一种用于禽肺病毒C亚群特异性检测的荧光定量RT-PCR检测试剂盒及其应用

摘要

本发明公开了一种用于禽肺病毒C亚群特异性检测的荧光定量RT-PCR检测试剂盒，其特征在于包括特异性扩增禽肺病毒C亚群G基因的特异性引物对和探针，其中所述的引物对中两条引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1、2所示，所述的探针序列如SEQ ID NO.3所示。使用本发明的试剂盒能够实现对禽肺病毒C亚群病毒的检测，本发明的试剂盒在1×103～1×109个拷贝·μL-1范围内具有良好的线性关系，灵敏度达到102个拷贝·μL-1，是普通RT-PCR方法的100倍，且与其他禽病病毒无交叉反应。结果表明，本发明的试剂盒具有良好的敏感性和特异性，可用于禽肺病毒C亚群的定量检测。

说明书

技术领域

本发明涉及一种荧光定量RT-PCR检测试剂盒，特别涉及一种用于禽肺病毒C 亚群特异性检测的荧光定量RT-PCR试剂盒及其应用，属于病毒检测领域。

背景技术

C亚型禽肺病毒（APV/C）是在1997年于美国科罗拉多州的发病火鸡群中分离 得到。APV属于副粘病毒科，肺病毒亚科，偏肺病毒亚属。根据其G基因的不同将 欧洲病毒株分为A、B、C、D四个亚型。C亚型G基因与A和B亚型的同源性较 低，且比A和B的G基因序列要长很多。APV的M蛋白高度保守，A和B亚型M 蛋白的同源性为89%，但C亚型与A和B亚型M蛋白的同源性分别为78%和77%， APV/C亚型与APV/A和APV/B亚型F蛋白的同源性为83%，因此，美国流行的 APV/C亚型与欧洲流行的APV/A和APV/B亚型有着显著的不同，但APV/C亚型 与人偏肺病毒（HMPV）核酸序列相似。虽然在中国没有关于APV/C亚型的报道， 且美国与中国地理位置上距离远，但中国和美国养禽业进出口贸易频繁，很有可能 对中国的养禽业造成危害。另外，中国的临近国韩国已有对APV/C亚型的报道，因 此建立一种针对APV/C亚型的快速、灵敏的诊断方法对APV快速检测、预防具有 重要意义。

本研究为针对C亚群APV检测的荧光定量RT-PCR的检测试剂盒及其应用， 本发明的检测试剂盒具有良好的敏感性和特异性，方便快捷且同时能够区分亚群， 为APV的临床检测、流行病学调查奠定了基础。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种用于禽肺病毒（Avian pneumovirus, APV）C亚群特异性检测的荧光定量RT-PCR检测试剂盒。

为达到以上目的，本发明采用的技术手段为：

根据GenBank中，禽肺病毒（APV）C亚群序列设计1对针对G基因的引物和 1条特异性TaqMan探针，建立了一种快速检测APV C亚群病毒载量的特异性 TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法并组装了试剂盒。通过对反应条件和反应体系 的优化，使得使用本发明试剂盒进行的荧光定量RT-PCR检测在1×10³～1×10⁹个拷 贝·μL^-1范围内具有良好的线性关系，灵敏度达到10²个拷贝·μL^-1，是常规RT-PCR 方法的100倍，而且与常规RT-PCR方法相比（-AUBOYER M,JESTIN V， TOQUIN D,et al Comparison of F-,G-and N-based RT-PCR protocols with conventional  virological procedures for the detection and typing of turkey rhinotracheitis virus.A rch  Virol，1999,144:1091-1109；或DAR A M,TUNE K,MUNIR S,et al,PCR-based  detection of an emerging avian pneumovirus in US turkey flocks,J Vet Diagn Invest， 2001,13(3):201-205；或GHARAIBEH1S M,ALGHARAIBEHG R,Serological and  Molecular Detection of Avian Pneumovirus in Chickens with Respiratory Disease in  Jordan,Poultry science，2007,86（6）:1677-1681），使用本发明试剂盒进行的荧光定 量RT-PCR检测可对结果进行实时监控，无需进一步进行凝胶电泳分析。试验表明， 使用本发明试剂盒进行的荧光定量RT-PCR检测与其他禽病病毒无交叉反应，且C 亚群的荧光定量RT-PCR与其他亚群的RNA标准品不反应，说明本发明试剂盒具有 良好的敏感性和特异性。将备检样品提取RNA后，不用反转录，直接进行荧光定 量RT-PCR反应，利用所建立的荧光定量RT-PCR检测试剂盒可以在2h内快速准确 地对APV C亚群进行检测，既能进行定性检测，又能准确定量，而且能够将阳性样 品的亚群进行准确的判断。

