禽星状病毒的特异性RT-PCR引物、检测试剂盒及反应体系

摘要

本发明涉及禽类病毒检测技术领域，尤其涉及一种禽星状病毒的特异性RT‑PCR检测引物、检测试剂盒及反应体系，针对禽星状病毒的RdRp区域设计合成特异性引物，所述特异性引物由上游引物和下游引物组成；所述上游引物、下游引物序列如下:上游引物：5’‑GAYTGGACNMGNTWYGAYGGNACNATNCC‑3’；下游引物：5’‑YTTNACCCACATNCCRAA‑3’，并提供了一种检测试剂盒，包含所述特异性RT‑PCR引物。本发明的有益效果是：含所述特异性引物检测试剂盒不容易受到毒株差异的影响，能够识别不同分支的星状病毒，具有使用方便，检测快速、准确，并且检测通量大、可定量、成本低廉等优点。

说明书

技术领域

本发明涉及禽类病毒检测技术领域，尤其涉及一种禽星状病毒的特异性RT-PCR检测引物、检测试剂盒及反应体系。

背景技术

禽星状病毒(Avian astrovirus，AAstV)属于星状病毒科，是危害家禽养殖业的重要病原。AAstV主要包括禽肾炎病毒(Avian nephritis virus，ANV)、鸭星状病毒(Duckastrovirus，DAstV)、鸡星状病毒(Chicken astrovirus，CAstV)、鹅星状病毒(Gooseastrovirus，GoAstV)等，可以感染多种禽类，引发雏鸡肾炎、鸭病毒性肝炎、腹泻、发育迟缓和痛风等症状。禽星状病毒是一种无囊膜的单股正链RNA病毒，基因组全长为6.1～7.9kb

在禽星状病毒发现初期，电子显微镜(EM)和荧光抗体的检测，早在1984年，Gough、Mcnulty等人就通过电镜从下痢的火鸡肠道中发现了星状病毒粒子。但是这两种方法都是比较费时的，容易受到毒株差异的影响，而且荧光抗体测试难以识别不同血清型的星状病毒。Herrmand等成功制备了星状病毒单抗，并建立了EIA和ELISA检测方法。王笑言等针对衣壳蛋白建立了检测鸭星状病毒血清抗体的间接ELISA方法(王笑言等,2010)。

分子生物学检测方法是目前应用最为广泛的方法，聚合酶链式反应(PCR)是一种体外扩增特异性基因片段的技术，在疾病的检测方面有着广阔的应用前景，现已被广泛应用。PCR能够选择性地将病毒基因组的一个特异性短片段放大10万倍以上，极大地增强了检测的敏感性。PCR方法的建立极大地提高了疾病的诊断速度，对病毒的流行病学调查具有重要的应用价值。目前，国内尚无对禽星状病毒进行PCR扩增的特异性引物、检测试剂盒及反应体系。

发明内容

本发明要解决的技术问题是：弥补现有技术中存在的不足，提供一种禽星状病毒的特异性RT-PCR检测引物、检测试剂盒及反应体系。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种禽星状病毒的特异性RT-PCR引物，针对禽星状病毒的RdRp区域设计合成特异性引物，所述特异性引物由上游引物和下游引物组成；所述上游引物、下游引物序列如下:

上游引物：5’-GAYTGGACNMGNTWYGAYGGNACNATNCC-3’；

下游引物：5’-YTTNACCCACATNCCRAA-3’。

进一步地，一种检测试剂盒，包含所述禽星状病毒的特异性RT-PCR引物。

进一步地，一种RT-PCR扩增的反应体系，包括以下组分：

进一步地，所述反应体系进行RT-PCR扩增的反应程序为：50℃反转录30min，94℃预变性5min，45次循环(94℃变性1min，45℃退火1min，72℃延伸40s)，然后72℃变性10min，4℃保存。

进一步地，所述禽星状病毒包括鸡星状病毒、禽肾炎病毒、鸭星状病毒、新型鹅星状病毒，所述新型鹅星状病毒属于3类禽星状病毒。

进一步地，所述检测试剂盒在制备检测待测样品中是否含有禽星状病毒的产品中的应用。

本发明的有益效果是：

(1)含特异性引物的检测试剂盒不容易受到毒株差异的影响，能够识别不同分支的星状病毒。

(2)含所述特异性引物的检测试剂盒具有使用方便，检测快速、准确，并且检测通量大、可定量、成本低廉等优点。

(3)能够检测星状病毒5个分支中鸡星状病毒、禽肾炎病毒、鸭星状病毒、新型鹅星状病毒，具有通用性好、操作方便、快速准确等特点。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对本发明实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地，下面所描述的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1本发明实施例部分样品RT-PCR产物毛细管电泳图，

