靶向内体中G蛋白偶联受体的纳米颗粒封装

摘要

本发明涉及用于调节内体GPCR信号传导的方法。特别地，本发明涉及聚合物纳米颗粒用于靶向递送内体GPCR的疏水性调节剂的用途，及其在相关疾病和病症的治疗中的用途。

说明书

相关申请的交叉引用

本申请要求2018年10月22日提交的澳大利亚临时申请No.2018903997的权益，其全部内容通过引用并入本文。

技术领域

本发明涉及用于调节内体GPCR信号传导的方法。特别地，本发明涉及聚合物纳米颗粒用于靶向递送内体GPCR的疏水性调节剂的用途及其在相关疾病和病症的治疗中的用途。

背景技术

细胞对细胞外环境作出应答的能力需要诸如G蛋白偶联受体(GPCR)和受体酪氨酸激酶(RTK，例如EGF或胰岛素受体)的细胞表面信号传导蛋白与迅速启动细胞内信号传导途径的细胞外配体结合。一旦实现了细胞应答，就可以通过偶联至β-arrestin(β-抑制蛋白)1/2衔接蛋白来终止这些信号，并通过网格蛋白/发动蛋白介导的途径内化以募集到内体膜网络。经典的受体信号传导范例假设，内化通过分解早期内体中的受体结合配体复合物，并将受体分类为再循环内体或走向降解溶酶体途径，从而促进信号终止。内化受体与其同源G蛋白相关的证据驳斥了这一假设，该同源G蛋白可启动持续的内体源性信号传导过程。

G蛋白偶联受体(GPCR)是细胞表面受体的最大家族，其参与大多数病理生理学过程，是约30％治疗药物的靶标(Audet,M.&Bouvier,M.《自然化学生物学》(Nat Chem Biol)2008,4,397-403)。细胞表面GPCR与细胞外配体相互作用，并与异三聚体G蛋白偶联，从而触发质膜定界信号(第二信使形成、生长因子受体反式激活、离子通道调节)。配体去除以及受体与β-抑制蛋白(βarrs)的缔合会终止质膜信号。

直到最近，人们普遍认为GPCR的激活、随后的下游信号传导以及信号终止仅发生在质膜上。质膜信号传导通过GPCR激酶(GRJC)使受体磷酸化而在激活的几分钟内终止，该GPCR激酶对于活性配体结合受体构象是选择性的。GRK使GPCR的C端富含S/T的结构域磷酸化(Sato,P.Y.等人，《生理学评论》(Physiological reviews)2015,95,377-404)。之后磷酸化的受体与βarr结合，从而在空间上阻止受体与G蛋白之间的偶联，继而终止激动剂介导的G蛋白激活。βarrs通过发动蛋白和网格蛋白依赖性内吞作用进一步促进配体结合受体从细胞表面向早期内体的转移。一旦被内吞，则配体和磷酸基团就会从GPCR中去除，并且受体迅速重新分布到细胞膜上或被转运到溶酶体中进行降解。

但是，最近发现，多种GPCR并不总是遵循常规范式。研究发现，在配体结合以及受体激活后，一些细胞表面GPCR内化，并重新分布到早期内体中，在这里异三聚体G蛋白信号传导会维持较长的时间。因此，内体不仅可以充当GPCR运输至回收或降解途径的管道，而且可以成为信号转导的重要部位(Murphy,J.E.等人《美国科学院院报》(Proc Natl Acad SciUSA)2009,106,17615-17622)。通过将GPCR和丝裂原活化蛋白激酶募集到内体中，βarrs可以介导内体GPCR信号传导(Murphy,J.E.等人《美国科学院院报》2009,106,17615-17622；DeFea,K.A.等人《美国科学院院报》2000,97,11086-11091；DeFea,K.A.等人《细胞生物学杂志》(J Cell Biol)2000,148,1267-1281)。

βarrs将各种信号传导蛋白募集到质膜和内体膜的激活受体上，并且是信号传导的重要介导物。MAPK级联激活[ERK，c-Jun氨基末端激酶(JNK)，p38]是最充分表征的βarr依赖性信号传导途径。βarrs是信号传导活跃参与者的第一个证据是观察到βarr的显性负性突变体抑制了β

因此，调节内吞GPCR可以有利地提供一种与该受体大家族有关的大量疾病和病症的新型治疗方法。

发明内容

本发明提供了新型方法来将GPCR的调节剂递送至内体腔，在内体腔中它们能够与内吞的受体相互作用。

因此，在一个方面，本发明提供了一种水性液体，其包含组装为形成核/壳结构的共聚物链的聚合物纳米颗粒，该共聚物链具有：

(i)形成该纳米颗粒的核的酸响应型疏水性聚合物嵌段；以及

(ii)形成该纳米颗粒的壳并被该水性液体溶剂化的亲水性聚合物嵌段，

其中，该纳米颗粒在其核内包含内体GPCR信号传导的疏水性调节剂或其药学上可接受的盐。

在一个实施方案中，本文所公开的聚合物纳米颗粒为胶束。

在另一个方面，本发明提供了一种调节有此需要的受试者内体GPCR信号传导的方法，该方法包括：向该受试者施用水性液体，该水性液体包含组装为形成核/壳结构的共聚物链的聚合物纳米颗粒，该共聚物链具有：

(i)形成该纳米颗粒的核的酸响应型疏水性聚合物嵌段；以及

(ii)形成该纳米颗粒的壳并被该水性液体溶剂化的亲水性聚合物嵌段，

其中，该纳米颗粒在其核内包含内体GPCR信号传导的疏水性调节剂或其药学上可接受的盐，

并且其中，该酸响应型聚合物嵌段在内体腔的酸性环境中经历转变，使所组装的共聚物链分解，并将内体GPCR信号传导的疏水性调节剂或其药学上可接受的盐释放到内体中。

在一个实施方案中，内体GPCR信号传导的疏水性调节剂或其药学上可接受的盐是内体GPCR信号传导的抑制剂或其药学上可接受的盐。

在一个方面，本发明提供了一种调节有此需要的受试者内体GPCR信号传导的方法，该方法包括向该受试者施用有效量的根据本发明的水性液体。

在另一个实施方案中，内体GPCR信号传导的疏水性调节剂或其药学上可接受的盐是内体NK

因此，在本发明的另一个方面，提供了一种用于治疗由内体NK

在另一个实施方案中，内体GPCR信号传导的疏水性调节剂或其药学上可接受的盐是内体CGRP和/或CLR信号传导的抑制剂或其药学上可接受的盐。

因此，在本发明的另一个方面，提供了一种用于治疗由内体CGRP受体信号传导(例如，CLR信号传导)介导的疾病或病症的方法，该方法包括向有此需要的受试者施用有效量的根据本发明的水性液体。

在一些实施方案中，本文所公开的水性液体还包含内体GPCR信号传导的第二疏水性调节剂或其药学上可接受的盐，其中，该内体GPCR信号传导的第二疏水性调节剂或其药学上可接受的盐包含在聚合物纳米颗粒的核内。

因此，在另一个方面，本发明提供了一种水性液体，其包含组装为形成核/壳结构的共聚物链的聚合物纳米颗粒，该共聚物链具有：

(i)形成该纳米颗粒的核的酸响应型疏水性聚合物嵌段；以及

(ii)形成该纳米颗粒的壳并被该水性液体溶剂化的亲水性聚合物嵌段，其中，该纳米颗粒在其核内包含：

a)内体GPCR信号传导的第一疏水性调节剂或其药学上可接受的盐；以及

b)内体GPCR信号传导的第二疏水性调节剂或其药学上可接受的盐。

在另一个方面，本发明提供了一种调节有此需要的受试者内体GPCR信号传导的方法，该方法包括向该受试者施用水性液体，该水性液体包含组装为形成核/壳结构的共聚物链的聚合物纳米颗粒，该共聚物链具有：

(i)形成该纳米颗粒的核的酸响应型疏水性聚合物嵌段；以及

(ii)形成该纳米颗粒的壳并被该水性液体溶剂化的亲水性聚合物嵌段，

其中，该纳米颗粒在其核内包含：

a)内体GPCR信号传导的第一疏水性调节剂或其药学上可接受的盐；以及

b)内体GPCR信号传导的第二疏水性调节剂或其药学上可接受的盐；

并且其中，该酸响应型聚合物嵌段在内体腔的酸性环境中经历转变，使组装的共聚物链分解，并将内体GPCR信号传导的疏水性调节剂或其药学上可接受的盐释放到内体中。

在一些实施方案中，内体GPCR信号传导的第一疏水性调节剂或其药学上可接受的盐是内体NK

在一些实施方案中，内体GPCR信号传导的第二疏水性调节剂或其药学上可接受的盐是CGRP受体信号传导(例如，CLR信号传导)的抑制剂或其药学上可接受的盐。

因此，在另一个实施方案中，本发明提供了一种用于治疗由内体GPCR信号传导介导的疾病或病症的方法，其中，该疾病或病症是由CGRP受体(例如，CLR)和/或NK

在另一个方面，本发明提供了一种调节有此需要的受试者内体GPCR信号传导的方法，该方法包括向该受试者施用有效量的：

1)第一水性液体或其药物组合物，其中，该第一水性液体如本文任何地方所述在聚合物纳米颗粒的核内包含NK

2)第二水性液体或其药物组合物，其中，该第二水性液体如本文任何地方所述在聚合物纳米颗粒的核内包含CGRP受体(例如，CLR)抑制剂。

已知降钙素基因相关肽(“CGRP”)在整个神经系统中均有表达。CGRP受体包括降钙素受体样受体(“CLR”)和受体活性修饰蛋白1(RAMP1)，前者是一种GPCR，后者是一种可赋予配体特异性并确保CLR靶向细胞表面的单次跨膜蛋白。伤害性刺激会引起CGRP从脊髓背角和外周组织中的初级感觉神经元末端释放。CGRP激活脊髓神经元上的CLR/RAMP1，诱导伤害性感受；并激活外周微动脉上的CLR/RAMP1，导致神经源性炎症。参见Yarwood等人《美国科学院院报》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA.)114(46)：12309-12314)。

在本发明的又一个方面，提供了一种药物组合物，其包含根据本发明的水性液体。

通过阅读下面结合所附实施例和权利要求的详细描述，本发明的这些和其他方面对于本领域技术人员将变得更加显而易见。

附图说明

本文将仅参考以下非限制性附图以示例的方式描述本发明，其中：

图1示出了DIPMA和BMA纳米颗粒示意图。A)DIPMA纳米颗粒由P(PEGMA-co-DMAEMA)的疏水性核和P(DIPMA-co-DEGMA)的亲水性壳组成。而B)BMA纳米颗粒由相同的亲水性壳形成，但疏水性核替换为了BMA。C)示出了DIPMA纳米颗粒的TEM图像。上面的图像示出了DIPMA-Ap负载纳米颗粒，下面的图像示出了DIPMA-空纳米颗粒。D)示出了DIPMA和BMA纳米颗粒的pH分解的图示。将200μg负载有尼罗红的DIPMA和BMA纳米颗粒加入到pH在7.4至5.0范围内的不同PBS溶液中。在pH 6.08±0.064下观察到50％的DIPMA-Nr纳米颗粒分解，而BMA-Nr没有显示出随pH变化的分解特性。Mean±SEM(平均值±标准误差)。n＝3。

图2示出了

图3示出了P(PEGMA-co-DMAEMA)和所得的二嵌段共聚物P(PEGMA-co-DMAEMA)-b-P(DIPMA-co-DEGMA)和P(PEGMA-co-DMAEMA)-b-P(BMA-co-DEGMA)的GPC迹线的图示。在与单体DIPMA和DEGMA扩链形成P(PEGMA-co-DMAEMA)-b-P(DIPMA-co-DEGMA)，与BMA扩链形成P(PEGMA-co-DMAEMA)-b-P(BMA-co-DEGMA)之后，观察到向更高分子量的转移(即，保留时间更短)。

图4示出了用Cy5标记的DIPMA纳米颗粒在被NK

图5示出了由SP刺激并且被Ap抑制的核ERK的浓度剂量响应曲线的图示。A)使用不同浓度的SP而得到的随时间变化的核ERK响应。B)通过与不同浓度的Ap预孵育，然后进行5nM SP刺激，而得到的随时间变化的核ERK响应。C)通过SP和Ap核的核ERK响应的65分钟时间迹线的AUC，而得到的随时间变化的核ERK响应。结果通过对PDBu 1μM的最大核ERK响应表示为标准化值。Mean±SE。n＝6。

图6示出了用空纳米颗粒刺激的HEK-293和HEK-hNK

图7示出了核ERK信号传导的空纳米颗粒和细胞活力对HEK-hNK

图8示出了用10μg空DIPMA和BMA纳米颗粒刺激的HEK-hNK

图9示出了在施用DIPMA纳米颗粒之后对运动模式评估的图示。用DIPMA-Ap和对照纳米颗粒处理动物，并在处理后30至240分钟记录跌倒潜伏期。纳米颗粒产生的跌倒潜伏期与媒介物相比没有差异。Mean±SEM。n＝3。

图10示出了鞘内施用后DIPMA-Cy5纳米颗粒的分布。A)施用DIPMA-Cy5后显示注射部位(L3-L4)内出现局部荧光，施用后2小时荧光开始减少，并在24小时后完全消失。B)A中所示图像的辐射效率的量化。Mean±SEM n＝3。C)利用转杆(Rotarod)评估的用纳米颗粒治疗的动物的运动活性(n＝3)。

图11示出了辣椒素诱发的急性疼痛模型中DIPMA-Ap纳米颗粒的镇痛效果的评估。鞘内施用纳米颗粒，30分钟后足底注射辣椒素，并使用Von Frey细丝(Von Freyfilaments)评估A)辣椒素刺激的爪(同侧)和B)未刺激的爪(对侧)上的机械性痛觉过敏。值数据显示为基础Von Frey响应的百分比。Mean±SEM。n＝6

图12示出了在施用了A)100、300nM和1μM阿瑞匹坦(对于每种浓度n＝4)、B)负载有100、300或500nM阿瑞匹坦的10、30或50μg BMA纳米颗粒(对于每种浓度n＝6)或C)负载有100、300或500nM阿瑞匹坦的10、30或50μg酸响应型DIPMA纳米颗粒(对于每种浓度n＝6)之后，使用Randall-Selitto电子痛觉计评估的慢性疼痛模型中DIPMA-Ap纳米颗粒的镇痛效果评估。

图13示出了线粒体功能的图示，该线粒体功能是用DEAEMA和DIPMA颗粒处理的细胞中细胞活力的指标。细胞活力是通过使用CellTiter Glo测量线粒体活性来确定的。用含有逐步增加的0％、5％、10％、20％和50％DEGMA的DEAEMA(A-D)或DIPMA(E-H)纳米颗粒处理细胞达24小时。细胞活力表示为媒介物对照组的百分比。Mean±S.E.M；n＝4-5次独立实验。