本发明一种用于禽肺病毒C亚群特异性检测的荧光定量RT-PCR试剂盒，其特 征在于包括特异性扩增禽肺病毒C亚群G基因的特异性引物对和探针，其中所述的 引物对中两条引物的核苷酸序列分别如下所示：

上游引物：5'GGGCTAGTCAGCTTTGAACTC3'（SEQ ID NO.1所示）

下游引物：5'CTGTGTTTGTCTTATTATCCCTTGG3'（SEQ ID NO.2所示）

所述的探针序列如下所示：

5'FAM-GCCCTAAGTTTATGTAGGATCCAAGGGACTC-TAMRA3'（SEQ ID  NO.3所示）。

在本发明中，所述的试剂盒中还可包括反应混合液，T7RNA聚合酶以及不含 RNase的双蒸水。

其中，反应混合液中包含有PCR扩增所需要的成分：25mmol/L MgCl₂以及 10mmol/L dNTPs。所述的反应混合液可为2×QuantiTect Probe RT-PCR Master Mix， 购自Qiagen公司。

进一步的，本发明还提出了所述的试剂盒在制备禽肺病毒C亚群检测试剂中的 应用。及所述的试剂盒在制备以禽肺病毒G基因为靶点区分禽肺病毒亚群试剂中的 应用。

附图说明

图1为荧光定量RT-PCR的动力学曲线;

图2为荧光定量RT-PCR的标准曲线;

图3为常规RT-PCR的敏感性试验；

图4为使用荧光定量RT-PCR对APV的A、B和C亚群的G基因以及B亚群 病毒进行扩增的动力学曲线。

具体实施方式

下面通过实验并结合实施例对本发明做进一步说明，应该理解的是，这些实施 例仅用于例证的目的，决不限制本发明的保护范围。

实施例1本发明试剂盒中探针及引物序列的设计和合成

根据GenBank中APV的C亚群的G基因序列（GenBank登录号为 G_C:AY590688.1）设计1对分别针对目的基因的上下游引物：

上游引物GCF：5'GGGCTAGTCAGCTTTGAACTC3'（SEQ ID NO.1所示）

下游引物GCR：5'CTGTGTTTGTCTTATTATCCCTTGG3'（SEQ ID NO.2所示）

及1条特异性Taqman探针：

探针GC：5'FAM-GCCCTAAGTTTATGTAGGATCCAAGGGACTC-TAMRA3' （SEQ ID NO.3所示）。

引物由北京六合华大基因公司合成，探针由TaKaRa公司合成。

实施例2本发明试剂盒在检测禽肺病毒（APV）C亚群病毒中的应用

1材料与方法

1.1菌株与质粒

E.coli DH5α由本实验室保存，APV的四个亚群的G基因（GenBank登录号分 别为G_A:AY640317.1，G_B:AB548428.1，G_C:AY590688.1，G_D:AJ251085.1）由哈尔滨 博仕生物合成并克隆到pBluescript IIKS（+）载体上，分别命名为PBL-G_A，PBL-G_B， PBL-G_C，PBL-G_D由本实验室保存。

1.2仪器与试剂

LightCycler480荧光定量PCR仪购自Roche公司，紫外分光光度计购自GE公 司；质粒提取试剂盒AxyGen公司；OneStep RT-PCR试剂盒和Probe  RT-PCR试剂盒购自Qiagen公司，T7RNA polymerase购自Pragma公司。

1.3探针的设计与合成

按照实施例1方法制备。

1.4阳性RNA标准品的制备

以合成的PBL-G_A，PBL-G_B，PBL-G_C，PBL-G_D质粒为模板，利用T7RNA  polymerase试剂盒分别生成RNA，测其浓度后，换算成拷贝数，并稀释至10¹⁰个拷 贝·μL^-1，-80℃保存，用前稀释作为阳性RNA标准品。

