实施方式中，有些相邻的甲基化位点在利用飞行时间质谱进行DNA甲基化分析时由于几个CpG位点位于一个甲基化片段上，峰图无法区分(无法区分的位点在表10中有记载)，因而在进行甲基化水平分析、以及构建和使用相关数学模型时将其按照一个甲基化位点进行处理。前文所述的(f1)、(f3)、(f11)、(f19)、(f20)、(f22)、(f34)和(f35)便是这种情况。

或，所述“全部或部分CpG位点”可为MGRN1基因中所述SEQ ID No.4所示的DNA片段中的全部或任意68个或任意67个或任意66个或任意65个或任意64个或任意63个或任意62个或任意61个或任意60个或任意59个或任意58个或任意57个或任意56个或任意55个或任意54个或任意53个或任意52个或任意51个或任意50个或任意49个或任意48个或任意47个或任意46个或任意45个或任意44个或任意43个或任意42个或任意41个或任意40个或任意39个或任意38个或任意37个或任意36个或任意35个或任意34个或任意33个或任意32个或任意31个或任意30个或任意29个或任意28个或任意27个或任意26个或任意25个或任意24个或任意23个或任意22个或任意21个或任意20个或任意19个或任意18个或任意17个或任意16个或任意15个或任意14个或任意13个或任意12个或任意11个或任意10个或任意9个或任意8个或任意7个或任意6个或任意5个或任意4个或任意3个或任意2个或任意1个。

或，所述“全部或部分CpG位点”可为MGRN1基因中所述SEQ ID No.3所示的DNA片段中的全部(见表3)和所述SEQ ID No.4所示的DNA片段中的全部(见表4)。

或，所述“全部或部分CpG位点”可为MGRN1基因中所述SEQ ID No.3所示的DNA片段中的全部(见表3)和所述SEQ ID No.6所示的DNA片段中的全部(见表6)。

或，所述“全部或部分CpG位点”可为MGRN1基因中所述SEQ ID No.4所示的DNA片段中的全部(见表4)和所述SEQ ID No.6所示的DNA片段中的全部(见表6)。

或，所述“全部或部分CpG位点”可为MGRN1基因中所述SEQ ID No.3所示的DNA片段中的全部(见表3)、所述SEQ ID No.4所示的DNA片段中的全部(见表4)和所述SEQ ID No.6所示的DNA片段中的全部(见表6)。

在上述各方面中，所述用于检测MGRN1基因甲基化水平的物质可包含(或为)用于扩增MGRN1基因全长或部分片段的引物组合。所述用于检测MGRN1基因甲基化水平的试剂可包含(或为)用于扩增MGRN1基因全长或部分片段的引物组合；所述用于检测MGRN1基因甲基化水平的仪器可为飞行时间质谱检测仪。当然所述用于检测MGRN1基因甲基化水平的试剂中还可包含进行飞行时间质谱所用的其他常规试剂。

进一步地，所述部分片段可为如下中至少一个片段：

(g1)SEQ ID No.1所示的DNA片段或其包含的DNA片段；

(g2)SEQ ID No.2所示的DNA片段或其包含的DNA片段；

(g3)SEQ ID No.3所示的DNA片段或其包含的DNA片段；

(g4)SEQ ID No.4所示的DNA片段或其包含的DNA片段；

(g5)SEQ ID No.5所示的DNA片段或其包含的DNA片段；

(g6)SEQ ID No.6所示的DNA片段或其包含的DNA片段；

(g7)SEQ ID No.7所示的DNA片段或其包含的DNA片段；

(g8)SEQ ID No.8所示的DNA片段或其包含的DNA片段；

(g9)与SEQ ID No.1所示的DNA片段或其包含的DNA片段具有80％以上同一性的DNA片段；

(g10)与SEQ ID No.2所示的DNA片段或其包含的DNA片段具有80％以上同一性的DNA片段；

(g11)与SEQ ID No.3所示的DNA片段或其包含的DNA片段具有80％以上同一性的DNA片段；

(g12)与SEQ ID No.4所示的DNA片段或其包含的DNA片段具有80％以上同一性的DNA片段；

(g13)与SEQ ID No.5所示的DNA片段或其包含的DNA片段具有80％以上同一性的DNA片段；

(g14)与SEQ ID No.6所示的DNA片段或其包含的DNA片段具有80％以上同一性的DNA片段；

(g15)与SEQ ID No.7所示的DNA片段或其包含的DNA片段具有80％以上同一性的DNA片段；

(g16)与SEQ ID No.8所示的DNA片段或其包含的DNA片段具有80％以上同一性的DNA片段。

在本发明中，所述引物组合具体可为引物对A和/或引物对B和/或引物对C和/或引物对D和/或引物对E和/或引物对F和/或引物对G和/或引物对H；

所述引物对A为引物A1和引物A2组成的引物对；所述引物A1具体可为SEQ ID No.9或SEQ ID No.9的第11-35位核苷酸所示的单链DNA；所述引物A2具体可为SEQ ID No.10或SEQ ID No.10的第32-56位核苷酸所示的单链DNA；

所述引物对B为引物B1和引物B2组成的引物对；所述引物B1具体可为SEQ IDNo.11或SEQ ID No.11的第11-35位核苷酸所示的单链DNA；所述引物B2具体可为SEQ IDNo.12或SEQ ID No.12的第32-56位核苷酸所示的单链DNA；

所述引物对C为引物C1和引物C2组成的引物对；所述引物C1具体可为SEQ IDNo.13或SEQ ID No.13的第11-35位核苷酸所示的单链DNA；所述引物C2具体可为SEQ IDNo.14或SEQ ID No.14的第32-56位核苷酸所示的单链DNA；

所述引物对D为引物D1和引物D2组成的引物对；所述引物D1具体可为SEQ IDNo.15或SEQ ID No.15的第11-35位核苷酸所示的单链DNA；所述引物D2具体可为SEQ IDNo.16或SEQ ID No.16的第32-56位核苷酸所示的单链DNA；

所述引物对E为引物E1和引物E2组成的引物对；所述引物E1具体可为SEQ IDNo.17或SEQ ID No.17的第11-35位核苷酸所示的单链DNA；所述引物E2具体可为SEQ IDNo.18或SEQ ID No.18的第32-56位核苷酸所示的单链DNA；

所述引物对F为引物F1和引物F2组成的引物对；所述引物F1具体可为SEQ IDNo.19或SEQ ID No.19的第11-35位核苷酸所示的单链DNA；所述引物F2具体可为SEQ IDNo.20或SEQ ID No.20的第32-56位核苷酸所示的单链DNA；

所述引物对G为引物G1和引物G2组成的引物对；所述引物G1具体可为SEQ IDNo.21或SEQ ID No.21的第11-35位核苷酸所示的单链DNA；所述引物G2具体可为SEQ IDNo.22或SEQ ID No.22的第32-56位核苷酸所示的单链DNA；

所述引物对H为引物H1和引物H2组成的引物对；所述引物H1具体可为SEQ IDNo.23或SEQ ID No.23的第11-35位核苷酸所示的单链DNA；所述引物H2具体可为SEQ IDNo.24或SEQ ID No.24的第32-56位核苷酸所示的单链DNA。

另外，本发明还要求保护一种区分待测样本为A类型样本还是B类型样本的方法。该方法可包括如下步骤：

(A)可按照包括如下步骤的方法建立数学模型：

(A1)分别检测n1个A类型样本和n2个B类型样本的MGRN1基因甲基化水平(训练集)；

(A2)取步骤(A1)获得的所有样本的MGRN1基因甲基化水平数据，按照A类型和B类型的分类方式，通过二分类逻辑回归法建立数学模型。

其中，(A1)中的n1和n2均为50以上的正整数。

(B)可按照包括如下步骤的方法确定所述待测样本为A类型样本还是B类型样本：

(B1)检测所述待测样本的MGRN1基因甲基化水平；

(B2)将步骤(B1)获得的所述待测样本的MGRN1基因甲基化水平数据代入所述数学模型，得到检测指数；然后比较检测指数和阈值的大小，根据比较结果确定所述待测样本的类型是A类型还是B类型。

在本发明的具体实施方式中，所述阈值设为0.5。大于0.5归为一类，小于0.5归为另外一类，等于0.5作为不确定的灰区。其中A类型和B类型为相对应的两分类，二分类的分组，哪一组是A类型，哪一组是B类型，要根据具体的数学模型来确定，无需约定。

