一种鉴定番茄绿色果肩的dCAPS分子标记及应用

摘要

本发明提出了一种鉴定番茄绿色果肩的dCAPS分子标记及应用，属于基因工程技术领域，包括鉴定番茄绿色果肩的dCAPS分子标记，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。本发明利用已知位点的DNA序列信息设计出一对特异性的引物并改进一对特异性引物，用该引物扩增DNA片段，接着用限制性内切酶酶切PCR产物，通过琼脂糖凝胶电泳分离酶切片段来鉴定不同的番茄材料；开发出dCAPS分子标记U11.5和改良的分子标记UG11.2，这两个分子标记可以用于苗期鉴定番茄果实是否携带绿色果肩这一特性。利用该标记方法不仅节约了田间育种成本，同时缩短了育种周期，加速了番茄育种进程。

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种鉴定番茄绿色果肩的dCAPS分子标记及应用。

背景技术

番茄(Solanum lycopersicum)又称西红柿，是茄科番茄属的一年或多年生的草本植物，是我国主栽蔬菜作物之一。番茄果实的均匀着色有利于番茄最适采收期的确定，同时能增加对消费者的吸引力。因此在长期以来的育种工作中，人们将番茄果实靠近果柄端不含绿果肩视为一个重要的育种目标，但是这一育种目标无意中导致了番茄果实中糖及风味物质含量的下降，降低了番茄成熟果实的品质。

研究表明，未成熟的番茄果实也能够进行光合作用，并且能够贡献高达20％的果实光合产物，而果实的其余光合作用产物则从叶片部分转运而来。Powell研究发现U基因编码转录因子SLGLK2，在未成熟的番茄果实中纬向梯度表达来决定叶绿素的积累与分布，因此SLGLK2在果实的茎端有较高的表达从而使番茄形成绿果肩表型；Nadakuduti研究发现UG基因编码转录因子KNOX转录因子TKN4，TKN4通过调控SLGLK2的纬度梯度表达来调控叶绿素的纬度梯度分布。两者共同作用导致番茄未成熟果实的果肩呈现为深绿色，同时提高了果实的光合能力，提高淀粉含量，最终促进糖在成熟果实中的积累，因此番茄的绿色果肩表型通过影响果实的营养价值和口感直接影响番茄品质。

番茄绿肩性状由U和UG两个基因控制，当基因U和UG同时存在时，番茄未成熟果实才呈现出绿色果肩性状。Powell研究发现基因u与U相比，仅仅是在SL2.40ch10:2292260-2292267之间有一个单碱基A的插入的区别。因为这个单碱基A的插入，导致在翻译过程中使得终止密码子提前到来。因此U基因编码一个具有310个氨基酸的蛋白质，而u基因只能编码一个被截断的80个氨基酸长度的蛋白质，导致无法行使原有正常的蛋白功能而无法形成绿色果肩；Nadakuduti研究发现突变体ug破坏了SLGLK2在未成熟果实中的梯度表达，使得绿色果肩消失。突变体ug第二外显子内发生了碱基T→A的替换，导致原本应该编码的苯丙氨酸被亮氨酸所取代，改变了蛋白原有的功能，破坏了番茄未成熟果实中叶绿素的梯度分布，因而不能形成绿色果肩。Nadakuduti针对UG基因开发出了相关的CAPS分子标记，但由于该分子标记在实际检测运用中易出现污染现象，影响检测结果的准确性，因此本专利对Nadakuduti开发出的分子进行了改进，但针对U基因并没有相关连锁的DNA分子标记报道。

专利CN111996192A涉及植物基因编辑技术领域，具体涉及一种通过基因编辑技术创制果实无绿色青肩番茄材料的方法及应用，包括创制果实无绿色青肩番茄材料的靶标位点、引物、表达载体及其应用。该发明针对SlGLK2基因进行进一步的研究，利用CRISPR/Cas9技术快速创制新材料、培育新品种，且可以分离筛选掉转基因载体，不涉及转基因争议，具有一定的商业价值，但是，该方法复杂，且无法只鉴别番茄是否有绿色果肩，而不影响番茄的遗传规律。

选育绿色果肩番茄对提高番茄品质具有重要的意义。在番茄苗期，使用与番茄绿肩性状紧密连锁的分子标记能够高效和准确地鉴定番茄绿色果肩性状，并鉴定相关基因型，不受发育时期和环境条件的限制，从而加速番茄的育种进程。