1:A1、A2、A3和A9为阴性；2:A4、A5、A6、A7和A8为阳性；3:A10为阴性对照；4:A11为阳性对照；5:A12为DL 2000Maker；

图2本发明实施例基于禽星状病毒RdRp基因序列的系统发育树。

具体实施方式

以下对本发明的原理和特征进行描述，所举实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

一种禽星状病毒的RT-PCR特异性引物、检测试剂盒及反应体系，

实施例一：一种禽星状病毒的特异性RT-PCR引物、检测试剂盒最佳实施例

本实施例针对禽星状病毒的RdRp区域设计合成特异性引物，所述特异性引物由上游引物和下游引物组成；所述上游引物、下游引物序列如下:

上游引物：5’-GAYTGGACNMGNTWYGAYGGNACNATNCC-3’；

下游引物：5’-YTTNACCCACATNCCRAA-3’

所述检测试剂盒，包括上述上游引物和下游引物。

实施例二：RT-PCR特异性引物设计方法及RT-PCR反应体系

1、二代测序

(1)将样品(经过培养的样品最佳)用EDTA酶处理后，按照QIAamp Viral RNA MiniKit说明书操作，提取病毒RNA。

(2)应用Super Script Reverse Transcriptase Kit对病毒RNA进行反转录，用磁珠按照1.8倍体积的量进行纯化。

(3)使用PathAmp FluA Reagent Kit扩增生成全基因组cDNA。

(4)使用Qubit dsDNA HS Kit和Qubit核酸浓度测定仪测定cDNA浓度。

(5)将测定浓度后的病毒全基因cDNA稀释成200ng/35μL，使用Ion Xpress PlusgDNA Fragment Library Kit将病毒全基因组DNA酶切为200bp的片段。

(6)在纯化后的DNA上加入含有Barcode的接头，构建为PGM测序仪可识别的DNA文库，用磁珠按照1.2倍体积的量进行纯化。

(7)将纯化后的DNA片段通过电泳回收目的片段。

(8)将DNA文库稀释为25pM，应用Ion PGM Template OT2 200Kit对DNA文库进行测序前的样品处理。将处理后的样品加到Ion 318芯片，置于PGM测序仪进行测序。测得序列经FluAnalysis(v4.0)软件进行序列拼接。

2、5′和3′RACE测序

按照SMARTer RACE 5′/3′试剂盒说明进行引物设计和序列扩增，具体步骤如下：

(1)于冰上配置Master mix 1，组分见表1所示，混合均匀，72℃孵育3min，42℃冷却2min。

表1 Master mix 1反应体系

(2)向Master mix 1中添加1μL SMARTerⅡA Oligonucleotide(24μM)，放置冰上。

(3)配置Master mix 2，组分见表2所示，混合后放置冰上备用。

表2 Master mix 2反应体系

(4)将Master mix 1和Master mix 2混合均匀，42℃孵育90min，70℃加热10min，终止反应。

(5)根据起始RNA浓度，用10μL Tricine-EDTA Buffer稀释第一条链cDNA合成的反应产物。得到的3′RACE-ready cDNA和5′RACE-ready cDNA可在-20℃最多保存3个月。

(6)准备Master Mix反应体系，组分见表3。

表3 Master Mix反应体系

(7)取(5)中稀释好的5′or 3′RACE Ready cDNA作为反应模板，并与(6)中准备好的Master Mix和10×UPM等混合，组成5′/3′RACE反应体系，具体组分见表4。