图14示出了核膜通透性的图示，该核膜通透性是用DEAEMA和DIPMA颗粒处理的细胞中细胞死亡的指标。细胞死亡通过使用碘化丙啶测量核膜通透性来确定。用含有逐步增加的0％、5％、10％、20％和50％DEGMA的DEAEMA(A-D)或DIPMA(E-H)纳米颗粒处理细胞达24小时。细胞死亡以0.2％曲拉通X-100的百分比表示(最大细胞死亡)。Mean±S.E.M；n＝4-5次独立实验。

图15示出了暴露12小时、24小时、48小时和72小时后，不同浓度的DEAMA和DIPMA纳米颗粒的细胞活力测定结果。

图16示出了DIPMA纳米颗粒在HEK-293细胞中的摄取和分解。A)示出了DIPMA-Cy5纳米颗粒被摄取到表达Rab5-GFP的细胞中。B)示出了30分钟后DIPMA-Cy5纳米颗粒在Rab5-GFP早期内体和Rab7-GFP晚期内体中共存。C)示出了在用SP刺激以诱导NK

图17示出了DIPMA纳米颗粒在HEK-293细胞中的摄取和分解。A)示出了60分钟后DIPMA-Cy5纳米颗粒在Rab5-GFP早期内体和Rab7-GFP晚期内体中共定位。B)示出了在用SP刺激以诱导NK

图18示出了DIPMA-AP和BMA-AP纳米颗粒对急性炎症和神经性疼痛的作用。A)在小鼠的辣椒素(CAP)诱发的急性伤害性感受模型中，鞘内(i.t.)注射媒介物(Veh)、AP或纳米颗粒，30分钟后足底(i.pl.)注射辣椒素。在小鼠的CFA诱发的持续性炎性疼痛模型中，足底注射CFA；48小时后，鞘内注射媒介物、AP或纳米颗粒。在大鼠中研究了慢性神经性疼痛的SNS模型。在SNS后10天，鞘内注射媒介物、AP或纳米颗粒。在小鼠中使用Von Frey细丝(VFF)，并在大鼠中使用Randall-Selitto测试，来评估爪缩回响应。B)和C)示出了小鼠中辣椒素诱导的机械性痛觉超敏。D)至F)示出了小鼠中CFA诱发的机械性痛觉过敏。G)至I)示出了大鼠中SNS诱发的机械性痛觉过敏。(n)表示动物编号。n＝6。###＝****，#＝***。P<0.005。

图19示出了DIPMA-AP和BMA-AP纳米颗粒对SNS模型中神经性疼痛的作用。在大鼠中研究了慢性神经性疼痛的SNS模型。在SNS后10天，鞘内注射媒介物、AP、DIPMA-AP或BMA-AP。利用Randall-Selitto测验，评估爪缩回反应。A)示出了缩回阈值随时间进程的变化。B)是0至7小时的曲线下面积(AUC)图。(n)表示动物编号。n＝6。##＝****，#＝***。P<0.005。

图20示出了由DIPMA-AP和BMA-AP纳米颗粒引起的疼痛传递的敏化和激活。A)至F)示出了SNS大鼠的C纤维反射和wind-up。SNS后10天测量C纤维反射(A至C)和wind-up(D至F)。鞘内注射媒介物(Veh)、AP或DIPMA-AP。A)和D)示出了比较AP和DIPMA-AP的代表性记录。B)和E)示出了作用的时间进程。C)和F)示出了整体响应。(n)动物编号。n＝5。##＝****，P<0.05。G)至I)示出了SP诱导的大鼠脊髓切片中神经元兴奋的细胞贴附式膜片钳记录。G)示出了代表性迹线，n＝6-8次实验。H)比较了标准发放率(firing rate)。I)比较了发放时间。n＝6-8**P<0.05。

图21示出了DIPMA-AP和BMA-AP纳米颗粒在HEK293细胞的内体中对NK

图22示出了HEK-hNK

图23示出了在施用了A)30nM、100nM、300nM和1000nM MK-3207(每种浓度n＝4)和B)负载有30nM、50nM和100nM MK-3207的酸响应型DIPMA纳米颗粒(每种浓度n＝4)之后，通过Von Frey纤毛(Von Frey hairs)评估的酸响应型DIPMA-(MK-3207)纳米颗粒在机械性痛觉超敏的CFA模型中的镇痛效果评估。

图24示出了1mg/mL DIPMA聚合物组合物中负载的阿瑞匹坦和MK-3207的浓度(μM)与阿瑞匹坦/MK-3207的初始负载比(LC-MS评估)。Mean-/+SD(平均值-/+标准偏差)，n＝4

图25示出了在施用了120nM阿瑞匹坦+120nM MK-3207；以及负载有(82nM阿瑞匹坦+12nM MK-3207)、(81nM阿瑞匹坦+25nM MK-3207)和(80nM阿瑞匹坦+81nM MK-3207)的酸响应型DIPMA纳米颗粒之后，通过Von Frey纤毛评估的双负载DIPMA-(Ap+MK-3207)纳米颗粒在机械性痛觉超敏的CFA模型中的镇痛效果评估(n＝4)(*P<0.05，**P<0.01，#P<0.001；双向方差分析(2-way ANOVA)，Dunnett’s后测)。

图26示出了在施用了120nM阿瑞匹坦+120nM MK-3207(n＝4)，以及以及DIPMA-Ap纳米颗粒(30nM Ap)+DIPMA-(MK-3207)纳米颗粒(30nM MK-3207)、DIPMA-Ap纳米颗粒(60nMAp)+DIPMA-(MK-3207)纳米颗粒(60nM MK-3207)，以及DIPMA-Ap纳米颗粒(120nM Ap)+DIPMA-(MK-3207)纳米颗粒(120nM MK-3207)之后，通过Von Frey纤毛评估的共施用DIPMA-Ap纳米颗粒和DIPMA-(MK3207)纳米颗粒在机械性痛觉超敏的CFA模型中的镇痛效果评估(*P<0.05，#P<0.001；双向方差分析(2-way ANOVA)，Dunnett’s后测)。

具体实施方式

在本说明书中，使用了本领域技术人员众所周知的许多术语。然而，为了清楚起见，将对一些术语进行定义。

术语“卤代”是指氟代(F)、氯代(Cl)、溴代(Br)或碘代(I)。

术语“酰基”是指式–C(＝O)-R的基团，其中R是化学取代基。作为非限制性实例，R可独立地选自H、烷基、卤代烷基、芳基、杂芳基、环烷基和杂环基，其中每个R均如本文其他地方所定义的那样被任选地取代。酰基的非限制性实例包括–C(＝O)Me和-C(＝O)Ph。

术语“酰氧基”是指式–C(＝O)-OR的基团，其中R是化学取代基。R可独立地选自H、烷基、卤代烷基、芳基、杂芳基、环烷基和杂环基，其中每个R均如本文其他地方所定义的那样被任选地取代。酰氧基的非限制性实例包括–C(＝O)OMe和-C(＝O)OPh。

术语“氨基”是指式-NR

术语“烷基”是指可以是直链或支链的烃链，其包含所示数目的碳原子。例如，C

术语“卤代烷基”是指其中一个或多个氢原子被独立选择的卤代取代的烷基。

术语“烷氧基”是指-O-烷基(例如，-OCH

术语“卤代烷氧基”是指-O-卤代烷基(例如，-OCH

术语“亚烷基”是指支链或直链二价烷基(例如，-CH

术语“亚芳基”等是指环体系的二价形式，在此为二价芳基。

术语“烯基”是指可以是具有一个或多个碳-碳双键的直链或支链的烃链。烯基部分包含指定数目的碳原子。例如，C

术语“炔基”是指可以是具有一个或多个碳-碳三键的直链或支链的烃链。炔基部分包含指定数目的碳原子。例如，C

术语“芳基”是指6-碳单环、10-碳双环或14-碳三环芳环体系，其中每个环的0、1、2、3或4个原子可被取代基取代，并且其中包含单环基团的环是芳族的，并且其中包含双环或三环基团的稠合环中的至少一个是芳族的，例如四氢萘基。芳基的实例还包括苯基、萘基等。

本文所用的术语“环烷基”或“碳环基”包括具有3至10个碳，优选3至8个碳，更优选3至6个碳的饱和环烃基，其中环烷基可以任选地被取代。优选的环烷基包括但不限于，环丙基、环丁基、环戊基、环戊烯基、环己基、环己烯基、环庚基和环辛基。

术语“杂芳基”是指芳族5-8元单环、8-12元双环或11-14元三环体系，如果是单环则具有1至3个杂原子，如果是双环则具有1至6个杂原子，如果是三环则具有1至9个杂原子，所述杂原子选自O、N或S(例如，如果是单环、双环或三环，则分别为O、N或S的碳原子和1-3、1-6或1-9个杂原子)，其中每个环的0、1、2、3或4个原子可以被取代基取代，并且其中包含单环基团的环是芳族的，并且其中包含双环或三环基团的稠合环中的至少一个是芳族的(但不一定是含有杂原子的环，例如四氢异喹啉基)。示例性杂芳基体系衍生自但不限于以下环体系：吡咯、呋喃、噻吩、咪唑、吡唑、恶唑(＝[1,3]恶唑)、异恶唑(＝[1,2]恶唑)、噻唑(＝[1,3]噻唑)、异噻唑(＝[1,2]噻唑)、[1,2,3]三唑、[1,2,4]三唑、[1,2,4]恶二唑、[1,3,4]恶二唑、[1,2,4]噻二唑、[1,3,4]噻二唑、四唑、吡啶、哒嗪、嘧啶、吡嗪、[1,2,3]三嗪、[1,2,4]三嗪、[1,3,5]三嗪、吲哚、异吲哚、苯并呋喃、苯并噻吩[1,3]苯并恶唑、[1,3]苯并噻唑、苯并咪唑、吲唑、喹啉、异喹啉、噌啉、喹唑啉、喹喔啉、酞嗪、不同的萘啶(例如，[1,8]萘啶)、不同的噻吩并吡啶(例如，噻吩并[2,3-b]吡啶)和嘌呤。

术语“杂环基”是指非芳族5-8元单环、8-12元双环或11-14元三环体系，如果是单环则具有1至3个杂原子，如果是双环则具有1至6个杂原子，如果是三环则具有1至9个杂原子，所述杂原子选自O、N或S(例如，如果是单环、双环或三环，则分别为O、N或S的碳原子和1-3、1-6或1-9个杂原子)，其中每个环的0、1、2或3个原子可以被取代基取代。杂环基的实例包括哌嗪基、吡咯烷基、二恶烷基、吗啉基、四氢呋喃基等。

术语“取代的”是指在分子的一个或多个非氢原子上具有取代氢的取代基的部分。应当理解，“取代”或“被……取代”包括隐含的条件，即该取代是根据取代原子和取代基的允许化合价，并且该取代产生稳定的化合物，例如，其不是自发地进行转化(例如通过重排、环化、消除等)。取代基可以包括例如，任选地由羟基、-NH

术语“阿瑞匹坦”、“沃氟匹坦”、“L-733060”、“MK-3207”和“olcegepant”是指具有下表中所示的结构、化学名称和CAS编号的化学实体。

如本文所使用的，术语“DIPMA纳米颗粒”或“酸响应型DIPMA纳米颗粒”是指由P(PEGMA-co-DMAEMA)-b-P(DIPMA-co-DEGMA)二嵌段共聚物形成的纳米颗粒。如图1所示，DIPMA纳米颗粒由P(PEGMA-co-DMAEMA)的疏水性核和P(DIPMA-co-DEGMA)的亲水性壳组成。

如本文所使用的，术语“DIPMA-Ap纳米颗粒”(或“DIPMA-AP纳米颗粒”)是指由负载有阿瑞匹坦的P(PEGMA-co-DMAEMA)-b-P(DIPMA-co-DEGMA)二嵌段共聚物(即，阿瑞匹坦包含在该纳米颗粒的核内)形成的纳米颗粒。因此，术语“DIPMA-(MK-3207)纳米颗粒”是指由负载有MK-3207的P(PEGMA-co-DMAEMA)-b-P(DIPMA-co-DEGMA)二嵌段共聚物形成的纳米颗粒；而术语“DIPMA-(Ap+MK-3207)纳米颗粒”是指由双负载有阿瑞匹坦和MK-3207的P(PEGMA-co-DMAEMA)-b-P(DIPMA-co-DEGMA)二嵌段共聚物(即，阿瑞匹坦和MK-3207均包含在该纳米颗粒的核内)形成的纳米颗粒。

如本文所使用的，术语“BMA-Ap纳米颗粒”是指由负载有阿瑞匹坦的P(PEGMA-co-DMAEMA)-b-P(BMA-co-DEGMA)二嵌段共聚物(即，阿瑞匹坦包含在该纳米颗粒的核内)形成的纳米颗粒。

通过研究物质P(SP)神经激肽1受体(NK

这些发现表明，靶向内体中的GPCR是最佳药物干预所必需的。内体是区分GPCR信号传导的平台，是病理生理学重要过程的基础，这一概念对受体信号特异性和治疗靶向性具有重要意义。内体运输使得GPCR可以在亚细胞区室中产生信号，这可以解释激活相同G蛋白和βarrs的不同受体如何特异性地调节应答。将GPCR调节剂递送至内体中可以使得靶向作为具有增强的功效和选择性地疾病相关过程基础的信号。

现已令人惊讶地发现，根据本发明的聚合物纳米颗粒可以有效地将完整GPCR的疏水性调节剂递送至内体腔中，在那里它们能够与内吞受体有效地相互作用。

对本发明的聚合物纳米颗粒的体外评估表明，施用空纳米颗粒既不会干扰也不会触发i[Ca

在一个方面，本发明提供了一种水性液体，其包含组装为形成核/壳结构的共聚物链的聚合物纳米颗粒，该共聚物链具有：

(i)形成该纳米颗粒的核的酸响应型疏水性聚合物嵌段；以及

(ii)形成该纳米颗粒的壳并被该水性液体溶剂化的亲水性聚合物嵌段，

其中，该纳米颗粒在其核内包含内体GPCR信号传导的疏水性调节剂或其药学上可接受的盐。

在一个实施方案中，本文所公开的聚合物纳米颗粒为胶束。

在另一个方面，本发明提供了一种调节有此需要的受试者内体GPCR信号传导的方法，该方法包括向该受试者施用水性液体，该水性液体包含组装为形成核/壳结构的共聚物链的聚合物纳米颗粒，该共聚物链具有：

(i)形成该纳米颗粒的核的酸响应型疏水性聚合物嵌段；以及

(ii)形成该纳米颗粒的壳并被该水性液体溶剂化的亲水性聚合物嵌段，

其中，该纳米颗粒在其核内包含内体GPCR信号传导的疏水性调节剂或其药学上可接受的盐，

并且其中，该酸响应型疏水性聚合物嵌段在内体腔的酸性环境中经历转变，使组装的共聚物链分解，并将内体GPCR信号传导的疏水性调节剂或其药学上可接受的盐释放到内体中。

在一些实施方案中，该方法还包括使受试者施用有效量的内体GPCR信号传导的第二调节剂或其药学上可接受的盐。内体GPCR信号传导的第二调节剂可如本文任何其他地方所述。