在实际应用中，所述阈值也可根据最大约登指数确定(具体可为最大约登指数对应的数值)。大于阈值归为一类，小于阈值归为另外一类，等于阈值作为不确定的灰区。其中A类型和B类型为相对应的两分类，二分类的分组，哪一组是A类型，哪一组是B类型，要根据具体的数学模型来确定，无需约定。

所述A类型样本和所述B类型样本可为如下中的任一种：

(C1)肺癌样本和无癌对照；

(C2)肺癌样本和肺良性结节样本；

(C3)肺癌不同亚型样本；

(C4)肺癌不同分期样本；

(C5)肺癌样本和食管癌样本；

(C6)肺癌样本和胰腺癌样本；

(C7)胰腺癌样本和食管癌样本；

(C8)胰腺癌样本和无癌对照；

(C9)食管癌样本和无癌对照。

以上任一所述数学模型在实际应用中可能会根据DNA甲基化的检测方法以及拟合方式不同有所改变，要根据具体的数学模型来确定，无需约定。

在本发明的实施例中，所述模型具体为log(y/(1-y))＝b0+b1x1+b2x2+b3x3+....+bnXn，其中y为因变量即将待测样品的一个或者多个甲基化位点的甲基化值代入模型以后得出的检测指数，b0为常量，x1～xn为自变量即为该测试样品的一个或者多个甲基化位点的甲基化值(每一个值为0-1之间的数值)，b1～bn为模型赋予每一个位点甲基化值的权重。

在本发明的实施例中，所述模型的建立还可酌情加入年龄、性别、白细胞计数等已知参数来提高判别效率。本发明的实施例中建立的一个具体模型为用于辅助区分肺部良性结节和肺癌的模型，所述模型具体为：log(y/(1-y))＝-2.419+0.707*MGRN1_D_11,12-1.181*MGRN1_D_13-1.182*MGRN1_D_14,15,16+0.760*MGRN1_D_17+1.710*MGRN1_D_18-0.760*MGRN1_D_19+0.124*MGRN1_D_20+5.981*MGRN1_D_21+2.555*MGRN1_D_22-8.751*MGRN1_D_23+1.965*MGRN1_D_24,25,26,27-2.260*MGRN1_D_28+1.971*MGRN1_D_29+2.419*MGRN1_D_30+7.971*MGRN1_D_31+0.709*MGRN1_D_32+2.709*MGRN1_D_33+1.326*MGRN1_D_34-1.850*MGRN1_D_35,36,37-10.638*MGRN1_D_38,39+0.709*MGRN1_D_40-1.988*MGRN1_D_41,42+2.150*MGRN1_D_43-2.151*MGRN1_D_44+3.554*MGRN1_D_45-1.971*MGRN1_D_46+1.152*MGRN1_D_47+2.060*MGRN1_D_48-2.071*MGRN1_D_49-1.710*MGRN1_D_50-1.153*MGRN1_D_51+1.182*MGRN1_D_52+1.181*MGRN1_D_53+2.260*MGRN1_D_54,55-0.707*MGRN1_D_56,57+0.020*年龄-0.834*性别(男性赋值为1，女性赋值为0)-0.003*白细胞个数。所述MGRN1_D_11,12为SEQ ID No.4所示的DNA片段自5’端第219-220和224-225位所示CpG位点的甲基化水平；所述MGRN1_D_13为SEQ ID No.4所示的DNA片段自5’端第237-238位所示CpG位点的甲基化水平；所述MGRN1_D_14,15,16为SEQ ID No4所示的DNA片段自5’端第347-348位、352-353位和362-363位所示CpG位点的甲基化水平；所述MGRN1_D_17为SEQ ID No.4所示的DNA片段自5’端第389-390位所示CpG位点的甲基化水平；所述MGRN1_D_18为SEQ IDNo.4所示的DNA片段自5’端第403-404位所示CpG位点的甲基化水平；所述MGRN1_D_19为SEQID No.4所示的DNA片段自5’端第424-425位所示CpG位点的甲基化水平；所述MGRN1_D_20为SEQ ID No.4所示的DNA片段自5’端第518-519位所示CpG位点的甲基化水平；所述MGRN1_D_21为SEQ ID No.4所示的DNA片段自5’端第524-525位所示CpG位点的甲基化水平；所述MGRN1_D_22为SEQ ID No.4所示的DNA片段自5’端第539-540位所示CpG位点的甲基化水平；所述MGRN1_D_23为SEQ ID No.4所示的DNA片段自5’端第546-547位所示CpG位的甲基化水平；所述MGRN1_D_24,25,26,27为SEQ ID No.4所示的DNA片段自5’端第563-564位、565-566位、570-571位和572-573位所示CpG位点的甲基化水平；所述MGRN1_D_28为SEQ ID No.4所示的DNA片段自5’端第583-584位所示CpG位点的甲基化水平；所述MGRN1_D_29为SEQ IDNo4所示的DNA片段自5’端第591-592位所示CpG位点的甲基化水平；所述MGRN1_D_30为SEQID No.4所示的DNA片段自5’端第594-595位所示CpG位点的甲基化水平；所述MGRN1_D_31为SEQ ID No.4所示的DNA片段自5’端第603-604位所示CpG位点的甲基化水平；所述MGRN1_D_32为SEQ ID No.4所示的DNA片段自5’端第612-613位所示CpG位点的甲基化水平；所述MGRN1_D_33为SEQ ID No.4所示的DNA片段自5’端第648-649位所示CpG位点的甲基化水平；所述MGRN1_D_34为SEQ ID No.4所示的DNA片段自5’端第653-654位所示CpG位点的甲基化水平；所述MGRN1_D_35,36,37为SEQ ID No.4所示的DNA片段自5’端第662-663位、664-665和669-670位所示CpG位点的甲基化水平；所述MGRN1_D_38,39为SEQ ID No.4所示的DNA片段自5’端第692-693和695-696位所示CpG位点的甲基化水平；所述MGRN1_D_40为SEQ IDNo.4所示的DNA片段自5’端第704-705位所示CpG位点的甲基化水平；所述MGRN1_D_41,42为SEQ ID No.4所示的DNA片段自5’端第713-714位和718-719位所示CpG位点的甲基化水平；所述MGRN1_D_43为SEQ ID No.4所示的DNA片段自5’端第724-725位所示CpG位点的甲基化水平；所述MGRN1_D_44为SEQ ID No4所示的DNA片段自5’端第729-730位所示CpG位点的甲基化水平；所述MGRN1_D_45为SEQ ID No.4所示的DNA片段自5’端第741-742位所示CpG位点的甲基化水平；所述MGRN1_D_46为SEQ ID No.4所示的DNA片段自5’端第771-772位所示CpG位点的甲基化水平；所述MGRN1_D_47为SEQ ID No.4所示的DNA片段自5’端第794-795位所示CpG位点的甲基化水平；所述MGRN1_D_48为SEQ ID No.4所示的DNA片段自5’端第825-826位所示CpG位点的甲基化水平；所述MGRN1_D_49为SEQ ID No.4所示的DNA片段自5’端第831-832位所示CpG位点的甲基化水平；所述MGRN1_D_50为SEQ ID No.4所示的DNA片段自5’端第848-849位所示CpG位点的甲基化水平；所述MGRN1_D_51为SEQ ID No.4所示的DNA片段自5’端第868-869位所示CpG位点的甲基化水平；所述MGRN1_D_52为SEQ ID No.4所示的DNA片段自5’端第882-883位所示CpG位点的甲基化水平；所述MGRN1_D_53为SEQ ID No.4所示的DNA片段自5’端第888-889位所示CpG位点的甲基化水平；所述MGRN1_D_54,55为SEQ IDNo.4所示的DNA片段自5’端第942-943位和949-950位所示CpG位点的甲基化水平；所述MGRN1_D_56,57为SEQ ID No.4所示的DNA片段自5’端第1015-1016位和1017-1018位所示CpG位点的甲基化水平；

所述模型的阈值为0.5。通过模型计算的检测指数大于0.5的患者候选为肺癌患者，小于0.5的患者候选为肺良性结节患者。

在上述各方面中，所述检测MGRN1基因甲基化水平为检测血液中MGRN1基因甲基化水平。

在上述各方面中，当所述A类型样本和所述B类型样本为(C3)中肺癌不同亚型样本时，所述A类型样本和所述B类型样本具体可为肺腺癌样本、肺鳞癌样本和小细胞肺癌样本中的任意两种。

在上述各方面中，当所述A类型样本和所述B类型样本为(C4)中肺癌不同分期样本时，所述A类型样本和所述B类型样本具体可为临床I期肺癌样本、临床II肺癌样本和临床III期肺癌样本中的任意两种。

