一种番茄果实中16种多酚类物质的提取与测定方法

摘要

本发明提供了一种番茄果实中16种多酚类物质的提取和测定方法，属于植物多酚提取与含量检测技术领域。本发明提供的方法包括以下步骤：(1)番茄果实多酚类物质的提取：样品经冷冻干燥后，采用甲醇超声提取，离心后收集上清液，有机滤膜过滤；(2)采用高效液相色谱仪对番茄果实多酚提取液中的各酚类物质进行测定，分别对流动相、梯度洗脱程序、流速、柱温、进样量和波长进行了优选。最终确定的方法线性关系好，相关系数R2均大于0.998，样品的平均回收率在82.99‑103.41％，检出限在15.625‑31.25μg·L‑1。该方法操作简单、提取效率高、检测灵敏度和精密度好，可应用于番茄果实中多酚类物质的定性和定量分析，对番茄营养品质评价具有重要意义。

说明书

技术领域

本发明属于植物多酚物质提取与含量检测技术领域，具体涉及一种番茄果实中16种多酚类物质的提取与测定方法。

背景技术

番茄(Solanumlycopersicum)原产南美洲，是茄科、番茄属的一年生或多年生草本植物，中国南北方广泛栽培。番茄果实营养丰富，含有可溶性糖、有机酸、矿物质、类胡萝卜素和多酚化合物等。食用番茄有助于促进身体健康，对降低癌症、心血管疾病的发病率有一定作用。多酚类物质具有良好的抗氧化活性，能与维生素C、E和胡萝卜素等其他抗氧化物在体内一起发挥抗氧化功效，清除自由基、延缓衰老。多酚类物质是番茄果实的主要次级代谢产物和生物活性物质，可在一定程度上反映番茄的营养水平。因此，番茄果实中多酚类物质的提取与检测方法对番茄营养品质评价至关重要。

查阅关于番茄多酚类物质的提取与检测相关专利文献，未见相关报道。查阅番茄多酚类物质的提取与检测相关期刊文献，发现《Extraction of tomato by-products’bioactivecompounds using ohmic technology》，Marta Coelho等报道了一种欧姆加热提取多酚物质的方法，当施加6或11V·cm

现有关于番茄果实多酚类物质提取与检测方法，要么提取成本高，要么检测物质种类少，因此迫切需要一种快速、经济、可靠的提取方法和准确度、精密度高、操作简单可同时测定多种多酚类物质的检测方法，以实现番茄果实多酚类物质的精准定量分析。

发明内容

本发明的目的在于提供一种番茄果实中16种多酚类物质的提取与测定方法，该方法提取效率高、成本低，检测灵敏度和精密度高、重现性好。

为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：

一种番茄果实中16种多酚类物质的提取与测定方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

步骤一：番茄果实中多酚类物质的提取

取番茄果实，经干燥研磨成粉，向其中加入甲醇进行超声提取，提取完毕后进行离心，取离心后的上清液用过滤膜过滤，得到番茄果实多酚提取液。

步骤二：番茄果实中多酚类物质的定性和定量分析

A.采用高效液相色谱仪测定提取液中各种多酚类物质的含量，所述方法中，色谱柱为：Waters Symmetry C18柱(250mm×4.6mm，5μm)；流动相A为甲醇；流动相B为1％乙酸；流速为0.8-1.2mL/min；柱温为25-40℃；进样量为5-20μL；检测器为DAD；检测波长为240-322nm；洗脱方式为梯度洗脱：0-30min时流动相A体积占5％，流动相B的体积占95％；30-40min时流动相A的体积为30％，流动相B的体积为70％；40-45min时流动相A的体积为40％，流动相B的体积为60％；45-50min时流动相A的体积为50％，流动相B的体积为50％；50-55min时流动相A的体积为70％，流动相B的体积为30％；55-57min时流动相A的体积为40％，流动相B的体积为60％；57-60min时流动相A体积占5％，流动相B的体积占95％。

B.标准溶液的配制：取各单酚标准品，分别用色谱甲醇溶解，配制成浓度为500mg/L母液，再逐级稀释配成浓度为0.0156、0.0312、0.312、0.625、1.25、2.5、5mg/L的标准溶液，进样分析，以峰面积对质量浓度绘制标准曲线。再配制混合标准溶液，进样，得到标准品色谱图。

C.根据高效液相色谱仪检测出的番茄样品色谱图与标准品色谱图进行对比鉴定，并通过样品中各多酚物质的峰面积代入标准曲线方程，计算得到各多酚类物质的含量。

进一步的，所述的番茄果实中16种多酚物质为芦丁、山萘酚、槲皮素、柚皮素、4-香豆酸、肉桂酸、芥子酸、咖啡酸、对羟基苯甲酸、没食子酸、洋蓟素、绿原酸、阿魏酸、苯甲酸、原儿茶酸、龙胆酸。