提及“水性液体”或“水性环境”应理解为是指包含至少50重量％水的液体介质。因此，水性液体介质可包含一种或多种其他混溶性共溶剂。在一些实施方案中，液体介质将主要包含水，例如至少约70重量％，或至少约80重量％，或至少约90重量％，或至少约95重量％的水。在本发明的一些实施方案中，可能期望该液体介质基本上由水和/或重水组成。“水性液体”或“水性环境”将包括例如，本文所定义的药物组合物，以及生理环境，包括但不限于细胞外和细胞内环境以及内体腔内环境。

为了避免任何疑问，本文中提及水性液体或水性环境并不旨在排除该介质中其他组分的存在。水性液体包含聚合物纳米颗粒(例如，聚合物胶束纳米颗粒)，并且还可包含一种或多种可例如调节pH的添加剂。因此，基本上由水组成的液体介质可包含一种或多种可溶或不可溶的非液体添加剂。

现已表明，本文所公开的聚合物纳米颗粒可通过网格蛋白依赖性和非依赖性内吞作用迅速内化于细胞中。内体中的细胞器pH受到严格调节，范围从早期内体中的弱酸性到晚期内体/溶酶体中的强酸性。可以通过许多因素来调节pH值，例如质子泄漏、CIC氯离子通道或Na,K-ATPases。然而，它主要由液泡ATPase的活性决定，液泡ATPase的功能是将质子从细胞质泵送到内体腔中(Kane,P.M.,Microbiol.《微生物学与分子生物学综述》(Microbiol.Mol.Biol.Rev.)2006,70,177-91)。

与常规纳米颗粒不同，根据本发明使用的聚合物纳米颗粒由共聚物链的组装形成，该共聚物链具有酸响应型聚合物嵌段(该酸响应型聚合物嵌段在生理或碱性pH下是疏水性的，并形成纳米颗粒的核)，以及被水性液体溶剂化的亲水性聚合物嵌段。本领域技术人员应当理解，(a)被液体介质溶剂化的亲水性聚合物嵌段表示纳米颗粒的“壳”或“电晕”，以及(b)形成纳米颗粒的核的酸响应型疏水性聚合物嵌段在生理或碱性pH下，很难被水性液体溶剂化。本领域技术人员还应当理解，该酸响应型聚合物是在酸性环境中经历物理变化或转变的聚合物。

如将在下文中更详细地讨论的，共聚物链的酸响应型疏水性聚合物嵌段不仅形成了纳米颗粒的核，还提供了促进纳米颗粒分解的手段。该酸响应型疏水性聚合物嵌段通过在酸性环境中经历转变而提供了用于分解的手段。

应当理解，提及在内体腔的酸性环境中“经历转变”的酸响应型疏水性聚合物嵌段是指在内体腔的酸性环境中经历亲水性转变，导致聚合物核溶剂化、共聚物链离解，以及内体GPCR的疏水性调节剂或其药学上可接受的盐释放到内体内的酸响应型聚合物嵌段。

例如，普遍认为，本发明的纳米颗粒的疏水性核中包含的酸响应型官能团在内体腔的酸性环境中被质子化，导致酸响应型聚合物嵌段发生亲水性转变，导致核被溶剂化，以及共聚物链解离，进而将内体GPCR的疏水性调节剂释放到内体腔中。

应当理解，本文所述的“酸性环境”是指pH低于生理pH或pH7.4的水性环境。因此，应当理解，术语“酸性环境”表示强酸性环境，以及弱酸性环境。合适的pH范围将在约pH1至pH7.3的范围内。在一个实施方案中，pH范围将在约pH2至约pH7的范围内。在另一个实施方案中，pH将在约pH3至约pH7、约pH4至约pH7，或约pH5至约pH7的范围内。优选地，pH将在约pH5.5至约pH7的范围内。更优选地，pH将在约pH5.9至约pH6.5的范围内(例如，约pH6.1)。

在一个实施方案中，本文所公开的聚合物纳米颗粒为胶束。术语“胶束”在本领域中是众所周知的，用于定义分散在液体介质中的两亲性分子的组装体或聚集体。水性液体介质中的常规胶束由组装的分子组成(该分子具有显示亲水性特性的部分或区域)，并被周围的水性液体介质溶剂化，从而隔离该分子的疏水性部分或区域，形成胶束的中心或核。这种胶束通常称为“正相胶束”或“水包油胶束”。

胶束的形状通常为球形或椭球形，但也可以包括圆柱形状和双层形状。给定胶束的形状和大小通常由形成胶束的两亲性分子的性质以及液体介质的性质决定，例如两亲性分子的浓度、温度、pH和离子强度。形成胶束的过程通常称为胶束化。所组装的两亲性分子也可称为“胶束”组装的两亲性分子。

在一些实施方案中，根据本发明使用的纳米颗粒直径为1nm至1000nm。在一个实施方案中，根据本发明使用的纳米颗粒直径为5nm至200nm。在一个实施方案中，根据本发明使用的纳米颗粒直径为5nm至150nm。在一个实施方案中，根据本发明使用的纳米颗粒的直径为15至120nm(例如，15至100nm、20至90nm、25至80nm、25至70nm、25至60nm、25至50nm或25至45nm)。

根据本发明使用的纳米颗粒是组装的共聚物链的纳米颗粒。换言之，该纳米颗粒由共聚物链形成。该共聚物链包含形成该纳米颗粒的核的酸响应型聚合物嵌段，和被液体介质溶剂化的聚合物嵌段。因此，本领域技术人员应当理解，该共聚物链表现出两亲特性。可以参考图1A进一步描述根据本发明使用的纳米颗粒。因此，共聚物链可以被描述为A-B二嵌段共聚物，其中一个嵌段由酸响应型疏水性聚合物嵌段表示，而另一个嵌段由能够被水性液体溶剂化的亲水性聚合物表示。组装共聚物链形成纳米颗粒，其中该酸响应型疏水性聚合物嵌段形成纳米颗粒的核，而被液体介质溶剂化的亲水性聚合物嵌段形成壳或电晕。

尽管图1A所示和本文所述的共聚物链是A-B二嵌段共聚物，但是根据本发明使用的共聚物链并不限于这种结构。特别地，只要该共聚物链能够形成聚合物纳米颗粒，并且包含(a)形成纳米颗粒的核的酸响应型疏水性聚合物嵌段，和(b)在生理或碱性pH下被液体介质溶剂化的亲水性聚合物嵌段，则对该共聚物的组成或结构没有特别的限制。

作为实例，该共聚物链可具有A-B-A三嵌段共聚物结构，其中A嵌段(可以相同或不同)表示能够被液体介质溶剂化的亲水性聚合物，而B嵌段表示形成纳米颗粒的核的酸响应型疏水性聚合物。

该共聚物链可以是直链或支链的。

该共聚物链可包含一种或多种酸响应型疏水性聚合物嵌段，以及在生理或碱性pH下被液体介质溶剂化的一种或多种亲水性聚合物嵌段。每个聚合物嵌段均可独立地为直链或支链的。每个聚合物嵌段均可独立地为均聚物或共聚物。

根据本发明使用的共聚物链的总数均分子量通常为约600至约130000。在一些实施方案中，根据本发明使用的共聚物链的总数均分子量为约1000至约100000。在某些实施方案中，根据本发明使用的共聚物链的总数均分子量为约5000至约75000。在某些实施方案中，根据本发明使用的共聚物链的总数均分子量为约10000至约50000。

与此相关，被液体介质溶剂化的聚合物嵌段的数均分子量通常在约100至约50000的范围内(例如，约500至约50000、约1000至约40000、约2000至约30000、约5000至约30000)，并且形成纳米颗粒的核的刺激响应型聚合物嵌段的数均分子量通常在约500到约80000的范围内(例如，1000至约70000、2000至约60000、3000至约50000、5000至约40000、5000至约30000、10000至约30000)。

本文提及的数均分子量旨在表示通过凝胶渗透色谱法(GPC)测定的数均分子量。

酸响应型聚合物嵌段(例如，酸响应型疏水性聚合物嵌段)可以衍生自包含官能团的烯键式不饱和单体，所述官能团例如是胺基团，包括伯、仲和叔烷基胺、含氮杂环基(例如，吗啉基、吡咯烷基、哌嗪基和哌啶基)、吡啶，以及其他在内体腔的酸性环境中被质子化的含氮杂芳基(例如，咪唑)。酸响应型聚合物嵌段可由烯键式不饱和单体制备，例如，N-乙烯基甲酰胺、N-乙烯基乙酰胺、丙烯酰胺和甲基丙烯酰胺、N-甲基丙烯酰胺、N,N-二甲基丙烯酰胺、二甲基氨基乙基或氨基乙基。酸响应型聚合物也可以由氨基酸(例如，聚赖氨酸)制备成多肽，或者衍生自诸如蛋白质(例如，溶菌酶、白蛋白、酪蛋白)的天然存在聚合物或诸如DNA的核酸。

在一个实施方案中，酸响应型聚合物嵌段可以衍生自选自以下的烯键式不饱和单体：

在一个实施方案中，酸响应型聚合物嵌段可以衍生自选自以下的烯键式不饱和单体：

在一个实施方案中，酸响应型聚合物嵌段可以衍生自选自以下的烯键式不饱和单体：

在一个实施方案中，该酸响应型聚合物嵌段可以衍生自烯键式不饱和单体，其包含诸如与聚烯化氧甲基丙烯酸酯单体共聚的胺基团的官能团。不希望受到理论的束缚，普遍认为，一旦发生了聚合物纳米颗粒的解离，则包含官能团的单体与聚烯化氧甲基丙烯酸酯单体的共聚可有助于减少与质子化聚合物相关的任何细胞毒性。

只要共聚物链在水性液体中组装形成纳米颗粒，则对在生理或碱性pH下被水性液体溶剂化的聚合物嵌段的性质或组成没有特别的限制。该聚合物嵌段通常不是酸响应型聚合物嵌段。

该嵌段必须包含足够的聚合单体残基，这些残基赋予嵌段亲水性特性，并共同促进在水性液体中被溶剂化的能力。本领域技术人员应当意识到可以为聚合物链提供亲水性特性的烯键式不饱和单体。此类烯键式不饱和单体包括但不限于，丙烯酸、甲基丙烯酸、甲基丙烯酸羟乙酯、甲基丙烯酸羟丙酯、丙烯酸羟乙酯或其共聚物。

只要该共聚物链可以形成如本文所述起作用的纳米颗粒，则该共聚物链的每个嵌段均可包含衍生自一系列烯键式不饱和单体的聚合单体残基。

用于形成聚合物链的常见的烯键式不饱和单体包括可以通过自由基聚合方法聚合的那些。这些单体应能够与其他单体聚合。确定各种单体的可共聚性的因素在本领域中有充分的文献记载，例如，参见：Greenlee,R.Z.，《聚合物手册》第3版(Brandup,J.和Immergut.E.H.编辑)Wiley：纽约，1989p II/53。

此类烯键式不饱和单体的实例包括式(I)所示的那些：

其中，U和W独立地选自-CO

V选自氢、R

U和V与各自连接的碳一起形成杂环，该杂环包括5至8个环原子，其中，1至3个环原子是各自独立地选自N、N(H)、O、S的杂原子，其中，该杂环任选地被选自C

每个R

每个R

R

在一个实施方案中，R

在一些实施方案中，R

聚合物链的实例包括选自聚环氧烷(polyalkylene oxide)、聚亚芳基醚和聚亚烷基醚的那些。

式(I)所示的单体的实例包括马来酸酐、N-烷基马来酰亚胺、N-芳基马来酰亚胺、富马酸二烷基酯和可环化聚合的单体、丙烯酸酯和甲基丙烯酸酯、丙烯酸和甲基丙烯酸、苯乙烯、丙烯酰胺、甲基丙烯酰胺以及甲基丙烯腈、这些单体的混合物，以及这些单体与其他单体的混合物。

式(I)所示单体的其他实例包括：甲基丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸乙酯、甲基丙烯酸丙酯(所有异构体)、甲基丙烯酸丁酯(所有异构体)、甲基丙烯酸-2-乙基己酯、甲基丙烯酸异冰片酯、甲基丙烯酸苄基酯、甲基丙烯酸苯酯、甲基丙烯腈、α-甲基苯乙烯、丙烯酸甲酯、丙烯酸乙酯、丙烯酸丙酯(所有异构体)、丙烯酸丁酯(所有异构体)、丙烯酸-2-乙基己酯、丙烯酸异冰片酯、丙烯酸苄酯、丙烯酸苯酯、丙烯腈、苯乙烯、官能甲基丙烯酸酯、选自甲基丙烯酸缩水甘油酯的丙烯酸酯和苯乙烯、甲基丙烯酸-2-羟乙酯、甲基丙烯酸羟丙酯(所有异构体)、甲基丙烯酸羟丁酯(所有异构体)、甲基丙烯酸N,N-二甲氨基乙酯、甲基丙烯酸二乙氨基乙酯、甲基丙烯酸三乙二醇酯、衣康酸酐、丙烯酸甘油醚酯、丙烯酸-2-羟乙酯、丙烯酸羟丙酯(所有异构体)、丙烯酸羟丁酯(所有异构体)、丙烯酸-N,N-二甲胺基乙酯、丙烯酸N,N-二乙基氨基乙酯、丙烯酸三乙二醇酯、甲基丙烯酰胺、N-甲基丙烯酰胺、N,N-二甲基丙烯酰胺、N-叔丁基异丁烯酰胺、N-正丁基甲基丙烯酰胺、N-羟甲基甲基丙烯酰胺、N-羟乙基甲基丙烯酰胺、N-叔丁基丙烯酰胺、N-N-丁基丙烯酰胺、N-羟甲基丙烯酰胺、N-羟乙基丙烯酰胺、二乙基氨基苯乙烯(所有异构体)、二乙基氨基α-甲基苯乙烯(所有异构体)、对苯乙烯磺酸、对苯乙烯磺酸钠盐、三甲氧基甲硅基甲基丙烯酸丙酯、三甲氧基甲硅基甲基丙烯酸丙酯、三丁氧基甲硅基甲基丙烯酸丙酯、二甲氧基甲基甲硅基甲基丙烯酸丙酯、二乙氧基甲基甲硅基甲基丙烯酸丙酯、二丁氧基甲基甲硅基甲基丙烯酸丙酯、二异丙氧基甲基甲硅基甲基丙烯酸丙酯、二甲氧基硅基甲基丙烯酸丙酯、二乙氧基硅基甲基丙烯酸丙酯、二丁氧基硅基甲基丙烯酸丙酯、二异丙氧基硅基甲基丙烯酸丙酯、三甲氧基硅基丙烯酸丙酯、三乙氧基硅基丙烯酸丙酯、三丁氧基硅基丙烯酸丙酯、二甲氧基甲硅基丙烯酸丙酯、二乙氧基甲硅基丙烯酸丙酯、二丁氧基甲硅基丙烯酸丙酯、二异丙氧基甲硅基丙烯酸丙酯、二甲氧基硅基丙烯酸丙酯、二乙氧基硅基丙烯酸丙酯、二丁氧基硅基丙烯酸丙酯、二异丙氧基硅基丙烯酸丙酯、乙酸乙烯酯、丁酸乙烯酯、苯甲酸乙烯酯、氯乙烯、氟乙烯、溴乙烯、马来酸酐、N-苯基马来酰亚胺、N-丁基马来酰亚胺、N-乙烯基吡咯烷酮、N-乙烯基咔唑、丁二烯、乙烯和氯丁二烯。此列表并非详尽。

