一种评估乳腺癌风险的方法及其使用的miRNA组合

摘要

本发明公开了一种评估乳腺癌风险的方法，包括如下步骤：根据乳腺癌患者和健康者的外周血样本中miR‑30b‑5p、miR‑148a‑3p、miR‑195‑5p、miR‑424‑5p和miR‑451a的表达量，进行二元Logistic回归分析，得到LogitP值计算公式并确定阈值；检测待测者的外周血样本中上述miRNA的表达量并代入LogitP值计算公式，得到待测者的LogitP值；之后进行如下判断：如果待测者的LogitP值大于阈值，则待测者患有乳腺癌的风险高；如果待测者的LogitP值为阈值以下，则待测者患有乳腺癌的风险低。实验证明，本发明提供的乳腺癌风险评估的方法特异性好、灵敏度高且准确率高。本发明具有重要的应用价值。

说明书

技术领域

本发明属于生物医学领域，具体涉及一种评估乳腺癌风险的方法及其使用的miRNA组合。

背景技术

乳腺癌是全球女性常见的恶性肿瘤之一。目前，用于乳腺癌早期诊断的影像医学诊断方法中，乳腺X线照相术是唯一经过临床验证的测试方法。然而，乳房X线照相术具有假阴性诊断、根据假阳性诊断过多额外检查、不必要的活检、心理负担和放射线暴露的问题。乳腺摄影的敏感性范围为62.2至89.5％，特异性为62.7％。与西方国家相比，我国女性的乳房密度更高，导致乳腺钼靶的敏感性明显降低。乳房超声检查主要用作乳房X线检查的辅助检查。但是，作为辅助检查的乳房超声波检查存在以下问题。首先，它高度依赖于测试设备和测试人员；第二，关于乳腺癌死亡率的科学和客观证据尚未建立；第三，假阳性是无法避免的，需要进行额外的检查和活检；第四，由于钙化病变，乳腺癌的早期诊断很困难。因此，有必要开发一种新的辅助筛查乳腺癌的方法，以解决乳房X线照相术的局限性。

miRNA是一类内源基因编码长度约为19-24nt的非编码单链RNA分子。由于miRNA能够很好的识别并配对后转录基因进而调控蛋白的表达，所以它与动物体内的生物过程息息相关。研究表明，miRNA与多种肿瘤发生有着密切的关系，它可能像癌基因或抑癌基因一样在肿瘤发生、发展过程中发挥重要的调控作用。当miRNA的行为异常时会导致疾病的发生，如miRNA-122是肝癌细胞发病的肿瘤标志物。此外，miRNA不仅存在于组织和细胞中，还稳定地存在于外周血及体液当中。所以在众多癌症的筛查、诊断及治疗过程中，miRNA是一个重要的生物指标。

发明内容

本发明的目的为对乳腺癌进行早筛或评估待测者的乳腺癌风险。

本发明首先保护一种乳腺癌早筛的方法，包括如下步骤：

(1)根据若干乳腺癌患者的外周血样本和若干健康者的外周血样本中miR-30b-5p、miR-148a-3p、miR-195-5p、miR-424-5p和miR-451a的表达量，进行二元Logistic回归分析，得到LogitP值计算公式并确定阈值；

(2)检测待测者的外周血样本中miR-30b-5p、miR-148a-3p、miR-195-5p、miR-424-5p和miR-451a的表达量并代入步骤(1)得到的LogitP值计算公式，得到待测者的LogitP值；之后进行如下判断：

如果待测者的LogitP值大于阈值，则待测者患有乳腺癌或疑似患有乳腺癌；

如果待测者的LogitP值为阈值以下，则待测者不患有乳腺癌或疑似不患有乳腺癌；

所述miR-30b-5p的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；

所述miR-148a-3p的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；

所述miR-195-5p的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；

所述miR-424-5p的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示；

所述miR-451a的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示；

所述方法用于非疾病的诊断与治疗。

上述方法可用于疾病的预防。

上述方法中，所述表达量可为相对表达量。

上述方法中，所述相对表达量可为目的miRNA相对内参的表达量。目的miRNA可为miR-30b-5p、miR-148a-3p、miR-195-5p、miR-424-5p或miR-451a。内参可为miR-19a-3p。所述miR-19a-3p的核苷酸序列可如SEQ ID NO:6所示。

本发明还保护miRNA组合甲在制备用于乳腺癌早筛的产品中的应用；

miRNA组合甲可为A1)或A2)：

A1)包括所述miR-30b-5p、所述miR-148a-3p、所述miR-195-5p、所述miR-424-5p和所述miR-451a；

A2)由所述miR-30b-5p、所述miR-148a-3p、所述miR-195-5p、所述miR-424-5p和所述miR-451a组成；

所述应用用于非疾病的诊断与治疗。

本发明还保护miRNA组合乙在制备用于乳腺癌早筛的产品中的应用；

miRNA组合乙为B1)或B2)：

B1)包括所述miR-19a-3p、所述miR-30b-5p、所述miR-148a-3p、所述miR-195-5p、所述miR-424-5p和所述miR-451a；