表4 5′/3′RACE反应体系

(8)混合均匀后，根据退火温度使用合适的PCR扩增程序进行扩增，反应程序如下：94℃30s，68℃30s，72℃3min，循环20次，4℃保存。

(9)使用1％的琼脂糖凝胶进行电泳检验，将有正确大小条带的PCR产物送睿博兴科公司测序。

3、全基因组分析

将测序获得的序列使用DNAstar中的Seqman进行拼接，获得禽星状病毒分离株的全基因组。所得序列用BLAST在Genbank中检索序列的同源性，分析分离株与其他毒株之间的进化关系，并选择不同宿主来源和不同基因型的毒株进行系统的进化树分析。将分离株与Genbank中的42株禽星状病毒全基因组序列以及3个开放阅读框构建进化树。利用Megalign软件将核苷酸序列翻译为氨基酸序列，并利用Clustal W方法进行对齐运算，使用Sequence Distances进行同源性分析。

按照说明构建测序文库，经One Touch进行油包水扩增，经ES收集纯化磁珠，最后将处理后的样品加到Ion 318芯片，置于PGM测序仪进行测序。测得序列经FluAnalysis(v4.0)软件进行序列拼接。

4、引物设计

针对禽星状病毒的RdRp区域设计合成特异性引物，按照引物设计要求设计合成特异性引物，见表5所示。

表5引物序列及扩增片段长度

5、RT-PCR反应体系

对临床样品利用建立的RT-PCR方法进行检测。以提取的样品核酸作为模板，以RdRp-F和RdRp-R为上下游引物，按照一步法RT-PCR试剂盒要求进行RT-PCR扩增，反应体系(25μL)见表6所示。

表6 RT-PCR反应体系

反应程序为：50℃反转录30min，94℃预变性5min，45次循环(94℃变性1min，45℃退火1min，72℃延伸40s)，然后72℃变性10min，4℃保存。

实施例三：非诊断目的RT-PCR特异性引物检测禽星状病毒的应用，包括以下步骤：

1、材料与方法

1.1样品来源

本研究从山东、江苏、福建、四川、黑龙江、广东、广西、河南共8个省份，随机选择零售市场、批发市场、养殖场和屠宰场等32个场点，共采集来自鸡、鸭、鹅、和鸽子源的样品1210份，其中拭子样品1160份，组织样品50份。拭子样品放入含1mL PBS(含有100U/mL青霉素和10mg/mL链霉素)的离心管中，组织样品放入塑封袋，低温运输。

1.2主要试剂及配制

PathAmp FluA Reagent Kit、Ion Xpress Plus Fragment Library Kit、Ion PGMTemplate OT2 200Kit、Ion PGM Sequencing 200Kit V2、E-Gel SizeSelect 2％Agarose、Ion 318Chip Kit V2、Dynabeads MyOne Streptavidin C1 Beads、Ion Xpress BatcodeAaptors、Qubit核酸浓度测定仪配套试剂，均购自Life technologies公司

一步法RT-PCR试剂盒购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司

SMART RACE试剂盒购自Takara Bio公司

核酸提取试剂盒购自德国Qiagen公司

胶回收试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司

pEASYTM-T5 Zero Cloning Kit购自北京全式金生物技术有限公司

50×TAE Buffer：使用电子秤称取242g tris和37.2g Na2EDTA·2H2O，加入烧杯中，量取800mL去离子水，充分搅拌溶解，再加入57.1mL醋酸，充分混匀后，加去离子水定容至1L，室温放置保存。使用时，需稀释为1×TAE Buffer。

1％的琼脂糖凝胶配置：使用电子秤称取1.0g的琼脂糖，加入到装有100mL去离子水的锥形瓶中，震荡混匀，使用微波炉加热3-5min，使琼脂糖充分溶解，稍微冷却后倒入插好梳子的制胶槽中，冷却25-30min，待琼脂糖凝固后使用。

LB液体培养基：使用电子秤分别称取5g胰蛋白胨、10g酵母提取粉和10g氯化钠，加入到装有1000mL去离子水的玻璃瓶中，充分混匀，121℃高压灭菌20min。

SOC培养基：使用电子秤分别称取20g胰蛋白胨、5g酵母粉、0.5g氯化钠、0.186g氯化钾和0.95g氯化镁，加入到装有950mL去离子水的玻璃瓶中，充分混匀，调整PH至7.5，定容至1L。121℃高压灭菌20min，待冷却至室温后，加入5mL葡萄糖溶液(预先配置，并用0.2μm滤器过滤除菌)，混合均匀后分装备用。