作为本发明一种优选的技术方案，步骤一中所述番茄果实干粉是将果实洗净、切块后经真空冷冻干燥研磨成粉。

作为本发明一种优选的技术方案，步骤一中所述番茄果实干粉与提取液的料液比为1:20g/mL。

作为本发明一种优选的技术方案，步骤一中所述超声提取条件为20-25℃下超声提取15-20min。

作为本发明一种优选的技术方案，步骤一中所述离心操作为4℃、8000rpm下离心10min。

作为本发明一种优选的技术方案，步骤一中所述过滤膜为0.22μm有机膜。

作为本发明一种优选的技术方案，步骤二中所述流速为1.1mL/min。

作为本发明一种优选的技术方案，步骤二中所述柱温为30℃。

作为本发明一种优选的技术方案，步骤二中所述进样量为10μL。

作为本发明一种优选的技术方案，步骤二中所述检测波长为240nm处检测对羟基苯甲酸、原儿茶酸、槲皮素、绿原酸、芦丁；280nm处检测肉桂酸、4-香豆酸、没食子酸、柚皮素、苯甲酸、阿魏酸；322nm处检测芥子酸、咖啡酸、洋蓟素、山萘酚、龙胆酸。

采用本发明的上述方法对番茄果实多酚进行提取和测定，提取后的各酚类物质稳定性好，多酚的回收率高，重复效果好，检测方法的灵敏度和精密度高，能够快速、准确检测出16种多酚类物质的含量。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

1.本发明提供了一种番茄果实中16种多酚类物质的提取与测定方法，经干燥、超声提取、离心和过滤得到提取液，并采用高效液相色谱法进行检测，对色谱柱、流动相、梯度洗脱、流速、柱温、进样量和波长进行了优选，最终确定的方法操作简单、提取效率高、成本低，检测灵敏度和精密度好。克服了原有技术提取成本高、测定多酚类物质组分少的缺点。

2.本发明涉及的16种多酚类物质基本涵盖了番茄果实中全部的多酚类物质，作为一类抗氧化活性成分，其准确定量对番茄果实的营养品质评价具有重要意义，可应用于不同番茄品种比较和不同栽培技术对番茄营养品质的影响等研究。

附图说明

图1为本发明实施例一中混合标准品多酚类物质在240nm波长下的色谱图；

图2为本发明实施例一中混合标准品多酚类物质在280nm波长下的色谱图；

图3为本发明实施例一中混合标准品多酚类物质在322nm波长下的色谱图；

图4为本发明实施例一中番茄果实多酚提取样品在240nm波长下的色谱图；

图5为本发明实施例一中番茄果实多酚提取样品在280nm波长下的色谱图；

图6为本发明实施例一中番茄果实多酚提取样品在322nm波长下的色谱图；

图7为本发明实施例二中流速分别为0.8、1、1.1、1.2mL·min

图8为本发明实施例二中柱温分别为25、30、35、40℃时混合标准品多酚类物质在280nm波长下的色谱图；

图9为本发明实施例二中进样量分别为5、10、15、20μL混合标准品多酚类物质在280nm波长下的色谱图；

具体实施方式

下面实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1

本发明提供了一种番茄果实中16种多酚类物质的提取与测定方法，按下列步骤进行。

1材料与方法

1.1提取方法

将番茄果肉洗净、切块后经真空冷冻干燥研磨成粉，称取0.1g番茄粉，用2mL甲醇提取液进行超声提取(按料液比1:20g/mL)，超声条件为20-25℃下超声提取15-20min。待充分提取后，将粗提液于4℃、8000rpm下离心10min，将离心后的上清液用0.22μm有机膜过滤后上机分析。

1.2测定方法

1.2.1仪器与试剂

仪器：配备有1525泵和2998光电二极管阵列检测器的Waters液相色谱系统；色谱柱为：Waters Symmetry C18柱(250mm×4.6mm，5μm)；超声波清洗机；Allegra X-64R高速冷冻离心机，美国贝克曼公司；Milli-Q Integral10超纯水仪，Millipore公司；0.22μm有机滤膜(上海化学试剂有限公司)；1mL注射器；waters棕色小样品瓶。

试剂：芦丁、山萘酚、槲皮素、柚皮素、4-香豆酸、肉桂酸、芥子酸、咖啡酸、对羟基苯甲酸、没食子酸、洋蓟素、绿原酸、阿魏酸、苯甲酸，均购自上海源叶生物科技有限公司；原儿茶酸、龙胆酸，购自上海吉至生化科技有限公司；甲醇、乙酸为色谱纯；水为Millipore超纯水。