在一些实施方案中，共聚物链的每个嵌段均可包含衍生自式(I-a)所示的烯键式不饱和单体的聚合单体残基：

其中，U

V

U

并且

R

在式(I-a)的某些实施方案中，U

在前述的某些实施方案中，U

在前述的某些实施方案(当U

在式(I-a)的某些实施方案中，V

在前述的某些实施方案中(当V

在一些实施方案中，式(I-a)所示的烯键式不饱和单体为式(I-a0)所示的：

其中U

V

R

(i)由一个或多个N(C

(ii)由包含4至10个环原子的杂环基取代的C

(iii)由包含5至10个环原子的杂芳基取代的C

(iv)包含4至10个环原子的杂环基，其中1至3个环原子为杂原子，各自均独立地选自由N、N(H)、N(C

R

(i)任选取代的C

(ii)包含5至10个环原子的杂芳基，其中1至4个环原子为杂原子，各自均独立地选自由N、N(H)、N(C

(iii)任选取代的C

在式(I-a0)的一些实施方案中，U

在式(I-a0)的某些实施方案中，V

在式(I-a0)的某些实施方案中，R

在式(I-a0)的某些实施方案中，R

在式(I-a0)的某些实施方案中，R

在式(I-a0)的某些实施方案中，R

在式(I-a0)的某些实施方案中，U

在式(I-a0)的某些实施方案中，U

在式(I-a0)的某些实施方案中，U

在式(I-a0)的某些实施方案中，U

在式(I-a0)的某些实施方案中，U

在式(I-a0)的某些实施方案中，U

在式(I-a0)的某些实施方案中，U

在式(I-a0)的某些实施方案中，U

在式(I-a0)的一些实施方案中，U

式(I-a)或(I-a0)所示的烯键式不饱和单体的非限制性实例包括：

式(I-a)或(I-a0)所示的烯键式不饱和单体的非限制性实例包括：

式(I-a)或(I-a0)所示的烯键式不饱和单体的其他非限制性实例包括：

在一些实施方案中，式(I-a)所示的烯键式不饱和单体为式(I-a1)所示的：

其中U

V

R

R

在式(I-a1)的某些实施方案中，R

在式(I-a1)的某些实施方案中，R

在式(I-a1)的某些实施方案中，R

作为前述实施方案的非限制性实例，式(I-a1)所示的单体可具有下式：

在一些实施方案中，式(I-a)所示的烯键式不饱和单体为式(I-a2)所示的：

其中U

V

R

R

在式(I-a2)的某些实施方案中，R

在式(I-a2)的某些实施方案中，R

在式(I-a2)的某些实施方案中，R

作为前述实施方案的非限制性实例，式(I-a2)所示的单体可具有下式：

在一些实施方案中，式(I-a)所示的烯键式不饱和单体为式(I-a3)所示的：

其中U

V

R

R

在式(I-a3)的某些实施方案中，R

在式(I-a3)的某些实施方案中，R

在式(I-a3)的某些实施方案中，R

作为前述实施方案的非限制性实例，式(I-a1)所示的单体可具有下式：

在一些实施方案中，式(I-a)所示的烯键式不饱和单体为式(I-a4)所述的：

其中U

V

R

R

在式(I-a4)的某些实施方案中，R

在式(I-a4)的某些实施方案中，R

在式(I-a4)的某些实施方案中，R

作为前述实施方案的非限制性实例，式(I-a4)所示的单体可具有下式：

在一些实施方案中，式(I-a)所示的烯键式不饱和单体为式(I-a5)所示的：

其中，U

作为前述实施方案的非限制性实例，式(I-a5)所示的单体可具有下式：

在一些实施方案中，该共聚物链的亲水性嵌段包含衍生自式(I-a3)所示单体的聚合单体残基。

在一些实施方案中，该共聚物链的亲水性嵌段包含衍生自式(I-a4)所示单体的聚合单体残基。

在某些实施方案中，该共聚物链的亲水性嵌段包含衍生自式(I-a3)所示单体的聚合单体残基，以及衍生自式(I-a4)所示单体的聚合单体残基。

在一些实施方案中，该共聚物链的疏水性嵌段包含衍生自式(I-a0)所示单体的聚合单体残基。

在一些实施方案中，该共聚物链的疏水性嵌段包含衍生自式(I-a1)所示单体的聚合单体残基。

在一些实施方案中，该共聚物链的疏水性嵌段包含衍生自式(I-a2)所示单体的聚合单体残基。

在某些实施方案中，该共聚物链的疏水性嵌段包含衍生自式(I-a1)所示单体的聚合单体残基，以及衍生自式(I-a2)所示单体的聚合单体残基。

在一些实施方案中，该共聚物链包含衍生自式(I-a1)所示单体的聚合单体残基；以及衍生自式(I-a3)所示单体的聚合单体残基。

在一些实施方案中，该共聚物链包含：

1)亲水性嵌段，其包含衍生自式(I-a3)所示单体的聚合单体残基，以及衍生自式(I-a4)所示单体的聚合单体残基；以及

2)疏水性嵌段，其包含衍生自式(I-a1)所示单体的聚合单体残基，以及衍生自式(I-a2)所述单体的聚合单体残基。

根据本发明使用的共聚物链可以通过本领域技术人员已知的任何合适的方法来制备。例如，可以通过本领域技术人员熟知的自由基、配位或离子聚合技术，通过聚合烯键式不饱和单体(例如本文所述的那些)来制备共聚物链。

用于制备共聚物链的聚合技术可以是活性或非活性的。

活性聚合在本领域中通常被认为是链式聚合的一种形式，其中基本上不存在不可逆的链终止。活性聚合的一个重要特征是，在提供单体和支持聚合的反应条件的同时，聚合物链将继续增长。通过活性聚合制备的聚合物链可有利地表现出良好定义的分子结构、预定分子量以及窄分子量分布或低多分散性。

活性聚合的实例包括离子聚合和可控自由基聚合(CRP)。CRP的实例包括但不限于，引发转移终止剂聚合(iniferter polymerisation)、稳定自由基介导聚合(SFRP)、原子转移自由基聚合(ATRP)和可逆-加成断裂链转移(RAFT)聚合。

设想可以使用活性聚合技术来制备本文所述的纳米颗粒的共聚物链。用于进行活性聚合以制备共聚物的设备、条件和试剂是本领域技术人员众所周知的，并将在下文中进行更详细地讨论。

当一种或多种烯键式不饱和单体要通过活性聚合技术进行聚合时，通常将必须包含一种或多种活性聚合剂作为一种或多种反应物。“活性聚合剂”是指可以参与和控制或介导一种或多种烯键式不饱和单体的活性聚合，从而形成活性聚合物链(即，已根据活性聚合技术形成的聚合物链)的化合物。

可以被包括作为根据本发明的一种或多种反应物的活性聚合剂包括但不限于，促进选自离子聚合和CRP的活性聚合技术的那些，例如引发转移终止聚合剂、SFRP剂、ATRP剂和RAFT聚合剂。

适用于本发明的RAFT剂包含硫代羰基硫基团(其为由-C(S)S-表示的二价部分)。RAFT剂的实例在Moad G.；Rizzardo,E；Thang S,H.《聚合物》(Polymer)2008,49,1079-1131中进行了描述(其全部内容通过引用并入本文)，并且包括黄原酸酯、双硫酯、二硫代碳酸酯、二硫代氨基甲酸酯和三硫代碳酸酯化合物。

聚合物纳米颗粒的核中包含的是内体GPCR信号传导的疏水性调节剂。如本文所使用的，术语“内体GPCR信号传导的调节剂”是指已经被内吞入内体的GPCR的激动剂和拮抗剂或抑制剂。内体GPCR信号传导的调节剂可以是任何形式，包括但不限于，有机分子、多肽序列、激素、蛋白质片段或任何这些的衍生物。

如本文所使用的，术语“内体GPCR信号传导”是指被激活的GPCR传导的信号，其已被内吞入内体，优选为早期内体。

在一个实施方案中，内体GPCR信号传导将是首先在质膜上转导并在受体被内吞入早期内体时得以维持的信号传导。

在另一个实施方案中，内体GPCR信号传导将是需要受体内吞和/或仅在内体膜上发生的信号传导，例如β-抑制蛋白介导的信号传导。普遍认为，βarrs在细胞表面与激动剂占据的G蛋白偶联受体激酶(GRK)—磷酸化的GPCR相互作用，并通过发动蛋白和网格蛋白依赖性内吞作用促进配体结合受体从细胞表面转移至早期内体中。最近发现，该途径可以介导第二内体GPCR信号传导，该信号传导与质膜上的G蛋白依赖性信号传导不同。普遍认为，该机制的重要性取决于GPCR与βarrs相互作用的亲和力，这种亲和力会因通过GRK的GPCR磷酸化程度而有所不同。“A类”GPCR(例如β

普遍认为，βarr诱导的MAPK信号传导的程度取决于受体对βarrs的亲和力，这依赖于受体结构以及七个哺乳动物GRK中的哪一个使受体磷酸化。因此，与α

在一个实施方案中，内体GPCR信号传导的调节剂是内体NK

在一些实施方案中，内体GPCR信号传导的调节剂或其药学上可接受的盐是内体NK

作为非限制性实例，内体GPCR信号传导的疏水性调节剂或其药学上可接受的盐选自由以下所构成的组：阿瑞匹坦、沃氟匹坦、L-733060，及其药学上可接受的盐。例如，内体GPCR信号传导的疏水性调节剂或其药学上可接受的盐是阿瑞匹坦或其药学上可接受的盐。

在一个实施方案中，本发明提供了一种用于治疗由内体NK

在另一个实施方案中，本发明提供了根据本发明的水性液体在制备用于治疗由内体NK

在又一个实施方案中，本发明提供了用于治疗由内体NK

在优选实施方案中，由内体NK

在一个实施方案中，由内体NK

在本发明的上下文中，术语“疼痛”包括慢性炎性疼痛(例如，与类风湿性关节炎、骨性关节炎、类风湿性脊椎炎、痛风性关节炎和幼年型关节炎相关的疼痛)；肌肉骨骼疼痛、下背部及颈部疼痛、扭伤及拉伤、神经性疼痛、交感神经维持性疼痛、肌炎、与癌症和纤维肌痛相关的疼痛、与偏头痛相关的疼痛、与丛集性和慢性每日头痛相关的疼痛、与流感或其他病毒感染(例如普通感冒和风湿热)相关的疼痛、与功能性肠道病症(例如，非溃疡消化不良、非心源性胸痛和肠易激综合征)相关的疼痛、与心肌缺血相关的疼痛、术后疼痛、头痛、牙痛、痛经、(头部或面部)神经痛、纤维肌痛综合征、复杂性区域疼痛综合征(CRPSⅠ型和II型)、神经性疼痛综合征(包括糖尿病神经病变、化疗所致神经性疼痛、坐骨神经痛、非特异性腰痛、多发性硬化疼痛、HIV相关神经病、带状疱疹后神经痛、三叉神经痛)，以及物理创伤、截肢术、癌症、毒素或慢性炎性病症引起的疼痛。在优选实施方案中，该疼痛是躯体痛或内脏痛。

在另一个实施方案中，由内体NK

在一些实施方案中，该方法或用途还包括使受试者施用有效量的内体GPCR信号传导的第二调节剂或其药学上可接受的盐。

在某些实施方案中，内体GPCR信号传导的第二调节剂或其药学上可接受的盐是内体CGRP和/或CLR信号传导的抑制剂，例如MK-3207、olcegepant或其药学上可接受的盐。

在一些实施方案中，内体GPCR信号传导的第二调节剂或其药学上可接受的盐包含在共聚物链的聚合物纳米颗粒的核内，

其中该共聚物链组装为形成核/壳结构，该共聚物链具有：

(i)形成该纳米颗粒的核的酸响应型疏水性聚合物嵌段；以及

(ii)形成该纳米颗粒的壳并被该水性液体溶剂化的亲水性聚合物嵌段。

在一些实施方案中，内体GPCR信号传导的疏水性调节剂或其药学上可接受的盐是内体CGRP和/或CLR信号传导的抑制剂或其药学上可接受的盐。

在这些实施方案的某些中，内体GPCR信号传导的疏水性调节剂或其药学上可接受的盐选自由以下所构成的组：BI 44370、MK-3207、olcegepant、ubrogepant、rimegepant、SB-268262、替卡格泮(telcagepant)，及其药学上可接受的盐。

作为非限制性实例，内体GPCR信号传导的疏水性调节剂或其药学上可接受的盐任选自由以下所构成的组：olcegepant、MK-3207，及其药学上可接受的盐。例如，内体GPCR信号传导的疏水性调节剂或其药学上可接受的盐是MK-3207或其药学上可接受的盐。

在另一个方面，本发明提供了一种用于治疗由内体CGRP受体信号传导(例如，CLR信号传导)介导的疾病或病症的方法，该方法包括向有此需要的受试者施用有效量的根据本发明的水性液体(例如，当内体GPCR受体信号传导调节剂(例如，CLR信号传导调节剂)是上述内体CGRP受体信号传导(例如，CLR信号传导)的调节剂(例如，抑制剂)时)。

在另一个实施方案中，本发明提供了根据本发明的水性液体在制备用于治疗由CGRP受体信号传导(例如，CLR内体信号传导)介导的疾病或病症的药物中的用途(例如，当内体GPCR信号传导调节剂是上述内体CGRP受体信号传导(例如，CLR信号传导)的调节剂(例如，抑制剂)时)。

在又一个实施方案中，本公开提供了用于治疗由内体CGRP受体信号传导(例如，CLR信号传导)介导的疾病或病症的根据本发明的水性液体，(例如，当内体GPCR信号传导调节剂是上述内体CGRP受体信号传导(例如，CLR信号传导)的调节剂(例如，抑制剂)时)。

在某些实施方案中，由内体CGRP受体信号传导(例如，CLR信号传导)介导的疾病或病症选自由以下所构成的组：偏头痛和与偏头痛相关的症状(包括疼痛、畏光、声音恐惧症、恶心呕吐)、感觉障碍、包括躯体痛和内脏痛的疼痛、与丛集性和慢性每日头痛相关的疼痛、呼吸道病症(包括COPD和哮喘)、胃肠道病症(包括炎性肠病、肠易激综合征、胃轻瘫和机能性消化不良)，以及慢性炎性病症(包括骨性关节炎和类风湿性关节炎)。