LB固体培养基：使用电子秤分别称取5g胰蛋白胨、10g酵母提取粉、10g氯化钠和15g琼脂，加入到装有1000mL去离子水的玻璃瓶中，充分混匀，121℃高压灭菌20min，于超净工作台中铺板，每个平皿15mL左右，充分冷却凝固后4℃保存。

LB+Amp液体培养基：在灭菌并冷却至室温的LB液体培养基中加入100mg/mL的氨苄，使氨苄终浓度为50μg/mL，混匀后4℃保存。

LB+Amp固体培养基：在灭菌并冷却至50℃左右的LB固体培养基中加入100mg/mL的氨苄，使氨苄终浓度为50μg/mL，混合均匀后铺板，每个平皿15mL左右，充分冷却凝固后4℃保存。

PBS缓冲液+双抗：使用电子秤分别称取0.24g磷酸二氢钾、1.44g磷酸氢二钠、8g氯化钠和0.2g氯化钾，加入到装有1000mL去离子水的玻璃瓶中，充分搅拌溶解，调节PH至7.2-7.4，121℃高压灭菌20min，待恢复室温后，加入青霉素和链霉素，使其终浓度分别为100U/mL和10mg/mL，混匀后4℃保存。

1.3特异性引物及检测试剂盒

针对禽星状病毒的RdRp区域设计合成的特异性引物及检测试剂盒，可以对鸡星状病毒、鸭星状病毒、鹅星状病毒、火鸡星状病毒和禽肾炎病毒进行综合检测，详见表6所示。

表6引物序列及扩增片段长度

1.4主要仪器及设备

PCR仪：Perkin Elmeter Gen Amp PCR System 9600

凝胶成像仪：英国UVltec公司

电泳仪：北京市六一仪器厂

毛细管电泳系统：德国Qiagen公司

高通量核酸提取工作站：德国Qiagen公司

基因分析仪：美国Ion Torrent公司

高速冷冻离心机：德国Heraeus Biofuge primoR公司

高通量组织匀浆机：德国莱驰公司

核酸蛋白分析仪：赛默飞世尔科技公司

Qubit核酸浓度测定仪：Life technologies公司

1.5样品处理

将装有拭子样品的离心管震荡混匀，10000r/min离心5min，取200μL上清液用于核酸提取；取适量组织样品研磨，加入1mL PBS缓冲液(含有100U/mL青霉素和10mg/mL链霉素)，10000r/min离心5min，取200μL上清液用于核酸提取。

1.6核酸提取

按照高通量核酸提取工作站操作说明，进行核酸提取，具体步骤如下：

(1)将样品震荡混匀，10000r/min离心5min，取200μL样品按照顺序加入到加样槽中，封口并做好标记。

(2)分别在试剂槽中加入相应的试剂，详见表7所示。

表7核酸提取工作站所需试剂及用量

(3)打开电脑软件和核酸提取仪，对照软件中提示将胶垫、扑捉板、试剂、枪头、加样槽、吸附柱和核酸收集板摆放到相应的位置。

(4)选择所有枪头为可用状态，确认仪器状态及试剂耗材正确后，按照提示在相应栏打对勾确认开始。

(5)再机器运行后的45-50min，检查吸附柱是否堵塞，若发生堵塞，则需要将吸附柱膜刺破。

(6)待机器运行完毕，将核酸收集板加盖标记，放于4℃暂存或-80℃保存。

(7)按照要求清洗仪器，并紫外灯照射15min，同时弃掉废液槽中的废液。

1.7RT-PCR扩增

以提取的样品核酸作为模板，以RdRp-F和RdRp-R为上下游引物，按照一步法RT-PCR试剂盒要求进行RT-PCR扩增，反应体系(25μL)见表8所示。

表8 RT-PCR反应体系

反应程序为：50℃反转录30min，94℃预变性5min，45次循环(94℃变性1min，45℃退火1min，72℃延伸40s)，然后72℃变性10min，4℃保存。

1.8实时毛细管电泳

(1)依次打开电脑、仪器电源，打开QIAxcel ScreenGel软件，进入程序界面。

(2)打开氮气瓶开关，调节减压器至压力为0.4Mpa。

(3)将卡胶取出，取下密封贴，竖直放置于水浴中加热10min，将卡胶装入电泳仪中，并将其芯片插入芯片槽。

(4)在试剂槽加入相应试剂，WI和WP槽中分别加入8mL Wash Buffer，上层滴加2mLOx Mineral Oil覆盖；Buffer槽中加入18mL Seperation Buffer，上层滴加4mL OxMineral Oil覆盖；Maker 1位置加入配置好的Alignment Maker；Maker 2位置加入Intensity Calibration Maker(仅在校准卡胶时放置)。