以上任一所述MGRN1基因具体可包括Genbank登录号：NM_015246.4(GI:1519311542)，转录物变体1、Genbank登录号：NM_001142289.2(GI:334883177)，转录物变体2、Genbank登录号：NM_001142290.2(GI:334883179)，转录物变体3、Genbank登录号：NM_001142291.2(GI:334883181)，转录物变体4、Genbank登录号：NR_102267.1(GI:456367266)，转录物变体5。

本发明提供了肺癌患者、胰腺癌患者和食管癌血液中MGRN1基因的低甲基化现象。实验证明，以血液为样本就能够区分癌症(肺癌、胰腺癌和食管癌)患者和无癌对照、区分肺部良性结节和肺癌、区分肺癌不同亚型和不同分期，并且能够区分肺癌和胰腺癌、肺癌和食管癌、胰腺癌和食管癌。本发明对于提高肺癌、胰腺癌和食管早期诊疗效果和降低死亡率均有重要的科学意义和临床应用价值。

附图说明

图1为数学模型示意图。

图2为数学模型举例说明。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

以下实施例中的红褐蛋白环指1(Mahogunin ring finger-1,MGRN1)基因定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

实施例1、用于检测MGRN1基因甲基化位点的引物设计

经过大量序列和功能分析，选择了MGRN1基因中的八个片段(MGRN1_A片段、MGRN1_B片段、MGRN1_C片段、MGRN1_D片段、MGRN1_E片段、MGRN1_F片段、MGRN1_G片段、MGRN1_H片段)进行甲基化水平和癌症相关性分析。

MGRN1_A片段(SEQ ID No.1)位于hg19参考基因组chr16:4673604-4674476，正义链。

MGRN1_B片段(SEQ ID No.2)位于hg19参考基因组chr16:4699588-4700441，反义链。

MGRN1_C片段(SEQ ID No.3)位于hg19参考基因组chr16:4713936-4714859，正义链。

MGRN1_D片段(SEQ ID No.4)位于hg19参考基因组chr16:4729664-4731004，反义链。

MGRN1_E片段(SEQ ID No.5)位于hg19参考基因组chr16:4730980-4732117，反义链。

MGRN1_F片段(SEQ ID No.6)位于hg19参考基因组chr16:4732088-4733325，反义链。

MGRN1_G片段(SEQ ID No.7)位于hg19参考基因组chr16:4735842-4736597，正义链。

MGRN1_H片段(SEQ ID No.8)位于hg19参考基因组chr16:4740316-4741205，正义链。

MGRN1_A片段中的CpG位点信息如表1所示。

MGRN1_B片段中的CpG位点信息如表2所示。

MGRN1_C片段中的CpG位点信息如表3所示。

MGRN1_D片段中的CpG位点信息如表4所示。

MGRN1_E片段中的CpG位点信息如表5所示。

MGRN1_F片段中的CpG位点信息如表6所示。

MGRN1_G片段中的CpG位点信息如表7所示。

MGRN1_H片段中的CpG位点信息如表8所示。

表1 MGRN1_A片段中CpG位点信息

表2 MGRN1_B片段中CpG位点信息

表3 MGRN1_C片段中CpG位点信息

表4 MGRN1_D片段中CpG位点信息

表5 MGRN1_E片段中CpG位点信息

表6 MGRN1_F片段中CpG位点信息

表7 MGRN1_G片段中CpG位点信息

表8 MGRN1_H片段中CpG位点信息

针对八个片段(MGRN1_A片段、MGRN1_B片段、MGRN1_C片段、MGRN1_D片段、MGRN1_E片段、MGRN1_F片段、MGRN1_G片段和MGRN1_H片段)设计特异PCR引物，如表9所示。其中，SEQID No.9、SEQ ID No.11、SEQ ID No.13、SEQ ID No.15、SEQ ID No.17、SEQ ID No.19、SEQID No.21和SEQ ID No.23为正向引物，SEQ ID No.10、SEQ ID No.12、SEQ ID No.14、SEQID No.16、SEQ ID No.18、SEQ ID No.20、SEQ ID No.22和SEQ ID No.24为反向引物；SEQID No.9、SEQ ID No.11、SEQ ID No.13、SEQ ID No.15、SEQ ID No.17、SEQ ID No.19、SEQID No.21和SEQ ID No.23中自5’第1至10位为非特异标签，第11至35位为特异引物序列；SEQ ID No.10、SEQ ID No.12、SEQ ID No.14、SEQ ID No.16、SEQ ID No.18、SEQ IDNo.20、SEQ ID No.22和SEQ ID No.24中自5’第1至31位为非特异标签，第32至56位为特异引物序列。引物序列中不包含SNP和CpG位点。

表9 MGRN1甲基化引物序列

实施例2、MGRN1基因甲基化检测及结果分析

一、研究样本

经患者知情同意，共收集722例肺癌患者、152例肺部出现良性结节患者、79例胰腺癌患者、118例食管癌患者和945例无癌对照(无癌对照即以前和现在没有患过癌症且没有报道过肺小结节患者且血常规指标都在参考范围内)的离体血液样本。

所有患者样本都是手术前收集的且都经过影像学和病理确诊。

肺癌、胰腺癌和食管癌亚型根据病理组织学进行判断。

肺癌分期以AJCC第8版分期系统为判断标准。

722例肺癌患者按照分型划分：肺腺癌619例，肺鳞癌42例，小细胞肺癌49例，其他12例。

722例肺癌患者按照分期划分：I期649例，II期41例，III期32例。

722例肺癌患者按照肺癌肿瘤大小(T)划分：T1 603例，T2 83例，T3 36例。

722例肺癌患者按照有无肺癌淋巴结浸润(N)划分：无肺癌淋巴结浸润688例，有肺癌淋巴结浸润34例。

79例胰腺癌患者按照分型划分：胰腺导管腺癌63例，其他亚型共计16例。

118例食管癌患者按照分型划分：食管鳞状细胞癌94例，其他亚型共计24例。

无癌人群、肺部良性结节、肺癌、胰腺癌和食管癌患者各自年龄的中位数分别为56、57、58、58和57岁，且这5种群体中各自的男女比例都约为1:1。

二、甲基化检测

1、提取血液样本的总DNA。

2、将步骤1制备的血液样本总DNA进行重亚硫酸盐处理(参照Qiagen的DNA甲基化试剂盒说明书操作)。重亚硫酸盐处理后，未发生甲基化的胞嘧啶(C)被转化成尿嘧啶(U)，而甲基化的胞嘧啶保持不变，即原来CpG位点的C碱基经重亚硫酸盐处理后转化为C或U。

3、以步骤2经过重亚硫酸盐处理的DNA为模板，采用表9中的8对特异引物对通过DNA聚合酶按照常规PCR反应要求的反应体系进行PCR扩增，8对引物都采用相同的常规PCR体系，且8对引物都按照以下程序进行扩增。

PCR反应程序为：95℃，4min→(95℃，20s→56℃，30s→72℃，2min)45个循环→72℃，5min→4℃，1h。

4、取步骤3的扩增产物，通过飞行时间质谱进行DNA甲基化分析，具体方法如下：

(1)向5μl PCR产物中加入2μl虾碱性磷酸盐(SAP)溶液(0.3ml SAP[0.5U]+1.7mlH

(2)取出2μl步骤(1)得到的SAP处理后的产物，根据说明书加入5μl T-Cleavage反应体系中，然后在37℃孵育3h；

(3)取步骤(2)的产物，加入19μl去离子水，再用6μg Resin在旋转摇床进行去离子化孵育1h；

(4)2000rpm室温离心5min，将微量上清由Nanodispenser机械手臂上样384SpectroCHIP；

(5)飞行时间质谱分析；获得的数据用SpectroACQUIRE v3.3.1.3软件收集，通过MassArray EpiTyper v1.2软件实现可视化。

上述飞行时间质谱检测使用的试剂均来试剂盒(T-Cleavage MassCLEAVE ReagentAuto Kit，货号：10129A)；上述飞行时间质谱检测使用的检测仪器为

5、对步骤4得到的数据进行分析。

数据统计分析由SPSS Statistics 23.0进行。

非参数检验用于两组之间的比较分析。

多个CpG位点的组合对于不同样品分组的鉴别效果通过逻辑回归和受试者曲线的统计学方法得以实现。

所有的统计检验都是双侧的，P值<0.05被认为具有统计学意义。

通过质谱实验，共获得268个可以区别的甲基化片段的峰图。采用SpectroACQUIREv3.3.1.3软件根据含甲基化片段的峰和非甲基化片段的峰面积比较，计算甲基化水平(SpectroACQUIRE v3.3.1.3软件可自动通过计算峰面积得到每个样本在每个CpG位点的甲基化水平)。