在某些实施方案中，由内体CGRP受体信号传导(例如，CLR信号传导)介导的疾病或病症是躯体痛或内脏痛。

在某些实施方案中，由内体CGRP受体信号传导(例如，CLR信号传导)介导的疾病或病症是慢性疾病或病症。

在某些实施方案中，该方法或用途还包括使受试者施用有效量的内体GPCR信号传导的第二调节剂或其药学上可接受的盐。

在某些实施方案中，内体GPCR信号传导的第二调节剂或其药学上可接受的盐是内体NK

在某些实施方案中，内体GPCR信号传导的第二调节剂或其药学上可接受的盐包含在共聚物链的聚合物纳米颗粒的核内，

其中，该共聚物链组装为形成核/壳结构，该共聚物链具有：

(i)形成该纳米颗粒的核的酸响应型疏水性聚合物嵌段；以及

(ii)形成该纳米颗粒的壳并被该水性液体溶剂化的亲水性聚合物嵌段。

在一些实施方案中，本文所公开的水性液体还包含内体GPCR信号传导的第二疏水性调节剂或其药学上可接受的盐，其中，内体GPCR信号传导的第二疏水性调节剂或其药学上可接受的盐包含在聚合物纳米颗粒的核内。

在某些实施方案中，内体GPCR信号传导的第二疏水性调节剂或其药学上可接受的盐是CGRP受体信号传导(例如，CLR信号传导)的抑制剂。

在某些实施方案中，内体GPCR信号传导的第二疏水性调节剂或其药学上可接受的盐选自由以下所构成的组：BI 44370、MK-3207、olcegepant、ubrogepant、rimegepant、SB-268262、替卡格泮(telcagepant)，及其药学上可接受的盐。

作为非限制性实例，内体GPCR信号传导的第二疏水性调节剂或其药学上可接受的盐任选自由以下所构成的组：olcegepant、MK-3207，及其药学上可接受的盐。例如，内体GPCR信号传导的第二疏水性调节剂或其药学上可接受的盐是MK-3207或其药学上可接受的盐。

在一些实施方案中，内体GPCR信号传导的第一疏水性调节剂或其药学上可接受的盐与内体GPCR信号传导的第二疏水性调节剂或其药学上可接受的盐的摩尔比为1:10至10:1。

在一些实施方案中，内体GPCR信号传导的第一疏水性调节剂或其药学上可接受的盐与内体GPCR信号传导的第二疏水性调节剂或其药学上可接受的盐的摩尔比为1:4至4:1(例如，1:2至2:1(例如，1:1))。

在某些实施方案中，内体GPCR信号传导的第一疏水性调节剂或其药学上可接受的盐是内体NK

作为非限制性实例，内体GPCR信号传导的第一疏水性调节剂或其药学上可接受的盐可以是阿瑞匹坦、沃氟匹坦、L-733060，或其药学上可接受的盐；并且内体GPCR信号传导的第二疏水性调节剂或其药学上可接受的盐可以是olcegepant、MK-3207，或其药学上可接受的盐。

因此，在另一个方面，本发明提供了一种水性液体，其包含组装为形成核/壳结构的共聚物链的聚合物纳米颗粒，该共聚物链具有：

(i)形成该纳米颗粒的核的酸响应型疏水性聚合物嵌段；以及

(ii)形成该纳米颗粒的壳并被该水性液体溶剂化的亲水性聚合物嵌段，其中，该纳米颗粒在其核内包含：

a)内体GPCR信号传导的第一疏水性调节剂或其药学上可接受的盐；以及

b)内体GPCR信号传导的第二疏水性调节剂或其药学上可接受的盐。

在这些实施方案的某些中，该水性液体可具有如本文任何地方所述的一个或多个特征。例如，

该酸响应型疏水性聚合物嵌段可包含在酸性环境(例如，在约pH＝6.1下)中质子化的叔胺官能团；

该酸响应型疏水性聚合物嵌段可包含甲基丙烯酸2-(二异丙基氨基)乙酯(DiPAEMA)的均聚物或共聚物；

该酸响应型疏水性聚合物嵌段可包含甲基丙烯酸2-(二异丙基氨基)乙酯(DiPAEMA)和聚烯化氧甲基丙烯酸酯(polyalkyleneoxide methacrylate)的共聚物；

该酸响应型疏水性聚合物嵌段可包含甲基丙烯酸2-(二异丙基氨基)乙酯(DiPAEMA)和二甘醇甲基丙烯酸酯(DEGMA)的共聚物；

该亲水性聚合物嵌段可包含聚(乙二醇)甲基丙烯酸酯(PEGMA)和甲基丙烯酸2(二甲氨基)乙酯(DMAEMA)的共聚物。并且/或者

该纳米颗粒直径可以为15至120nm(例如，15至100nm(例如，25至50nm))。

在某些实施方案中，内体GPCR信号传导的第一疏水性调节剂或其药学上可接受的盐是内体GPCR的抑制剂。

在某些实施方案中，内体GPCR信号传导的第一疏水性调节剂或其药学上可接受的盐是内体NK

在这些实施方案中的某些中，该内体GPCR信号传导的第一疏水性调节剂或其药学上可接受的盐选自由以下所构成的组：阿瑞匹坦、福沙吡坦、曲地匹坦、马罗匹坦、HTX-019、奈妥吡坦、司洛匹坦、奥维匹坦(orvepitant)、NAS-911B、ZD-6021、KD-018、DNK-333、NT-432、NK-949、NT-814、EU-C-001、维替匹坦、1144814、SCH-900978、AZD-2738、BL-1833、卡索匹坦、AV-810、KRP-103、424887、cizolirtine、沃氟匹坦、L-742694、辣椒平、GR-82334、MEN-11149、L-732138、NiK-004、TA-5538、CP-96345、拉奈匹坦(lanepitant)、LY-2590443、达匹坦、burapitant、贝非匹坦(befetupitant)、CJ-17493、AVE-5883、CGP-49823、CP-122721、CP-99994、SLV-317、TAK-637、L-733060、L-703,606、地洛培汀(dilopetine)、MPC-4505、L-742311、FK-888、WIN-64821、NIP-530、SLV-336、ezlopitant、TKA-457、figopitant、ZD-4794、CP-100263、GR-203040、L-709210、MEN-10930、MEN-11467、LY-306740、FK-355、WIN-67689、WIN-51708、FK-224、BL-1832、CAM-6108、CP-98984、WS-9326A、L-741671、L-737488、L-740141、L-760735、L-161664、YM-49244、Sch-60059、SDZ-NKT-343、S-18523、RPR-111905、S-19752、L-161644、LY-297911、RPR-107880、L-736281、anthrotainin、RP-73467、WIN-64745、WIN-68577、WIN-62577WIN-66306、RP-67580、CP-0364、L-743986、S-16474、CGP-47899、FR-113680、YM-44778、GR-138676、CGP-73400、CAM-2445、MDL-105172A、L-756867、异丁茶碱、R-673、SR-48968和SR-14033、GW679769、CP-0578，及其药学上可接受的盐。

作为非限制性实例，内体GPCR信号传导的第一疏水性调节剂或其药学上可接受的盐任选自由以下所构成的组：阿瑞匹坦、沃氟匹坦、L-733060，及其药学上可接受的盐。

在某些实施方案中，内体GPCR信号传导的第二疏水性调节剂或其药学上可接受的盐是CGRP和/或CLR信号传导的抑制剂。

在某些实施方案中，内体GPCR信号传导的第二疏水性调节剂或其药学上可接受的盐选自由以下所构成的组：BI 44370、MK-3207、olcegepant、ubrogepant、rimegepant、SB-268262、替卡格泮(telcagepant)，及其药学上可接受的盐。

作为非限制性实例，内体GPCR信号传导的第二疏水性调节剂或其药学上可接受的盐任选自由以下所构成的组：olcegepant、MK-3207，及其药学上可接受的盐。

在某些实施方案中，内体GPCR信号传导的第一疏水性调节剂或其药学上可接受的盐与内体GPCR信号传导的第二疏水性调节剂或其药学上可接受的盐的摩尔比为1:10至10:1。

在某些实施方案中，内体GPCR信号传导的第一疏水性调节剂或其药学上可接受的盐与内体GPCR信号传导的第二疏水性调节剂或其药学上可接受的盐的摩尔比为1:4至4:1(例如，1:2至2:1(例如，1:1))。

在某些实施方案中，内体GPCR信号传导的第一疏水性调节剂或其药学上可接受的盐是内体NK

作为非限制性实例，内体GPCR信号传导的第一疏水性调节剂或其药学上可接受的盐可以是阿瑞匹坦、沃氟匹坦、L-733060，或其药学上可接受的盐；并且，内体GPCR信号传导的第二疏水性调节剂或其药学上可接受的盐可以是olcegepant、MK-3207，或其药学上可接受的盐。

因此，在另一个方面，本发明提供了一种调节有此需要的受试者内体GPCR信号传导的方法，该方法包括使受试者施用有效量的根据本发明的水性液体，其中，该聚合物纳米颗粒的核包含上述内体GPCR信号传导的第一调节剂和内体GPCR信号转导的第二调节剂。

在另一个方面，本发明提供了一种调节有此需要的受试者内体GPCR信号传导的方法，该方法包括向该受试者施用水性液体，该水性液体包含组装为形成核/壳结构的共聚物链的聚合物纳米颗粒，该共聚物链具有：

(i)形成该纳米颗粒的核的酸响应型疏水性聚合物嵌段；以及

(ii)形成该纳米颗粒的壳并被该水性液体溶剂化的亲水性聚合物嵌段，

其中，该纳米颗粒在其核内包含：

a)内体GPCR信号传导的第一疏水性调节剂或其药学上可接受的盐；以及

b)内体GPCR信号传导的第二疏水性调节剂或其药学上可接受的盐；

并且其中，该酸响应型聚合物嵌段在内体腔的酸性环境中经历转变，使组装的共聚物链分解，并将内体GPCR信号传导的疏水性调节剂或其药学上可接受的盐释放到内体中。

在另一个方面，本发明提供了一种用于治疗由内体GPCR信号传导介导的疾病或病症的方法，其中，该疾病或病症是由CGRP受体信号传导(例如，CLR信号传导)和/或NK

在一些实施方案中，该疾病或病症是由内体CGRP受体信号传导(例如，CLR信号传导)介导的疾病或病症，例如，偏头痛和与偏头痛相关的症状(包括疼痛、畏光、声音恐惧症、恶心和呕吐)、感觉障碍、包括躯体痛和内脏痛的疼痛、与丛集性和慢性每日头痛相关的疼痛、呼吸道病症(包括COPD和哮喘)、胃肠道病症(包括炎性肠病、肠易激综合征、胃轻瘫和机能性消化不良)，或慢性炎性病症(包括骨性关节炎和类风湿性关节炎)。

在一些实施方案中，该疾病或病症是由内体NK

在某些实施方案中，该疾病或病症为躯体痛或内脏痛。

在某些实施方案中，该疾病或病症为慢性疾病或病症。

在另一个方面，本发明提供了一种调节有此需要的受试者内体GPCR信号传导的方法，该方法包括向该受试者施用有效量的：

1)第一水性液体或其药物组合物，其中，该第一水性液体如本文任何地方所述在聚合物纳米颗粒的核内包含NK

2)第二水性液体或其药物组合物，其中，该第二水性液体如本文任何地方所述在聚合物纳米颗粒的核内包含CGRP受体(例如，CLR)抑制剂。

在另一个方面，本发明提供了一种用于治疗由内体GPCR信号传导介导的疾病或病症的方法，该方法包括向该受试者施用有效量的：

1)第一水性液体或其药物组合物，其中，该第一水性液体如本文任何地方所述在聚合物纳米颗粒的核内包含NK

2)第二水性液体或其药物组合物，其中，该第二水性液体如本文任何地方所述在聚合物纳米颗粒的核内包含CGRP受体(例如，CLR)抑制剂。

在某些实施方案中，NK

在某些实施方案中，由内体GPCR信号传导介导的疾病或病症如本文中任何地方所述。

在本文所述的某些前述实施方案中，该抑制剂是拮抗剂。

当内体GPCR的疏水性调节剂包含可以被质子化或去质子化(例如在生理pH下)的一个或多个官能团时，可以制备调节剂，并且/或者可以将调节剂分离为药学上可接受的盐。应当理解，在给定pH下，该调节剂可以是两性离子的。如本文所使用的，表述“药学上可接受的盐”是指给定化合物的盐，其中该盐适合作为药物施用。此类盐可以例如通过使酸或碱分别与胺或羧酸基团发生反应而形成。

可以用无机酸和有机酸制备药学上可接受的酸加成盐。无机酸的实例包括盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等。有机酸的实例包括乙酸、丙酸、乙醇酸、丙酮酸、草酸、苹果酸、丙二酸、琥珀酸、马来酸、富马酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、肉桂酸、扁桃酸、甲磺酸、乙磺酸、对甲苯磺酸、水杨酸等。

可以用无机碱和有机碱制备药学上可接受的碱加成盐。衍生自无机碱的相应反离子包括钠、钾、锂、铵、钙和镁盐。有机碱包括伯胺、仲胺和叔胺、取代胺(包括天然存在的取代胺)，以及环胺，包括异丙胺、三甲胺、二乙胺、三乙胺、三丙胺、乙醇胺、2-二甲基乙醇胺、氨丁三醇、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、咖啡因、普鲁卡因、海巴明哈胺青霉素(hydrabamine)、胆碱、甜菜碱、乙二胺、葡萄糖胺、N-烷基葡糖胺、可可碱、嘌呤、哌嗪、哌啶和N-乙基哌啶。

本发明还提供了一种药物组合物，其包含治疗有效量的根据本发明的水性液体，以及至少一种药学上可接受的载体或稀释剂。

尽管根据本发明的包含含有内体GPCR信号传导的疏水性调节剂或其药学上可接受的盐的聚合物纳米颗粒的水性液体可能是使受试者施用的唯一活性成分，但其他活性成分与内体GPCR信号转导的疏水性调节剂一起使用也在本发明的范围内。在一个或多个实施方案中，设想将内体GPCR信号传导的两种或更多种调节剂组合施用于受试者。设想还可以将调节剂与一种或多种其他治疗剂组合施用。该组合可允许将上文所述的内体GPCR信号传导的疏水性调节剂与其他活性成分分开、依次或同时施用。可以以药物组合物的形式提供该组合。

如本文所使用的，术语“组合”是指上述组合搭配物可以依赖地或独立地给药，或者通过使用与不同量的组合搭配物的不同固定组合而进行给药(即，同时或在不同时间点给药)的组合物或试剂盒。之后可以同时施用或依次施用组合搭配物，对于试剂盒的任何部分，在不同的时间点，以相同或不同的时间间隔施用。待在组合中施用的组合搭配物的总量的比可以是不同的，例如为了应对待治疗的患者亚群的需要或单个患者的需要，其中这些不同的需要可能是由于患者的年龄、性别、体重等而引起的。