(5)在Maker 2位置放置配置好的Intensity Calibration Maker，选择Service-Start Calibration，在弹出窗口中输入Calibration Maker Lot ID，点击OK开始校准。待校准完成后才可以使用。

(6)配置合适条带大小的Size Maker：在PCR管中加入18μL Qx DNA DilutionBuffer和2μL 50-800bp QX Size Maker，吹打混匀，不要产生气泡。

(7)配置合适条带大小的Alignment Maker：在12连PCR管中分别加入15μL 15-1kbp QxAlignment Maker，然后每管上层加入1滴QxMineral Oil(矿物油)覆盖。

(8)将RT-PCR产物和配置好的Size Maker放于96孔管架上，无样品处用Qx DNADilution Buffer替代。

(9)设置程序：在Run Parameters选项的Sample Row Selection选项中选择样品和Size Maker位置，在Method栏中选择AM320；在Sample Selection选项的Plate栏中输入输出文件名称，在Maker栏中选择合适的Alignment Maker；在Sample Information栏中输入样品信息；在Run Check栏中检查程序设置是否正确，同时检查样品是否放置妥当。检查无误后运行程序。

(10)电泳结束后，在Analysis选项进行结果分析：根据输出文件名找到电泳结果文件，鼠标右键选择Activate，然后将文件拖入右侧空白栏中，全部选中点击StartAnalysis开始分析，使序列对齐。

(11)选择Size Maker对应的条带，点击Reference Maker，在弹出页面选择SizeMaker的规格，从而确定本次电泳中Size Maker各个条带的大小，返回Gle Image中，再次点击Start Analysis，将Size Maker不同条带大小应用到样品结果中，根据目的条带大小判断结果的阴阳性。

(12)实验结束后，将卡胶取出插入软体胶中，上方用密封贴贴好，取出AlignmentMaker和Size Maker，放于4℃保存。

(13)关闭氮气开关，关闭软件程序，关闭电脑和仪器电源。

1.9琼脂糖凝胶回收

将经毛细管电泳检测为阳性的RT-PCR产物使用琼脂糖凝胶进行电泳，在紫外灯下切下含有目的片段的琼脂糖凝胶，放入干净离心管并称重。然后使用索莱宝胶回收试剂盒对RT-PCR产物进行回收，具体步骤如下：

(1)按照琼脂糖凝胶称重结果，在离心管中加入约3倍体积的溶胶液，放置于50-55℃水浴中加热10min，期间将离心管上下颠倒，使胶块充分溶解。

(2)等溶液充分溶解并恢复室温后，将离心管中溶液全部转移到吸附柱中，于12000r/min离心1min，弃掉废液，将吸附柱放回收集管。

(3)向吸附柱中加入600μL漂洗液，于12000r/min离心1min，弃掉废液，将吸附柱放回收集管。

(4)于12000r/min离心2min，使除去吸附柱中的漂洗液，然后将吸附柱开口并放置于室温数分钟，将残余的漂洗液去除干净。

(5)将吸附柱转移到一个新的离心管中，加入50-100μL 65℃预热的洗脱液，室温放置2min，于12000r/min离心1min，将产物4℃暂存或-20℃保存。

1.10连接转化

按照全式金pEASYTM-T5 Zero Cloning Kit说明将胶回收产物进行连接转化，步骤如下：

(1)根据胶回收产物浓度，按照1kb添加20ng的比例将4μL胶回收产物和1μLpEASYTM-T5 Zero Cloning Vector混合，轻轻混匀，25℃反应5min，反应结束后将离心管放置于冰上。

(2)将连接产物加到50μL Trans 1-T1感受态细胞中，轻弹混匀，冰浴20-30min。

(3)42℃热激30s，立即放到冰上，静置2min。

(4)加入250μL恢复至室温的SOC/LB，220r/min，37℃孵育1h。

(5)4000r/min离心1min，弃掉部分上清，保留100μL，重悬菌体，将全部菌液铺板，过夜培养。

(6)挑取单一菌落到100μL恢复室温的含Amp+的SOC/LB中，220r/min，37℃孵育至浑浊。

(7)取1μL菌液作为模板，使用M13F和M13R引物进行PCR鉴定，反应条件为：94℃预变形10min，然后94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，循环30次，最后72℃延伸10min。