发明内容

本发明的目的在于提出一种鉴定番茄绿色果肩的dCAPS分子标记及应用，根据已知序列的U基因，获得一个鉴定番茄绿色果肩性状的dCAPS分子标记，并且此标记利用琼脂糖凝胶电泳可以清晰的显示差异，便于应用于筛选果实带有绿色果肩的番茄品种。

本发明的技术方案是这样实现的：

本发明提供一种鉴定番茄绿色果肩的dCAPS分子标记，其核苷酸序列如SEQ IDNO:1所示。

5’-TCTTTGAATGAGTTGATTATCTGTTGTAGCAGGTAATTTGTCTTATTTTCAACATTACAAAAATTTAAGAGTTTAAGGAGAGACTTATCTACACATTTAACTAATTTATAACAGATAATTTATCTTATTTTTAAAATTACGAATCTCATTTTACGAAAAGGCTTGCTTGTCTATATTCTTTGAATAATTGATTATCTGTTATATCGAGTAATTTAGGTTGATTCTCAATATTACAAATCTCACATTTTAAGATGCTGGCATTTGTGTGATTCTTATCTTTTAGTGACTTGTTATAGCATGTAATCTTATCTTACTTTTAATATTACTAATTAATCTTACATTTTTATTTTCTTGAAGGTTAATTATACTTATAGTATTTGAAATAATGCTTGCTCTATCTTCATCATTGAGCTACAAAAATGAAAGGGAAAATTATGATTTATTCCAAGATTTTTCCCATGGGAATTTAATCGACACCATCAATTTCGATGACTTTTTCGATGAAATCAACGGTGGAGATTTACTGCCAGATTTCGAAATTTTTTGTGAAGAACCTGCTATTCATGGAAATATGAAATCTAAGTCAAAAGAAGCTAAAAAA-/ATCATCTAGCAAAATCAAAAATCCTCAAGGAAAGAAAAAAGTAAAGGT-3’(参见SEQ ID NO:1)，其中-为参考基因组对应碱基，A为突变碱基。

本发明进一步保护一种如上述鉴定番茄绿色果肩的dCAPS分子标记的特异性引物对A，所述正向引物核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；所述反向引物核苷酸序列如SEQ IDNO:3所示。

正向引物：5’-TCTTTGAATGAGTTGATTATCTGTT-3’(参见SEQ ID NO:2)，

反向引物：5’-ACCTTTACTTTTTTCTTTCCTTGAGGATTTTTGATTTTGCTAGATGCTTTTT-3’(参见SEQ ID NO:3)。

本发明一步保护一种如上述鉴定番茄绿色果肩的dCAPS分子标记的特异性引物对B，所述正向引物核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示；所述反向引物核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示。

正向引物：5’-TCCAGCTCACGTCACAGTAGTG-3’(参见SEQ ID NO:4)，

反向引物：5’-AATTATCTTTGCATAGGGAACTGAG-3’(参见SEQ ID NO:5)。

本发明进一步保护一种如上述特异性引物对A的扩增序列，其核苷酸序列如SEQID NO:6所示。

5’-TCTTTGAATGAGTTGATTATCTGTTGTAGCAGGTAATTTGTCTTATTTTCAACATTACAAAAATTTAAGAGTTTAAGGAGAGACTTATCTACACATTTAACTAATTTATAACAGATAATTTATCTTATTTTTAAAATTACGAATCTCATTTTACGAAAAGGCTTGCTTGTCTATATTCTTTGAATAATTGATTATCTGTTATATCGAGTAATTTAGGTTGATTCTCAATATTACAAATCTCACATTTTAAGATGCTGGCATTTGTGTGATTCTTATCTTTTAGTGACTTGTTATAGCATGTAATCTTATCTTACTTTTAATATTACTAATTAATCTTACATTTTTATTTTCTTGAAGGTTAATTATACTTATAGTATTTGAAATAATGCTTGCTCTATCTTCATCATTGAGCTACAAAAATGAAAGGGAAAATTATGATTTATTCCAAGATTTTTCCCATGGGAATTTAATCGACACCATCAATTTCGATGACTTTTTCGATGAAATCAACGGTGGAGATTTACTGCCAGATTTCGAAATTTTTTGTGAAGAACCTGCTATTCATGGAAATATGAAATCTAAGTCAAAAGAAGCTAAAAAA-/AGCATCTAGCAAAATCAAAAATCCTCAAGGAAAGAAAAAAGTAAAGGT-3’(参见SEQ ID NO:6)，其中-为参考基因组对应碱基，A为突变碱基。