三、结果分析

1、无癌对照、良性结节和肺癌血液中MGRN1基因甲基化水平

以722位肺癌患者、152位肺部出现良性结节患者和945名无癌对照的血液为研究材料进行分析MGRN1基因中所有CpG位点的甲基化水平(表10)。结果表明，MGRN1基因中所有CpG位点在无癌对照组中甲基化水平中位数为0.36(IQR＝0.26-0.52)，良性结节中甲基化水平中位数为0.31(IQR＝0.22-0.44)，肺癌患者中甲基化水平中位数为0.32(IQR＝0.22-0.48)。

2、血液中MGRN1基因甲基化水平可以区分无癌对照和肺癌患者

通过比较分析722位肺癌患者和945名无癌对照的MGRN1基因的甲基化水平，结果发现肺癌患者MGRN1基因中所有CpG位点甲基化水平显著低于无癌对照(p<0.05，表11)。此外，肺癌不同亚型(肺腺癌，肺鳞癌，小细胞肺癌)中MGRN1基因所有CpG位点的甲基化水平分别都与无癌对照有显著性差异。肺癌不同分期(临床I期、II-III期)中MGRN1基因所有CpG位点的甲基化水平分别都与无癌对照有显著性差异。此外，无淋巴浸润的肺癌患者和有淋巴浸润的肺癌患者的甲基化水平分别与无癌对照之间有显著性差异(p<0.05)。因此，MGRN1基因的甲基化水平可以用于肺癌的临床诊断，尤其可用于肺癌的早期诊断。

3、血液中MGRN1基因甲基化水平可以区分肺部良性结节和肺癌患者

通过比较分析722位肺癌患者和152名良性结节中MGRN1基因的甲基化水平，结果发现良性结节患者中MGRN1基因所有CpG位点甲基化水平显著低于肺癌患者(p<0.05，表12)。此外还发现肺癌不同亚型(肺腺癌，肺鳞癌，小细胞肺癌)、不同临床时期(I期或II-III期)和有无淋巴浸润的肺癌患者的MGRN1基因中所有CpG的甲基化水平分别都与良性结节有显著性差异。因此，MGRN1基因的甲基化水平可应用于区分肺癌患者和良性结节患者，是非常有潜在价值的标志物。

4、血液中MGRN1基因甲基化水平区分肺癌不同亚型或者肺癌不同分期

通过比较分析不同亚型肺癌患者(肺腺癌，肺鳞癌，小细胞肺癌)和945名无癌对照中MGRN1基因的甲基化水平，发现MGRN1基因中所有CpG位点甲基化水平分别在肺癌不同亚型(肺腺癌患者，肺鳞癌患者，小细胞肺癌患者)、肺癌肿瘤大小(T1、T2和T3)、肺癌不同分期(临床I期、II期和III期)、有无淋巴结浸润条件下存在显著性差异(p<0.05，表13)。因此，MGRN1基因的甲基化水平可以用于区分肺癌不同亚型或者肺癌不同分期。

5、血液中MGRN1甲基化水平可以区分胰腺癌患者和无癌对照

以79名胰腺癌患者和945名无癌对照的血液为研究材料进行分析两者之间MGRN1_C、MGRN1_D和MGRN1_F扩增片段中所有CpG位点的甲基化水平差异(表14)，其中79名胰腺癌患者中有63例为胰腺导管腺癌。79名胰腺癌患者中所有目标CpG位点的甲基化水平中位数为0.32(IQR＝0.21-0.44)，无癌对照组甲基化水平中位数为0.40(IQR＝0.26-0.54)，胰腺癌患者中MGRN1_C、MGRN1_D和MGRN1_F扩增片段中所有CpG位点甲基化水平显著低于无癌对照(p<0.0001)。63位胰腺导管腺癌患者所有目标CpG位点甲基化水平的中位数为0.31(IQR＝0.21-0.43)，且甲基化水平显著低于无癌对照(p<0.0001)。因此，MGRN1基因的甲基化水平可以用于胰腺癌的临床诊断。

6、血液中MGRN1甲基化水平可以区分食管患者和无癌对照

以118名食管癌患者和945名无癌对照的血液为研究材料进行分析食管癌患者和无癌对照之间的MGRN1_C、MGRN1_D和MGRN1_F扩增片段中甲基化水平差异(表15)，118位食管癌中包括94位食管鳞状细胞癌。结果表明，食管癌患者中所有目标CpG位点的甲基化水平中位数为0.34(IQR＝0.23-0.46)，无癌对照组甲基化水平中位数为0.40(IQR＝0.26-0.54)，食管癌患者MGRN1_C、MGRN1_D和MGRN1_F扩增片段中所有CpG位点甲基化水平显著低于无癌对照(p<0.0001)。食管鳞状细胞癌中所有目标CpG位点甲基化水平的中位数为0.33(IQR＝0.23-0.46)，且甲基化水平显著低于无癌对照(p<0.0001，表15)。因此，MGRN1基因的甲基化水平可以用于食管癌的临床诊断。

7、血液中MGRN1甲基化水平可以区分胰腺癌患者和肺癌患者

以79名胰腺癌患者和722名肺癌患者的血液为研究材料进行分析胰腺癌患者和肺癌患者血液中MGRN1_C、MGRN1_D和MGRN1_F扩增片段中甲基化水平差异(表16)。结果表明，胰腺癌患者中所有目标CpG位点的甲基化水平中位数为0.32(IQR＝0.21-0.44)，肺癌患者甲基化水平中位数为0.36(IQR＝0.24-0.48)，胰腺癌患者中所有CpG位点甲基化水平显著低于肺癌患者(p<0.05)。因此，MGRN1基因的甲基化水平可以用于区分胰腺癌和肺癌患者。

8、血液中MGRN1甲基化水平可以区分食管癌患者和肺癌患者

以118名食管癌患者和722名肺癌患者的血液为研究材料进行分析食管癌患者和肺癌患者血液MGRN1_C、MGRN1_D和MGRN1_F扩增片段中甲基化水平差异(表16)。结果表明，食管癌患者中所有目标CpG位点的甲基化水平中位数为0.34(IQR＝0.23-0.46)，肺癌患者甲基化水平中位数为0.36(IQR＝0.24-0.48)，食管癌患者中所有CpG位点甲基化水平显著低于肺癌患者(p<0.05)。因此，MGRN1基因的甲基化水平可以用于区分食管癌和肺癌患者。

9、血液中MGRN1甲基化水平可以区分胰腺癌患者和食管癌患者

分析79名胰腺癌患者和118名食管癌患者的血液中MGRN1_C、MGRN1_D和MGRN1_F扩增片段中甲基化水平差异(表16)。结果表明，胰腺癌患者中所有目标CpG位点的甲基化水平中位数为0.32(IQR＝0.21-0.44)，食管癌患者中所有目标CpG位点的甲基化水平中位数为0.34(IQR＝0.23-0.46)，胰腺癌患者中所有CpG位点甲基化水平显著低于食管癌患者(p<0.05)。因此，MGRN1基因的甲基化水平可以用于区分胰腺癌患者和食管癌患者。

10、用于辅助癌症诊断的数学模型的建立

本发明建立的数学模型可以用于达到如下目的：

(1)区分肺癌患者和无癌对照；

(2)区分肺癌患者和肺良性结节患者；

(3)区分胰腺癌患者和无癌对照；

(4)区分食管癌患者和无癌对照；

(5)区分胰腺癌患者和肺癌患者；

(6)区分食管癌患者和肺癌患者；

(7)区分胰腺癌患者和食管癌患者

(8)区分肺癌亚型；

(9)区分肺癌分期。

数学模型的建立方法如下：

(A)数据来源：步骤一中列出的722例肺癌患者、152例肺部出现良性结节患者、79例胰腺癌患者、118例食管癌患者和945例无癌对照的离体血液样本的目标CpG位点(表1-表2中的一种或多种的组合)甲基化水平(检测方法同步骤二)。