(8)将PCR检测为阳性的克隆送睿博兴科公司测序。

2、结果与分析

2.1禽星状病毒流行病学调查结果

从我国8个省份共采集了1210份拭子和组织样品，包含1160份拭子和50份组织。所有样本包括435份鸡源样本、666份鸭源样本、5份鸽子源样本、104份鹅源样本，来自22个零售市场、6个批发市场、2个屠宰场、20个家禽养殖场。

利用RT-PCR方法进行禽星状病毒RdRp部分基因序列的扩增，结果表明：从1210份样品中共检测到17个样品为禽星状病毒核酸阳性，总体阳性率为1.40％，部分样品RT-PCR产物的电泳结果如图1所示。

2.2基于RdRp序列的遗传进化分析

将RT-PCR扩增的片段测序，将测序结果与Genbank上发表的39株禽星状病毒序列进行比对，并构建系统发育树进行分析。结果表明，所检测到的17个禽星状病毒分别处于5个不同的分支上，有7个为鸡星状病毒，5个为禽肾炎病毒，2个为鸭星状病毒，2个为鸭源新型鹅星状病毒，1个为新型禽星状病毒，该新型毒株属于3类禽星状病毒，如图2所示。其中7株鸡星状病毒分为两个小分支，同源性为84.2％-94.4％。鸭星状病毒Y-5株与鸭星状病毒KY646154处于同一分支，同源性为88.1％；鸭星状病毒G1254株与北京分离株KF753804、KF753805和KF753806同处一分支，同源性为90.2％-90.5％。5株禽肾炎病毒分为两个分支，其中分离株J1054和J1017与MG846415株处于同一分支，同源性为98.6％-99.5％，J1018、J1038和J1013与MN732559同属于一个分支，同源性为97％-99.5％。分离株616g1和616g2同属于一个分支，同源性100％，与参考株之间同源性为78.6％-79.8％。分离株G1272仅与香港分离株JX985714、JX985697和JX985711同源性较高，为87.9％-88.8％，与其余参考株同源性低于60％，所测得序列已提交Genbank，登录号为MW401207-MW401223，分离株详细信息及其RdRp序列同源性分析结果如表9所示。

表9基于禽星状病毒RdRp基因序列的同源性分析结果

2.3禽星状病毒的基因组特性

使用二代测序对分离的17株禽星状病毒进行全基因组测序，并通过5′和3′RACE技术对末端序列进行补充。共得到17个全基因组序列，全长为6.7-7.6kb。详细信息如表11所示。

表11禽星状病毒分离株基因组全长

2.4核苷酸同源性分析

使用Megalign软件对分离株的全基因组和3个开放阅读框进行核苷酸分析，同时挑选Genbank中部分序列进行比较，结果显示，7株鸡星状病毒分离株全基因组核苷酸与参考序列同源性为74.0％-98.2％，其中，ORF1a同源性为84.3％-99.6％，ORF1b同源性为89.7％-97.4，ORF2同源性为34.5％-99.2％；2株新型鹅星状病毒全基因组核苷酸与参考序列同源性为99.1％-99.7％，ORF1a同源性为90.0％-99.7％，ORF1b同源性为99.5-99.7％，ORF2同源性为99.4％；5株禽肾炎病毒全基因组核苷酸与参考序列同源性为77.8％-99.7％，ORF1a同源性为77.0％％-99.9％，ORF1b同源性为90.8％-99.7％，ORF2同源性为34.3％-99.8％，其中J1017株的全基因组、ORF1a和ORF1b序列与禽肾炎病毒序列同源性较高，但是其ORF2序列与鸡星状病毒株KT886453同源性为99.2％；G1254分离株全基因组和鸭星状病毒2型序列同源性为94.8％-94.9％；Y-5分离株全基因组和鸭星状病毒1型序列同源性最高，为95.9％-99.6％；G1272分离株在全基因组、ORF1a和ORF1b区域序列与鸡星状病毒、鸭星状病毒1型、新型鹅星状病毒、鸭星状病毒2型和禽肾炎病毒相比同源性小于50％，而ORF2序列同源性与AAstV-3香港分离株JX985651和JX985652同源性较高，为92.6％-92.8％。如表12所示。