1.5荧光定量RT-PCR反应条件的优化

以阳性RNA标准品为模板，在不同退火温度下进行常规RT-PCR反应，扩增产 物用2%的琼脂糖凝胶电泳进行分析，确定最佳的引物退火温度。应用矩阵法对荧 光定量RT-PCR的引物和探针浓度进行优化，以得到最佳的反应体系和反应条件。

1.6荧光定量RT-PCR标准曲线的建立

将阳性标准品10倍梯度稀释至浓度范围为1×10³～1×10⁹个拷贝·μL^-1。以稀释 的RNA标准品为模板，每个稀释度设3个重复，进行荧光定量-RT-PCR检测，绘 制标准曲线。

1.7敏感性试验

将阳性RNA10倍梯度稀释至最低浓度为每微升10个拷贝，每个梯度做3个重 复，进行荧光定量RT-PCR反应，确定检测的敏感性。同时以等量的RNA为模板， 进行常规RT-PCR反应，具体引物(2F/2R)和退火温度参照文献（DARA M,TUNE K, MUNIR S,et al,PCR-based detection of an emerging avian pneumovirus in US turkey  flocks,J Vet Diagn Invest，2001,13(3):201-205.）。取扩增产物5μL，用2%的琼脂糖凝 胶电泳进行分析，比较二者敏感性的差异。

1.8特异性试验

鸡传染性支气管炎病毒（IBV），禽流感病毒（AIV H5，AIV H7，AIV H9），鸡 传染性法氏囊病病毒（IBDV），新城疫病毒（NDV），鸡病毒性关节炎病毒（ARV） 和网状内皮增生症病毒（REV）等病毒的RNA，利用建立的荧光定量RT-PCR方法 对其进行检测，同时利用建立的针对C亚群的荧光定量RT-PCR检测APV其他3 个亚群的RNA标准品，同时设阴性和阳性对照。

2结果

2.1荧光定量RT-PCR反应条件的优化

C亚群荧光定量RT-PCR反应体系共为20μL，含10μL2×QuantiTect Probe  RT-PCR Master Mix，6.75μL水，0.25μＬEnzyme，0.125μL探针GC（20nM），0.1875μL 上游引物GCF（40nM），0.1875μL下游引物GCR（40nM），阳性RNA标准品 2.5μL。反应条件为：48℃30min，95℃10min；95℃15sec，60℃1min，40个循环。

2.2标准曲线的建立

通过荧光定量RT-PCR反应条件进行优化，获得了检测APV C亚群的动力学曲 线（见图1）和标准曲线（见图2）。标准品浓度从1×10³～1×10⁹个拷贝·μL^-1具有 良好的线性关系（Error均小于0.2，Light Cycler480分析软件计算得到的Error值 为用于拟合线性回归时的单个数据点的平均方差，它代表定量结果的准确性，可以 接受的误差值应小于0.2）。图1x轴为循环阈值，y轴为荧光强度。图2x轴为RNA 标准品拷贝数的对数值，y轴为循环阈值。

2.3敏感性试验

荧光定量RT-PCR能检出的模板最低浓度为10²个拷贝·μL^-1，而常规RT-PCR 能检出的模板最低浓度为10⁴个拷贝·μL^-1（见图3），表明所建立的荧光定量RT-PCR 的敏感性是常规RT-PCR的100倍。

2.4特异性试验

用荧光定量RT-PCR对IBV，AIV H5，AIV H7，AIV H9，IBDV，NDV， ARV和REV进行检测，检测结果均为阴性，这些病毒的扩增曲线均为水平线，未 达到检出阈值，而RNA标准品（G_C:AY590688.1），有良好的扩增。

用荧光定量RT-PCR对APV的A、B和C亚群的G基因（GenBank登录号分 别为G_A:AY640317.1、G_B:AB548428.1和G_C:AY590688.1）和B亚群病毒RNA进行 检测，结果只有C亚群的为阳性，其他两个亚群均为阴性（见图4）。图4x轴为 循环阈值，y轴为荧光强度。

以上所述仅为本发明的优选实施例，对本发明而言仅是说明性的，而非限制性 的；本领域普通技术人员理解，在本发明权利要求所限定的精神和范围内可对其进 行许多改变，修改，甚至等效变更，但都将落入本发明的保护范围内。