本发明进一步保护一种如上述特异性引物对B的扩增序列，其核苷酸序列如SEQID NO:7所示。

5’-TCCAGCTCACGTCACAGTAGTGAAATTGGAGCTGATCCAGAACTTGATGAGTTT/AATGGTAATAAACAAACAAACAAAAAAAAACTAAACCCACACATATATCATGATTTTTTCTAAAAGAGGGTTTTTGTGTTGAAGGAATCATATTGTGCGGTACTAGTGAAATACAAAGAGGAGTTTTCAAAACCGTTTGATGAAGCTACAAGTTTCTTGAGTAACATAGAGTCACAGCTCAGTTCCCTATGCAAAGATAATT-3’(SEQ ID NO:7)，其中T为参考基因组对应碱基，A为突变碱基。

本发明进一步保护一种如上述dCAPS分子标记在鉴定番茄绿色果肩基因型中的应用。

本发明进一步保护一种如上述特异性引物对A在鉴定番茄绿色果肩基因型中的应用。

作为本发明的进一步改进，利用所述特异性引物对A对待测番茄基因组DNA进行PCR扩增，所得到的PCR产物经过限制性内切酶HpyF10VI酶切，若获得的酶切产物是长度分别为599bp和49bp的两条片段，则待测番茄材料携带绿色果肩基因U且为纯合基因型UU；若获得的酶切产物是长度分别为649bp、599bp和49bp三条片段，则待测番茄材料携带绿色果肩基因U且为杂合基因型Uu；若所得到的PCR产物经过限制性内切酶HpyF10VI酶切后，若获得的是长度为649bp的一条片段，则待测番茄材料不携带绿色果肩基因且为纯合基因型uu。

本发明进一步保护一种用于鉴别番茄未成熟果实绿色果肩的试剂盒，所述试剂盒中含有上述的特异性引物对A、上述的特异性引物对B。

本发明进一步保护一种鉴定番茄未成熟果实绿色果肩的方法，包括以下步骤：

1)以待测番茄的基因组DNA为模板：采用上述的特异性引物对A进行扩增得到扩增产物A，采用上述的特异性引物对B进行扩增得到扩增产物B；

2)用限制性内切酶HpyF10VI对扩增产物A进行酶切；

3)电泳，若酶切产物中仅具有599bp和49bp的两条片段，则待测番茄材料携带绿色果肩基因U且为纯合基因型UU；若酶切后产物中具有649bp、599bp和49bp三条片段，则待测番茄材料携带绿色果肩基因U且为杂合基因型Uu；若酶切产物中仅有649bp片段，则待测番茄材料不携带绿色果肩基因U且为纯合基因型uu。

4)用限制性内切酶MseI对扩增产物B进行酶切；

5)电泳，若酶切产物中仅有255bp片段，则待测番茄材料携带绿色果肩上游调控基因UG且为纯合基因型UGUG；若酶切后产物中具有255bp、203bp和52bp三条片段，则待测番茄材料携带绿色果肩上游调控基因UG且为杂合基因型UGug；若酶切产物中仅具有203bp和52bp两条片段，则待测番茄材料不携带绿色果肩上游调控基因UG且为纯合基因型ugug。

6)当番茄待测材料同时含有U和UG基因时，则番茄未成熟果实有绿色果肩。

本发明还提供了基于SNP分子标记开发dCAPS分子标记的详细操作，dCAPS分子标记的反向引物是根据SEQ ID NO:1中的SNP位点附近序列5’-AGAAGCTAAAAAA-/ATCATCTAGC-3’设计而来。将-/A突变位点附近的序列改造成为HpyF10VI酶的酶切位点GCTAAAAAAGC(HpyF10VI酶在酶切位点的第7个碱基A和第8个碱基A之间切开序列片段)，将序列5’-AGAAGCTAAAAAA-/

本发明具有如下有益效果：本发明利用已知位点的DNA序列信息设计出一对特异性的引物并改进一对特异性引物，用该引物扩增DNA片段，接着用限制性内切酶酶切PCR产物，通过琼脂糖凝胶电泳分离酶切片段来鉴定不同的番茄材料；开发出dCAPS分子标记，并得到改良分子标记，这两个分子标记可以用于苗期鉴定番茄果实是否携带绿色果肩这一特性。利用该标记方法不仅节约了田间育种成本，同时缩短了育种周期，加速了番茄育种进程。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为特异性引物对A对1-20号样本番茄基因组DNA的扩增产物经酶切后的扩增图图谱；