1.2.2检测条件

色谱柱为：Waters Symmetry C18柱(250mm×4.6mm，5μm)；流动相A为甲醇；流动相B为1％乙酸；流速为1.1mL/min；柱温为30℃；进样量为10μL；检测器为DAD；检测波长为240nm处检测对羟基苯甲酸、原儿茶酸、槲皮素、绿原酸、芦丁；280nm处检测肉桂酸、4-香豆酸、没食子酸、柚皮素、苯甲酸、阿魏酸；322nm处检测芥子酸、咖啡酸、洋蓟素、山萘酚、龙胆酸；洗脱方式为梯度洗脱：0-30min时流动相A体积占5％，流动相B的体积占95％；30-40min时流动相A的体积为30％，流动相B的体积为70％；40-45min时流动相A的体积为40％，流动相B的体积为60％；45-50min时流动相A的体积为50％，流动相B的体积为50％；50-55min时流动相A的体积为70％，流动相B的体积为30％；55-57min时流动相A的体积为40％，流动相B的体积为60％；57-60min时流动相A体积占5％，流动相B的体积占95％。

1.2.3混合标准品和样品的测定

取各多酚类物质标准品，分别用色谱甲醇溶解，配制成浓度为500mg/L母液，其中各取山萘酚和柚皮素0.02mL，其它14种多酚类物质0.2mL配制成5mL的10mg/L混标，再逐级稀释配成浓度为0.0156、0.0312、0.312、0.625、1.25、2.5、5mg/L的标准溶液，取10μL混合标准溶液进行高效液相色谱分析，得到混合标准品色谱图。

取10μL按1.1方法得到的番茄果实多酚提取液进行高效液相色谱分析，得到番茄果实样品色谱图。

2结果与分析

多酚类物质混合标准品在240nm、280nm、332nm波长下的检测色谱图如图1-3所示。根据保留时间，峰依次为没食子酸、原儿茶酸、对羟基苯甲酸、绿原酸、龙胆酸、咖啡酸、洋蓟素、4-香豆酸、阿魏酸、芥子酸、苯甲酸、芦丁、肉桂酸、槲皮素、柚皮素、山萘酚。

番茄果实多酚提取样品在240nm、280nm、332nm波长下的检测色谱图如图4-6所示。12种多酚类物质在番茄果实样品中被检测到，原儿茶酸、4-香豆酸、槲皮素和柚皮素未检测到。

实施例2

考虑到高效液相色谱法中流速、柱温、进样量、检测波长等参数对色谱图各峰的分离度及峰型的影响，本实施例对不同流速、柱温、进样量进行筛选优化，根据混合标准品的色谱图来确定，具体步骤如下：

1仪器与试剂

仪器：配备有1525泵和2998光电二极管阵列检测器的Waters液相色谱系统；色谱柱为：Waters Symmetry C18柱(250mm×4.6mm，5μm)；Milli-Q Integral10超纯水仪，Millipore公司；waters棕色小样品瓶。

试剂：芦丁、山萘酚、槲皮素、柚皮素、4-香豆酸、肉桂酸、芥子酸、咖啡酸、对羟基苯甲酸、没食子酸、洋蓟素、绿原酸、阿魏酸、苯甲酸，均购自上海源叶生物科技有限公司；原儿茶酸、龙胆酸，购自上海吉至生化科技有限公司；甲醇、乙酸为色谱纯；水为Millipore超纯水。

2检测条件

色谱柱为：Waters Symmetry C18柱(250mm×4.6mm，5μm)；流动相A为甲醇；流动相B为1％乙酸；流速为0.8-1.2mL/min；柱温为25-40℃；进样量为5-20μL；检测器为DAD；检测波长为280nm；洗脱方式为梯度洗脱：0-30min时流动相A体积占5％，流动相B的体积占95％；30-40min时流动相A的体积为30％，流动相B的体积为70％；40-45min时流动相A的体积为40％，流动相B的体积为60％；45-50min时流动相A的体积为50％，流动相B的体积为50％；50-55min时流动相A的体积为70％，流动相B的体积为30％；55-57min时流动相A的体积为40％，流动相B的体积为60％；57-60min时流动相A体积占5％，流动相B的体积占95％。

3混合标准品的测定

分别称取16种多酚类物质标准品各1mg，用色谱甲醇溶解，定容至10mL，均配制成100mg/L的母液。分别取各酚类物质2mL混匀后，取10μL混合标准溶液进行高效液相色谱分析，得到混合标准品色谱图。