如本领域技术人员容易理解的，施用途径和药学上可接受的载体的性质将取决于病症的性质和待治疗的哺乳动物。普遍认为，本领域技术人员可以轻易地确定特定载体或递送系统以及施用途径的选择。在制备包含根据本发明的水性液体的任何制剂时，应注意确保内体GPCR信号传导的疏水性调节剂的活性在该过程中不被破坏，并确保该调节剂能够在不被损坏的情况下到达其作用位点。同样，选择的施用途径应使化合物达到其作用位点。

本领域技术人员可以使用常规的方法轻易地确定用于本发明水性液体的合适制剂。优选的pH范围和合适的药学上可接受的赋形剂(例如，抗氧化剂)的确定是本领域常规的。缓冲液系统通常用于提供所需范围的pH值，并且包括羧酸缓冲液，例如乙酸盐、柠檬酸盐、乳酸盐和琥珀酸盐。对此类制剂可施用多种抗氧化剂，包括诸如BHT或维生素E的酚类化合物、诸如蛋氨酸或亚硫酸盐的还原剂，以及诸如EDTA的金属螯合剂。

设想根据本发明的水性液体将制备为肠胃外剂型，包括适合于静脉内、鞘内和脑内或硬膜外递送的那些。适用于注射用途的药物形式包括无菌注射溶液或分散液，以及用于无菌注射溶液的一次性制品的无菌粉末。它们在生产和储存条件下应该是稳定的，并且可以进行保存以防还原或氧化以及诸如细菌或真菌之类的微生物的污染。

用于注射溶液或分散液的溶剂或分散介质可包含用于活性化合物的任何常规溶剂或载体体系，并且可包含例如水、乙醇、多元醇(例如，丙三醇、丙二醇和液体聚乙二醇等)、其合适的混合物，以及植物油。可以例如通过使用诸如卵磷脂的包衣、在分散液的情况下通过维持所需的粒径，以及通过使用表面活性剂来维持适当的流动性。必要时可以通过加入各种抗菌剂和抗真菌剂来预防微生物的作用，例如，对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等。在许多情况下，优选包括调节渗透压的试剂，例如糖或氯化钠。优选地，用于注射的制剂将与血液等渗。通过在组合物中使用延迟吸收的试剂(例如，单硬脂酸铝和明胶)，可以使注射组合物的吸收延长。适合用于注射用途的药物形式可以通过任何适当的途径递送，包括静脉内、肌内、脑内、鞘内、硬膜外注射或输注。

通过将所需量的本发明的水性液体根据需要在适当的溶剂中与各种其他成分(如上述枚举的那些所需要的)合并，然后进行过滤灭菌，来制备无菌注射溶液。一般情况下，通过将各种无菌活性成分掺入含有基本分散介质和上述例举的其他所需成分的无菌载体中，而制备分散剂。

药学上可接受的载体和/或稀释剂包括任何和所有的溶剂、分散介质、抗细菌和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。此类介质和试剂用于药物活性物质的用途是本领域众所周知的。除非任何常规的介质或试剂与活性成分不相容，否则预期将用其在治疗组合物中。该组合物中也可掺入补充活性成分。

为了易于施用和剂量均匀，特别有利的是将组合物配制为单位剂型。如本文所使用的，单位剂型是指适合作为用于待治疗的哺乳动物受试者的单位剂量的物理离散单位；每个单位包含预定量的活性材料，经计算产生与所需的药学上可接受的载体相关联地所需治疗效果。本发明的新型单位剂型的规范由以下决定或取决于以下：(a)活性物质的独特特性和待实现的特定治疗效果，以及(b)本领域中对于复合用于治疗如本文详述的身体健康状况受损的活受试者体内疾病的活性物质存在的固有局限性。

如上所述，可以将主要活性成分复合，以便可以以治疗有效量与单位剂型的合适的药学上可接受的载体一起便利有效地进行施用。单位剂型可以例如包含量为0.25μg至约2000mg的主要活性化合物。以比例表示，该活性化合物存在的量可以为约0.25μg至约2000mg/mL载体。在包含补充活性成分的组合物的情况下，该剂量通过参考所述成分的常规剂量和施用方式来确定。

如本文所使用的，术语“有效量”是指化合物在根据期望给药方案施用时提供期望治疗活性的量。给药可进行一次，或以分钟或小时为间隔，或在这些时间段中的任何一个时间段连续给药。合适的剂量可在约0.1ng/kg体重/剂量至1g/kg体重/剂量的范围内。典型的剂量范围为1μg至1g/kg体重/剂量，例如在1mg至1g/kg体重/剂量的范围内。在一个实施方案中，该剂量可以在1mg至500mg/kg体重/剂量的范围内。在另一个实施方案中，该剂量可以在1mg至250mg/kg体重/剂量的范围内。在又一个实施方案中，该剂量可以在1mg至100mg/kg体重/剂量的范围内，例如高达50mg/kg体重/剂量。

本文所用的术语“治疗”包括对动物，优选哺乳动物，更优选人的病症或疾病的任何治疗。本文所用的术语“预防”包括对动物，优选哺乳动物，更优选人的病症或疾病的预防。

在本说明书和随后的权利要求书中，除非上下文另有要求，否则词语“包括”以及诸如“包含”或“含有”之类的变体应被理解为是指包括所述整数或整数组或步骤，而非排除任何其他整数或整数组。

本说明书中对任何在先出版物(或从中获得的信息)或任何已知事项的提及不是，也不应该被视为确认或承认或以任何形式表明该在先出版物(或从中获得的信息)或已知事事项形成本说明书所涉及领域中的公知常识的一部分。

现在将参考以下非限制性实施例对本发明进行描述：

实施例1：二嵌段共聚物的合成与表征

根据方案5/方案5B和以下概述的方法合成二嵌段共聚物。这些二嵌段共聚物含有相同的亲水性共聚物P(PEGMA-co-DMAEMA)，但含有不同的疏水性共聚物。使用P(DIPMA-co-DEGMA)使聚合物具有酸响应特性，而使用P(BMa)形成具有非酸响应特性的对照聚合物。在每次合成之前，使用碱性氧化铝对单体进行去抑制处理。

方案5：P(PEGMA-co-DMAEMA)-b-P(DIPMA-co-DEGMA)和P(PEGMA-co-DMAEMA)-b-P(BMA)二嵌段共聚物的序列聚合。A)利用(1)CPDB、(2)PEGMA和(3)DMAEMA形成(4)亲水性嵌段p(PEGMA-co-DMAEMA)，从而合成亲水性嵌段。B)通过扩链反应合成P(PEGMA-co-DMAEMA)-b-P(DIPMA-co-DEGMA)，其中，向(4)亲水性嵌段中加入(5)DIPMA和(6)DEGMA，形成(7)二嵌段P(PEGMA-co-DMAEMA)-b-P(DIPMA-co-DEGMA)；以及C)向(4)亲水性嵌段中加入(8)BMA，形成(9)P(PEGMA-co-DMAEMA)-b-P(BMA)。所用的引发剂是AIBN。

根据方案5B和以下概述的方法合成P(PEGMA-co-DMAEMA)-b-P(DIPMA-co-DEGMA-co-Cy5)二嵌段共聚物。

方案5B：P(PEGMA-co-DMAEMA)-b-P(DIPMA-co-DEGMA-co-Cy5)二嵌段共聚物的合成。利用(4)亲水性嵌段p(PEGMA-co-DMAEMA)、(5)DIPMA、(6)DEGMA和(10)VDM进行聚合，形成(11)。随后，将(11)与Cy5(12)偶联，形成(13)。

大分子链转移剂：P(PEGMA-co-DMAEMA)亲水性嵌段共聚物。将2-氰丙基-2-基苯并二硫(CPBD)用作RAFT剂、偶氮二异丁腈(AIBN)用作引发剂(比为2:0.2)，通过可逆-加成断裂链转移(RAFT)聚合，合成大分子链转移剂(Macro-CTA)。聚乙二醇甲基丙烯酸酯(数均分子量Mn约为500)(PEGMA)、甲基丙烯酸二甲氨基乙酯(DMAEMA，98％)、甲基丙烯酸二乙氨基乙酯(DEAEMA，99％)、2-(二异丙基氨基)乙基甲基丙烯酸酯(DIPAEMA，97％)、甲基丙烯酸丁酯(BMA，99％)和4,4-二甲基-2-乙烯基-2-恶唑啉-5-酮(VDM)均从Sigma Aldrich公司获得。

P(PEGMA-co-DMAEMA)亲水性嵌段共聚物

将2-氰丙基-2-基苯并二硫(CPBD)用作RAFT剂、偶氮二异丁腈(AIBN)用作引发剂(比为2:0.2)，通过可逆-加成断裂链(RAFT)聚合，合成大分子链转移剂(Macro-CTA)P(PEGMA-co-DMAEMA)。将PEGMA和DMAEMA(比为120:12)溶解在具有CPBD和AIBN的30mL甲苯中。通过用氮气鼓泡30分钟而使溶液脱氧。在70℃和400RPM下聚合21小时后，将反应物在冰浴中冷却至0℃，并暴露在空气中。采样溶液的等分试样，以通过

P(PEGMA-co-DMAEMA)-b-P(DIPMA-co-DEGMA)二嵌段共聚物。在AIBN的存在下，使用亲水性嵌段P(PEGMA-co-DMAEMA)和单体DIPMA及DEGMA(比为1:0.15:100:11)进行扩链反应。将混合物溶解在甲苯中，并且一旦脱氧，则使其在70℃、400RPM下反应17.5小时。如前所述对最终产物进行纯化。

P(PEGMA-co-DMAEMA)-b-P(BMA)二嵌段共聚物。在甲苯中存在AIBN的情况下，由亲水性P(PEGMA-co-DMAEMA)嵌段通过扩链反应而聚合BMA。[BMA]:[Macro-CTA]:[AIBN]的比为120:1:0.2。将溶液脱氧，并使小瓶中的内容物在70℃和400RPM下反应15小时。如前所述对最终产物进行纯化。

P(PEGMA-co-DMAEMA)-b-P(DIPMA-co-DEGMA-co-Cy5)二嵌段共聚物。

P(PEGMA-co-DMAEMA)的扩链反应是在甲苯中通过加入DIPMA、DEGMA和4,4-二甲基-2-乙烯基-2-恶唑啉-5-酮(VDM)，并在AIBN的存在下(四者之比为1:100:11:0.15)进行的。将混合物脱氧，并使其在70℃、400RPM下反应17.5小时。在第二个步骤中，通过将反应物与花菁5胺(Cyanine5 amine)混合来进行Cy5偶联。使该混合物在室温、400RPM下在黑暗条件下反应72小时，并如前所述对最终产物进行纯化。

凝胶渗透色谱法(GPC)。在装配有(RID-10A)示差折光检测器(λ＝633nM)和SPD-20A紫外检测器的岛津(Kyoto,Japan)液体色谱系统上进行GPC分析，以确定聚合物分子量，其中该检测器连接至在40℃下串联运行的一个孔径为5.0μm的保护柱(50x7.8mm)，接着是三个Shodex KF-850L柱(300x8mm，孔径：10μm，最大孔径：

质子核磁共振(

使用峰积分(I)通过

表1总结了所合成的共聚物和二嵌段共聚物的所得特征。由于GPC被校准为聚苯乙烯标准品，因此发现通过GPC测定的分子量低于通过

表1亲水性嵌段共聚物P(PEGMA-co-DMAEMA)和二嵌段共聚物P(PEGMA-co-DMAEMA)-b-P(DIPMA-co-DEGMA)和P(PEGMA-co-DMAEMA)-b-P(BMA-co-DEGMA)的特征

转化率和组成是通过

Mn是利用聚苯乙烯校准曲线，通过GPC测量的，通过

实施例2：根据本发明的聚合物纳米颗粒和对照纳米颗粒的自组装和特征。

纳米颗粒的自组装。将P(PEGMA-co-DMAEMA)-b-P(DIPMA-co-DEGMA)用作二嵌段共聚物以自组装根据本发明的酸响应型聚合物纳米颗粒，并用P(PEGMA-co-DMAEMA)-b-P(BMA)自组装不具有酸响应特性的对照纳米颗粒。

为了自组装负载有阿瑞匹坦(Ap)的聚合物纳米颗粒，将53.5μg Ap和5mg二嵌段共聚物的混合物溶解在0.5mL四氢呋喃(THF)中，而空纳米颗粒是在不添加Ap的情况下进行自组装的。然后在室温下使用Harvard apparatus注射泵(MA，USA)以1.2mL/h的流速在剧烈搅拌下将该混合物加入到4.5mL的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中。使用透析袋(MWCO 3500，Membrane Filtration Products，USA)在氮气流下，将负载有Ap的酸响应型聚合物纳米颗粒(DIPMA-Ap)和负载的非酸响应型纳米颗粒(BMA-Ap)的组装体相对PBS透析24小时。使用Slide-A-Lyzer小型透析装置MWCO 3.5K(Thermo Fisher Scientific，MA，USA)将不含Ap的酸响应型纳米颗粒(DIPMA-空和BMA-空)的组装体透析24小时。如关于不含AP的纳米颗粒的描述，组装纳米颗粒，用于活细胞成像。所用的二嵌段共聚物是P(PEGMA-co-DMAEMA)-b-P(DIPMA-co-DEGMA-co-Cy5)，其在疏水性部分上偶联Cy5，从而得到Cy5定位于核内的纳米颗粒(DIPMA-Cy5)。

以与上述相似的方式制备负载有MK-3207的P(PEGMA-co-DMAEMA)-b-P(BMA)聚合物纳米颗粒(DIMPA-(MK-3207)纳米颗粒)。

动态光散射。使用Zetasizer Nano ZS ZEN3600粒度分析仪(Malvern,UK)，通过动态光散射(DLS)确定纳米颗粒的尺寸分布。使用0.45μm尼龙过滤器过滤浓度为1mg/mL的DIPMA-Ap、DIPMA-空和BMA-Ap，并将其添加到聚苯乙烯比色皿中。在25℃下以173°反向散射角进行测量。