数据可根据实际需要加入年龄、性别、白细胞计数等已知参数来提高判别效率。

(B)模型建立

根据需要选取任意两类不同类型患者数据即训练集(例如：无癌对照和肺癌患者、无癌对照和胰腺癌患者、无癌对照和食管癌患者、肺良性结节患者和肺癌患者、肺癌患者和胰腺癌患者、肺癌患者和食管癌患者、食管癌患者和胰腺癌患者，肺腺癌和肺鳞癌患者，肺腺癌和小细胞肺癌患者，肺鳞癌和小细胞肺癌患者，I期肺癌和II期肺癌患者，I期肺癌和III期肺癌患者，II期肺癌和III期肺癌患者)作为用于建立模型的数据，使用SAS，R，SPSS等统计软件使用二分类逻辑回归的统计方法通过公式建立数学模型。数学模型公式计算出的最大约登指数对应的数值为阈值或直接设定0.5为阈值，待测样品经过测试和代入模型计算后得到的检测指数大于阈值归为一类(B类)，小于阈值归为另外一类(A类)，等于阈值作为不确定的灰区。在对新的待测样品进行预测来判断属于哪一类时，首先通过DNA甲基化的测定方法检测该待测样品MGRN1基因上一个或者多个CpG位点的甲基化水平，然后将这些甲基化水平的数据代入上述数学模型(如果构建模型时纳入了年龄、性别、白细胞计数等已知参数，则该步骤同时向模型公式中代入该待测样品的相应参数的具体数值)，计算得到所述待测样本对应的检测指数，然后比较所述待测样本对应的检测指数和阈值的大小，根据比较结果确定所述待测样本属于哪一类样本。

举例：如图1所示，将训练集中MGRN1基因单个CpG位点的甲基化水平或者多个CpG位点组合的甲基化水平的数据通过SAS、R、SPSS等统计软件使用二分类逻辑回归的公式建立用于区分A类和B类的数学模型。该数学模型在此为二类逻辑回归模型，具体为：log(y/1-y)＝b0+b1x1+b2x2+b3x3+....+bnXn，其中y为因变量即将待测样品的一个或者多个甲基化位点的甲基化值代入模型以后得出的检测指数，b0为常量，x1～xn为自变量即为该测试样品的一个或者多个甲基化位点的甲基化值(每一个值为0-1之间的数值)，b1～bn为模型赋予每一个位点甲基化值的权重。具体应用时，先根据训练集中已经检测的样本的一个或者多个DNA甲基化位点的甲基化程度(x1～xn)及其已知的分类情况(A类或者B类，分别对y赋值0和1)建立数学模型，由此确定该数学模型的常量b0以及各个甲基化位点的权重b1～bn,并由该数学模型计算出的以最大约登指数对应的检测指数(在此例中为0.5)为划分的阈值。待测样品经过测试和代入模型计算后得到的检测指数即y值大于0.5归为B类，小于0.5归为A类，等于0.5作为不确定的灰区。其中A类和B类为相对应的两分类(二分类的分组，哪一组A类，哪一组是B类，要根据具体的数学模型来确定，在此不做约定)，比如无癌对照和肺癌患者、无癌对照和胰腺癌患者、无癌对照和食管癌患者、肺良性结节患者和肺癌患者、肺癌患者和胰腺癌患者、肺癌患者和食管癌患者、食管癌患者和胰腺癌患者、肺腺癌和肺鳞癌患者、肺腺癌和小细胞肺癌患者、肺鳞癌和小细胞肺癌患者、I期肺癌和II期肺癌患者、I期肺癌和III期肺癌患者、II期肺癌和III期肺癌患者。对受试者的样品进行预测来判断属于哪一类时，首先采集受试者的血液，然后从中提取DNA。将提取的DNA通过重亚硫酸盐转化后，用DNA甲基化的测定方法对受试者的MGRN1基因的单个CpG位点的甲基化水平或者多个CpG位点组合的甲基化水平进行检测，然后将检测得到的甲基化数据代入上述数学模型。如果该受试者的MGRN1基因一个或者多个CpG位点的甲基化水平代入上述数学模型后计算出来的检测指数大于阈值，则该受试者判定与训练集中检测指数大于0.5的归属于一类(B类)；如果该受试者的MGRN1基因一个或者多个CpG位点的甲基化水平数据代入上述数学模型后计算出来的值即检测指数小于阈值，则该受试者跟训练集中检测指数小于0.5的归属于一类(A类)；如果该受试者的MGRN1基因一个或者多个CpG位点的甲基化水平数据代入上述数学模型后计算出来的值即检测指数等于阈值，则不能判断该受试者是A类还是B类。

举例：图2的示意图举例说明MGRN1_D的优选CpG位点(MGRN1_D_11,12、MGRN1_D_13、MGRN1_D_14.15.16、MGRN1_D_17、MGRN1_D_18、MGRN1_D_19、MGRN1_D_20、MGRN1_D_21、MGRN1_D_22、MGRN1_D_23、MGRN1_D_24,25,26,27、MGRN1_D_28、MGRN1_D_29、MGRN1_D_30、MGRN1_D_31、MGRN1_D_32、MGRN1_D_33、MGRN1_D_34、MGRN1_D_35,36,37、MGRN1_D_38,39、MGRN1_D_40、MGRN1_D_41,42、MGRN1_D_43、MGRN1_D_44、MGRN1_D_45、MGRN1_D_46、MGRN1_D_47、MGRN1_D_48、MGRN1_D_49、MGRN1_D_50、MGRN1_D_51、GRN1_D_52、MGRN1_D_53、MGRN1_D_54.55和MGRN1_D_56,57)的甲基化以及数学建模在用于肺部良恶性结节判别的应用：将肺癌患者和肺良性结节患者训练集(在此为：722名肺癌患者和152位肺良性结节患者)中已经检测的35个可区分的优选CpG位点组合的甲基化水平的数据以及患者的年龄、性别(男性赋值为1，女性赋值为0)、白细胞计数通过R软件使用二分类逻辑回归的公式建立用于区分肺癌患者和肺良性结节患者的数学模型。该数学模型在此为二类逻辑回归模型，由此确定该数学模型的常量b0以及各个甲基化位点的权重b1～bn，在此例中具体为：log(y/(1-y))＝-2.419+0.707*MGRN1_D_11,12-1.181*MGRN1_D_13-1.182*MGRN1_D_14,15,16+0.760*MGRN1_D_17+1.710*MGRN1_D_18-0.760*MGRN1_D_19+0.124*MGRN1_D_20+5.981*MGRN1_D_21+2.555*MGRN1_D_22-8.751*MGRN1_D_23+1.965*MGRN1_D_24,25,26,27-2.260*MGRN1_D_28+1.971*MGRN1_D_29+2.419*MGRN1_D_30+7.971*MGRN1_D_31+0.709*MGRN1_D_32+2.709*MGRN1_D_33+1.326*MGRN1_D_34-1.850*MGRN1_D_35,36,37-10.638*MGRN1_D_38,39+0.709*MGRN1_D_40-1.988*MGRN1_D_41,42+2.150*MGRN1_D_43-2.151*MGRN1_D_44+3.554*MGRN1_D_45-1.971*MGRN1_D_46+1.152*MGRN1_D_47+2.060*MGRN1_D_48-2.071*MGRN1_D_49-1.710*MGRN1_D_50-1.153*MGRN1_D_51+1.182*MGRN1_D_52+1.181*MGRN1_D_53+2.260*MGRN1_D_54,55-0.707*MGRN1_D_56,57+0.020*年龄-0.834*性别(男性赋值为1，女性赋值为0)-0.003*白细胞个数，其中y为因变量即将待测样品的35个可区分的甲基化位点的甲基化值以及年龄、性别、白细胞计数代入模型以后得出的检测指数。在设定0.5为阈值的情况下，待测样品的MGRN1_D_11,12、MGRN1_D_13、MGRN1_D_14.15.16、MGRN1_D_17、MGRN1_D_18、MGRN1_D_19、MGRN1_D_20、MGRN1_D_21、MGRN1_D_22、MGRN1_D_23、MGRN1_D_24,25,26,27、MGRN1_D_28、MGRN1_D_29、MGRN1_D_30、MGRN1_D_31、MGRN1_D_32、MGRN1_D_33、MGRN1_D_34、MGRN1_D_35,36,37、MGRN1_D_38,39、MGRN1_D_40、MGRN1_D_41,42、MGRN1_D_43、MGRN1_D_44、MGRN1_D_45、MGRN1_D_46、MGRN1_D_47、MGRN1_D_48、MGRN1_D_49、MGRN1_D_50、MGRN1_D_51、GRN1_D_52、MGRN1_D_53、MGRN1_D_54.55和MGRN1_D_56,57这35个可区分的CpG位点的甲基化水平经过测试后连同其年龄、性别、白细胞计数的信息代入模型进行计算，得到的检测指数即y值大于0.5归为肺癌患者，小于0.5归为肺良性结节患者，等于0.5则不确定为肺癌患者还是肺良性结节患者。此模型的曲线下面积(AUC)计算结果为0.75(表20)。具体受试者判断方法举例如图2所示，从两位受试者(甲，乙)分别采集血液提取DNA，将提取的DNA通过重亚硫酸盐转化后，用DNA甲基化的测定方法对受试者的MGRN1_D_11,12、MGRN1_D_13、MGRN1_D_14.15.16、MGRN1_D_17、MGRN1_D_18、MGRN1_D_19、MGRN1_D_20、MGRN1_D_21、MGRN1_D_22、MGRN1_D_23、MGRN1_D_24,25,26,27、MGRN1_D_28、MGRN1_D_29、MGRN1_D_30、MGRN1_D_31、MGRN1_D_32、MGRN1_D_33、MGRN1_D_34、MGRN1_D_35,36,37、MGRN1_D_38,39、MGRN1_D_40、MGRN1_D_41,42、MGRN1_D_43、MGRN1_D_44、MGRN1_D_45、MGRN1_D_46、MGRN1_D_47、MGRN1_D_48、MGRN1_D_49、MGRN1_D_50、MGRN1_D_51、GRN1_D_52、MGRN1_D_53、MGRN1_D_54.55和MGRN1_D_56,57这35个可区分的CpG位点的甲基化水平进行检测。然后将检测得到的甲基化水平数据连同受试者的年龄、性别和白细胞计数的信息代入上述数学模型。甲受试者经数学模型后计算出来的值为0.84大于0.5，则甲受试者判定为肺癌患者(与临床判定结果相符)；乙受试者的MGRN1基因一个或者多个CpG位点的甲基化水平数据代入上述数学模型后计算出来的值为0.18小于0.5，则乙受试者判定肺良性结节患者(与临床判定结果相符)。