4最优流速的筛选

流速分别设置为0.8、1、1.1、1.2mL/min，进行混合标准品的HPLC分析。如图7所示，流速为1.1和1.2mL/min时的色谱图效果最佳，考虑到节约流动相的用量，故选取1.1mL/min流速为最优。

5最优柱温的筛选

柱温分别设置为25、30、35、40℃，进行混合标准品的HPLC分析。如图8所示，柱温为30℃时色谱图效果最佳，故选取30℃柱温为最优。

6最优进样量的筛选

进样量分别设置为5、10、15、20μL，进行混合标准品的HPLC分析。如图9所示，进样量为10μL时色谱图效果最佳，故选取10μL进样量为最优。

7检测波长确定

采用上述确定的最优色谱条件，在2D通道280nm处及3D通道检测16种多酚类物质。最终确定在240nm处检测对羟基苯甲酸、原儿茶酸、槲皮素、绿原酸、芦丁；280nm处检测肉桂酸、4-香豆酸、没食子酸、柚皮素、苯甲酸、阿魏酸；322nm处检测芥子酸、咖啡酸、洋蓟素、山萘酚、龙胆酸。此波长条件下的各多酚物质色谱图的分离度和峰型最优。

实施例3

HPLC方法的考察

1线性关系与检出限

将多酚类物质混合标准品配制成0.0156、0.0312、0.312、0.625、1.25、2.5、5mg/L浓度梯度进行高效液相色谱测定，检测条件同1.2.2。根据液相色谱中的峰面积与标准样中标准物质的绝对进样量关系进行线性回归，确定回归方程、相关系数和线性范围。取最低浓度的标准品混合溶液，以信噪比S/N＝3为标准，测试该色谱条件下的最低检测量。

如表1所示，16种酚类物质标准品相应的线性范围内的浓度与峰面积呈现良好的线性关系，相关系数均在0.998以上。原儿茶酸、对羟基苯甲酸、绿原酸、芦丁、槲皮、没食子酸、4-香豆酸、苯甲酸、肉桂酸、龙胆酸、咖啡酸、洋蓟素、阿魏酸、芥子酸，最低检测限为31.25μg·L

表1各酚类物质的回归方程、相关系数、线性范围和检出限

2精密度试验

为了验证方法的精密度，将浓度为500mg·L

如表2所示，16种多酚类物质的日内RSD介于0.97％-4.93％，日间RSD介于1.61％-6.86％，说明该方法的精密度良好，符合测定要求。

表2各酚类物质的日内和日间相对标准偏差(RSD)

3稳定性试验

制备同一份番茄果实多酚提取样品，按照1.2.2色谱条件分别于0h、4h、8h、12h、24h、48h进样，测定样品中酚类物质的含量。根据各多酚物质的积分峰面积计算相对标准偏差RSD。

结果显示，原儿茶酸、对羟基苯甲酸、绿原酸、芦丁、槲皮素、没食子酸、4-香豆酸、苯甲酸、肉桂酸、柚皮素、龙胆酸、咖啡酸、洋蓟素、阿魏酸、芥子酸、山萘酚16种酚类物质的RSD分别为4.24％、2.90％、5.07％、8.68％、1.60％、1.13％、0.97％、0.85％、1.68％、0.71％、0.93％、3.11％、1.79％、1.33％、1.92％、1.88％，均小于8.70％，表明样品在48h内稳定，该方法稳定性良好。

4重复性试验

称取同一份番茄样品6份，按1.1提取方法获得多酚提取液，在1.2.2色谱条件下进行测定，根据各多酚物质的积分峰面积计算RSD值检验方法的重复性。

结果显示，原儿茶酸、对羟基苯甲酸、绿原酸、芦丁、槲皮素、没食子酸、4-香豆酸、苯甲酸、肉桂酸、柚皮素、龙胆酸、咖啡酸、洋蓟素、阿魏酸、芥子酸、山萘酚16种酚类物质的RSD分别为2.96％、3.43％、4.6％、9.72％、1.36％、1.12％、1.77％、1.22％、1.10％、0.86％、2.04％、4.63％、3.17％、3.60％、4.42％、1.70％，均小于10％，说明该方法重复性良好。

5回收率试验

称取已知多酚物质含量的样品6份，加入一定量的各酚类标准品，按照1.1方法进行多酚物质提取，在1.2.2色谱条件下进行测定，按下式计算加标回收率，验证方法的准确性。

加标回收率(％)＝〔实测值(mg/L)-样品中含量(mg/L)〕/添加值(mg/L)×100％

如表3所示，各物质加标回收率在82.99％-103.41％之间，RSD值在0.00％-8.82％之间，说明该方法的准确性较高，能用于番茄果实多酚物质的检测分析。

表3各酚类物质的加标回收率试验结果

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。