图2为特异性引物对A对21-41号样本番茄基因组DNA的扩增产物经酶切后的扩增图图谱；

图3为特异性引物对A对42-49号样本番茄基因组DNA的扩增产物经酶切后的扩增图图谱；

图4为特异性引物对B对1-20号样本番茄基因组DNA的扩增产物经酶切后的扩增图图谱；

图5为特异性引物对B对21-41号样本番茄基因组DNA的扩增产物经酶切后的扩增图图谱；

图6为特异性引物对B对42-49号样本番茄基因组DNA的扩增产物经酶切后的扩增图图谱。

具体实施方式

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

若未特别指出，本发明实施例中所用的技术手段均为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1

本实施例提供了一种鉴定绿色果肩番茄和非绿色果肩的番茄的试剂盒，包括上述特异性引物对A和特异性引物对B，特异性引物对A由如SEQ ID NO:2所示序列和如SEQ IDNO:3所示序列组成；特异性引物对B由如SEQ ID NO:4所示序列和如SEQ ID NO:5所示序列组成。

上述试剂盒鉴定绿色果肩番茄和无绿色果肩番茄的方法：步骤如下：

1)采用生工Ezup柱式植物基因组DNA抽提试剂盒方法提取待测番茄基因组DNA；

2)利用上述试剂盒中特异性引物对A扩增分析待测番茄基因组DNA，扩增出的序列如SEQ ID NO:6所示。

PCR反应体系如下：5μLApexHF HS DNA Polymerase FS Master Mix(艾科瑞生物公司)，浓度为50ng/μL的DNA0.5μL，浓度为10μmol/L的正向引物和反向引物各0.25μL，ddH

PCR扩增程序为：98℃10s，55℃15s，72℃40s，35个循环；4℃保存，反应是在Veriti96-Well Thermal Cycler PCR仪上完成的；

3)将上述得到的PCR产物使用限制性内切酶HpyF10VI进行酶切处理。

酶切体系为：2μLPCR扩增产物，0.4μL限制性内切酶HpyF10VI(Thermo Scientific公司)，1μLBuffer，ddH

4)电泳检测分析：酶切产物用2％的琼脂糖凝胶在180V电压条件下电泳40min，最终结果在凝胶成像系统上显示。

若酶切产物中仅具有599bp和49bp的两条片段，则待测番茄材料携带绿色果肩基因U且为纯合基因型UU；若酶切后产物中具有649bp、599bp和49bp三条片段，则待测番茄材料携带绿色果肩基因U且为杂合基因型Uu；若酶切产物中仅有649bp片段，则待测番茄材料不携带绿色果肩基因U且为纯合基因型uu。

5)利用上述试剂盒中特异性引物对B扩增分析待测番茄基因组DNA，扩增出的序列如SEQ ID NO:7所示。

PCR反应体系如下：5μLApexHF HS DNA Polymerase FS Master Mix(艾科瑞生物公司)，浓度为50ng/μL的DNA0.5μL，浓度为10μmol/L的正向引物和反向引物各0.25μL，ddH

PCR扩增程序为：98℃10s，55℃30s，72℃40s，35个循环；4℃保存，反应是在Veriti96-Well Thermal Cycler PCR仪上完成的。

6)将上述得到的PCR产物使用限制性内切酶MseI进行酶切处理。

酶切体系为：2μLPCR扩增产物，0.3μL限制性内切酶MseI(NEB公司)，1μLBuffer，ddH

7)电泳检测分析：酶切产物用2％的琼脂糖凝胶在180V电压条件下电泳40min，最终结果在凝胶成像系统上显示。

若酶切产物中仅有255bp片段，则待测番茄材料携带绿色果肩上游调控基因UG且为纯合基因型UGUG；若酶切后产物中具有255bp、203bp和52bp三条片段，则待测番茄材料携带绿色果肩上游调控基因UG且为杂合基因型UGug；若酶切产物中仅具有203bp和52bp两条片段，则待测番茄材料不携带绿色果肩上游调控基因UG且为纯合基因型ugug。