(C)模型效果评价

根据上述方法，分别建立用于区分肺癌患者和无癌对照、肺癌患者和良性结节患者、胰腺癌患者和无癌对照、无癌对照和食管癌患者、肺癌患者和胰腺癌患者、肺癌患者和食管癌患者、胰腺癌患者和食管癌患者、肺腺癌和肺鳞癌患者、肺腺癌和小细胞肺癌患者、肺鳞癌和小细胞肺癌患者、I期肺癌和II期肺癌患者、I期肺癌和III期肺癌患者、II期肺癌和III期肺癌患者的数学模型，并且通过受试者曲线(ROC曲线)对其有效性进行评价。ROC曲线得出的曲线下面积(AUC)越大，说明模型的区分度越好，分子标志物越有效。采用不同CpG位点进行数学模型构建后的评价结果如表17、表18和表19所示。表17、表18和表19中，1个CpG位点代表MGRN1_D扩增片段中任意一个CpG位点的位点，2个CpG位点代表MGRN1_D中任意2个CpG位点的组合，3个CpG位点代表MGRN1_D中任意3个CpG位点的组合，……以此类推。表中的数值为不同位点组合评价结果的范围值(即任意个CpG位点组合方式的结果均在此范围内)。

上述结果显示，MGRN1基因对于各组的鉴别能力(肺癌患者和无癌对照、肺癌患者和肺良性结节患者、胰腺癌患者和无癌对照、食管癌患者和无癌对照、胰腺癌患者和肺癌患者、食管癌患者和肺癌患者、胰腺癌患者和食管癌患者、肺腺癌和肺鳞癌患者、肺腺癌和小细胞肺癌患者、肺鳞癌和小细胞肺癌患者、I期肺癌和II期肺癌患者、I期肺癌和III期肺癌患者、II期肺癌和III期肺癌患者)随着位点数的增加而增加。

除此以外，在表1-表8所示的CpG位点中，还存在少数几个较优位点的组合比多个非较优位点组合的鉴别能力更好的情况。例如表20、表21和表22所示的MGRN1_D_11,12、MGRN1_D_13、MGRN1_D_14.15.16、MGRN1_D_17、MGRN1_D_18、MGRN1_D_19、MGRN1_D_20、MGRN1_D_21、MGRN1_D_22、MGRN1_D_23、MGRN1_D_24,25,26,27、MGRN1_D_28、MGRN1_D_29、MGRN1_D_30、MGRN1_D_31、MGRN1_D_32、MGRN1_D_33、MGRN1_D_34、MGRN1_D_35,36,37、MGRN1_D_38,39、MGRN1_D_40、MGRN1_D_41,42、MGRN1_D_43、MGRN1_D_44、MGRN1_D_45、MGRN1_D_46、MGRN1_D_47、MGRN1_D_48、MGRN1_D_49、MGRN1_D_50、MGRN1_D_51、GRN1_D_52、MGRN1_D_53、MGRN1_D_54.55和MGRN1_D_56,57这35个可区分的最优位点的组合是MGRN1_D中任意35个组合的优选位点。

综上所述，MGRN1基因上的CpG位点及其各种组合，MGRN1_C片段上的CpG位点及其各种组合，MGRN1_D片段上的CpG位点及其各种组合，MGRN1_D片段上MGRN1_D_11,12、MGRN1_D_13、MGRN1_D_14.15.16、MGRN1_D_17、MGRN1_D_18、MGRN1_D_19、MGRN1_D_20、MGRN1_D_21、MGRN1_D_22、MGRN1_D_23、MGRN1_D_24,25,26,27、MGRN1_D_28、MGRN1_D_29、MGRN1_D_30、MGRN1_D_31、MGRN1_D_32、MGRN1_D_33、MGRN1_D_34、MGRN1_D_35,36,37、MGRN1_D_38,39、MGRN1_D_40、MGRN1_D_41,42、MGRN1_D_43、MGRN1_D_44、MGRN1_D_45、MGRN1_D_46、MGRN1_D_47、MGRN1_D_48、MGRN1_D_49、MGRN1_D_50、MGRN1_D_51、GRN1_D_52、MGRN1_D_53、MGRN1_D_54.55和MGRN1_D_56,57位点及其各种组合，MGRN1_F片段上的CpG位点及其各种组合，以及MGRN1_C、MGRN1_D和MGRN1_F上的CpG位点及其各种组合的甲基化水平都对肺癌患者和无癌对照、肺癌患者和肺良性结节患者、胰腺癌患者和无癌对照、食管癌和无癌对照、胰腺癌患者和肺癌患者、食管癌患者和肺癌患者、胰腺癌患者和食管癌患者、肺腺癌和肺鳞癌患者、肺腺癌和小细胞肺癌患者、肺鳞癌和小细胞肺癌患者、I期肺癌和II期肺癌患者、I期肺癌和III期肺癌患者、II期肺癌和III期肺癌患者有判别能力。

表10比较无癌对照、良性结节和肺癌的甲基化水平

表11比较无癌对照和肺癌的甲基化水平差异

表12比较良性结节和肺癌的甲基化水平差异

表13比较肺癌不同亚型或者肺癌不同分期的甲基化水平差异

表14比较无癌对照和胰腺癌的甲基化水平差异

表15比较无癌对照和食管癌的甲基化水平差异

表16比较肺癌、胰腺癌和食管癌的甲基化水平差异

表17 MGRN1_D的CpG位点及其组合用于区分肺癌和无癌对照，肺癌和良性结节，胰腺癌和无癌对照，以及肺癌和胰腺癌

表18 MGRN1_D的CpG位点及其组合用于区分食管癌和无癌对照，食管癌和胰腺癌，以及食管癌和肺癌

表19 MGRN1_D的CpG位点及其自由组合用于区分肺腺癌和肺鳞癌患者、肺腺癌和小细胞肺癌患者、肺鳞癌和小细胞肺癌患者、肺癌I期和肺癌II期、肺癌I期和肺癌III期、肺癌II期和肺癌III期癌患者

表20 MGRN1_D的最佳CpG位点及其组合用于区分肺癌和无癌对照，肺癌和良性结节，胰腺癌和无癌对照，以及肺癌和胰腺癌

表21 MGRN1_D的最佳CpG位点及其组合用于区分食管癌和无癌对照，食管癌和胰腺癌，以及食管癌和肺癌

表22 MGRN1_D的最佳CpG位点及其组合用于区分肺腺癌和肺鳞癌患者、肺腺癌和小细胞肺癌患者、肺鳞癌和小细胞肺癌患者、肺癌I期和肺癌II期、肺癌I期和肺癌III期、肺癌II期和肺癌III期癌患者