超高效液相色谱-串联质谱法(UPLC-MS)。使用耦合Waters Acquity UPLC液相色谱仪的Waters Micromass QUattro Premier三重四极杆质谱仪(MA,USA)，通过UPLC-MS测定负载在聚合物纳米颗粒的核内的Ap。将浓度为1mg/mL的冻干DIPMA-Ap和BMA-Ap溶解在DMSO:0.1％甲酸水溶液的5:2混合物中。通过将每种制剂的等分试样与内标溶液(地西泮，5μg/mL)以5:2的比例混合，并用稀释溶剂(50％乙腈和0.1％甲酸的1:1混合物)补足至500μL，来制备样品以进行分析。在Supelco Ascentis Express RP Amide色谱柱(50mm x2.1mm，粒径2.7μm)上进行色谱分离，该色谱柱装配有配有带Synergi Polar盒的Phenomenex Security GUard预柱，二者均保持柱温度为40℃。AP负载根据AP标准进行定量(0.016至20μM)。流动相由0.05％甲酸水溶液和乙腈组成，化合物在梯度条件下进行洗脱。在正电喷雾电离条件下进行质谱分析，并通过多反应监测来监测化合物的洗脱。

pH依赖性分解。尼罗红(Nr)是一种仅在非极性溶剂中发出荧光，从而可以确定纳米颗粒的分解pH值的溶剂化变色染料。具体地，通过观察由于从纳米颗粒的核中释放NR而引起的Nr荧光损失来鉴定分解pH。如前所述自组装纳米颗粒，并将Ap替换为每毫克聚合物0.5毫克尼罗红，并如前所述进行透析。负载有尼罗红的酸响应型聚合物纳米颗粒(DIPMA-Nr)和非酸响应型聚合物纳米颗粒(BMA-Nr)制备为浓度200μg/mL。制备pH范围为7.6至5.0的PBS溶液，并通过用FlexStation 3(Molecular Devices,CA,USA)测量尼罗红(Sigma-Aldrich,MO,USA)荧光(激发/发射552/636nm)来评估pH分解特性。

临界胶束浓度(CMC)。CMC由芘I

表2总结了使用P(PEGMA-co-DMAEMA)-b-P(DIPMA-co-DEGMA)自组装的酸响应型纳米颗粒以及使用P(PEGMA-co-DMAEMA)-b-P(BMA)自组装的对照纳米颗粒的特征，DIPMA和BMA纳米颗粒在疏水性NK

表2使用二嵌段共聚物P(PEGMA-co-DMAEMA)-b-P(DIPMA-co-DEGMA)和P(PEGMA-co-DMAEMA)-b-P(BMA-co-DEGMA)自组装的酸响应型纳米颗粒和对照纳米颗粒的特征

N/A：无适用。Mean±SD

实施例3：DIPMA纳米颗粒内化到SP NK

在40分钟时，将用GFP标记的r NK

实施例4：核ERK信号传导的特征。

SP浓度响应曲线示出了随时间增加的快速核ERK激活。有趣的是，SP 10nM示出了信号快速增加，然后逐渐减小(图5A)。曲线下面积(AUC)示出在实验期间(65分钟)计算时SP的EC

实施例5：通过酸响应型聚合物纳米颗粒调节NK

用DIPMA-空和BMA-空纳米颗粒测定HEK-293和HEK-hNK

通过在添加媒介物之前，将HEK-hNK

使用alamar Blue检测细胞活力，从而评估活细胞将活性化合物Rezasurin还原为resofurin的能力，这可以通过荧光检测到。与纳米颗粒(1、3、10、30和100μg/mL)一起孵育24小时(图7C)和48小时(图7D)后，细胞还原Rezasurin的能力并未显示出任何显著的降低。

实施例6：负载有阿瑞匹坦的聚合物纳米颗粒对核ERK活性的影响。

在SP刺激和NK

实施例7：纳米颗粒对运动模式的影响。

通过转杆试验来评估纳米颗粒对动物运动能力的影响。在检查的任何时间点，治疗组的跌倒潜伏期与媒介物组相比并没有显著差异，这表明鞘内施用纳米颗粒不会改变小鼠的运动模式，也不会影响小鼠的神经肌肉协同性(图9)。

实施例8：DIPMA-Cy5纳米颗粒的分布。

施用DIPMA-Cy5纳米颗粒可以追踪纳米颗粒在体内的运动。单次施用后，在所有的评估时间点，纳米颗粒都位于注射部位(L3-L4)(图10)。在4至6小时之间观察到Cy5荧光减弱，其信号减弱了8小时。在24小时，未观察到荧光，这可能表明纳米颗粒已降解。但是，在DIPMA-Cy5纳米颗粒分解和二嵌段共聚物形成单元进一步降解之后，降解的Cy5共轭二嵌段共聚物有可能淬灭Cy5荧光，因此导致难以准确地解释Cy5荧光的损失。

实施例9：鞘内施用聚合物纳米颗粒可缓解急性疼痛模型的伤害性响应。

为了评估酸响应型聚合物纳米颗粒选择性抑制参与急性疼痛产生的NK

实施例10：鞘内施用聚合物纳米颗粒可缓解慢性疼痛模型的伤害性响应。

慢性疼痛模型是由坐骨神经结扎诱发的，使得对疼痛的敏感性(痛觉超敏、痛觉过敏)持续10天。通过使用Randall-Selitto电子痛觉计测量基线(手术前)和手术后爪缩回来确认敏感性(Eva Santos-Nogueira等人，《神经创伤杂志》(J Neurotrauma)2012,29(5):898–904)。

然后使大鼠鞘内注射(脊柱中的L3-L4位置，总量为10μL)聚合物纳米颗粒(DIPMA、BMA：空或负载有阿瑞匹坦)、媒介物对照(人工脑脊液)或不断增加浓度的阿瑞匹坦(100、300nM和1μM，每种浓度n＝4)。用三种不同浓度的阿瑞匹坦进行试验，以确定哪种药物浓度可以在慢性疼痛模型中显示出镇痛效果。用100、300或500nM阿瑞匹坦负载10、30或50μg的非酸响应型BMA纳米颗粒(每种浓度n＝6)，并用100、300或500nM阿瑞匹坦负载10、30或50μg的酸响应型DIPMA纳米颗粒(每种浓度n＝6)。

Randall-Selitto在15分钟、30分钟、1小时进行，然后每30分钟测量一次，持续5小时，之后每小时测量一次，直到7小时，结果如图12A、图12B和图13所示。显而易见的是，负载有阿瑞匹坦的纳米颗粒的镇痛效果更大，镇痛效果持续时间更长。虽然300nM的游离阿瑞匹坦导致压力提高20g(约25％的疼痛恢复)，但这种效果仅持续2个小时。而将300nM阿瑞匹坦负载到DIPMA聚合物纳米颗粒中，则压力提高60g(<80％疼痛恢复)，持续5个小时。

实施例11：评估纳米颗粒对ATP生产的影响

过去，纳米颗粒的毒性是使用无数不同的细胞健康测定方法进行评估的。CellTiter Glo、碘化丙啶和AlamarBlue用于评估纳米颗粒分别对线粒体健康、核膜完整性和细胞氧化还原电位的影响。这些是测量在选择检测方法之前需要考虑的不同细胞健康指标的常用检测方法。

CellTiter Glo测定用于测量聚合物纳米颗粒对作为线粒体活性指标的ATP生产的影响。该测定法利用甲虫荧光素的ATP依赖性Ultra-Glo重组荧光素酶酶法转化，产生氧化荧光素和光。这种酶相互作用产生的生物发光可以被测量，并与ATP和细胞活力相关。使用此分析的优点在于，它很灵敏，不受血清或苯酚红(生长培养基中常见的pH指示剂)的影响，只需要添加一种试剂，并且在室温下只需要孵育10分钟就可以发出稳定的发光信号。这可以减少误差，因为它减少了所需的步骤数量和人工处理。但是，CellTiter Glo试剂还包含去污剂和ATPase抑制剂，用以裂解细胞并释放ATP进行检测，并且不能用于随时间监测细胞活力。用增加浓度的DEAEMA和DIPMA纳米颗粒处理细胞，并以0-50％掺入DEGMA。将细胞与纳米颗粒一起孵育长达24小时，并使用CellTiter Glo测量细胞活力。在DEAEMA和DIPMA纳米颗粒孵育长达8小时后，仅在浓度为50μg/mL下才观察到毒性(图13)。在24小时时，浓度为10μg/mL和50μg/mL的纳米颗粒降低了细胞活力。在所有测量时间点，引入50％DEGMA提高了用50μg/mL DEAEMA纳米颗粒处理的细胞的细胞活力。在DIPMA处理的细胞中，与0％纳米颗粒相比，0-20％DEGMA纳米颗粒降低了细胞活力。有趣的是，只有50％DEGMA-DIPMA纳米颗粒改善了细胞活力概况。

实施例12：评估纳米颗粒对膜完整性和渗透性的影响

为了确定聚合物纳米颗粒是否破坏膜完整性，进行了碘化丙啶(PI)测定。这种细胞不渗透性染料通过嵌入核酸碱基使细胞核和染色体复染色，并用于检测细胞死亡。在低于CMC的浓度下，DEAEMA和DIPMA不会影响膜完整性。与ATP检测方法一致，在PI检测方法中，将50μg/mLDEAEMA纳米颗粒孵育2至24小时，导致了约40％的细胞死亡(图14)。与细胞孵育2、8和24小时后，引入50％DEGMA，DEAEMA纳米颗粒的毒性显著降低。孵育24小时后，DIPMA纳米颗粒的毒性较小，并且在最高颗粒浓度下显示出约15％的细胞群体死亡。与ATP检测相比，该检测值较低，ATP检测显示出在相同浓度和时间下，DIPMA纳米颗粒的细胞活力损失约40％。DEAEMA和DIPMA毒性的差异可能是因为pKa，pKa可通过内体网络影响颗粒转运的命运。DEAEMA的pKa高于DIPMA，报道的pKa分别为7.1和6.1。因此，在较高的pH下，DEAEMA可能会在内体成熟过程中的早起分解，而DIPMA纳米颗粒则可能在内体网络中保持完整状态。延迟分解可能导致聚阳离子依赖性细胞死亡的发生较慢，也可能决定细胞死亡的机制。

实施例13：评估纳米颗粒对细胞内氧化还原电位的影响

膜完整性和ATP生产测定表明，从检测的浓度和时间参数来看，DEAEMA和DIPMA纳米颗粒不会导致完全细胞毒性。因此，为了观察颗粒的完整细胞毒性概况，使用AlamarBlue试剂研究了更高浓度(0.4-250μg/mL)和延长暴露时间(12-72小时)的纳米颗粒对细胞内氧化还原电位的影响。AlamarBlue(resazurin)是一种细胞渗透性氧化还原指示剂，其在具有活动代谢的细胞的细胞质中被还原为荧光产物resorufin。测得的荧光与群体中活细胞的数量相关。与膜完整性和ATP生产测定一致，DEAEMA纳米颗粒在50μg/mL下在72小时内诱导细胞死亡(图15)。在250μg/mL的DEAEMA纳米颗粒中也观察到100％的细胞毒性。50％DEGMA的掺入在最多72小时(包括72小时)内完全恢复50μg/mL的细胞活力，并在250μg/mL下恢复14.4±5.5％的细胞活力(12小时)。用50μg/mL和250μg/mL处理48小时后，以及用10-250μg/mL孵育72小时后，DIPMA纳米颗粒诱导细胞死亡。50％DEGMA的掺入改善了DIPMA颗粒在48小时处理细胞中的生物相容性。但是，当将细胞分别以50μg/mL(22.5±7.5％)和250μg/mL(19.6±2.0％)的浓度孵育时，50％DEGMA的屏蔽效果只能部分改善细胞活力。在72小时时，当与10μg/mL的纳米颗粒一起孵育时，5％和10％DEGMA可以防止细胞毒性，而20％和50％的则会部分提高细胞活力。在与更高浓度的纳米颗粒一起孵育了72小时后，DEGMA的掺入对细胞活力的影响最小。

实施例14：纳米颗粒在NK

通过共聚焦显微镜检查负载有花菁5的DIPMA纳米颗粒(DIPMA-Cy5)的摄取和细胞内运输。为了检查DIPMA-Cy5纳米颗粒向内体的运输，将DIPMA-Cy5纳米颗粒与表达Rab5-GFP(可识别早期内体)或Rab7-GFP(可指示晚期内体)的HEK-293细胞一起孵育。在150秒内检测到DIPMA-Cy5纳米颗粒的摄取，到300秒时，在Rab5-GFP阳性早期内体中检测到DIPMA-Cy5纳米颗粒(图16A)。30和60分钟后，DIPMA-Cy5纳米颗粒广泛定位于Rab5-GFP早期内体和Rab7-GFP晚期内体中(图16B、图17A)。为了确定纳米颗粒是否运输至含有NK

通过高容量成像(共聚焦显微镜)检查负载有香豆素153的DIPMA纳米颗粒(DIPMA-CO)的摄取和分解，该纳米颗粒在水性环境中发射而在疏水性核中不发射。当将DIPMA-CO纳米颗粒与HEK-293细胞一起孵育时，细胞荧光在5分钟内显著增加，持续30分钟(图16D、E)。网格蛋白抑制剂PitStop2和发动蛋白抑制剂Dyngo4a抑制了细胞荧光。抑制液泡H

实施例15：纳米颗粒封装的AP对伤害性感受的影响

尽管AP会抑制急性化疗所致恶心呕吐，但NK

辣椒素诱发的机械性痛觉超敏。

使小鼠鞘内注射AP、纳米颗粒或媒介物(5μl)，30分钟后向后爪足底注射辣椒素，可激活TRPV1，引起急性痛觉超敏和神经源性炎症。在辣椒素注射前后，测量对用校准的vonFrey细丝(VFF)刺激注射后爪趾面的缩回响应。在接受媒介物或DIPMA-空纳米颗粒的小鼠中，辣椒素在0.5至4小时降低VFF阈值，这与机械性痛觉超敏一致，在24小时后恢复到基线(图18B)。游离AP(5μl，100nM)和与游离AP混合的DIPMA-空纳米颗粒(100nM)在1小时后产生了适度的抗痛觉超敏(分别为16±4％和15±3％抑制)，这在1.5小时后检测不到。BMA-AP纳米颗粒(100nM AP)在0.5至1小时后具有相似的效果，但这种效果比游离AP更持久，可持续2小时。当其他治疗方法无效时，递送相同剂量AP的DIPMA-AP纳米颗粒(5μl，100nM)在0.5至1小时引起明显的抗痛觉超敏(1小时，34±3％抑制)，持续4小时(35±2％抑制)。对整体响应(0-4小时曲线下面积，AUC)的分析确认，DIPMA-AP纳米颗粒提供了对辣椒素诱发的机械性痛觉超敏的最有效抑制(图18C)。

完全弗氏佐剂诱发的机械性痛觉过敏。

足底注射完全弗氏佐剂(CFA)会引起持续的机械性痛觉过敏，从而可以检查以治疗方式施用的纳米颗粒封装的AP逆转炎性疼痛的能力(图18A)。足底注射CFA后48小时，VFF阈值明显降低，这与机械性痛觉过敏一致(图18D)。注射CFA后48小时鞘内注射媒介物不会影响机械性痛觉过敏，该现象会持续24小时。AP(5μl，100或300nM)会依赖剂量逆转痛觉过敏2至3小时(1.5小时，抑制％：100nM，30±6％；300nM，47±3％)。BMA-AP纳米颗粒(100nMAP)与游离AP(300nM)一样有效。当其他AP治疗无效时，DIPMA-AP纳米颗粒(100nM AP)比同剂量的游离AP产生更大的痛觉超敏抑制作用(1.5小时，抑制％：54±4％)，并且这种抑制持续了6小时。尽管全身性吗啡(3mg/kg，腹膜内注射)在0.5小时后完全逆转了机械性痛觉过敏，但3小时后这种效果迅速下降至基线。整体响应分析(0-8小时AUC，半宽响应(halfwidth response))表明，DIPMA-AP纳米颗粒产生了最持续的痛觉过敏逆转(图18E、F)。