B2)由所述miR-19a-3p、所述miR-30b-5p、所述miR-148a-3p、所述miR-195-5p、所述miR-424-5p和所述miR-451a组成；

所述应用用于非疾病的诊断与治疗。

本发明还保护一种评估乳腺癌风险的方法，可包括如下步骤：

(1)根据若干乳腺癌患者的外周血样本和若干健康者的外周血样本中miR-30b-5p、miR-148a-3p、miR-195-5p、miR-424-5p和miR-451a的表达量，进行二元Logistic回归分析，得到LogitP值计算公式并确定阈值；

(2)检测待测者的外周血样本中miR-30b-5p、miR-148a-3p、miR-195-5p、miR-424-5p和miR-451a的表达量并代入步骤(1)得到的LogitP值计算公式，得到待测者的LogitP值；之后进行如下判断：

如果待测者的LogitP值大于阈值，则待测者患有乳腺癌的风险高；

如果待测者的LogitP值为阈值以下，则待测者患有乳腺癌的风险低；

所述miR-30b-5p的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；

所述miR-148a-3p的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；

所述miR-195-5p的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；

所述miR-424-5p的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示；

所述miR-451a的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示；

所述方法用于非疾病的诊断与治疗。

上述方法可用于疾病的预防。

上述方法中，所述表达量可为相对表达量。

上述方法中，所述相对表达量可为目的miRNA相对内参的表达量。目的miRNA可为miR-30b-5p、miR-148a-3p、miR-195-5p、miR-424-5p或miR-451a。内参可为miR-19a-3p。所述miR-19a-3p的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示。

上述任一所述的方法中，检测外周血样本中miR-30b-5p、miR-148a-3p、miR-195-5p、miR-424-5p和miR-451a的相对表达量的方法可如下：

(1)获得外周血样本的cDNA；

(2)以外周血样本的cDNA为模板，采用通用扩增引物(核苷酸序列为：5’-CAGTGCAGGGTCCGAGGT-3’)和相应的目的miRNA的特异扩增引物组成的引物对进行实时荧光定量PCR，获得目的miRNA的表达量；以外周血样本的cDNA为模板，采用通用扩增引物和5’-TCGGTGTGCAAATCTATGCAA-3’组成的引物对进行实时荧光定量PCR，获得miR-19a-3p的表达量。

(3)将实时荧光定量PCR的结果通过ABI 7300plus Real-Time PCR Softwarev2.4输出，即每个样本的Ct值；之后计算ΔCt

所述步骤(1)中，获得外周血样本的cDNA是以外周血样本的的RNA为模板，采用反转录酶进行逆转录得到的。进行反转录的RT引物可为5’-CAGTGCAGGGTCCGAGGTCAGAGCCACCTGGGCAATTTTTTTTTTTVN-3’。

所述步骤(2)中，目的miRNA的特异扩增引物的核苷酸序列见表2。

上述任一所述miRNA组合甲在制备用于评估乳腺癌风险的产品中的应用也属于本发明的保护范围；

所述应用用于非疾病的诊断与治疗。

上述任一所述miRNA组合乙在制备用于评估乳腺癌风险的产品中的应用也属于本发明的保护范围；

所述应用用于非疾病的诊断与治疗。

在本发明的一个实施例中，检测140个健康者的外周血样本和60个乳腺癌患者的外周血样本中miR-30b-5p、miR-148a-3p、miR-195-5p、miR-424-5p和miR-451a的相对表达量，进行二元Logistic回归分析，得到LogitP值计算公式为：LogitP＝ΔCt

实验证明，本发明提供的早筛乳腺癌或乳腺癌风险评估的方法特异性好、灵敏度高且准确率高。本发明具有重要的应用价值。

附图说明

图1为利用MedCalc 19对200个样本的LogitP值制作的ROC曲线。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中，采用SPSS 25.0软件进行统计学分析，P<0.05被认为具有统计学意义。

下述实施例中，9种miRNA的名称和核苷酸序列如表1中第2行至第10行所示。

表1

实施例、

一、阳性样本和阴性样本的获得

1、乳腺癌组

乳腺癌组由77份阳性样本组成，依次命名为P001-P077。

分别抽取临床上已确诊为乳腺癌的77例患者(所有患者均知情同意)的外周血5-6mL，置于含EDTA抗凝采血管，上下颠倒5-6次(目的为抗凝液和外周血混匀)，之后3000rpm离心10min，收集上清，得到77份阳性样本。