<110> 南京腾辰生物科技有限公司

<120> 一个基因的甲基化水平在辅助诊断癌症中的应用

<130> GNCLN200268

<160> 24

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 873

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 1

aatcccagct actggggagg ctgaggcacg agaatcgctt gaacacggga ggcaaaggct 60

gtagtgagct gagattgtgc cacttctctc cagactgcgc gacagaacaa tttaaaaaaa 120

aagaggaaga ctggatcctg gactgtggtc tctggaaggg tataagaagc atttccacat 180

ggactgtggt gaattgacca ttggagactc agtctgcctt gccctcccta gctgctttct 240

tggtacagca ggcttgactt gggaaatcac tctgctcaga atccaagttc ctcaactgaa 300

aagtaggtaa aaagcgatct atttgcagag ctgtgtgtga ctcaaaagcc agggaacacc 360

ttgcacactg cgaggttttc attctgaaag cgattcttgc aatcttgccc gcagcgccat 420

ttcatgcggc tctctctcct ctgtgcctca gtttccctgt gtgtaaaatg tgggagagtc 480

tactgccttc cgtggaggct gtgaaattat gtctttaaac taattggtcc agacgtgggg 540

ccaaagtatc gggattacag gtgagccact gcaccgggcc tcagccttgt cagggggccg 600

gaggttgctt aaccccctgg atcccagctt cctcatctgt aaaacgggct gatgcctata 660

cagctctcag aaccacacct ggttcagaag tccccaaatg gtagtcctca aattctggcc 720

aaggccaaag caggtgcttc acttcttccg tgcacaccct gcaagtgggc tccgggtggc 780

aggtgcagct acgccctctg ccggtcgggg cgggagacaa actcagggga gtggggagaa 840

ccacagcgac tcagggagct atttcagagg ggg 873

<210> 2

<211> 854

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 2

ccaaagaggt aaccttcagg gtggggggtg tcgaatttct ctcctcccat gaaaaagtgc 60

gaagcaaagt agtttcctgt ttaaaaaagg aaacacgatt atagattttt tttttttttt 120

tttgagacag agtctcaggc tagagtgcag tggcgctcca cccaggctgg agtgcagtgg 180

cgctatctca gctcactgca agctccgccc accgggttca agcgattctt ctgcctcagc 240

ctcccgagta gctgggatta ccggcaccca ccaccacgcc cagctgattt ttgtattctt 300

agtggagacg gggtttcacc atattggcca ggatggtctc caatgcccgg cctcaggtaa 360

tccgcccgcc tcagcctccc aaggttctgg gattacaggt atgagccacg gcgcccagcc 420

tggaaacagt tatcgactct gaggctgaac acagcctggt gggaacatct gacggccaag 480

aagctcggcc ctgagaaagg ctccacctga ggggagctga tgcagacagg ccagcgggtg 540

cccctcatac cctctgcctc ggccacctgg cctcgggcct tccaaggtgg cctcctggcc 600

tctccacact gccagcctca acacccttcc ctggacggct cctcgctgct cccagcccat 660

cagccagcat ccagctccaa caccactttc ttctgtagtg gcctgagctg tgtttccgat 720

gaagttcggg tcctactcca cacccagccc ctacctgtgc atgtgacctt atttggatct 780

agggtctttg cagatgtaat caagttaaga ggaggtcata ctggattgag gggctctaaa 840

tccagtgact ggtt 854

<210> 3

<211> 924

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 3

ccttgcttgc cttttgtgtt tgctggggcc aagtccggtg ccttcttcag aaagttacag 60

ggagttgccc agtgaccagc acttcccctc agaggcacgc acccgggaga actgaaaacg 120

cggttcaggc agacacttgc gcaccggtgt ccagtgcagc gctgctcacc gtagccagga 180

cacaggccca gcccggtgtc cgtcgcaaag gaacgcgtgc acagcgtgtg gatatccaca 240

cagtgcctgt tatttggcca gaaaaaggaa agcagcaccg atgcgtgctg caccgtgggt 300

gaactttgga aacataccta gacacagaag gtcacctgtt gtgcaattcc atgtaaatga 360

caggtccaaa aatggcaaat ccctggagac aggaagcaca tggtggctgc cgggggctgg 420

aggaggggat ggggagtgtg tgggtgctga tggctacgtg tggggtttcc gtttggggtg 480

atgaaaagtt ctggaaatgg atggtggcgg ttgcatgaca ttatagatgt actttactca 540

acgctgttga aacgtagtta aaatggcaga ttttgtgttg tatctgtttt aacacacaca 600

taaaaaaggt gccaagcctg gcatccgcct tccctgccat ctcgaggcgt gtcctctgag 660

ctctgctgct gcctcctgct cctgcctgct ttgtccagct catttgttga ccgactccag 720

gcttccaggc ttggctgtgt gggtcctgac cattcttggc aactctctcc tcagctgaac 780

tttgacctgg accggggcgt gtttccagta gtcatccagg ctgtggtgga cgaaggagat 840

ggtgagtgcg tcctcttccg tcctcctggg cgtgcaggcc gtgcagggag gaagcacgtc 900

ttgagggagg agtgcttgca gcag 924

<210> 4

<211> 1341

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 4

aagaaggaaa atgcccaggt tctggggaac ggaagtcaga ctgcgggggc ccctgctctg 60

tccccacaaa accaggttga ggggcacaac gctcgtcagt gctcctttcg ggagaccccg 120

gcctgcctga ccgagctcct ggaaggaagg ggaaagtgag atgggtgcgg gatgcctgga 180

gaccacgggg aggtggggga gaaatggggg agcgggcacg gcccgggcaa tgagcccggg 240

atgcttttct ggacctctgt gtaccccaca tttgctccca tacctgcctc caagttaagg 300

gtaaataacc acacagaatc ccctcacccc tctagaaagg aaaacacggt ccgggtggct 360

ccggagtggc ctccaccttc tacaccaacg cacacagggt ttcggctggg tctgcctggg 420

ccacggaggc tccaggtggt tgtgtgctgg tccccctgcc tgctccctgg ggcacaaggg 480

aagcccaagg aaaccaaaaa gctcagccca aggagctcga acccgcaggg taaaggagcg 540

ggacacgggg ccaagaagca tgcgcggggc gcgattgcaa aacgcagcag cgacgttagt 600

tccgcctgca acgtccattc cactgccagc aagaaaaaaa agggaaacgg cacgggggcc 660

acgcggggcg gaggcaaagc tgaggggagg gcggcggggc cagcgcacct ggcgtttcgc 720

ccacggaccg agagcttttc cggttccaca aactccctgg gcagggaggc cgggactggg 780

caagtggagc tgacgggtta tatgaatcag acactagcct ggggcggaaa cgatctcccc 840

tacttgtcgt gggtttaaaa atgagggcgg gggcaaaaaa acgtagccgg aggaccagac 900

acttactgtt tcccttttag gtttcttgct ggccagggag gcggggtgcg gctttgattt 960

tttaaaggga cactgtcaag ataaaaatca tatgttttac aactaccacc cccacgcggc 1020

cctggagtgg gctggacagg tctgactggc tgtcctcttg ccacaccgtg gcgcagaact 1080

tcacaagctt ccgggggacg tgaatctcgg gactgtccta agtgagggtt gactcgggtc 1140

tgggtgggcc atgtgtgcgt ctcggcagct cccgggagct gtgctgctgc agtggggagg 1200

ctgtggagcc caatctcatc cccattgcct gtccccccgc agtctgggtc acctggggca 1260

acagatttgg ccaaggtgga cgtgagggca gctgaacgct gcctaatgca ggctgggtgc 1320

agggtggaga tcctgaagcc a 1341

<210> 5

<211> 1138

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 5

gtctgggaac ccagaggctc aaaggggctc ccctcagcag agacacagca ccgacccctg 60

cagtttcctg ctcgagagca cgtatgcgcc tgcacgccgg tgtggccctg gtcgggggat 120

caaagcctcc agctgcccgg acgctcttcc tgcctcgtct gctgcgttct ttgccgtaat 180

aaactttacc catgagtcta acctgatacg gggtctccga gtccttctgg ggaatcgcca 240

cacagaacac atcacaaact gatttgaaac cacaaagaca cccgctccgc acgcgcgcca 300

ccacacaccc tgccatgcac ctggcctggc tgctgctcac ctgtcggggg ccttgctctg 360

cggcctgccc ttctggcggc tgctgtccag gatgtggtcg atagccgcga ggggacagct 420

ggcctgggac aggccgtccg agatgcctga ataggtgatt tcttcataaa gaggggccga 480

ggggatggcc ggggagacag cccggaggcc gttgagcgcc tcgagcagcg agatgggctc 540

gtagccaggt gggacgctgt cagagttctg tagggacagg gtgcgtgagg gggctcatgc 600

ccagggacca cctgctcccc agacgctcct cctgatgacc tcctgtccac tctgttcttt 660

gggggattga gactccccca ccctcagagg gtggccaaga gctccctggc agcaccgatg 720

ccctccctgc ctcagccatc agctccagca cggggctgga tgcccaaatg cccacgctgg 780