当番茄待测材料同时含有U和UG基因时，则番茄果实有绿色果肩。

实施例2

利用上述试剂盒对49个样本进行检测，准确率为97.96％，如表1结果所示。图1-3为特异性引物对A对49个样本番茄基因组DNA的扩增产物经酶切后的扩增图图谱，最右侧为阴性对照；图4-6为特异性引物对B对49个样本番茄基因组DNA的扩增产物经酶切后的扩增图图谱，最右侧为阴性对照。

表1利用分子标记鉴别番茄未成熟果实绿色果肩

注：果实有绿色果肩：+；果实无绿色果肩：-

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 上海交通大学

<120> 一种鉴定番茄绿色果肩的dCAPS分子标记及应用

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 648

<212> DNA

<213> 番茄(Solanum lycopersicum)

<400> 1

tctttgaatg agttgattat ctgttgtagc aggtaatttg tcttattttc aacattacaa 60

aaatttaaga gtttaaggag agacttatct acacatttaa ctaatttata acagataatt 120

tatcttattt ttaaaattac gaatctcatt ttacgaaaag gcttgcttgt ctatattctt 180

tgaataattg attatctgtt atatcgagta atttaggttg attctcaata ttacaaatct 240

cacattttaa gatgctggca tttgtgtgat tcttatcttt tagtgacttg ttatagcatg 300

taatcttatc ttacttttaa tattactaat taatcttaca tttttatttt cttgaaggtt 360

aattatactt atagtatttg aaataatgct tgctctatct tcatcattga gctacaaaaa 420

tgaaagggaa aattatgatt tattccaaga tttttcccat gggaatttaa tcgacaccat 480

caatttcgat gactttttcg atgaaatcaa cggtggagat ttactgccag atttcgaaat 540

tttttgtgaa gaacctgcta ttcatggaaa tatgaaatct aagtcaaaag aagctaaaaa 600

atcatctagc aaaatcaaaa atcctcaagg aaagaaaaaa gtaaaggt 648

<210> 2

<211> 25

<212> DNA

<213> 番茄(Solanum lycopersicum)

<400> 2

tctttgaatg agttgattat ctgtt 25

<210> 3

<211> 52

<212> DNA

<213> 番茄(Solanum lycopersicum)

<400> 3

acctttactt ttttctttcc ttgaggattt ttgattttgc tagatgcttt tt 52

<210> 4

<211> 648

<212> DNA

<213> 番茄(Solanum lycopersicum)

<400> 4

tctttgaatg agttgattat ctgttgtagc aggtaatttg tcttattttc aacattacaa 60

aaatttaaga gtttaaggag agacttatct acacatttaa ctaatttata acagataatt 120

tatcttattt ttaaaattac gaatctcatt ttacgaaaag gcttgcttgt ctatattctt 180

tgaataattg attatctgtt atatcgagta atttaggttg attctcaata ttacaaatct 240

cacattttaa gatgctggca tttgtgtgat tcttatcttt tagtgacttg ttatagcatg 300

taatcttatc ttacttttaa tattactaat taatcttaca tttttatttt cttgaaggtt 360

aattatactt atagtatttg aaataatgct tgctctatct tcatcattga gctacaaaaa 420

tgaaagggaa aattatgatt tattccaaga tttttcccat gggaatttaa tcgacaccat 480

caatttcgat gactttttcg atgaaatcaa cggtggagat ttactgccag atttcgaaat 540

tttttgtgaa gaacctgcta ttcatggaaa tatgaaatct aagtcaaaag aagctaaaaa 600

agcatctagc aaaatcaaaa atcctcaagg aaagaaaaaa gtaaaggt 648

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 番茄(Solanum lycopersicum)

<400> 5

tccagctcac gtcacagtag tg 22

<210> 6

<211> 25

<212> DNA

<213> 番茄(Solanum lycopersicum)

<400> 6

aattatcttt gcatagggaa ctgag 25

<210> 7

<211> 255

<212> DNA

<213> 番茄(Solanum lycopersicum)

<400> 7

tccagctcac gtcacagtag tgaaattgga gctgatccag aacttgatga gtttatggta 60

ataaacaaac aaacaaaaaa aaactaaacc cacacatata tcatgatttt ttctaaaaga 120

gggtttttgt gttgaaggaa tcatattgtg cggtactagt gaaatacaaa gaggagtttt 180

caaaaccgtt tgatgaagct acaagtttct tgagtaacat agagtcacag ctcagttccc 240

tatgcaaaga taatt 255