2、健康对照组

健康对照组由163份阴性样本组成，依次命名为N001-N163。

分别抽取163例健康人(均知情同意)的外周血5-6mL，置于含EDTA抗凝采血管，上下颠倒5-6次(目的为抗凝液和外周血混匀)，之后3000rpm离心10min，收集上清，得到163份阴性样本。

二、cDNA的获得

1、分别取240份样本(即77份阳性样本和163份阴性样本组成)，获取相应的血浆。

2、采用TRIzol试剂分别提取240份血浆的RNA，即获得240份样本的RNA。

3、完成步骤2后，分别取(少量)240份样本的RNA，使用Qubit 4.0(LifeTechnologies)进行定量(即测量240份样本的RNA的浓度)。

4、完成步骤3后，分别以240份样本的RNA为模板(约10ng RNA)，采用反转录酶进行逆转录，得到相应的cDNA。进行反转录的RT引物为5’-CAGTGCAGGGTCCGAGGTCAGAGCCACCTGGGCAATTTTTTTTTTTVN-3’。

三、目的miRNA的筛选和基于5种目的miRNA的相对表达量辅助诊断乳腺癌

目的miRNA为miR-30b-5p、miR-148a-3p、miR-195-5p、miR-424-5p、miR-451a、miR-205-5p、miR-96-5p或miR-140-3p。

1、实时荧光定量PCR检测

分别以步骤二得到的cDNA为模板，采用通用扩增引物(核苷酸序列为：5’-CAGTGCAGGGTCCGAGGT-3’)和相应的目的miRNA的特异扩增引物组成的引物对进行实时荧光定量PCR(每个模板做三个平行样)。通过实时荧光定量PCR检测目的miRNA的相对表达量(以miR-19a-3p为内参)。目的miRNA的特异扩增引物的核苷酸序列见表2。

表2

分别以步骤二得到的cDNA为模板，采用通用扩增引物和5’-TCGGTGTGCAAATCTATGCAA-3’组成的引物对进行实时荧光定量PCR(每个模板做三个平行样)，获得miR-19a-3p的表达量。

2、将步骤1得到的实时荧光定量PCR的结果通过ABI 7300plus Real-Time PCRSoftware v2.4(美国Thermo Fisher Scientific公司的产品)输出，即每个样本的Ct值。Ct值越小，目的miRNA的表达量越高(经统计分析，将Ct值大于35视作不表达)。同时计算ΔCt

其中200份样本的目的miRNA的Ct见表3-1和表3-2。

表3-1

表3-2

3、目的miRNA的筛选

采用SPSS 25.0软件对步骤2中8个miRNA的相对表达量(以miR-19a-3p为内参)进行统计学分析。结果表明，miR-205-5p、miR-96-5p和miR-140-3p在阳性样本和阴性样本之间没有显著差异。因此，最终确认的用于辅助诊断的目的miRNA为5个，分别为miR-30b-5p、miR-148a-3p、miR-195-5p、miR-424-5p和miR-451a。

4、辅助诊断乳腺癌

(1)根据200份样本中的ΔCt

LogitP＝ΔCt

(2)根据上述公式计算出每个样本的LogitP值，之后利用MedCalc 19制作ROC曲线。

ROC曲线见图1。结果显示对乳腺癌诊断的敏感性为93.33％，特异性为87.14％，阈值为-1.3221，即如果LogitP>-1.3221，则样本为阳性，即样本的提供者患有乳腺癌；否则样本的提供者不患有乳腺癌。

5、验证

以步骤2中其它的40份样本进行验证，具体为17份阳性样本(样本编号为P061-P077)和23份阴性样本(样本编号为N141-N163)。

40份样本的6个miRNA的Ct见表4中第2-7列。

表4

分别将40份样本中的ΔCt

40份样本的LogitP值见表4中第8列。

检测结果见表5。

表5

利用SPSS 25.0软件进行Kappa一致性检验。Kappa值为0.7954，一致性较好。

上述结果表明，采用本发明提供的方法检测乳腺癌具有较高的准确率。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

<110> 深圳市展行生物有限公司

<120> 一种评估乳腺癌风险的方法及其使用的miRNA组合

<160> 9

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 22

<212> RNA

<213> Artificial sequence

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uguaaacauc cuacacucag cu 22

<210> 2

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<212> RNA

<213> Artificial sequence

<400> 2

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<210> 3

<211> 21

<212> RNA

<213> Artificial sequence

<400> 3

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<210> 4

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<212> RNA

<213> Artificial sequence

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<210> 5

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<212> RNA

<213> Artificial sequence

<400> 5

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<210> 6

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uuuggcacua gcacauuuuu gcu 23

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<213> Artificial sequence

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