表12分离株与参考株的同源性分析

2.5氨基酸同源性分析

使用Megalign软件对分离株的全基因组和3个开放阅读框进行氨基酸分析，同时挑选Genbank中部分序列进行比较，结果显示，氨基酸序列比对结果与核苷酸比对结果基本一致。7株鸡星状病毒分离株的全基因组以及3个开放阅读框所编码的氨基酸与参考株同源性分别为61.0％-96.6％，94.0％-99.3％，77.9％-95.5％和37.9％-98.8％；2株新型鹅星状病毒分离株全基因组以及3个开放阅读框所编码的氨基酸序列与参考株同源性分别为98.2％-99.2％，99.1％-99.5％，99.2％-99.4％和99.2％-99.5％；分离株G1254全基因组和3个开放阅读框所编码的氨基酸与鸭星状病毒2型同源性较高，分别为90.9％-91.1％，98.1％-98.2％，89.4％-99.1％和98.7％-98.8％；分离株Y-5全基因组和3个开放阅读框所编码的氨基酸与鸭星状病毒1型同源性较高，分别为93.1％-99.3％，99.0％-99.5％，85.0％-97.9％和97.6％-99.6％；分离株G1272的ORF2区域所编码的氨基酸序列与AAstV分离株JX985651和JX985652同源性较高，为98.3％-98.5％；5株禽肾炎病毒分离株的全基因组以及ORF1a和ORF1b所编码的氨基酸与参考株同源性分别为64.9％-99.5％，52.5％-99.9％和94.4％-99.5％，在ORF2所编码的氨基酸区域，分离株J1013、J1018、J1038和J1054与参考株同源性较高为95.1％-99.5％，而J1017与参考株同源性很低，为26.8％-35.0％，但是J1017在ORF2区域所编码的氨基酸与参考株KT886453同源性较高为98.8％。

2.6禽星状病毒基因组的遗传进化分析

利用禽星状病毒分离株与Genbank中42株病毒的全基因组序列和3个开放阅读框区域基因序列构建系统发育树，结果显示，所选取序列共分为7个分支，分别为HAstV、ANV、AAstV-3、DAstV、GoAstV、DAstV-2和CAstV。其中人星状病毒和禽星状病毒分属于两个大的分支，17个分离株分属于多个分支，在ORF1a、ORF1b和ORF2区域，H1283与加拿大2014年和2015年的鸡星状病毒Bⅳ分离株同属于一个分支，具有相近的遗传进化关系；在ORF1b和ORF2区域，J1002与印度2006年的分离株属于一个分支；在全基因组中J1011、J1049和N-2P分属于鸡星状病毒的一个小分支，在ORF1a区域，J1049、J1011与印度分离株KY038163具有较近的遗传进化关系，在ORF1b区域，两者相差较远；在三个开放阅读框区域，0607和L1389均与波兰分离株KT886453具有相近的遗传进化关系。在全基因组序列和ORF1a区域中，J1017和J1013均与参考株MN732559处在同一个分支上，J1018、J1038和J1054与巴西分离株MG846415遗传进化关系相近。此外，616g1和616g2与Genbank上的鹅星状病毒参考毒株序列同属于同一分支，G1254与鸭星状病毒2型(DAstV-2)同属于一个分支，Y-5与鸭星状病毒1型(DAstV-1)参考株遗传进化关系较近。G1272只在ORF2区域存在AAstV-3分离株JX985651和JX985652两个在遗传进化关系上相近的毒株，在ORF1a和ORF1b区域并未发现与之遗传进化关系相近的参考毒株序列。

2.7临床样品检测结果

利用所测得序列设计特异性引物，用于70份临床样品的检测，同时使用宏基因组测序技术进行复核，结果表明：所建立的RT-PCR方法检测结果与宏基因组测序结果一致，只是RT-PCR产物电泳结果显示咽肛拭中的1份条带较弱，为弱阳性。这表明所建立的RT-PCR方法可以较准确地检测到临床样品中的禽星状病毒。详细结果如表13所示。

表13临床样品检测结果

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