神经损伤诱发的机械性痛觉过敏。

腓肠神经保留(SNS)模型在大鼠中产生稳定而强大的机械性痛觉过敏，其可持续50天以上，从而可以检查纳米颗粒封装的AP缓解另一种物种的慢性神经性疼痛的功效。手术后10天，与假手术大鼠相比，SNS降低了引起后爪缩回的压力(Randal-Siletto试验)，这表明了机械性痛觉过敏(图18A、G)。在接受鞘内注射媒介物的大鼠中，机械性痛觉过敏维持了7小时(图18G)。尽管AP(10μl，100nM)不会改变缩回阈值，但AP(300nM)在0.5小时后抑制缩回阈值，在1小时后达到最大抑制40±2％，并在2.5小时后恢复至基线。AP(1μM)在1小时后几乎完全逆转了痛觉过敏(75±4％抑制)，但痛觉过敏在3小时后恢复至基线(图19)。BMA-AP(10μl，100、300nM AP)抑制了痛觉过敏的程度与游离AP(300nM)相似。在其他方法均无效时，DIPMA-AP(100、300nM AP)强烈逆转了痛觉过敏，1.5小时后几乎完全抑制(300nM，80±4％抑制)，并持续4.5小时。DIPMA-AP(500nM)使痛觉过敏完全缓解4.5小时(图19)。尽管吗啡使痛觉过敏完全逆转2小时，但与DIPMA-AP相比，这种效果是短暂的，并且在2.5小时后消失。整体响应分析(0-7小时AUC，半宽响应)表明，DIPMA-AP纳米颗粒产生了最持续的痛觉过敏逆转(图18H、I)。

因此，在两种物种的急性(辣椒素)、炎性(CFA)和神经性(SNS)疼痛模型中，将AP封装入pH响应型DIPMA纳米颗粒可增强AP的抗伤害性感受作用，从而增加响应的幅度和持续时间。由于将AP封装入非pH响应型纳米颗粒中没有比游离AP更有效，因此DIPMA-AP的功效增强取决于pH响应型递送，而不是纳米颗粒本身的封装。

实施例16：纳米颗粒封装的AP对初级感觉神经元和脊髓神经元的敏化和激活的影响

从脊髓背角的初级感觉神经元的中心突起(C纤维伤害性感受器)释放的SP、CGRP和谷氨酸激活二级脊髓神经元的受体，以介导伤害性感受传递。初级感觉神经元和二级脊髓神经元的敏化是慢性疼痛的标志。为了检查敏化程度，我们测量了激活C纤维反射所需的阈值电流，并评估了wind-up(由C纤维的电刺激引起的脊髓神经元兴奋性的频率依赖性增加)。与假手术对照组相比，SNS大鼠中同侧股二头肌中C纤维介导的反射响应激活所需的阈值电流降低(SNS，3.2±2.8mA；假手术组，10.3±1.2mA，P<0.05)。施加电刺激(0.1Hz)会导致一段时间内持续稳定的C反射活动，以及诱发的wind-up活动(图20A-F)。对SNS大鼠施用AP(10μl、1μM鞘内)降低了C反射(但仅在30分钟有效)，但没有影响wind-up。DIPMA-AP纳米颗粒(300nM AP)在45分钟内降低C反射，在15分钟内降低wind-up活动，并在观察期间(120分钟)抑制响应。

鞘内注射DIPMA-AP抑制伤害性感受的有效性可能是由于对SP诱导的脊髓神经元持续兴奋的拮抗作用，这需要来自内体的NK

实施例17：内体NK

使用基因编码的FRET生物传感器使得能够以高时空保真度评估活细胞中的信号传导途径。通过使用FRET生物传感器评估阻隔的信号传导，以及利用遗传和药理学方法抑制网格蛋白和发动蛋白介导的NK

为了检测核ERK的激活，我们在HEK-hNK

为了确定无负载纳米颗粒是否会影响核ERK活性，我们将HEK293细胞与DIPMA-空和BMA-空纳米颗粒(10、20、30μg/mL)一起孵育了30分钟。DIPMA-空和BMA-空纳米颗粒在任何研究浓度下均不会激活核ERK(图21D-E)。使用alamar Blue检测细胞的活力，其评估活细胞将活性化合物rezasurin还原为resofurin的能力。将HEK293细胞暴露于DIPMA-空和BMA-空纳米颗粒(1-100μg/mL)中24小时或48小时，并没有影响细胞活力(图21F)。因此，纳米颗粒在HEK293细胞中不会激活ERK或不具有细胞毒性作用。

为了比较游离AP和纳米颗粒封装的AP拮抗内体中NK

实施例18：鞘内施用DIPMA-(MK-3207)纳米颗粒

在CFA模型中评估了酸响应型DIPMA-MK-3207纳米颗粒的镇痛效果。通过Von Frey纤毛评估了机械性痛觉超敏。

鞘内给药30nM、100nM、300nM和1μM的MK-3207(每种浓度n＝4)。随时间测量爪缩回阈值(PWT/g)。结果以图形方式总结在图23(A)中。

鞘内给药(小鼠)负载有30nM、50nM和100nM MK-3207的酸响应型DIPMA纳米颗粒组合物(DIMPA-(MK-3207)纳米颗粒)(与施用100nMMK-3207相比)。随时间测量爪缩回阈值(PWT/g)。结果以图形方式总结在图23(B)中。

实施例19：双负载DIMPA纳米颗粒--DIPMA-(Ap+MK-3207)纳米颗粒--的制备

使用与本文其他地方(例如，实施例2)所述类似的方法，用P(PEGMA-co-DMAEMA)-b-P(DIPMA-co-DEGMA)二嵌段聚合物，制备双负载有阿瑞匹坦(Ap)和MK-3207的酸响应型DIPMA纳米颗粒。负载比为1:0.5、1:1、1:2和1:4的阿瑞匹坦和MK-3207得到下表中所示的双负载纳米颗粒组合物。用LC-MS评估纳米颗粒组合物中所负载的阿瑞匹坦和MK-3207的浓度，并将其总结在下表中(参见第二和第三列)(也参见图24)。

注：Mean-/+SD，n＝4

实施例20：双负载DIPMA-(Ap+MK-3207)纳米颗粒的鞘内施用

在CFA模型中评估了双负载有阿瑞匹坦和MK-3207的酸响应型DIPMA纳米颗粒的镇痛效果。通过Von Frey纤毛评估了机械性痛觉超敏。

鞘内给药(小鼠)负载有82nM阿瑞匹坦+12nM MK-3207、81nM阿瑞匹坦+25nM MK-3207，以及80nM阿瑞匹坦+81nM MK-3207的酸响应型DIPMA纳米颗粒。随时间测量爪缩回阈值(PWT/g)。将其与鞘内给药120nM阿瑞匹坦+120nM MK-3207(小鼠)进行比较。结果以图形方式总结在图25中。

施用双负载DIPMA-(Ap+MK-3207)纳米颗粒与施用游离Ap和MK-3207相比，增强了效果和作用持续时间。

实施例21：DIPMA-(MK-3207)纳米颗粒和DIPMA-Ap纳米颗粒的鞘内共施用

施用CGRP

在CFA模型中评估了共同施用DIPMA-(MK-3207)纳米颗粒与DIPMA-Ap纳米颗粒的镇痛效果。通过Von Frey纤毛评估了机械性痛觉超敏。

鞘内给药DIPMA-Ap纳米颗粒(Ap 30nM)+DIPMA-(MK-3207)纳米颗粒(MK-320730nM)、DIPMA-Ap纳米颗粒(Ap 60nM)+DIPMA-(MK-3207)纳米颗粒(MK-3207 60nM)，以及DIPMA-Ap纳米颗粒(Ap 120nM)+DIPMA-(MK-3207)纳米颗粒(MK-3207 120nM)(小鼠)。随时间测量爪缩回阈值(PWT/g)。将其与鞘内给药120nM阿瑞匹坦+120nM MK-3207(小鼠)进行比较。结果以图形方式总结在图26中。

共给药DIPMA-(MK-3207)纳米颗粒和DIPMA-Ap纳米颗粒在CFA疼痛模型中是有效的：当纳米颗粒以120nM的剂量共同给药时，镇痛效果和效果持续时间与施用相同浓度的游离AP和MK-3207相比得到了改善。

材料和方法

透射电子显微镜(TEM)。通过TEM成像确定纳米颗粒的形态。使用Tecnai F20透射电子显微镜在环境温度下以200kV的加速电压进行TEM成像。将等份试样(5μL)的0.1wt％乳胶溶液(用MiliQ水稀释)沉积在涂覆Formvar的铜网格(GSCu100F-50，Proscitech)上，并使其在空气中和室温下干燥过夜。

细胞系。使用Gibson Assembly(NEB)将具有CD8信号序列和N端FLAG标签的人NK

细胞培养。将HEK-hNK

细胞系中的纳米颗粒运输。将HEK-293细胞铺板在补充有10％(v/v)FBS的DMEM(DMEM/FBS)中的涂覆多聚-D-赖氨酸的ibidi腔室(Germany)上。24小时后，使用PEI，以1:6的比例用300ng大鼠(r)NK

使用FRET生物传感器确定阻隔的信号传导。将HEK-hNK

细胞内钙(iCa

纳米颗粒在HEK-293细胞中的摄取和分解。香豆素153是一种溶剂化变色染料，仅在极性溶剂中发出荧光，从而可以检测到完整细胞中香豆素荧光的出现，从而观察到纳米颗粒核中负载的香豆素的释放。每毫克DIPMA聚合物(DIPMA-CO)使用0.5mg香豆素153来自组装纳米颗粒。将HEK-293细胞与媒介物(Hank’s平衡盐溶液，HBSS)、发动蛋白抑制剂(Dyngo4a、Dy4，30μM)、网格蛋白抑制剂(Pitstop、PS2，30μM)、液泡H

动物。从莫纳什动物研究平台(Monash Animal Research Platform)购买了成年雄性C57BL/6小鼠(6-10周)，并从智利大学医学院(the Faculty of Medicine of theUniversity of Chile)获得了雄性Sprague-Dawley大鼠(225-250g)。将所有动物分成4只一组进行饲养，放置在温度(22±4℃)和湿度受控、具有12小时的明/暗循环的环境中。食物和水可随意获得。对动物的所有行为测试均由对治疗组不知情的实验者以不知情的方式进行。在光循环下进行实验，将每个笼子中的动物随机分配到不同的治疗组中。通过麻醉剂过量和开胸手术对动物实施安乐死。这些研究是根据美国国立卫生研究院(NationalInstitutes of Health，NIH)的实验动物护理和使用指南进行的，并遵守了IASP的道德准则。住房条件和实验程序得到了莫纳什大学莫纳什制药科学研究所(Monash Institute ofPharmaceutical Sciences，Monash University)的动物伦理委员会和智利圣地亚哥大学生物伦理委员会(Bioethics Committee of the University of Santiago of Chile)的批准。

药物施用。

转杆试验。实验进行前，使小鼠适应环境，并在转杆装置上训练，连续两天进行连续三轮训练，以评估运动能力。在实验当天，记录了三个基线读数，并预设了120秒的截止阈值。鞘内注射(5μL)DIPMA-Ap、BMA-Ap、DIPMA-空或媒介物(aCSF)。随后，在注射后30分钟、60分钟、90分钟、120分钟、180分钟和240分钟记录小鼠的跌倒潜伏期(秒)。

NP的生物分布。对小鼠进行镇静(2％异氟烷)，然后将其置于体内成像系统(IVIS光谱，Perkin Elmer，USA)中。在鞘内施用DIPMA-Cy5 NP(10μg/mL)之前获得图像。采集2组小鼠的后部图像，第一组在DIPMA-Cy5施用后2小时和6小时成像，第二组在DIPMA-Cy5施用后4小时和8小时成像。

小鼠急性和炎性疼痛的诱导和评估

大鼠神经性疼痛的诱导和评估

对大鼠C纤维诱发的伤害性感受反射和wind-up活动的电生理评估。通过测量与腓肠神经C纤维的电激活诱发的伤害性后肢屈曲反射相关的肌电图(EMG)活性，评估伤害性突触传递。将大鼠维持在麻醉状态下(使用隔膜啮齿动物口罩，在氧气中存在1.2-1.5％的异氟烷)，然后将其置于调节的导热垫上(37±0.5℃)。使用一对皮下插入第三和第四脚趾的外侧部分的铂刺激电极，以及通过皮肤插入同侧股二头肌的记录电极来测量EMG活性。C-反射对应于反射响应在刺激后150-450ms时间窗内的整合。当刺激频率增加到1Hz时，Windup是C反射响应的增强。windup对应于与在1Hz刺激下记录的前七个连续窗口的整体响应相吻合的回归线的斜率。进行记录以获得稳定的C反射响应(约30分钟)后，估算C反射的阈值，并在实验期间以阈值强度的2倍刺激大鼠。通过在0.1Hz下进行15次连续刺激的平均值来评估C反射，而后在1Hz下进行7次刺激来评估windup。手术后10天(基础)和鞘内注射后30、60、90和120分钟进行记录。药物施用。整体C反射响应表示为基础响应的百分比。

大鼠脊髓神经元的细胞贴附式膜片钳记录。如上所述，从大鼠腰脊髓制备矢状切片(300-400μm)。将切片转移到记录室中，并用aCSF浇盖(2ml.min

细胞活力测定。将HEK-hNK

根据Promega提供的说明制备CellTiter Glo试剂。处理后，将板在室温下孵育30分钟。首先从每个孔中取出50μL细胞培养基，并丢弃。用50μL的CellTiter Glo试剂对每个孔的剩余内容物进行处理。将细胞在室温下孵育至少10分钟，并使用CLARIOstar(BMGlabtech)在λ＝555±40nm下测量生物发光。然后通过减去曲拉通X-100对照物，并将这些值表示为媒介物对照的百分比，来计算细胞活力。数据表示为5个独立实验的mean±S.E.M。

使用500nM的最终孔浓度进行碘化丙啶细胞毒性测定。将细胞与染料在室温下一起孵育30分钟。使用CLARIOstar检测荧光(ex：λ＝535±10nm，em：λ＝617±10nm)。通过媒介物基线减法计算细胞毒性值，并将细胞毒性值表示为曲拉通X-100对照的细胞死亡百分比。数据表示为5个独立实验的mean±S.E.M。

在AlamarBlue细胞活力测定中，去除细胞培养基，并将其替换为100μL的新鲜培养基。在37℃、5％CO

统计分析。除非另有说明，否则数据以mean±SEM表示。使用学生t检验评估了两次比较的差异。对于多重比较，通过Dunnett’s多重比较试验(机械性痛觉过敏和水肿)和Tukey’s多重比较试验(FRET和iCa