tgcctgggat gacgggcacg agggcatctg ccaagaaccg ccccagccct ggcctcaacc 840

agcccctccc tggctttcag tcccgcctgg ccccaggtgg agagtgaagg gttagtgaca 900

gacaggagct gggagcgggg gcagagcaaa gccatgccag aggcgagaga cacggtcagg 960

ggcgtcctgg accagggaga gctgagctgt tgggagctgt gccctgcccg ggcctctggg 1020

ggctgacctg ctccaggtgg ttctaacggg caccctggct aagagccact gttcttccct 1080

cactgggagc agacagaatc aacaaggctg aggaagaagg aaaatgccca ggttctgg 1138

<210> 6

<211> 1238

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 6

gccagggctg cctggtccct gcatgcggtt tgtgcccatg gaaggaggcg ctcaccttgc 60

tgtggtgacg acgactcatc aacctcttct gttatgaaac tctaggaaac aaaggggaaa 120

gtagcctaga gctcagagag ccgcggccac cgctccagga caagccgcca tcaggcacgg 180

ccctcccggg accgcacagc cgctccacca gggggtgctg cctccacaga ccgaggctaa 240

ggagccgcgc agctcagcaa gagccaacaa gcacgggggc gcccaggcgg gcagtgggat 300

ggggtctgat tccagcgaca gaagctggag gagggctggc ccgggcgggt gcgcaaagct 360

tccccggggg ggcctcacct caggggagct gctttcccgc agggccagct ctgcgccacc 420

cagtggggga ggggcgtcca cgtcctcgga gagcttctcc tcatcctctt cgtggatggg 480

ggaagacggg gaccgtaggg tgctggggac agaggagagg gtgggcaggg gtgagaggat 540

aacgacaagg aaggctaacc ctgccaaagc catgcagggc acctgggggc ccctgcacac 600

gcctgccagg acccacgcaa ggacactccc tggagaaggg catcaccagc caccgggacc 660

aacccaaacg gccaacaggc aacagcggcc accacagacc cgcccgacag aggggctccc 720

gacacactgg cacgggccta gccttccttt tctttctaga aggagaagag aaaccgctgg 780

tggttcctgg ggaggagaag cagcaggaga cagaggcccc cgtttctctg agctttggcg 840

ctgcctcctc gtgggcatgg agggtgccca gggcgggcct gcagaacccg cgccttcctg 900

acactcttct acgagaaccg acaggcctga ggcacagagt ccccctggca gccgccgctc 960

tatacaccgc aaggctccag gggaaccacg aatgacccgt ggccaacccc aggagccagg 1020

ccctccgaag gctgtcgtat gagtgatgga tgatgcactc atcgcctgga gagggaccgt 1080

gccccgtggc tcgtcacggg cgaacggcaa gagcagtgag tgtgcctggg tcactgtcag 1140

gtcctgagtt tcggctgccc tggctggtca ccggcagagt gggcctacgt ggccagcccc 1200

ccaatgaagt ctgggaaccc agaggctcaa aggggctc 1238

<210> 7

<211> 756

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 7

gaaccctgct gtccctgtag atgggagggc ccatgagatg gtgaacactg ggggccctgg 60

tgtcttggac ttggccctga gctcggtcct gtctagcctc agccccccac ccagggcctt 120

cactcctgaa accagaggtg gactgcgccc gttaggtcct tcatgcgccc ttccctaggc 180

tgcggcagcg ggaggtatgg gagggagggg cagggccagt gcgctcctcc gcgttgaatt 240

ctggctgcgc tctgcctccc agctgtggtt ctccttgtgg ttctctgtgg ttgcagcaga 300

gtgtttgttt ctagacggcc tcgaccgtgt ccccaagctg gtgcccttgc tgtggctgtg 360

ctggctgctg cgcgcttgct aaccgagctt ccgtctgtct ctccccctct ccgcgcagcc 420

ctggggcccg actcctgctc tgttggtata gacgagtaag ccggtacgtg acctcccaga 480

cgcgcttcgg gggctctgac gcgcgtcctt ggagagagga gccctcccct gctctctggc 540

gggggttcct tctggttttt gggtcttcgt ccgcatccgc atcttcccag gggccctgga 600

ttccgaatcc agagctctcc agtggctgct gcaccttccc ccagaaagtg gcctcctggg 660

gggtcctgac tttcggggcc agaggtctct ccatctggac taggcggccg gtcaggctct 720

tcttccagcc ttgaggggcc ctggaacagt cccagc 756

<210> 8

<211> 890

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 8

gggccaggca ggtgtctgct gctcacctgg ctctggaggg ctgccctgca gctgggcctg 60

gggacaggtc ggctgtgggg cagctcagta ccctccctga ggctcacggt ggctccgagc 120

atgaggtccg cctcctgggc gagacccagc agtggacagc atggtcctca cacccagctc 180

cctgcacacc caggccagcc acccctcccg ctcgtgcaca ggcacgcaga tgcgctcaca 240

cgtacacaca cacaaatgca cgcccacttg cacatgctca cgcacatgtt cacacatgca 300

cactcacgct cacacatgct gtcacgcata cacacacgca catactcctg cacatgttcc 360

catgcatgtg tgtgcactcg gaccgagcat ctcccacgca cctctacccc accccaagca 420

cctctctccc cccatgcacc tctccccaac aacacacaca gccccctgca ccgcccgccc 480

cccgccccca ccaaggcccc agcctctggc catcagtcct ggtgccagag ctttgcgtga 540

agttcgggcc gcagagtggc ccgctgggac tcccatgtgc tgccgtctga tgtgctcaga 600

tgggctcatc gttggttcgt ttttactgta tatttatagt aataaaatca tgcagcaata 660

tcctgtctgc tccttcctcc gggtgcagcc ctcaggattg tggctgtttc ctgacccgga 720

gttttgccgc tgggtggttg gcggtggctc ccgcaccgtg gcagctccac ggcctctgcc 780

tggcttccct ctggggtcag ggcagtgagc aaggtgaggg ctaacgagaa cgggcagctc 840

ccagccatcc ctgtcagggc tagttgtctg gttggaggga agccacaccc 890

<210> 9

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 9

aggaagagag aattttagtt attggggagg ttgag 35

<210> 10

<211> 56

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 10

cagtaatacg actcactata gggagaaggc tccccctcta aaataactcc ctaaat 56

<210> 11

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 11

aggaagagag ttaaagaggt aatttttagg gtggg 35

<210> 12

<211> 56

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 12

cagtaatacg actcactata gggagaaggc taaccaatca ctaaatttaa aacccc 56

<210> 13

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 13

aggaagagag ttttgtttgt tttttgtgtt tgttg 35

<210> 14

<211> 56

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 14

cagtaatacg actcactata gggagaaggc tctactacaa acactcctcc ctcaaa 56

<210> 15

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 15

aggaagagag aagaaggaaa atgtttaggt tttgg 35

<210> 16

<211> 56

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 16

cagtaatacg actcactata gggagaaggc ttaacttcaa aatctccacc ctacac 56

<210> 17

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 17

aggaagagag gtttgggaat ttagaggttt aaagg 35

<210> 18

<211> 56

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 18

cagtaatacg actcactata gggagaaggc tccaaaacct aaacattttc cttctt 56

<210> 19

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 19

aggaagagag gttagggttg tttggttttt gtatg 35

<210> 20

<211> 56

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 20

cagtaatacg actcactata gggagaaggc taaacccctt taaacctcta aattcc 56

<210> 21

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 21

aggaagagag gaattttgtt gtttttgtag atggg 35

<210> 22

<211> 56

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 22

cagtaatacg actcactata gggagaaggc tactaaaact attccaaaac ccctca 56

<210> 23

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 23

aggaagagag gggttaggta ggtgtttgtt gttta 35

<210> 24

<211> 56

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 24

cagtaatacg actcactata gggagaaggc taaatataac ttccctccaa ccaaac 56